CN1814807A - 诺瓦克病毒表达量检测试剂盒及其专用引物与探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诺瓦克病毒表达量检测试剂盒及其专用引物与探针，属于病毒核酸的检测技术领域。该试剂盒包含样品前处理液A、样品前处理液B、样品前处理液C、样品前处理液D、RNA提取试剂、无RNA酶的水、随机引物、反转录缓冲液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆转录酶储存液、GG I型PCR反应液、GG II型PCR反应液、GG I型探针、GG II型探针、GG I型UNG酶、GG II型UNG酶、GG I型标准品、GG II型标准品、GG I型质控品、GG II型质控品。本发明所提供的试剂盒可用于牡蛎或人粪便中诺瓦克病毒RNA表达的检测，可以为诺瓦克病毒的研究、预防和控制诺瓦克病毒经新鲜海产品介导引起大规模的爆发提供方便快捷的检测工具。

Description

诺瓦克病毒表达量检测试剂盒及其专用引物与探针

技术领域

本发明涉及一种诺瓦克病毒表达量检测试剂盒及其专用引物与探针，尤指一种定量检测标本中诺瓦克病毒(Norovirus)的量并区分出其基因型的检测试剂盒及其专用引物与探针，属于病毒核酸的检测技术领域。

背景技术

Norovirus(曾称作诺瓦克样病毒，Norwalk-like virus)，1972年首次从美国俄亥俄州诺瓦克城爆发的急性胃肠炎患者粪便标本中分离出来，是一种直径27μm的RNA病毒。最近Norovirus(NoV)被认为是食源性疾病爆发最重要的病原，其通过人传人方式传播的多为二、三代患者，而初发事件多是通过污染食品以及水、尤其是新鲜海产品引起的爆发流行，已成为日益严重的公共卫生问题。美国每年有2300万例胃肠炎，其中5万例需住院治疗、300例死亡，是由NoV引起的；美国的疾病预防控制中心(CDC)仅在2002年11月～12月间，就接到来自华盛顿、新罕布什尔和纽约3个州的104起NoV引起的胃肠炎爆发报告。欧洲10个监测系统的数据显示，NoV应该对1995年～2000年间超过85％的病毒性食源性疾病负责。据日本IASR(Infectious AgentsSurveillance Report)监测网报道，仅2003年10月一个月，在青森、岩手和滋贺县三个县就相继发生4起NoV引起的胃肠炎爆发；同时日本冬季儿童腹泻的主要病原也是NoV。继2002年CDC报道NoV通过食品引起的爆发迅速上升后，食品中、尤其是新鲜海产品中NoV的研究便成为人们十分关注的课题。我国由于对NoV本身的认识不足、相关研究少、检测手段落后、误诊率高或不能确诊等影响因素，至今尚未见NoV引起食源性疾病爆发的报道。

目前国内外对食品、尤其是新鲜海产品中NoV的研究因受检测技术的限制而裹足不前。由于NoV原型株不能用细胞株培养、也不能建立动物模型，传统的检测方法是用电镜检查患者的粪便标本，因其分辨率低(接近10⁶～10⁷个病毒/克浓度时才能被检测到)，而不能用于检测食品或水标本中较低浓度的病毒，加之电镜调查成本高、标本难获得，只限于进行小规模标本的调查；免疫电镜技术可使敏感度提高10～100倍，但与操作者的经验和技能间关系密切，因而假阴性率较高。酶联免疫吸附法(ELISA)可检测浓度在10⁴～10⁶/ml的临床标本(双分血清)，但由于NoV不同株间壳衣蛋白抗原具有相当大的变异性，降低了该法的特异性和敏感性，且材料来源有限，限制了该法的使用。

荧光定量RT-PCR技术的出现，为我们提供了一个定量检测病毒RNA的准确方法，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。

