CN1779441A - 检测贝类中诺沃克病毒的实时荧光检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测诺沃克病毒的方法，在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增诺沃克病毒的特异性引物对和诺沃克病毒特异性探针。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒。

Description

检测贝类中诺沃克病毒的实时荧光检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测诺沃克病毒的方法和试剂盒。

背景技术

食源性病毒污染是食品安全性问题的一个重要方面。引起腹泻的病原包括细菌、寄生虫、病毒三大类。引起腹泻的病毒包括：轮状病毒(Rotavirus)、肠腺病毒(Entericadenovirus)、杯状病毒(Calicivirus)、星状病毒(Astovirus)。杯状病毒包括诺沃克(样)病毒和札幌病毒两大类。诺沃克病毒(Noroviruses)是一种分布很广泛的病毒，食品(包括水)被诺沃克病毒感染后，出现以急性胃肠炎为主的临床症状，即水样腹泻、呕吐和腹痛等症状。若治疗不及时或治疗方法不正确，轻者影响人体的生长发育，严重者可导致脱水死亡。该类病毒主要存在于贝类等体内。

目前我国对进出口食品只进行常规的细菌检测，还没有相应方法对进出口食品诺沃克病毒进行检测。也就是说，进出口食品诺沃克病毒检测仍处于空白状态，这严重地制约着我国食品进出口贸易的发展，威胁着人民的身体健康。然而，目前尚没有快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒的检测技术。

因此，本领域迫切需要开发新的快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒的技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒的技术。

在本发明的第一方而，提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增诺沃克病毒的特异性引物对和诺沃克病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区。

在另一优选例中，所述的扩增诺沃克病毒的特异性引物对选自下组：

引物1：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：1；

引物2：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：2。

在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针是Taqman探针。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在聚合酶链式反应过程中或之后，检测诺沃克病毒特异性探针发出的荧光信号。

在本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，它含有以下试剂：

(a)扩增诺沃克病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区；

(b)诺沃克病毒特异性探针。

在另一优选例中，所述的扩增诺沃克病毒的特异性引物对选自下组：

引物1：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：1

引物2：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：2。

在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针是Taqman探针。

附图说明

图1牡蛎中诺沃克病毒的实时荧光RT-PCR检测结果。其中，从上至下各曲线分别为：(a)加入含有诺沃克病毒样品原液的牡蛎，10ul RNA溶液；(b)加入含有诺沃克病毒样品原液的牡蛎，20ul RNA溶液；(c)未加入含有诺沃克病毒粪便的牡蛎；(d)空白对照。

图2显示了引物NLV-F/NLV-R和探针NLV浓度梯度实时PCR。其中，曲线自左到右对应的质粒拷贝数分别为：3.521×10⁸；3.521×10⁷；3.521×10⁶；3.521×10⁵；3.521×10⁴；3.521×10³；3.521×10²；3.521×10¹。

图3显示了Ct值与模板拷贝数之间的线性关系。

具体实施方式

本发明人经过对诺沃克病毒的各种基因序列的广泛而深入的研究，认为诺沃克病毒的ORF1和ORF2区的连接区序列特别适合用于检测和鉴定诺沃克病毒。针对该区域不仅可以设计出特异性扩增诺沃克病毒的引物，还可设计出诺沃克病毒特异性探针。这样，在一次PCR反应中，通过检测TaqMan探针的荧光信号，就可快速简便地鉴定诺沃克病毒。

如本文所用，术语“诺沃克病毒特异性探针”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：1和2所示的序列。

如本文所用，术语“诺沃克病毒特异性探针”指能够结合于诺沃克病毒的扩增产物，但不结合于其他病毒(如)的扩增产物的探针。更佳地，所述的诺沃克病毒特异性探针特异性结合于诺沃克病毒的ORF1和ORF2区的连接区。一种优选的探针具有SEQ ID NO：3所示的序列。

实时荧光PCR是密闭扩增检测方法，扩增体系加样完毕后，即可进行扩增和检测，不需扩增后再进行分析；不仅减少环境污染的可能性，还由于有引物对与探针共同杂交，比普通PCR特异性更高。

TaqMan聚合酶链反应技术利用Taq酶5′→3′外切酶活性，在延伸的过程中实现对杂交探针的切断，消除探针3′端荧光基团对5′端标记报告荧光基团信号的淬灭作用。荧光信号的强弱与PCR产物的数量呈正比，检测系统通过检测荧光可推测PCR产物的数量。

