CN1710077A - 一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明设计了5对简并引物(共6条)用于快速扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因。本发明设计的5对简并引物序列为：引物1，AARTAYATYGTCAAGYWSAAG/ AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物2，AARTAYATYGTC GTCYWSAAG/AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物3，AAR TAYATYGTCGTCYWSAAG/TTAAGYRKHKCCRTTGWAG；引物4，MAWGMTKWYGAACSKYCT/GTRTCRATGACGTA GACKG；引物5，MAWGMTKWYGAACSKYCT/TTAAGYRK HKCCRTTGWAG。本发明以捕食线虫真菌基因组DNA作为模板，通过以上引物快速扩增胞外蛋白酶的编码基因。本发明能够快速扩增捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因，具有良好的应用前景。

Description

一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

技术领域：

本发明涉及一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。

背景技术：

植物寄生线虫是一大类重要的植物病害，每年造成损失巨大。在线虫生物防治中，食线虫真菌是一类非常重要的线虫生防资源，目前已有包括线虫必克等商品化的线虫生防制剂上市。

在线虫侵染过程中，无论是对于线虫虫体或者虫卵来说，其覆盖于表面的体壁或卵壳都是防止侵染的重要保护结构。线虫的体壁主要由包括角蛋白、胶原蛋白在内的蛋白质和纤维质所构成，卵壳则主要是由几丁质层构成。体壁和卵壳共同形成了防止侵染的主要屏障。研究表明，在食线虫菌物侵染线虫的过程中，主要是机械与酶共同作用的结果，其中显微结构和组织化学的研究表明，至少在线虫体壁的刺入、线虫被侵入、线虫的消化等过程中均有蛋白酶和水解酶的参与。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助完成侵染过/程，是线虫侵染的重要毒力因子。因此，从食线虫菌物中获取蛋白酶基因是提高线虫生防制剂毒力，对现有菌株进行基因工程改造的重要手段之一。

目前克隆食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法主要是通过分离纯化目的蛋白酶，测定蛋白酶的N-端氨基酸序列，根据N-端氨基酸设计简并引物，然后通过以下两种方法克隆得到目的蛋白酶的编码基因。一是通过RACE技术扩增得到全长基因序列；二是建立cDNA文库，通过杂交筛选得到全长编码基因，以上两种方法共同的特点是难度大，时间长，而且费用极高。

经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术不足，通过发明一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法，迅速获得需要的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因，促进线虫生防菌株的基因工程菌研究开发。

本发明根据GenBank上发表的丝氨酸蛋白酶编码序列设计了5对共6条简并引物用于扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因，对PCR扩增片段进行测序，测序结果在NCBI(美国国立生物技术信息中心，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索，根据检索结果就可以判断用专利引物扩增得到的基因序列是不是捕食线虫真菌丝氨酸蛋白酶基因，并初步判断蛋白酶杀线虫能力大小。

本发明用于引物设计的产胞外丝氨酸蛋白酶的真菌和相关的基因序号(GenBank索引号)如下(表1)，利用生物分析软件DNAman对这些真菌的胞外蛋白酶基因进行比对，并根据它们的保守序列设计了5对共6条简并引物(表2)。

表1用于简并引物设计的真菌和胞外丝氨酸蛋白酶编码基因

真菌名称	蛋白酶性质	GenBank索引号	备注
				Arthrobotrysoligospora	表皮降解丝氨酸蛋白酶(PII)	X94121	捕食线虫真菌
Arthrobotrysoligospora	中性丝氨酸蛋白酶(Aoz1)	AF516146	捕食线虫真菌
				Paecilomyceslilacinus	丝氨酸蛋白酶(Pr)	L29262	线虫内寄生真菌
Verticilliumchlamydosporium	碱性丝氨酸蛋白酶(VCP1)	AJ427460	线虫内寄生真菌
				Beauveriabassiana	表皮降解丝氨酸蛋白酶(Pr)	AF154118	昆虫病原真菌
Metarhiziumanisopliae	丝氨酸蛋白酶(PrA)	AJ251925	昆虫病原真菌
				Cordycepsbrongniartii	表皮降解蛋白酶(Pr1)	AY520815	昆虫病原真菌
Fusarium sp.S-19-5	碱性蛋白酶(Alp)	S71812
				Tritirachiumalbum	丝氨酸蛋白酶	X56116