在本发明中，我们采用了目前最先进的实时荧光定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性的干扰。克服了常规PCR检测技术的诸多难题，如产物电泳费时、溴化乙啶毒性、易出现假阳性、特异性低等难题。本发明试剂盒可以对牡蛎、人粪便中诺瓦克病毒(Norovirus，NoV)的含量进行定量检测，并可区分其基因型(GG I型、GG II型)。本发明试剂盒对诺瓦克病毒进行定量及分型检测将有助于该病毒的流行病学研究，并可为分析海鲜产品中NoV的基因型与人群流行NoV基因型的关系、中国NoV基因型与国际NoV基因型的比较分析以及海产品的NoV污染特点、流行变异趋势及其规律研究提供方便快捷的检测工具；亦可为我国NoV的研究、预防和控制NoV经新鲜海产品介导引起大规模的爆发提供方便快捷的检测工具。

发明内容

本发明的第一个目的是提供检测诺瓦克病毒的专用引物与探针。

本发明的第二个目的是提供一种灵敏、快速、操作简便的诺瓦克病毒表达量检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

检测诺瓦克病毒的引物与探针，具有如下核苷酸序列：

1.CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC；

2.TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT；

3.TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA；

4.AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT；

5.GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC；

6.CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA；

其中N为A，C，G，或T；Y为T/U或C。

本发明试剂盒包含：样品前处理液A、样品前处理液B、样品前处理液C、样品前处理液D、RNA提取试剂、无RNA酶的水、逆转录引物、反转录缓冲液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆转录酶保存液、GG I型PCR反应液、GG II型PCR反应液、GG I型探针、GG II型探针、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GGI型标准品、GG II型标准品、GG I型质控品、GG II型质控品。

(1)样品前处理液A为0.05M的甘氨酸缓冲液(pH 9.5，25℃)：1000ml中含0.05mol的甘氨酸、0.15mol NaCI，溶剂为水；

(2)样品前处理液B为16％的聚乙二醇6000(PEG6000)溶液：1000ml中含160克的PEG6000、0.3mol的NaCI，溶剂为水；

(3)样品前处理液C为0.15M的Na₂HPO₄溶液(pH 9.0，25℃)：1000ml中含0.15mol的Na₂HPO₄，溶剂为水；

(4)样品前处理液D为PBS缓冲液：1000ml中含1.47mmol的KH₂PO₄、136.9mmol的NaCl、2.68mmol的KCl、7.96mmol的Na₂HPO₄·12H₂O，溶剂为水；

(5)RNA提取试剂：为Trizol试剂；

(6)无RNA酶的水：制备方法为向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，37℃放置2小时，121℃，20min高压，备用；

(7)逆转录引物：为随机引物六引物，用去离子水溶解成100μmol/L的使用液；

(8)反转录缓冲液：1000ml中含250mmol的Tris-HCl(pH 8.3，25℃)、375mmol的KCl、15mmol的MgCl₂，溶剂为水；

(9)dNTP混合物：1000ml中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol，溶剂为水(pH7.0-7.5，25℃)；

(10)逆转录酶保存液：1000ml中含20mmol的Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、100mmol的NaCl、0.1mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、500ml的甘油、0.1ml的Nonidet p-40、2.0×10⁸U的逆转录酶(M-MLV)、水；

(11)GG I型PCR反应液：1000ml中含20mmol的Tris-HCI(pH8.3，25℃)、3.0mmol的MgCI₂、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物(/L)、1.0×10⁵U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP、，溶剂为水；

上、下游引物序列分别为：

P1：5’-CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC-3’

P2：5’-TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT-3’

(12)GG II型PCR反应液：1000ml中含20mmol的Tris-HCI(pH8.3，25℃)、3.0mmol的MgCI₂、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物(/L)、1.0×10⁵U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP，溶剂为水；

上、下游引物序列分别为：

P1：5’-TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA-3’

P2：5’-AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT-3’

(13)GG I型探针为荧光标记探针，其序列为：

5’-FAM-GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC-TAMRA-3’；

(14)GG II型探针为荧光标记探针，其序列为：

5’-FAM-CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA-TAMRA-3’；

(15)GG I型UNG酶：1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl(pH7.5，25℃)、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×10⁶U的UNG酶，溶剂为水；

(16)GGII型UNG酶：1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×10⁶U的UNG酶，溶剂为水；