本发明方法中优选的扩增区域为诺沃克病毒的ORF1和ORF2的连接区序列，该区域是诺沃克病毒特有的，可用于检测诺沃克病毒。

根据本发明的教导，本领域技术人员将能够设计和合成引物以及诺沃克病毒特异性探针，并用于常规的荧光实时PCR和TaqMan聚合酶链反应等检测技术。

在本发明中，除了检测所针对的靶序列与现有技术不同之外，诸如从样品总抽提DNA、引物的标记、PCR扩增和荧光检测等步骤的条件都与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。

在本发明的优选实施例中，电泳结果表明，扩增诺沃克病毒的特异性引物对能对诺沃克病毒的核酸进行扩增。实时荧光检测结果表明，仅在含诺沃克病毒的标本表现阳性，达到了预期的效果。这表明，通过合理选择出的诺沃克病毒特异性探针是极为有效和特异的。

使用定量PCR仪进行实时荧光检测时，根据荧光标记物(FAM、TET)的不同，可在530nm或640nm等波长检测。在优选例中，宜采用具备波长分辩能力的检测仪，并可用常规方法或，采用仪器自配软件进行数据处理和分析。扩增产物在用常规方法进行凝胶电泳，常规紫外检测并拍照。

本发明的主要优点在于：

(1)可简便、快速地检测和鉴定诺沃克病毒。

(2)基于ORF1和ORF2连接区的引物对可有效地特异性扩增诺沃克病毒的核酸序列，而诺沃克病毒特异性探针则可更特异性地区分诺沃克病毒和其他病毒。

(3)检测结果线性好，可用于定量分析。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、实验材料和方法

1 菌株来源

含有病毒的粪便样品：诺沃克病毒毒株32695，35616，35617，HuCV，札幌病毒(Sapporo virus)，均购自中国预防医学科学院病毒所。

2 供试贝类

牡蛎、淡水河贝，均购自上海水产品市场。

3 试剂

3.1 1mol/L Tris·Cl缓冲液，pH7.5

称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，溶于800mL水中，搅拌，加入浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至7.5，分装后高压灭菌备用。

3.2 5mol/L EDTA

在800mL H₂O中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA·2H₂O)，在磁力搅拌器剧烈搅拌，然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

3.3 甘氨酸缓冲液(pH 9.5)含有0.1M甘氨酸，0.3M NaCl。

50g甘氨酸，17.55g NaCl，加水至1L，调pH至9.5。

3.4 洗涤缓冲液含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，0.15M LiCl，1mM EDTA

3.5 16％PEG 8000-0.525M NaCl溶液

80g PEG，15.34g Nacl加水至500mL；

3.6 Dynabeads-oligo(dT)25(Cat.No.61005，Dynal Biotech Inc.，Oslo，Norway)

3.7 1X RNA bing buffer含有20mM Tri-HCl(pH7.5)，1.0M LiCl，2mM EDTA

3.8 氯仿；

3.9 异丙醇；

3.10 70％乙醇；

3.11 无水乙醇

3.12 RNaseA 2mg/μL；

3.13 双蒸水；

3.14 TE缓冲液，pH8.0

量取10mL 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)和2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加水定容至1000mL，分装后高压灭菌备用。

3.15 10×PCR缓冲液

含500mmol/L KCL，100mmol/L Tris·Cl(pH8.3)，15mmol/L MgCl₂，0.1％明胶；

3.16 10×MgCl2 25mmol/L；

3.17 10×dNTP含2.5mmol/L dATP，dUTP，dCTP，dGTP；

3.18 Taq酶5Unit/μL；

3.19 引物 根据表1的序列进行合成引物，加超纯水配制成100μmol/L储存，直接用于PCR测试的引物浓度为5μmol/L。

                      表1 PCR引物和探钟序列

引物/探针编号	引物/探针序列	SEQ ID NO：
			NLV-FNLV-RNLV-P	5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’5’-TCGACGCCATCTTCATTCAC-3’5’-FAM-AGATTGCGATCGCCCT-MGB-3’	123

3.20 溴化乙锭10mg/mL；

3.21 DNA分子量标记100bp-2000bp；

3.22 琼脂糖；

3.23 50×TAE缓冲液

称取484g Tris，量取114.2mL冰醋酸，200mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用；