表2用于捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的简并引物

引物	上游引物序列(5’--3’)	下游引物序列(5’-3’)	用途
				1	AARTAYATYGTCAAGYWSAAG	AYRTGDGGRSWRGCCATSGA	用于基因中间片段扩增

2	AARTAYATYGTCGTCYWSAAG	AYRTGDGGRSWRGCCATSGA	用于基因中间片段扩增
				3	AARTAYATYGTCGTCYWSAAG	TTAAGYRKHKCCRTTGWAG	用于蛋白酶3’端序列扩增
4	MAWGMTKWYGAACSKYCT	GTRTCRATGACGTAGACKG	用于中性蛋白酶5’端序列扩增
				5	MAWGMTKWYGAACSKYCT	TTAAGYRKHKCCRTTGWAG	用于中性蛋白酶全长序列扩增

表中的简并碱基代码：M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。

表2中所设计的引物用途说明如下：

引物1：能够扩增包括捕食线虫真菌在内的丝状真菌的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的中间序列，尤其适合于扩增等电点较高(pI＞8.0)的碱性丝氨酸蛋白酶基因，扩增片段900-1200bp(由于不同真菌的内含子序列大小不同，所以扩增片段大小也不完全相同)，一般的扩增片段为1000bp.

引物2：能够扩增包括捕食线虫真菌在内的丝状真菌的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的中间序列，尤其适合于扩增等电点较低(pI＜7.0)的中性丝氨酸蛋白酶基因，扩增片段900-1200bp(由于不同真菌的内含子序列大小不同，所以扩增片段大小也不完全相同)，一般的扩增片段为1000bp.

引物3：能够扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的3’端序列，扩增片段1100-1300bp，由于不同捕食线虫真菌的内含子序列大小不同，所以扩增片段大小也不完全相同。

引物4：能够扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的5’端序列，尤其适合于扩增等电点较低(pI＜7.0)的中性丝氨酸蛋白酶基因，扩增片段一般为450-500bp.

引物5：能够扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全长序列，尤其适合于扩增等电点较低(pI＜7.0)的中性丝氨酸蛋白酶基因，扩增片段一般为1200-1400bp，由于不同捕食线虫真菌的内含子序列大小不同，所以扩增片段大小也不完全相同。

采用本发明设计的引物可以实现对包括捕食线虫真菌在内的丝状真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因的快速扩增，引物1和引物2适合于包括捕食线虫真菌在内的丝状真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因的快速扩增，引物3和4能够用于分别扩增捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的3’端和5’端序列的扩增，引物5适合于扩增捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因全序列。

本发明是这样实现的

真菌培养，从菌丝中提取基因组DNA作为模板，利用以上设计的引物进行PCR扩增，扩增片段测序，测序结果在NCBI中利用BLAST N( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行检索，根据检索结果判断扩增序列的性质。

1.真菌培养：捕食线虫真菌一般用PDA培养基进行培养，不同真菌的营养要求可能有所差异，本发明不做特殊要求。等菌丝长好以后，用常规的封口塑料袋收集，并用液体氮气进行速冻，速冻的菌丝可以放在-70℃进行长期保存。

2.真菌基因组DNA的提取：以常用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法进行提取，常规的提取步骤如下：

1)收集在平板或者液体培养基中新鲜菌丝；

2)用液氮研磨或者用石英砂研磨(100mg石英砂，100mg菌体，300ml CTAB溶液)，菌体磨好后再加300ml CTAB溶液，混合均匀；

3)65℃水浴1小时，20分钟翻转一次；如果要除去RNA，可以在水浴40分钟的时候加入1μl的RNA酶(10mg/ml)：

4)加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均匀；

5)6500rpm离心30分钟；

6)把上清溶液转移到新的EP管中，注意不要吸到中间的沉淀物质，在上清液中加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均匀；

7)6500rpm离心20分钟；

8)把上清溶液转移到新的EP管中，加入0.5倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混合均匀；