(17)GG I型标准品的序列为：

1  CCATGTTCCG CTGGATGCGT TTCCATGATC TGAGTTTGTG GACAGGAGAT CGCGATCTCC

61 TGCCCGATTA TGTAAATGAT GATGGCGTCT AAGGACGCCC CA

(18)GGII型标准品的序列为：

1  TGCCCAGACA AGAGTCAATG TTTAGGTGGA TGAGGTTCTC AGATCTAAGC ACATGGGAGG

61 GCGATCGCAA TCTGGCTCCC AGTTTTGTGA ATGAAGATGG CGTCGAATGA CGCTGCT

(19)GG I型质控品分为阳性质控品与阴性质控品，阳性质控品为含有GG I型RNA的样品，阴性质控品为不含GG I型RNA的样品。

(20)GG II型质控品分为阳性质控品与阴性质控品，阳性质控品为含有GG II型RNA的样品，阴性质控品为不含GG II型RNA的样品。

本发明试剂盒的规格为20份/盒；样品前处理试剂及RNA提取试剂保存于4℃；RT-PCR试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明试剂盒的制备过程(具体的制备步骤见实施例1)

1.设计引物、探针并合成；制备标准品。

2.按发明内容中的制备方法制备无RNA酶的水。

3.制备阳性对照品及阴性对照品。

4.按发明内容中的浓度要求配制样品前处理液A、样品前处理液B、样品前处理液C、样品前处理液D、逆转录引物、反转录缓冲液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆转录酶保存液、GG I型PCR反应液、GG II型PCR反应液、GG I型探针、GG II型探针、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GG I型标准品、GG II型标准品、GG I型质控品、GG II型质控品。

5.按本发明试剂盒的规格对上述各组分进行分装。

本发明试剂盒的使用方法：

【自备试剂及材料】

无菌的50ml离心管、无菌的三角烧瓶(100ml)、无RNA酶的1.5ml离心管、无RNA酶的0.5ml离心管、无RNA酶的枪头(量程为1ml，200μl，10μl，2μl)；氯仿、异丙醇、无水乙醇。

【仪器】

ABI PRISM5700、ABI PRISM 7000、iCycle或其它类似的荧光定量检测仪。

【样品要求】

新鲜或-20℃保存的牡蛎或人粪便，并按下列步骤进行样品的前处理：

(一)牡蛎的前处理(浓缩液的制备)

注：3个牡蛎的消化腺为1个样品，1批可检3～10个样品，注意避免样品间的交叉污染。

(1)用竹签、手术刀等切断牡蛎的贝柱，打开壳。

(2)去除外膜，将消化腺(深色物质)周围的脂肪组织(白色物质)尽量用手术刀、小镊子等去除，取出消化腺。

(3)将消化腺置匀浆器中快速匀浆后，将匀浆液放入灭菌的三角烧瓶中，加入7倍体积的样品前处理液A，室温下充分振荡后分装于50ml离心管中，4℃，3000g，30min离心。

(4)将上清液转移至新的无菌的50ml离心管中，调PH值至7.5，加入等体积的样品前处理液B，轻微混匀，4℃沉淀4小时后，4℃，3000g，30min离心。

(5)弃上清，沉淀用1.5ml样品前处理液C重悬，室温下100rpm振荡20分钟后，分装于1.5ml的无RNA酶的离心管中，4℃，10000g，30min离心。

(6)将上清夜移至新的1.5ml的无RNA酶的离心管中，并调节PH值7.4，置于-20℃中保存，备用。

(二)粪便样品的前处理(浓缩液的制备)

注：操作时既要注意粪便的感染性，又要注意避免样品间的交叉污染。

用样品前处理液D将粪便制成10％(g/ml)的悬液。

剧烈振荡后，4℃，12000rpm，20min离心。

取上清于1.5ml的无RNA酶的离心管中，置于-20℃中保存，备用。

【操作步骤】

(一)、RNA提取

1.取牡蛎样品浓缩液或粪便样品浓缩液300μl，加入1ml RNA提取试剂，上下颠倒混匀后，加入200μl氯仿，剧烈摇动15sec，冰盒中放置3min。

4.4℃，12000g离心15min，若离心前管中出现分层可重新摇动使之混匀。

5.取出离心管，吸上清于另一无RNA酶的1.5ml离心管中，注意不要吸入中间的DNA层。加入700μl的异丙醇，冰盒中放置10min，之后12000g，4℃离心10min。