3.24 10×上样缓冲液含0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，30％甘油水溶液。

4 试验用试剂盒

4.1 TRIzol RNA抽提试剂盒(Invitrogen公司，Cat.No.15596-026)

4.2 TRI REAGENT RNA提取试剂盒(Sigma公司，Cat.No.T-9424)

4.3 Access RT-PCR System(Promega公司，Cat.#A1250)

5 仪器

5.1 ABI 7700定量PCR仪；

5.2 PCR仪；

5.3 电泳仪；

5.4 电泳槽；

5.5 凝胶分析成像系统；

5.6 冷冻干燥离心机；

5.7 冷冻离心机；

5.8  匀浆器；

5.9  水浴锅；

5.10 微波炉；

5.11 微量加样器：0.1μL-2.5μL，0.5μL-10μL，2μL-20μL，10μL-100μL，20μL-200μL，200μL-1000μL；

5.12 RNase free吸嘴；

5.13 天平：感量0.001g；

5.14 高压灭菌锅；

5.15 -80℃低温冰箱；

5.16 PCR反应管200μL，500μL两种规格；

5.17 RNase free Eppendorf离心管：1.5mL；

5.18 15mL、50mL离心管。

6 序列分析软件

Clustalx，Genedoc，GC

7 病毒RNA提取方法

7.1 粪便病毒RNA的提取

(1)10倍稀释粪便样品

(2)每100μL稀释样品加入1mL TRIzol Reagent，颠倒混匀，15-30℃放置5mins。

(3)加入0.2mL氯仿，震荡15secs，15-30℃放置5mins。

(4)4℃，＜12000g离心15mins。

(5)移取上层清夜(约0.6mL)入RNase-free新管，

(6)加入0.5mL异丙醇，15-30℃放置10mins。

(7)4℃，＜12000g离心10mins。

(8)弃上清液，加入1mL 75％乙醇(冰冷)震荡洗涤RNA，

(9)4℃，7500g离心5mins。弃液体，室温自然干燥10mins。

(10)加入50μL RNase-free水，55-60℃助溶10mins。(-80℃保存备用或立即进行后续实验)，每次RT-PCR取10μL作为模板。

7.2 贝类中病毒的富积

(1)解剖取下新鲜贝类的胃、肠组织(-80℃保存备用或立即进行后续实验)；

(2)每25g组织加入175mL甘氨酸缓冲液；

(3)20℃匀浆器高速匀浆3min。匀浆液按30mL/管分装入50mL离心管[可加入病毒溶液，终浓度分别为15-1.5PFU(10倍梯度)]；

(4)37℃温育30min(降解贝类RNA)。4℃，15000g离心30min；

(5)分别移取上清至新管，加入等体积的16％PEG 8000(聚乙二醇，Sigma)/0.525M NaCl混合液，冰上放置(沉淀)至少1小时；

(6)4℃，10000g离心5min，弃上清，保留沉淀。

7.3 贝类病毒的提取

(1)在2.7.3步骤(6)的沉淀中加入5mL Tri-reagent(Sigma公司)，剧烈震荡混合，20℃放置5min。

(2)转移溶液入15mL离心管，加入1.2mL氯仿，剧烈震荡30s，20℃放置5min。

(3)12000g离心5min，取上清。

(4)加入0.5体积(约2.5mL)异丙醇，20℃放置5min。5000g离心5min。

(5)75％乙醇(冰冷)洗涤沉淀。

(6)沉淀重悬于300μL RNase-free的水，加热至90℃，震荡助溶。

(7)加入400μL 1×RNA binding buffer，震荡30s，60℃放置3min。

(8)加入100μL Dynabeads-oligo(dT)₂₅(Dynal，Oslo，Norway)，轻柔混合30s，磁性抽提器上放置1min。

(9)弃上清，加入500μL 2×RNA binding buffer、20℃8rpm晃动5min洗涤。

(10)微型离心管在磁性抽提器上放置1min，弃上清。洗涤缓冲液洗涤3次。

(11)沉淀用100μL RNase-free water悬浮，90℃放置2min释放RNA。磁性抽提器上放置1min，取上清、弃沉淀(-80℃保存备用或立即进行后续实验)。每次RT-PCR取10μL作为模板。

8实时荧光PCR

使用Access RT-PCR System试剂盒进行实时荧光RT-PCR。反应体系见表2。

                     表2实时荧光RT-PCR反应体系

名称	贮液浓度	终浓度	加样量(μL)
				AMV/TfI 5×Reaction Buffer	5×	1×	10
MgSO4	25mmol/L	1mmol/L	2
				dNTP Mix	各10mmol/L	0.2mmol/L	1
Primer1	50μmol/L	1μmol/L	1
				Primer2	50μmol/L	1μmol/L	1
Probe	50μmol/L	1μmol/L	1
				AMV Reverse Transcriptase	5U/μL	0.1U/μL	1
TFI DNA Polymerase	5U/μL	0.1U/μL	1
				模板	——	——	10
水	——	——	23
				总体积	——	——	50

