CN101041864A - 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光pcr检测方法 - Google Patents
沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光pcr检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法以及试剂盒组成。本发明分别针对沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR方法扩增目的基因。本发明采用两种互不干扰的波长检测荧光，波长1检测探针FCT标记的荧光染料强度，Ct值为0或大于27：沙眼衣原体阴性，Ct值小于26：阳性，病人沙眼衣原体感染；波长2检测探针FNG标记的荧光染料强度，Ct值为0或大于27：淋病奈瑟菌阴性，Ct值小于26：阳性，病人淋病奈瑟菌感染。如果沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测同时为阳性，则病人合并感染沙眼衣原体、淋病奈瑟菌。
Description
技术领域
本发明涉及双重实时荧光PCR同步检测性传播疾病沙眼衣原体(ChlamydiaTrachomatis，CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae，NG)技术。
背景技术，
随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光PCR技术(real-timefluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测，也包括多种病毒、细菌耐药性检测。实时荧光PCR(real-time fluorescencepolymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。目前临床用的PCR检测技术多数采用实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。
性病是全球流行最广泛的传染性疾病，它的概念已从过去经典的5种性病演变为包括艾滋病在内的与性行为接触密切相关的20余种传染病，统称性传播疾病(sexually transmitteddisease，STD)。性病临床传统的检测方法包括细菌涂片、细菌培养、酶联反应等，普遍存在检出率低、周期长、特异性差的缺点，给临床诊断带来困难。近几年发展起来的荧光PCR技术不仅解决了检出率低、周期长的问题，而且克服了常规PCR技术假阳性率高的缺陷。随着人们思想的改变和性观念的转变，以及对性传播疾病(STD)有关知识的匮乏，加之管理上缺乏相应法规，检测手段不先进，性健康教育和公共卫生宣传严重不足，致使STD发病率呈现逐年上升之势，且多种STD病原体混合感染率高达28.8％。STD除了引起男、女泌尿生殖道的感染，造成尿道狭窄、排尿困难，还可导致盆腔炎和菌血症(严重的病例)，引起关节炎、心内膜炎、皮肤损害和不孕不育症。混合感染机理：当感染一种病原体时，生殖道粘膜受损，使得其它病原体更易入侵。沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)是泌尿生殖系统性传播疾病(STD)的三个最常见病原体。UU在非淋菌性尿道炎中占40％-50％，CT占非淋菌性尿道炎40％。约有19％-40％的NG患者伴有CT感染。淋病伴混合感染时仅用对淋病奈瑟菌有效的药物治疗，则80％以上病人的尿道炎持续存在或好转后复发。
目前应用于沙眼衣原体、淋病奈瑟菌临床检测的方法：主要是检测NG感染常用的方法是涂片革兰氏染色，因为分泌物中含大量的杂菌而影响检测结果，在慢性感染病人中其检出阳性率则更低；CT感染常用的方法是ELISA法，但该法与许多细菌如金葡球菌、A及B群链球菌有相同的抗原，易发生交叉反应，使其准确性不高，以上检测方法操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性低。其次用于临床检测的PCR方法，多是单检荧光PCR或者常规PCR方法。
发明内容
为了克服以上沙眼衣原体、淋病奈瑟菌临床检测技术的不足，本发明采用一种双重实时荧光PCR技术同步检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌病原体。本发明分别针对沙眼衣原体的Bourcryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因的特异性核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增的方法，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，Ct值0或大于27：阴性；Ct值小于27：阳性。沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法具有以下特点：①有利于早期诊断。对于女性患者，可以说沙眼衣原体初感染时几乎见不到特异症状，但正是这个原因，导致了不理会后有可能不孕的生育力损害，延误了治疗。淋球菌感染若不及时治疗，可进入后尿道或宫颈，向上蔓延引起泌尿生殖道和附近器官的炎症。因此对淋球菌和沙眼衣原体感染的早期诊断及时预防和治疗甚为重要。②有利于无症状诊断。非淋菌性尿道炎中约30％-40％病人症状不典型或根本无症状。约1/3左右的淋球菌尿道炎病人合并沙眼衣原体感染，淋病治愈后又出现尿道炎症状，易误诊为慢性淋病或ppNG菌株感染。③诊断方便简单，从样本取材到结果只需数小时即可完成。④减轻患者痛苦，一次取样即可同时诊断两种病原体。⑤生产成本低，一份酶与反应液即可检测两种病原体。⑥指导临床用药。
本发明的双重实时荧光PCR方法包括以下步骤：
1、确定待检测的特异性基因--即扩增序列沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因；
2、根据沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因分别设计引物、探针，沙眼衣原体设计一对引物PCT，探针FCT，淋病奈瑟菌设计一对引物PNG，探针FNG；其中探针FCT，PNG分别标记不同的荧光物质；两对引物设计过程中，尽量将两对引物PCT、PNG的Tm值设置相近，在PCR扩增过程中，采用相同的变性温度；
3、双重实时荧光PCR反应体系组成：5XPCR缓冲液，两对引物、两条探针，反应用Taq酶、UNG酶，DNA模板。
双重实时荧光PCR扩增反应体系：
5xPCR缓冲液(mix) 10μl
PCT(80pmol/μl) 1μl
PNG(80pmol/μl) 1μl
FCT(60pmol/μl) 1μl
FNG(60pmol/μl) 1μl
Taq酶(2U/μl) 2μl
UNG酶(0.1U/μl) 2μl
模板 5μl
ddH2O 27μl
总反应体积：50μl
5XPCR缓冲液组成成分：
250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl2、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uMdGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。
4、阳性、阴性质控样品组成：阳性样品是经过基因工程克隆、纯化的位于T-vector上的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因的PCR扩增序列；阴性质控样品包括阴性临床样品、ddH2O；
5、反应条件：
PCR程序
1 37℃ 5min
2 93℃ 45s
3 55℃ 1min
4 Go to 2，10cycles
5 93℃ 30s
6 55℃ 45s
7 Go to 5 30cycles，