6.弃离心管中的液体，加入75％乙醇1ml，上下颠倒3-5次，室温放置2分钟，7500g，4℃，离心5min；重复洗涤一次。

7.弃管中液体，室温下倒置10min，加入20-50μl的DEPC处理过的水，溶解RNA。冰盒放置备用或-70℃保存。

(二)、RT反应

1.将RT试剂盒中各组分混匀，短暂离心。

2.在0.5ml PCR管中准备RNA/引物混合物，表格如下：

          表1

成分	样品
		总RNAdNTP混合物	2μg1μl

逆转录引物无RNA酶的水

1μlTo 13μl

3.65℃孵育5min，冰盒放置至少1min。

4.将装有DTT、M-MLV及逆转录缓冲液的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将DTT及逆转录缓冲液全部加入M-MLV管中配制成混合液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，

5.向RNA/引物混合物每管加入7μl上述混合液，混匀，短暂离心收集。

6.25℃，孵育5min；之后37℃，孵育50min。

7.70℃，15min终止反应，冰上冷却或-20℃保存。

(三)、PCR扩增

注：a.一个样品的RT产物要同时用GG I，GG II型引物进行检测，并需同时制备两型的标准曲线；以便对阳性样品进行分型及定量检测。

b.每次检测均应设立阳性及阴性对照。

1.将装有PCR缓冲液、UNG酶及探针的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应混合液可放入-20℃冰箱中保存。

按下列组成配制PCR体系：

             表2

反转录产物	3.0μl
		PCR反应混合液去离子水	15.0μl7.0μl

PCR反应条件：37℃10分钟；95℃15分钟；(95℃15秒，56℃1分钟，40个循环)。

2.标准曲线的制作

将标准品贮存液(2×10⁶copies/ul)梯度稀释为2×10⁵，2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹copies/ul，5个浓度的标准品稀释液各取5ul为模板同待测样品一同进行PCR扩增，制作标准曲线。

(四)、结果分析

1.使用实时荧光定量PCR仪的随机软件进行文件的保存及阈值的设定。

2.选中不同浓度标准品对应的孔并标注标准值，进行分析，得出标准曲线及相关信息。

3.选中所有样品检测孔，应用相应进行分析，得出待测样品的起始模板数，进而计算出样品中的拷贝数。

本发明建立了利用实时荧光定量RT-PCR技术检测牡蛎或人粪便样品中Norovirus表达量及其基因分型的方法，标本的检测结果表明本发明试剂盒操作简便，性能优越。

1.本发明试剂盒的样品前处理方法具有以下优点：(1).操作简便；(2).使用安全，操作过程无有机溶液污染；(3).所得病毒颗粒的浓度及纯度均较高。

2.本发明试剂盒采用进口的高效优质逆转录酶及热启动Taq DNA聚合酶，利用设计合理的引物及探针，可保证检测结果的敏感性、特异性及可重复性。

3.利用基因工程技术，获得特异标准品，设定为2×10¹、2×10²、2×10³、2×10⁴、2×10⁵copies/μl，标准曲线相关性大于0.99，可准确定量待测基因的拷贝数。

4.本发明试剂盒采用荧光定量PCR作为检测方法，同时应用UNG酶防污染体系，一举克服了常规PCR技术的诸多难题，如产物电泳费时、溴化乙啶毒性、易出现假阳性、特异性低等难题。

5.本发明试剂盒具有很高的实际应用价值，其意义在于：(1).监测食品是否被诺瓦克病毒污染的有力工具；(2).辅助患者的早期诊断，为治疗争取时间；(3).患者临床治疗效果的评价；(4).海产品诺瓦克病毒污染特点、流行变异趋势及其规律研究方便快捷的检测工具。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做出的任何本领域的等同替换均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为GG I型标准品检测结果图。