9)12000rpm离心5分钟，弃上清：

10)沉淀用70％的乙醇清洗两遍：

11)把残余的乙醇真空抽干，加入20-30μl的水溶解沉淀；

12)取2-3μl样品电泳检测(1％agarose)，DNA样品-20℃保存备用。

3.PCR扩增：把基因组DNA稀释5-20倍(根据提取质量)，利用以上所设计的引物配制PCR反应体系，PCR扩增程序采用降落(Touch-down)PCR程序。

1)PCR扩增体系

10 X PCR buffer25mM MgCl2dNTP(10μM)灭菌水上游引物(100μM)H下游引物(100μM)Taq DNA聚合酶(2-5units/μl)DNA总体积

5μl3μl1μl36.5μl1μl1μl0.5μl2μl50μl

^a使用简并引物，所以引物的浓度较高

2)降落(Touch-down)PCR程序

94℃	5min
			94℃65℃72℃	40sec40sec100sec
94℃63℃72℃	40sec40sec100sec
			94℃61℃72℃	40sec40sec100sec	3个循环
94℃59℃72℃	40sec40sec100sec	3个循环
			94℃57℃72℃	40sec40sec100sec	3个循环
94℃55℃72℃	40sec40sec100sec	6个循环

94℃53℃72℃	40sec40sec100sec	9个循环
			94℃51℃72℃	40sec40sec100sec	12个循环

由于以上PCR扩增采用的是简并引物，通过降落PCR能够有效的提高扩增产物的特异性，如果PCR产物比较弱的话也可以进行二次PCR来提高PCR反应的特异性。同时由于引物和模板浓度或者扩增程序不匹配等原因而导致没有预期扩增产物出现的话，可以对以上因素进行修正，然后再次进行扩增。

4.PCR扩增片段测序：可以把PCR扩增片段纯化出来并和商业化的测序载体连接，也可以直接把PCR扩增液体送给专业的公司进行测序。

5.测序结果分析：测序结果出来后，可以利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLAST N(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行分析，根据检索结果判断扩增序列的是否是捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因，也可以用DNAman进行同源序列分析。

本发明与现有技术相比，具有快捷、简便、经济等优点。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：刀孢轮枝菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因保守序列扩增

将刀孢轮枝菌(L.psalliotae，syn.V.psalliotae)菌体接种到PDA平板上，26℃培养6-8天，收集菌丝并提取基因组DNA，以刀孢轮枝菌的基因组DNA作为模板，用引物1进行扩增得到胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的保守序列。

实施例二：囊孢单顶孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因保守序列扩增

将囊孢单顶孢(M.cystosporium)菌体接种到PDA平板上，26℃培养6-8天，收集菌丝并提取基因组DNA，并用引物2进行扩增得到胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的保守序列。

实施例三：隔子孢YMF1.00118的胞外丝氨酸蛋白酶基因扩增

基本同实施例二，以隔子孢YMF1.00118(Dactylella spp.YMF1.00118)的基因组DNA作为模板，用引物3进行扩增得到胞外丝氨酸蛋白酶成熟肽全序列和部分前肽序列。

实施例四：秀丽单顶孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因5′端序列扩增

基本同实施例二，以秀丽单顶孢(M.elegans)的基因组DNA作为模板，并用引物4进行扩增得到胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的5′端序列。

实施例五：圆锥节丛孢胞外丝氨酸蛋白酶基因扩增

基本同实施例二，以圆锥节丛孢(A.conoides)的基因组DNA作为模板，并用引物5进行扩增得到胞外丝氨酸蛋白酶全长编码基因序列，圆锥节丛孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因已经整理完成，并已经递交到GenBank上，基因的序列索引号为AY859782。

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<110>云南大学

<120>一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

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<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1090

<212>DNA

<213>Lecanicillium psalliotae(syn.Verticillium psalliotae)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1090)

<223>

<400>1

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<212>DNA

<213>Monacrosporium cystosporium

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<110>云南大学

<120>一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

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<211>1110

<212>DNA

<213>Dactylella spp.YMFl.00118

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<221>gene

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cgcatctctc gcttccaccg caactcggcc cgcgacctca gcggtgcacc aacccacggt  120