二、实验结果

(a)RT-PCR检测贝类样品中的诺沃克病毒

采用引物NLV-F/NLV-R分别对上述样品进行常规RT-PCR检测，四个诺沃克样病毒样品均得到109bp的PCR扩增产物。经对PCR产物克隆测序，序列与GenBank中的诺沃克样病毒序列不同株系相一致。用引物NLV-F/NLV-R和探针NLV-P对贝类中提取的诺沃克病毒RNA进行检测，出现扩增曲线，札幌病毒RNA、未含诺沃克病毒的贝类RNA阴性对照和空白对照未出现扩增曲线。说明引物NLV-F/NLV-R和TaqMan MGB探针NLV-P能特异检测诺沃克病毒(表3)。

表3粪便病毒样品的RT-PCR检测结果

样品	普通RT-PCR	实时荧光RT-PCR
			326953561635617HuCVSapporo	++++-	++++-

(-：表示阴性，Negative；+：表示阳性，Positive)

在未感染诺沃克病毒的牡蛎肠胃组织中分别加入诺沃克病毒样品35616原液140μL，按照“7.病毒RNA提取方法”中所述的方法进行病毒RNA提取。用引物NLV-F/NLV-R和探针NLV-P对贝类中提取纯化的病毒RNA溶液进行实时荧光RT-PCR检测，加入诺沃克病毒样品35616原液的牡蛎样品中均出现荧光扩增曲线。

结果表明，引物NLV-F/NLV-R和探针NLV-P能够检测出按照2.7的方法从贝类中富集提取和纯化的诺沃克病毒RNA(图1)。

(b)引物NLV-F/NLV-R和探针NLV-P的检测灵敏度

使用引物NLV-F/NLV-R对诺沃克病毒进行RT-PCR检测，对PCR产物进行克隆，对克隆质粒进行10倍梯度稀释至10^-7倍，用引物NLV-F/NLV-R和探针NLV-P分别测定各稀释质粒的Ct值，不同拷贝数的质粒实时荧光PCR检测结果见图2和表4，标准曲线见图3。

结果表明，可见Ct值与模板拷贝数之间的线性关系良好，在质粒拷贝数为35.21时仍能检测出。说明使用引物NLV-F/NLV-R和探针NLV-P进行检测时，检测结果准确，有较高的灵敏度。

表4不同克隆质粒稀释液的Ct值

Ct	拷贝数	Log拷贝数
			15.27817.50720.64324.09227.18730.29634.08337.670	3.521×1083.521×1073.521×1063.521×1053.521×1043.521×1033.521×1023.521×101	8.5477.5476.5475.5474.5473.5472.5471.547

实施例2

对水产品的检测

按实施例1相同方式，用引物(SEQ ID NO：1和2)通过普通RT-PCR方法，或者结合SEQ ID NO：3所示的探针通过实时荧光RT-PCR，分别对购自市场上的20批牡蛎和文蛤样品进行诺沃克样病毒实时荧光RT-PCR检测，从2批牡蛎中检测出II型诺沃克样病毒。

此外，用测序仪对检测出的样品的RT-PCR扩增产物进行了核苷酸序列测定，结果表明扩增出的正是诺沃克病毒ORF1和ORF2之间的连接区。

           表5不同批次样品的实际检测结果

批次	普通RT-PCR	荧光实时RT-PCR
			1	阴性	阴性
2	阴性	阴性
			3	阴性	阴性
4	阴性	阴性
			5	阴性	阴性
6	阴性	阴性
			7	阴性	阴性
8	阴性	阴性
			9	阳性	阳性
10	阴性	阴性
			11	阴性	阴性
12	阴性	阴性
			13	阳性	阳性
14	阴性	阴性
			15	阴性	阴性
16	阴性	阴性
			17	阴性	阴性
18	阴性	阴性
			19	阴性	阴性
20	阴性	阴性

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表

<110>潘，良文

<120>检测贝类中诺沃克病毒的实时荧光检测方法和试剂盒

<130>048369

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

gatgagrtty tcwgayytva gcac                                             24

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

tcgacgccat cttcattcac                                                  20

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>3

agattgcgat cgccct                                                      16

Claims (9)

1.一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增诺沃克病毒的特异性引物对和诺沃克病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增诺沃克病毒的特异性引物对选自下组：

引物1：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：1；

引物2：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诺沃克病毒特异性探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诺沃克病毒特异性探针是Taqman探针。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：在聚合酶链式反应过程中或之后，检测诺沃克病毒特异性探针发出的荧光信号。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有以下试剂：

(a)扩增诺沃克病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区；

(b)诺沃克病毒特异性探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增诺沃克病毒的特异性引物对选自下组：

引物1：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：1

引物2：5’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO：2。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的诺沃克病毒特异性探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的诺沃克病毒特异性探针是Taqman探针。

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