图2为GG I型标准曲线图。

图3为GG II型标准品检测结果图。

图4为GG II型标准曲线图。

具体实施方式

实施例1.诺瓦克病毒表达量检测试剂盒制备及应用

一、试剂盒的制备

(一)、材料及设备

PEG6000(进口分装，化学纯)购自广东汕头市西陇化工厂；NaCl(分析纯)购自中国医药集团上海化学试剂公司；Na₂HPO₄·12H2O(分析纯)购自中国医药集团上海化学试剂公司；甘氨酸(进口分装，TBD产品号：G7403)购自中国医学科学院生物医学工程研究所；KH₂PO₄(分析纯)购自中国医药集团上海化学试剂公司；KCI(分析纯)购自中国医药集团上海化学试剂公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；氯仿(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；异丙醇(分析纯)购自中国上海五联化工厂；无水乙醇(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；DEPC购自BIO BASICINC公司；琼脂糖购自BIO BASIC INC公司；溴化乙锭购自华美生物技术有限公司；M-MLV逆转录酶、DTT(二硫苏糖醇，0.1M)购自Invitrogen公司；随机引物、dNTP混合物、GG I型引物及探针、GG II型引物及探针均由上海生工生物技术公司合成；UNG酶购自Invitrogen公司；荧光定量PCR试剂购自ABgene公司；感受态细菌(DH5α)、标准品(GG I型、GG II)：自制；Taq酶、Oligo(dT)、T-载体、普通PCR扩增试剂盒购自Takara公司；DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂购自杭州维特洁生化技术有限公司；1-15K型微量高速低温离心机、2-5型低速常温离心机购自德国Sigma公司；超速低温离心机购自德国Hettich公司，3111型恒温水套式CO₂培养箱购自美国Forma公司；超低温冰箱购自日本SANYO公司；超净工作台购自上海智诚生物设备公司；Biometra PCR仪购自Biometra公司；ABI7000型实时荧光定量PCR仪、测序试剂、377测序仪、购自美国Applied Biosystems公司。

(二)、引物及探针设计与合成

以诺瓦克病毒(GG I及GG II型)全长cDNA序列为模板，使用ABI7000型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑病毒基因组RNA序列情况，从中选择最佳组合。

GG I标准品引物序列与检测用PCR引物序列相同，上下游引物序列分别为：

P1：5’-CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC-3’；

P2：5’-TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT-3’

荧光探针序列为：5’-FAM-GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC-TAMRA-3’，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

GG II标准品引物序列与检测用PCR引物序列相同，上下游引物序列分别为：

P1：5’-TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA-3’；

P2：5’-AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT-3’

荧光探针序列为：5’-FAM-CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA-TAMRA-3’，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(三)、制备无RNA酶的水：

向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，37℃放置2小时后，121℃，高压20min，备用。

(四)、标准品制备

1.病毒RNA的提取：利用本发明试剂盒方法浓缩已确诊由诺瓦克病毒引起腹泻的病人粪便样品(来源于中国疾病预防控制中心)并提取病毒RNA。

2.逆转录反应：

(1)将RT试剂盒中各组分混匀，短暂离心。

(2)在0.5ml PCR管中准备RNA/引物混合物，表格如下：

             表3

成分	样品
		总RNAdNTP混合物逆转录引物无RNA酶的水	2μg1μl1μlTo 13μl

(3)65℃孵育5min，冰盒放置至少1min。

(4)将装有DTT、M-MLV及逆转录缓冲液的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将DTT及逆转录缓冲液全部加入M-MLV管中配制成混合液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，

(5)向RNA/引物混合物每管加入7μl上述混合液，混匀，短暂离心收集。

(6)25℃，孵育5min；之后37℃，孵育50min。

(7)70℃，15min终止反应，冰上冷却或-20℃保存。

3.PCR扩增(GG I及GG II型同时扩增)

