发明内容
本发明目的之一在于提供侦测脑膜炎病原菌核酸的核酸分子。本发明特别针对已知引起人类脑膜炎的20种病原菌,找到在各个病原菌本身亚种(或变异种及血清型)间之共通性序列(consensus sequence),且这些各别病原菌之共通性序列与该病原菌本身以外之其它脑膜炎病原菌基因体序列具有很低的类似性(homology)或不具类似性。因此本发明根据这些共通性序列所设计出的探针(probe),与来自脑膜炎患者检体之核酸进行杂交反应后,可以兼具灵敏度及专一性来侦测引起脑膜炎的病原菌种类。
因此,本发明的另一目的在于提供一种侦测脑膜炎病原菌核酸的方法,包括将脑膜炎病原菌核酸进行萃取;依需要将已萃取的脑膜炎病原菌核酸进行扩增;及将一种或多种前述本发明提供的核酸分子接触该脑膜炎病原菌核酸以进行杂交反应。
本发明的另一目的在于提供一种诊断脑膜炎的套组,其包含一种或多种前述本发明提供的核酸分子。
在较佳的实施方案中,本发明所使用的一种或多种核酸分子系固着于一基质上。在本发明较佳的具体事实中,该基质为一生物芯片。
传统医疗检测中,细菌培养较无时效性且辨识效率不佳,有鉴于生物芯片检测迅速、操作简便、成本降低之特性,不但效率大大提升,且符合市场的需要,因此本发明人针对脑膜炎的诊断程序积极开发出脑膜炎病原菌诊断探针及其应用套组,如检测用生物芯片等,以提高脑膜炎病原菌医疗检测之品质。
本发明的用于诊断脑膜炎病原菌的套组在制作程序方面,首先选定20种常见的脑膜炎致病菌为芯片检测的标的菌种。其菌种种类如下表所列:
No. |
菌种名称 |
本发明提供共通性序列之代号 |
1 |
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus |
1-1,1-2及1-3 |
2 |
表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis |
2-1,2-2及2-3 |
3 |
腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus |
3-1,3-2及3-3 |
4 |
无乳链球菌Streptococcus agalactiae |
4-1,4-2及4-3 |
5 |
发热链球菌Streptococcus.Pyogens |
5-1,5-2及5-3 |
6 |
肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae |
6-1,6-2及6-3 |
7 |
粪肠球菌Enterococcus faecium |
7-1,7-2及7-3 |
8 |
粪肠球菌Enterococcus faecalis |
8-1,8-2及8-3 |
9 |
结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis |
9-1,9-2及9-3 |
10 |
嗜肺性退伍军人杆菌Legionella pneumophilia |
10-1,10-2及10-3 |
11 |
产单核细胞李斯特氏菌Listeria monocytogenes |
11-1,11-2及11-3 |
12 |
大肠杆菌E.coli |
12-1,12-2及12-3 |
13 |
肺炎克雷白氏杆菌Klebsiella pneumoniae |
13-1,13-2及13-3 |
14 |
粘质锯杆菌Serratia marcescens |
14-1,14-2及14-3 |
15 |
阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae |
15-1,15-2及15-3 |
16 |
绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa |
16-1,16-2及16-3 |
17 |
Stenotrophomonas maltophilia |
17-1,17-2及17-3 |
18 |
奇异变形杆菌Proteus mirabilis |
18-1,18-2及18-3 |
19 |
感冒嗜血杆菌Haemophilus influenzae |
19-1,19-2及19-3 |
20 |
脑膜炎双球菌Neisseria meningitidis |
20-1,20-2及20-3 |
其中20种脑膜炎病原菌具有下列之通用引物:
引物名称 |
序列5′到3′ |
碱基 |
F |
5’-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3’(M=A+C) |
20 |
R |
5’-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3’ |
20 |
又,从20种已知脑膜炎病原菌DNA中,分别从每一种病原菌中确定3种可作为判断依据、与脑膜炎病原菌互补的杂交探针核酸序列,成为20组之套组检验组:
核酸分子1
1-1 CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCG
1-2 TTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGG
1-3 TTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGC
核酸分子2
2-1 AACAGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGACGTTAGC
2-2 GGATAATATATTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGG
2-3 GTGAAAGACGGTTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCG
核酸分子3
3-1 TAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGC
3-2 CATTTGGACCCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATG
3-3 ATGGTTTTGCTATCACTTATAGATGGACCCGCGC
核酸分子4
4-1 CTGAGGTTTGGTGTTTACACTAGACTGATGAGTTGCGA
4-2 GTAATTAACACATGTTGGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTG
4-3 GGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTGTGAGATGGAC
核酸分子5
5-1 CTGAGAACTGGTGCTTGCACCGGTTCAAGG
5-2 AAGAGAGACTAACGCATGTTAGTAATTTAAAAGGGGCAA
5-3 GCATGTTAGTAATTTAAAAGGGGCAATTGCTCCACTATG
核酸分子6
6-1 AGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGAT
6-2 AAGAGTGGATGTTGCATGACATTTGCTTAAAAGGTGC
6-3 GACATTTGCTTAAAAGGTGCACTTGCATCACTACCAG
核酸分子7
7-1 CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAA
7-2 TATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGG
7-3 TTGATTTGAAAGGGGCTTTCGGGTGTCG
核酸分子8
8-1 TCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGG
8-2 CAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGC
8-3 TTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCG
核酸分子9
9-1 GAAAGGTCTCTTCGGAGATACTCGAGTGGCGAAC
9-2 GGACCACGGGATGCATGTCTTGTGGTG
9-3 TCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTG
核酸分子10
10-1 GCAGCATTGTCTAGCTTGCTAGACAGATGGCGA
10-2 ATGTCTGAGGACGAAAGCTGGGGACCTTCG
10-3 CTGGGGACCTTCGGGCCTGGCGCTTTAAGATTA
核酸分子11
11-1 AACGGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGG
11-2 AATGATAAAGTGTGGCGCATGCCACGCTTT
11-3 CCACGCTTTTGAAAGATGGTTTCGGCTATCG
核酸分子12
12-1 CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACG
12-2 ACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC
12-3 GGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCC
核酸分子13
13-1 GCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGG
13-2 TGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTC
13-3 CAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCAT
核酸分子14
14-1 AGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGT
14-2 AACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC
14-3 CAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTG
核酸分子15
15-1 GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGAC
15-2 CGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC
15-3 CTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGG
核酸分子16
16-1 GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGG
16-2 GTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGG
16-3 TTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTC
核酸分子17
17-1 GCAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTG
17-2 ACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACG
17-3 CGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTC
核酸分子18
18-1 GCGGTAACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGA
18-2 CCGATGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGG
18-3 GCTCTTCGGACCTTGCACTATCGGATGAACC
核酸分子19
19-1 GTAGCAGGAGGAAGCTTGCTTTCTTGCTGACG
19-2 CGAGAGACGAAAGTGCGGGACTGTAAGGCC
19-3 CGCATGCCATAGGATGAGCCCAAGTGG
核酸分子20
20-1 GCAGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTG
20-2 CGTCTTGAGAGAGAAAGCAGGGGACCTTCGG
20-3 CTTGCGCTATTCGAGCGGCCGATATCTG
其中每一组脑膜炎病原菌诊断探针系包括至少核酸分子3或核酸分子3与其余19种核酸分子之一或多种的专一性杂交探针核酸序列。
将脑膜炎病原菌探针以至少一株的数量种植于适当之基质上,每一探针包含与欲侦测的病原菌核酸序列之一部份互补的序列且该等探针中与欲侦测的病原菌核酸序列的一部份互补的序列彼此不同,其中探针物理性或化学性方式固着于基质上。其中化学性是以原位合成(in situ synthesis)或化学性固着连结(chemical-link)为主;物理性以异位合成(ex situ synthesis)后,再用打点式、喷墨式、压电式等其它方式将探针固着于基质上。其中基质可为尼龙薄膜(nylon membrane)、玻璃(glass)、高分子材质(polymer)等固相表面材质。
另外,将不同种类的探针分别种植于不同之区域,以利于辨视病原菌的种类。种植方法为一小面积标的探针外的区域种满多数非标的探针,或者将区域划分为多个特定标的区域、种植多种侦测探针,以利于同时检验数种不同标的。本发明中脑膜炎诊断芯片最佳实施例为同时将20种脑膜炎病原菌专一性探针种植于同一芯片上,以确认脑膜炎病原菌的种类,使诊断用药更为精确。
其中基质可为玻璃、硝化纤维膜、尼龙薄膜、硅片及高分子材质等。基质上种植探针方式可为常用的种植方法,将目标或探针连接于固体支持物上,而能够在溶液中与脑膜炎病原菌的互补性核酸进行片断杂交反应。示范性固体相模式包含Southern氏杂交反应,点渍法及类似方法。杂交反应之侦测可于固体支持物上进行,如微效价盘,滤膜(如硝基纤维)或微球体(小珠)或一芯片及任何可行的杂交反应缓冲液系统。
另外在脑膜炎病原菌处理方面将脑膜炎病原菌核酸经过萃取后以聚合酶链扩增并同时标记,以增强与探针杂交的结合力,其中病原菌PCR序列分别为:
1.Staphylococcus aureus
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG
AAC GGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATA
ATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGA CGGTC
TTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
2.Staphylococcus epidermidis
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG
AAC AGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACC
TTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCCGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
3.Staphylococcus saprophyticus
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCAGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACAGA
TAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAA
