CN1320116C - O型口蹄疫病毒o_ny00株基因组序列 - Google Patents

Abstract

一种O型口蹄疫病毒O_NYOO株基因组序列，属于生物技术领域。本发明是采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列测定技术，对本室分离、保存的中国O型口蹄疫NYOO株的全基因组进行了分段扩增、克隆及序列测定，构建了基因组cDNA文库，测定了7.6kb的核苷酸序列。对中国O型口蹄疫NYOO株的全基因组进行分段扩增、克隆及序列测定，并构建基因组cDNA文库，然后从该文库中亚克隆出免疫相关基因插入表达载体中，制备安全、高效、可靠的基因工程疫苗和诊断试剂。

Description

O型口蹄疫病毒O_NY00株基因组序列

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种O型口蹄疫病毒O_NY00株基因组序列。

背景技术：

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的最烈性传染病之一，也是对人类健康造成一定危害的人畜共患传染病。口蹄疫呈世界性流行，黄牛、猪、绵羊、山羊、水牛等家畜均易感。本病传播迅速，覆盖面广，每次流行几乎都给当地畜牧业带来灾难性损失。因此各国对于口蹄疫的防疫和检疫高度重视。二十世纪八十年代以来，应用基因工程技术研究和开发新型口蹄疫疫苗和诊断试剂已成为国内外学者关注的焦点。而扩增、克隆并测定口蹄疫病毒的基因组的核苷酸序列，是进行上述研究和开发工作的基础。

技术内容：

本发明的目的是采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列测定技术，对本室分离、保存的中国O型口蹄疫NY00株的全基因组进行了分段扩增、克隆及序列测定，构建了基因组cDNA文库，测定了7.6kb的核苷酸序列。对中国O型口蹄疫NY00株的全基因组进行分段扩增、克隆及序列测定，并构建基因组cDNA文库，然后从该文库中亚克隆出免疫相关基因插往有达载体中，制备安全、高效、可靠的基因工程疫苗和诊断试剂。

本发明的基因组序列是SEQ ID NO：1。

本发明将中国O型口蹄疫病毒NY00株基因组分段扩增并克隆到pGEM-T或pGEM-T Easy载体中，构建了pTL、pTP1、pTP2和pTP3四个质粒，建立口蹄疫病毒基因组cDNA文库。

本发明将免疫相关基因构建的cDNA文库中亚克隆到表达载体中，在宿主细胞中表达出相应基因，可作为预防或诊断口蹄疫的多肽、蛋白质、基因重组体或重组免疫原。

本发明的表达载体可以是原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体、植物表达载体以及相关真核表达载体。

本发明的免疫相关基因是P1、VP1、2A、2C、3ABC、3D以及人工合成的核苷酸或氨基酸片段。

本发明的优点和积极效果在于：扩增、克隆并测定了中国O型口蹄疫O_NY00株基因组的核苷酸序列。同时构建了含该毒株全基因组的文库。本发明可从该文库中亚克隆出目的基因用于口蹄疫新型疫苗、诊断试剂以及其他相关基因工程产品的研究和开发。

附图说明：

图1是中国O型口蹄疫病毒NY00株的基因组cDNA文库结构。

具体实施方式：

1、病毒的培养与总RNA的提取

(1)病毒的培养：将保存的1953年牛口蹄疫水泡皮病料，用生理盐水1∶5研磨，4°浸毒过夜后，-40°保存备用。不合实验要求的病料研磨后，接种3~5日龄乳熟鼠，连传3~5代，乳鼠出现典型症状后，将胴体用生理盐水1∶5研磨，4℃浸毒过夜后，-40℃保存备用。

(2)毒型鉴定：采用反向间接红细胞凝集试验(标准抗原和口蹄疫A、O、AsiaI、猪水泡病诊断液等购自兰州兽医研究所)鉴定其血清型为O型，具体方法参考文献进行。

(3)总RNY的提取：用Trizol(INVETROGEN公司，原GIBCO BRL公司产品)试剂盒提取总RNA。将处理好的病料研磨液，3000rpm离心5min，取350ul上清与700ul Trizol振荡混匀，冰浴10min。加氯仿350ul，振荡混匀后静置10min待其分层，4℃12000rpm离心10min。收集上清到另一离心管内，加入氯仿350ul，振荡混匀后静置10min待其分层，4℃12000rpm离心5min。收集上清到另一离心管内，加入等体积异丙醇，-20℃1hour，4℃12000rpm离心20min。小心倾去异丙醇，加入250ul70％冰预冷乙醇(DEPC水配制)洗涤，弃去。37℃干燥后，加入20ul DEPC(二乙酯焦碳酸)水。

2、病毒基因组的分段RT-PCR

(1)病毒RNA的反转录：提取的总RNA加入反转录缓冲液(5X)、DNTP、随机引物和RNA酶抑制剂，70℃水浴5min，再加入反转录酶(Promega公司的AMV)，反应体系总体积为20ul，42℃反应1h。

(2)病毒基因组的分段PCR：取3ul反转录产物加PCR缓冲液、DNTP、氯化镁、上游引物、下游引物和去离子水和Ex-Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)，总体积为25ul，混匀后进行扩增。具体引物及扩增程序如下：

5’非编码区：上游引物为5′-AGGGTGTGACCGCAAGATCATAC-3′，下游引物为5′-CCAAGTTGCGTGTCCATGGAGTTCT-3′；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大水为1361bp。

P1-2A区：上游引物为5′-CATGCAATCTGGCAACACTGGCAGC-3′，下游引物为5′-CTTAGAAGGGCCCAGGGTTGGACTC-3；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为2231bp。

P2区：一上游引物为5′-CCTGGGCCCTTCTTCTTCTCTGAC-3′，下游引物为5′-CTTGAAAATCGGGTGGCTCGACAC-3′；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，46.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为1416bp。