按下列组成配制PCR反应液：

            表4

反转录产物	10ul
		10×buffer	5.0ul

dNTPmix	4.0ul
		上下游引物Taq酶水	3.0ul0.5ul27.5ul

PCR反应条件：94℃3分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，35个循环)；72℃7分钟。

4.扩增产物的获得：

(1)制备1.2％琼脂糖凝胶，将所得PCR产物电泳，在紫外灯下切取含目的DNA的琼脂，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照100mg＝100μl的比例确定胶的体积。

(2)按照DNA gel extraction kit说明书中的比例加入DE-A液，60℃加热至完全熔化。

(3)加入0.5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20％。

(4)将上述液体转入制备管中，5500rpm离心1min，弃滤液。

(5)加入0.5ml buffer W1后，5500rpm离心1min，弃滤液。

(6)加入0.7ml buffer W2，5500rpm离心1min，弃滤液。

(7)再加入0.7ml buffer W2，5500rpm离心1min，弃滤液；12000rpm，离心1min，以甩干滤膜基质。

(8)将制备管置于新的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25μl水，室温静置1min后，12000rpm，离心1min洗脱DNA。

5.扩增产物的克隆及鉴定：

(1)重组克隆载体的构建

10μl体系中，加入1μl T载体，4μl DNA样品，加入5μl连接buffer，16℃过夜(10-14小时)。

取5μl连接产物，加入到100μl感受态细胞中，混匀后冰浴40min，置于42℃水中热休克90s，冰浴2min。

加入无抗生素的LB培养基400μl，于37℃摇床上以150rpm的速度混合振摇45min后，将离心管中液体均匀地涂布于LA平板上，37℃平放20min后，倒置培养10-14小时。

(2)重组载体的鉴定(质粒的提取方法/PCR鉴定)

A.观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5ml LA培养基的大试管中，编号后置37℃摇床中，250rpm，振摇8-14小时左右，至OD600≈0.4。

B.取1.5ml培养物至离心管中，4℃，11000rpm离心30s，弃尽上清液。

C.100μl预冷的碱裂解液I重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200μl新配置的碱裂解液II，混匀后，冰浴3min，再加入150μl预冷的碱裂解液III，颠倒混匀后冰浴3-5min；4℃，11000rpm离心5min后将上清转移至另一离心管中。

D.加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡后4℃，11000rpm离心2min，再将上清转移至另一离心管。

E.加入1/10体积的3M NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混匀后，室温静置10min，4℃，11000rpm离心10min后弃上清。

F.加入1ml 70％乙醇，振荡漂洗后4℃，11000rpm离心2min；弃去上层液体。

G.加入少量无水乙醇，4℃，11000rpm离心2min，弃去乙醇后，室温倒置10min，加入30μl蒸馏水溶解质粒DNA。

H.取适量的DNA进行PCR扩增，通过电泳图像确定所取菌落是否是所要的目的菌落。

6.质粒测序

经美国Applied Biosystems公司的377测序仪测序，制备的标准品其序列与预期完全相符，标准品序列如下(为插入T载体中的片段)：

GG I型：

1  CCATGTTCCG CTGGATGCGT TTCCATGATC TGAGTTTGTG GACAGGAGAT CGCGATCTCC

61 TGCCCGATTA TGTAAATGAT GATGGCGTCT AAGGACGCCC CA

GG II型：

1  TGCCCAGACA AGAGTCAATG TTTAGGTGGA TGAGGTTCTC AGATCTAAGC ACATGGGAGG

61 GCGATCGCAA TCTGGCTCCC AGTITTGTGA ATGAAGATGG CGTCGAATGA CGCTGCT

(五)、阳性对照品和阴性对照品的制备

阳性对照品为分别含有GG I及GG II型诺瓦克病毒RNA的RNA样品，阴性对照品为不含有GG I及GG II型诺瓦克病毒RNA的RNA样品，RNA提取方法与上述方法相同。

(六)、按发明内容中的浓度要求配制样品前处理液A、样品前处理液B、样品前处理液C、样品前处理液D、逆转录引物、反转录缓冲液、dNTP混合物、0.1M DTT、逆转录酶保存液、GG I型PCR反应液、GG II型PCR反应液、GG I型探针、GG II型探针、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GG I型标准品、GG II型标准品、GG I型质控品、GG II型质控品。