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ctcggtggtg gcaagtctgc tgccgtcaac agcgctgtcg atgccatcta cgctgccgga  720

atcactgtcg ttgtcgctgc cggtaacgag aaccgcgatg cttccctcgt ctccccagct  780

tccgctccaa aggccatcac tgttgccgct atggacaaga ccaacacccg cgcctacttc  840

tccaactttg gcactctcat tgatatctgg gccccaggtg tcgatgtcct cagcgcttgg  900

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aacaagctcg cctacaacgg caacgcttaa                                     1110

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<120>一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

<130>1

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>486

<212>DNA

<213>Monacrosporium elegans

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<221>gene

<222>(1)..(486)

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aatgatttcg aacggcctca tctctctctt agccattgct ggattggcat ttgcaggtcc    60

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<110>云南大学

<120>一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

<130>1

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1297

<212>DNA

<213>Arthrobotrys conoides

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1297)

<223>

<300>

<308>AY859782

<309>2004-12-16

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aatgctgacg aacggcctca tctccctcct agcaatcgct ggattggcta ccaatgcctt    60

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atcccgagct acatggggat tcaactctgt tgacaagact gactccgatg gtaatggcca    660

cggcacccac tgtgctggca ctatcgccgg gaagacctat ggtgtttcga agaaagccaa    720

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tggaggctct aagtctgctg ctctcaatac tgctgttgac tctatcttca atgctggaat    900

ctccattgtc gttgctgctg gtaacgagaa ccaagatgct aagaatgttt cgcccgcttc    960

tgcccctaat gccattactg ttggcgccat tgacagcaac aacaagaggg cttctttctc    1020

taactgggga actctcattg atgtctttgc tccaggtgtc tctgtgttga gttcctgggc    1080

tacatctgat actgacacca agtccatctc cggtacttct atggcctgcc cacacgttgc    1140

cggtttggcc gcctactaca tcagcagttt tgaaggtgcc ggcgctaaac cgcaagtcat    1200

caccgacagg atcaccgaaa gcgcaattac tggcaagctc aaccctagtg atatcaaggg    1260

atctccaaac aggattgcct acaacggaac cgcttaa                             1297

Claims (2)

1、一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法，包括真菌培养、真菌基因组DNA的提取、用引物进行PCR扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用引物由下列方法设计得到：

(1)选择GenBank上发表的下列真菌和胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因用于简并引物设计；

真菌名称            蛋白酶性质            GenBank索引

                                          号

Arthrobotrys        表皮降解丝氨酸蛋      X94121

oligospora          白酶(PII)

Arthrobotrys        中性丝氨酸蛋白酶      AF516146

oligospora          (Aozl)

Paecilomyces        丝氨酸蛋白酶(Pr)      L29262

lilacinus

Verticillium        碱性丝氨酸蛋白酶      AJ427460

chlamydosporium     (VCP1)

Beauveria           表皮降解丝氨酸蛋      AF154118

bassiana            白酶(Pr)

Metarhizium         丝氨酸蛋白酶          AJ251925

anisopliae          (PrA)

Cordyceps           表皮降解蛋白酶        AY520815

brongniartii        (Pr1)

Fusarium sp.        碱性蛋白酶            S71812

S-19-5              (Alp)

Tritirachium        丝氨酸蛋白酶          X56116

album

(2)利用生物分析软件DNAman对上述真菌和胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因进行比对，并根据它们的保守序列设计出下列5对共6条简并引物：

     上游引物序列             下游引物序列

引

     (5’--3’)               (5’--3’)

物

1    AARTAYATYGTCAAGYWSAAG    AYRTGDGGRSWRGCCATSGA

2    AARTAYATYGTCGTCYWSAAG    AYRTGDGGRSWRGCCATSGA

3    AARTAYATYGTCGTCYWSAAG    TTAAGYRKHKCCRTTGWAG

4    MAWGMTKWYGAACSKYCT       GTRTCRATGACGTAGACKG

5    MAWGMTKWYGAACSKYCT       TTAAGYRKHKCCRTTGWAG

表中的简并碱基代码：M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。

2、权利要求1所述的方法，其特征在于本方法作为快速扩增捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的应用。