P3区：上游引物为5′-GCATGGCCGTTGAAATGAAGAGAA-3′，下游引物为5′-CTACCGTGACATCTGAGGGATTAG-3′；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为2887bp。

3、目的DNA的克隆与阳性克隆菌鉴定

(1)目的DNA的纯化：用WizardDNA纯化试剂盒(Promega公司产品)从PCR二扩产物中纯化目的DNA，具体按试剂盒操作说明进行。

(2)目的DNA与载体的连接；纯化的目的DNA与pGEM-T(用于5’非编码区、P2区、P3区基因)或pGEM-Teasy(用于P1-2A基因)与载体连接，具体操作是在离心管中按下列组成调制连接反应液，体系为15ul；2X快速连接缓冲液7.5ul，载体1ul，PCR回收产物2.5ul，T4DNA连接酶(3WU/ul)1ul，然后用灭菌双蒸水将体系定容到15ul；将反应液混匀；4℃连接过夜。

(3)感受态细胞的制备：感受态细胞工程菌JM109500ul加入50mlLB培养基中，37℃震荡培养(250-300rpm)2到3小时；冰浴10分钟，使菌液冷却；无菌操作转移入50ml离心管中，4℃4000rpm10分钟；弃上清，加入新配0.1M CaCl2(预冷)20ml，吹打沉淀，冰浴45分钟；4℃4000rpm 8分钟；弃上清，加入0.1CaCl2甘油1-2ml，重悬；按100-200ul每管分装入离心管，-40℃保存。

(4)转化：向200ul感受态细胞中加入连接产物5ul，用Tip头轻轻搅匀；冰浴30分钟；42~C热击90秒，不振荡，并快速移至冰上3分钟；加入37℃预热的LB800ul，37℃振荡培养45分钟；4000rpm2分钟；弃部分上清，约留200ul，混匀；均匀涂布在加有16ulX-gal(50rug/ul)和4ulIPTG(200mg/ul)LB板上；液体干时，·倒放平皿，37℃过夜。

(5)阳性克隆菌的挑选和鉴定：以a—互补挑选阳性克隆菌。在涂有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白色菌落，接种于有2ml含AMP(氨卞青霉素)的LB培养基15ml试管中，37℃摇振培养。

(6)小量制备重组质粒：用碱裂解法提取质粒DNA，具体方法是将细菌沉淀重悬于100ul冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，充分悬浮，冰浴10min；，加200ul新配置的溶液II，盖紧轻轻倒转3-5次，冰浴5min；加入150ul冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置于冰上5-15分钟，必须温和震荡；4℃12000rpm离心10min；将上清液转移到另一个管中，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，4℃12000rpm离心8min取上层水相；用2倍体积的冷无水乙醇沉淀双链DNA，-20℃放置2小时或更长时间；4℃12000rpm离心5min弃上清加入0.5ml 70％乙醇漂洗：小心彻底去上清，用25ul含无DNA酶的TE重新溶解核酸，震荡，储存于-20℃。

4、病毒基因组核苷酸序列的测定、序列拼接以及序列分析

(1)目的片段的核苷酸序列测定：采用ABI PRISM377型自动核苷酸序列测定仪进行测序，具体操作由大连宝生物工程有限公司完成。

(2)基因组序列的拼接以及序列分析：采用DNA Star计算机分析软件(DNASTAR Inc.USA)进行序列的拼接并与GenBank中报道的韩国O型口蹄疫病毒基因组序列O_SKR2000(AF377945)比较结果发现两者编码区核苷酸序列同源性为97.1％，推导的氨基酸序列同源性为96.8％。见表2和表3。

证实所获得的基因组序列为中国O型口蹄疫病毒O-NY00株的基因组序列。

       表2  NY00株与O_SKR2000株编码区核苷酸序列同源性比较

表  3NY00株与O_SKR2000株编码区氨基酸序列同源性比较

<110>中国人民解放军军需大学军事兽医研究所

<120>O型口蹄疫病毒O_NY00株基因组序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>7661

<212>DNA

<213>Influenza A virus

<220>

<221>gene

<222>(1)..(7661)

<400>1

agggctgtga ccgcaagatc ataccgcctt tcccggcgtt aattggatgc aaccacaaga      60

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cctttccagg gcctctttga gattccaagc tacagatcac tttacctgcg ttgggtgaac    7620

gccgtgtgcg gtgatgcata atccctcaga tgtcacggta g                        7661

Claims (5)

1、一种O型口蹄疫病毒NYOO株的全基因组序列，其特征在于：该基因组序列是SEQ ID NO：1。

2、权利要求1所述的O型口蹄疫病毒NYOO株的全基因组序列的制备方法，其特征在于：将中国O型口蹄疫病毒NYOO株基因组分段扩增并克隆到pGEM-T或pGEM-T Easy载体中，构建了pTL、pTP1、pTP2和pTP3四个质粒，建立口蹄疫病毒基因组cDNA文库。

3、权利要求1所述的O型口蹄疫病毒NYOO株的全基因组序列的用途，其特征在于：将免疫相关基因构建的cDNA文库中亚克隆到表达载体中，在宿主细胞中表达出相应基因，可作为预防或诊断口蹄疫的多肽、蛋白质、基因重组体或重组免疫原。

4、根据权利要求3所述的O型口蹄疫病毒NYOO株的全基因组序列的用途，其特征在于：表达载体可以是原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体、植物表达载体以及相关真核表达载体。

5、根据权利要求3所述的O型口蹄疫病毒NYOO株的全基因组序列的用途，其特征在于：免疫相关基因是P1、VP1、2A、2C、3ABC、3D以及人工合成的核苷酸或氨基酸片段。