(七)、按本发明试剂盒的规格对上述各组分进行分装。

实施例2.试剂盒的应用

一、标本检测

牡蛎样品60份，腹泻病人粪便20人，正常人粪便10份；应用本发明的试剂盒进行样品前处理及病毒RNA提取，取8μl RNA，在20μl总反应体系内进行逆转录后，用检测用上下游引物及探针在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增(GG I及GG II型同时检测)，同时应用标准品制作标准曲线，结果经相应软件处理，计算出检测标本病毒RNA的表达量。

二、实验结果

1.GG I型：标准品检测结果见图1，标准曲线见图2。

2.GG II型：标准品检测结果见图3，标准曲线见图4。

3.牡蛎样品检测结果：30个牡蛎样品中有10为阳性，其余20个样品为阴性，具体结果见下表：

                                    表5

样品编号	样品重量(g，去壳)	定量结果(copie/g)	基因型
				1789121618212328	69758076737274757872	3.2×1031.3×1042.5×1036.5×1044.2×1033.7×1033.8×1041.5×1032.9×1057.3×102	GG I型GG I型GG II型GG II型GG II型GG II型GG I型+GG II型GG I型GG II型GG II型

4.人粪便样品检测结果：20例腹泻病人中有13例为阳性，其余7例为阴性；10例正常人粪便均为阴性，结果见下表：

                              表6

样品编号	样品重量(g)	定量结果(copie/g)	基因型
				126791011131516171920	0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1	3.6×1053.7×1045.0×1042.2×1051.2×1037.3×1042.4×1052.9×1061.4×1042.9×1055.5×1048.3×1041.9×103	GG II型GG II型GG I型GG I型GG II型GG II型GG II型GG II型GG II型GG I型GG II型GG II型GG I型

                            序列表

<110>中国疾病预防控制中心营养与食品安全所

<120>诺瓦克病毒表达量检测试剂盒及其专用引物与探针

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>n is a，c，g，or t，y is t/u or c

<400>1

ccatgttccg ytggatgcgn ttyc                                           24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tggggcgtcc ttagacgcca tcat                                           24

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gacaggagat ygcgatctcc tgycc                                          25

<210>4

<211>102

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ccatgttccg ctggatgcgt ttccatgatc tgagtttgtg gacaggagat cgcgatctcc    60

tgcccgatta tgtaaatgat gatggcgtct aaggacgccc ca                       102

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

tgcccagaca agagtcaatg ttta                                           24

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

agcagcgtca ttcgacgcca tct                                            23

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ctaagcacat gggagggcga tcgcaa                                         26

<210>8

<211>117

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

tgcccagaca agagtcaatg tttaggtgga tgaggttctc agatctaagc acatgggagg    60

gcgatcgcaa tctggctccc agttttgtga atgaagatgg cgtcgaatga cgctgct       117

Claims (4)

1.检测诺瓦克病毒的引物与探针，具有如下核苷酸序列：

(1)CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC；

(2)TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT；

(3)TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA；

(4)AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT；

(5)GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC；

(6)CTAAGCACATGGGAGGGC GATCGCAA；

其中N为A，C，G，或T；Y为T/U或C。

2.诺瓦克病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含：样品前处理液A、样品前处理液B、样品前处理液C、样品前处理液D、RNA提取试剂、无RNA酶的水、逆转录引物、反转录缓冲液、DNTP混合物、0.1M DTT、逆转录酶保存液、GG I型PCR反应液、GG II型PCR反应液、GG I型探针、GG II型探针、GG I型UNG酶保存液、GG II型UNG酶保存液、GG I型标准品、GG II型标准品、GG I型质控品、GG II型质控品。