CATTTGGACCCGCATGGTTCTAAAGTGAAAG CGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
4.Streptococcus agalactiae
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACG
CTG AGGTTTGGTGTTTACACTAGACTGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGA
GTAATTAACACATGTT CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
5.Streptococcus.Pyogens
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACG
CTG AGAACTGGTGCTTGCACCGGTTCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT
AAGAGAGACTAAC AGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
6.Streptococcus pneumoniae
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT
AGAACGCTG AAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTGGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT
AAGAGTGGATGTTGCAT ATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGKCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
7.Enterococcus faecium
GAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCTT
CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGARGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCG
TATAACAATCGAAACCGCATGGTT CTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
8.Enterococcus faecalis
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCT
T CTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAAGAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAA
CAGTTTATGCCGCATGGCATAA GAGTGAAAGGCGCT
TTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
9.Mycobacterium tuberculosis
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACG
GAA AGGTCTCTTCGGAGATACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATA
GGACCACGGGATGCATG GGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
10.Legionella pneumophilia
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG
GCA GCATTGTCTAGCTTGCTAGACAGATGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGCCTTGAAGAGGGGGACAACTTGGGGAAACTCAAGCTAATACCGCATA
ATGTCTGAGGACGAAAG GCCTGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGGGCCTACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
11.Listeria monocytogenes
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACG
AAC GGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGTTGGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG
AATGATAAAGTGTGGCGCATG CTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAATGGCCTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
12.E.coli
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAA
CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTYGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATA
ACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC CAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
13.Klebsiella pneumoniae
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGA
GCGGTA GCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAA
TGTCGCAAGAC GCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
14.Serratia marcescens
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGT
A GCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCAT
AACGTCGCAAGAC CCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
15.Enterobacter cloacae
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACG
GTA ACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAA
CGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCT
CTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
16.Pseudomonas aeruginosa
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAT
GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATAC
GTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATC GGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG
17.Stenotrophomonas maltophilia
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGTAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACG
GCA GCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCT
ACTTTTTCG TGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATA
CGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
18.Proteus mirabilis
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGA
GCGGTA ACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGC
CCGATAG AGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGCAGGG
GCTCTTCGGA CCTTGCACTATCGGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAAAGGCTCACCTAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
19.Haemophilus influenzae
GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACG
GTA GCAGGAGGAAGCTTGCTTTCTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATCTGGCTTATGGAGGGGGATAACGACGGGAAACTGTCGCTAATACCGCGTAGTGT
CGAGAGACGAAAGTGCGGGACTGTAAGG GATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCTGCGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
20.Neisseria meningitidis
GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTTGAACGCTGGCGGCATGCTTTACACATGCAAGTCGGACG
GC AGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACATATCGGAACGTACCGAGTAGTGGGGGATAACTGATCGAAAGATCAGCTAATACCGCATA
CGTCTTGAGAGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGC
CTTGCGCTATTCGAGCGGCCGATATCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCYTACGGGAGGCAGCAGT
其中,标示底线(单、双线者为)每一种脑膜炎病原菌可作为判断依据、与标的杂交探针互补的核酸序列片段,加底纹之区段为两互补核酸序列片段重叠的部份。
本发明其它的特征及优点将可明显见于下列较佳实施方案及权利要求范围。
实施例
下列实施例用于示范说明本发明。这些实施例不以任何方式意欲限制本发明的范围,但用于指示如何实施本发明的材料及方法。本发明的脑膜炎病原菌诊断芯片的最佳实施状态包含下列步骤:
A.病原菌DNA的萃取:
(1)一病原菌菌落以500ul溶液I筛选,其中溶液I为:
50mM 葡萄糖
10mM EDTA
25mM Tris-HCl pH=8.0
之混合溶液。
(2)对G(+)病原菌,添加1mg/ml溶菌酶,并于37℃下温育30-60分钟;对G(-)病原菌,直接跳至步骤(3)。
(3)加入10% SDS 50μl,在65℃下温育30-60分钟。
(4)加入RNase 4mg/mL,在37℃下温育30-60分钟。
(5)添加100μl的5M KAc与300μl的CHCl3。
(6)搅拌混合15秒后以12,000 RPM转速旋转离心5分钟。
(7)将悬浮物移至新试管,并添加2倍体积的95%乙醇。
(8)均匀混合并再快速旋转离心。
(9)移出悬浮物,以600μl的70%乙醇清洗沉淀物。
(10)移出悬浮物后风干沉淀物.。
(11)以500μl的ddH2O或TE缓冲液溶解,其中TE为10mM Tris-HCl与1mMEDTA pH=8.0的混合溶液。
(12)以OD-260量测DNA浓度。
(13)稀释DNA浓度至约为2ng/μl以进行PCR。
B.聚合酶链反应:
准备下列物品:
1.模板 2λ;
2.缓冲液 25mM10X缓冲液5λ;
3.F引子 1λ;
4.R引子 1λ;
5.Taq 1U;
6.DIG(digoxigenin)-dUTP 2λ;
将上述6项物品置于PCR机器上,经95℃,10分钟的变性,再进行30次的循环反应(95℃1分钟;58℃1分钟;72℃2分钟)。最后以72℃10分钟进行延展。之后取3μl与芯片反应。
C.芯片反应:
脑膜炎诊断芯片的测试流程如下:
1.3μl PCR产物与脑膜炎芯片反应。
2.预先杂交(阻断反应)30分钟,之后加入标示性探针进行杂交反应6小时。
3.除去非专一性部份反应3小时。
4.进行感光或其它讯号辨识发展20分钟。
之后,判读脑膜炎诊断芯片上的讯息,对应专一性探针的种植位置,有显示讯号者即为感染的病原菌。如图片(a)、(b)所示,本实施例中的芯片内容主要分为三大部分:病原菌专一性探针、聚合酶链反应正向控制探针以及呈色正向控制探针。其主要目的分述于下:
1.病原菌专一性探针:芯片同时种植有20种脑膜炎病原菌诊断探针,依序如图中标示1-20的顺序,每种菌3支探针,每一探针2重复(共六个位置),由上而下,由左至右,由呈色的行别,即可辨识出感染的病原菌菌种。
2.聚合酶链反应正向控制探针:在A区、B区均有呈色,则表示聚合酶链反应的过程无误。
3.呈色正向控制探针:在C、D、E、F区均有反应,则表示呈色反应的过程无误。
在本实施例中,可以肉眼判读所感染的脑膜炎病原菌菌种,如图标:(a)图中感染的菌种为Staphylococcus saprophyticus,而(b)图中感染的菌种为Neisseria meningitidis。
另外,其它种类的讯号辨视方式配合标定的讯号标计,可以为光检验或扫描侦测系统,能够专一性与一目标进行杂交的核酸探针的标记(labeling),用任何一种典型用于侦测被杂交的核酸存在的方法进行,其中光检验可为萤光标记、放射线标记、化学标记、或分光光度计分析。此外,整体性的光电与电子感应成分也可。
由于本发明中脑膜炎病原菌诊断探针可检测的20种细菌种类已涵盖80~90%的脑膜炎患者可能感染的菌种,其中更包含近日流行性脑脊髓膜炎的脑膜炎双球菌。且整合了多项生物技术,利用生物信息找出其专一性探针,制成脑膜炎诊断芯片,使用者只需将从检体取得的细菌DNA,进行简单的聚合酶链反应将讯号扩增,即可与芯片进行杂交,反应后用肉眼即可辨识出感染的菌种,无需其它辨识系统,与传统的一对一检测方式相比,芯片的一对多检测法,可在24小时内检测出感染的菌种,且至少节省一半以上的成本,芯片技术运用于医疗检测上的突破,对于患者而言,无疑是一大福音。
根据本发明可作的不同修正及变化对于本领域技术人员而言显然均不会偏离本发明的范围与精神。虽然本发明已叙述具体的较佳实施方式,但必须了解的是本发明不应被不恰当地限制于这些具体实施方式上。事实上,在实施本发明的上述模式方面,对于本领域技术人员而言,显然不同修改亦被涵盖于下列权利要求范围之内。