3.根据权利要求2所述的诺瓦克病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含：

(1)样品前处理液A为0.05M的甘氨酸缓冲液，pH9.5：1000ml中含0.05mol的甘氨酸、0.15mol NaCI，溶剂为水；

(2)样品前处理液B为16％的聚乙二醇6000溶液：1000ml中含160克的PEG6000、0.3mol的NaCI，溶剂为水；

(3)样品前处理液C为0.15M的Na₂HPO₄溶液，pH9.0：1000ml中含0.15mol的Na₂HPO₄，溶剂为水；

(4)样品前处理液D为PBS缓冲液：1000ml中含1.47mmol的KH₂PO₄、136.9mmol的NaCl、2.68mmol的KCl、7.96mmol的Na₂HPO₄·12H₂O，溶剂为水；

(5)RNA提取试剂：为Trizol试剂；

(6)无RNA酶的水；

(7)逆转录引物：为随机引物六引物，用去离子水溶解成100μmol/L的使用液；

(8)反转录缓冲液：1000ml中含250mmol的Tris-HCl，pH8.3、375mmol的KCl、15mmol的MgCl₂，溶剂为水；

(9)dNTP混合物：1000ml中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol，溶剂为水，pH7.0-7.5；

(10)逆转录酶保存液：1000ml中含20mmol的Tris-HCl，pH7.5、100mmol的NaCl、0.1mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、500ml的甘油、0.1ml的Nonidet p-40、2.0×10⁸U的逆转录酶、水；

(11)GG I型PCR反应液：1000ml中含20mmol的Tris-HCI，pH8.3、3.0mmol的MgCI₂、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物/L、1.0×10⁵U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP，溶剂为水；

上、下游引物序列分别为：

P1：5’-CCATGTTCCGYTGGATGCGNTTYC-3’

P2：5’-TGGGGCGTCCTTAGACGCCATCAT-3’

(12)GG II型PCR反应液：1000ml中含20mmol的Tris-HCI，pH8.3、3.0mmol的MgCI₂、100mmol的KCI、0.4μmol的上下游引物/L、1.0×10⁵U的Taq酶、400nmol的dATP、400nmol的dCTP、400nmol的dGTP、800nmol的dUTP，溶剂为水；

上、下游引物序列分别为：

P1：5’-TGCCCAGACAAGAGTCAATGTTTA-3’

P2：5’-AGCAGCGTCATTCGACGCCATCT-3’

(13)GG I型探针为荧光标记探针，其序列为：

5’-FAM-GACAGGAGATYGCGATCTCCTGYCC-TAMRA-3’；

(14)GG II型探针为荧光标记探针，其序列为：

5’-FAM-CTAAGCACATGGGAGGGCGATCGCAA-TAMRA-3’；

(15)GG I型UNG酶：1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl，pH7.5，25℃、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×10⁶U的UNG酶，溶剂为水；

(16)GG II型UNG酶：1000ml中含50ml的甘油、30mmol的Tris-HCl，pH7.5、150mmol的NaCl、1.0mmol的EDTA、1.0mmol的DTT、0.5ml的Tween 20、1.0×10⁶U的UNG酶，溶剂为水；

(17)GG I型标准品的序列为：

1 CCATGTTCCG CTGGATGCGT TTCCATGATC TGAGTTTGTG GACAGGAGAT CGCGATCTCC

61 TGCCCGATTA TGTAAATGAT GATGGCGTCT AAGGACGCCC CA

(18)GG II型标准品的序列为：

1  TGCCCAGACA AGAGTCAATG TTTAGGTGGA TGAGGTTCTC AGATCTAAGC ACATGGGAGG

61 GCGATCGCAA TCTGGCTCCC AGTTTTGTGA ATGAAGATGG CGTCGAATGA CGCTGCT。

(19)GG I型质控品分为阳性质控品与阴性质控品，阳性质控品为含有GG I型RNA的样品，阴性质控品为不含GG I型RNA的样品。

(20)GG II型质控品分为阳性质控品与阴性质控品，阳性质控品为含有GG II型RNA的样品，阴性质控品为不含GG II型RNA的样品。

4.根据权利要求3所述的诺瓦克病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述(6)无RNA酶的水的制备方法为：向去离子水加入焦碳酸二乙酯，至终浓度为0.05％V/V，37℃放置2小时，121℃，20min高压，备用。

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