在第六步采集荧光。
8 end
6、检测：本发明采用双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长。使用ABI实时荧光PCR仪进行检测，检测采用两个不同波长(波长1，波长2)进行检测。
7、结果判断：波长1检测探针FCT标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：沙眼衣原体阴性，Ct值小于26：沙眼衣原体阳性，病人沙眼衣原体感染；波长2检测探针FNG标记的荧光染料强度，Ct值0或大于27：淋病奈瑟菌阴性，Ct值小于26：淋病奈瑟菌阳性，病人淋病奈瑟菌感染。如果沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测同时为阳性，则病人合并感染沙眼衣原体、淋病奈瑟菌。
本发明扩增的沙眼衣原体基因序列、引物、探针如下所示：
扩增模板序列：(109bp)
1AGCTTTTGCG GCGTCGTATC AAAGATATGG ACAAATCGTA
21TCTCGGGTTA ATGTTGCATG ATGCTTTATC AAATGACAAG
81CTTAGATCCG TTTCTCATAC GGTTTTCCT
特异性引物：
PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT----3’23bp
PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3’25bp
FCT特异性探针：
5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3’27bp
针对淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因设计的特异性引物、探针：
特异性引物：
PNG1：5’--CTGAACCGCGTGCTTTTACTAA--3’22bp
PNG2：5’--ACTTCAGTTGTTGATCCGACAAAC--3’24bp
特异性探针：
FNG：5’--CGAGCA AGGCTTCAAAGTTTTCCTGATG--3’28bp
本发明扩增的淋病奈瑟菌基因序列、引物、探针如下所示：
扩增特异性模板(88bp)：
1CTGAACCGCG TGCTTTTACT AATAGAGAAC GAGCAAGGCT
41TCAAAGTTTT CCTGATGATT TTGAGTTTGT CGGATCAACA
81ACTGAAGT
特异性引物：
PNG1：5’--CTG AAC CGC GTG CTT TTA CTA A--3’22bp
PNG2：5’--ACT TCA GTT GTT GAT CCG ACA AAC--3’24bp
特异性探针：
FNG：5’--CGA GCA AGG CTT CAA AGT TTT CCT GAT G--3’28bp
具体实施方式
实施例----沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测及其试剂盒
1、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR诊断试剂盒组成
试剂盒由PCR缓冲液(mix)，两对引物PCT、PNG，两条探针FCT、FNG，Taq酶，UNG酶组成，包括沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因两种阳性对照、阴性对照。
通过大量的基因保守序列分析，我们分别选择沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因保守序列设计两对引物、两条探针，其中探针分别标记不同波长的荧光染料。两对引物、两条探针设计的Tm值接近，相差不到2℃，因此反应程序可设置同样的参数。
针对沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因设计的特异性引物、探针：
特异性引物：
PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT----3’23bp
PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3’25bp
FCT特异性探针：
5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3’27bp
针对淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因设计的特异性引物、探针：
特异性引物：
PNG1：5’--CTGAACCGCGTGCTTTTACTAA--3’22bp
PNG2：5’--ACTTCAGTTGTTGATCCGACAAAC--3’24bp
特异性探针：
FNG：5’--CGAGCAAGGCTTCAAAGTTTTCCTGATG--3’28bp
沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因扩增序列为一段编码序列，全长109bp，在基因组中是单拷贝序列；淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因扩增序列为一段编码序列，全长89bp。
试剂盒的配置过程如下：
5xPCR缓冲液(mix) 10μl
PCT(80pmol/μl) 1μl
PNG(80pmol/μl) 1μl
FCT(60pmol/μl) 1μl
FNG(60pmol/μl) 1μl
Taq酶(2U/μl) 2μl
UNG酶(0.1U/μl) 2μl
模板 5μl
ddH2O 27μl
总反应体积：50μl
5XPCR缓冲液组成成分：
250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl2、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uMdGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。
DNA裂解液分为两部分：
DNA提取液体系
裂解液1：20％ PEG6000
1M NaCl
1％ SiO2
裂解液2：20mmol/L NaOH
10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)
0.1mmol/L EDTA
1％ Triton X-100
1％ NP-40
阴性样品：非阳性菌株、ddH2O；
阳性样品：阳性样品是经过基因工程克隆、纯化的位于T-vector上的Bour cryptic plasmidORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因的PCR扩增序列
2、使用沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR诊断试剂盒检测
(1)样品处理和模板提取
收集尿道分泌物、生殖道分泌物，根据收集样品的量，用100--500μl生理盐水处理，取100μl生理盐水处理的上清液用于DNA提取。
DNA提取方法
1.将100ul待测样品血清置入一干净的1.5ml离心管，加入100ul裂解液1。
2.振荡5秒混匀，室温静置5min。
3.13000rpm，4℃离心10min，小心弃净上清。
4.向管中加入20ul裂解液2，振荡使沉淀完全悬浮。
5.100℃恒温处理10min。
6.13,000rpm，4℃离心10min。
7.小心转移上清至一干净的离心管中(小心不要带上沉淀)，以作为定量PCR模板备用。
(2)荧光PCR扩增
配制双重实时荧光PCR反应体系：
5xPCR缓冲液(mix) 10μl
PCT(80pmol/μl) 1μl
PNG(80pmol/μl) 1μl
FCT(60pmol/μl) 1μl
FNG(60pmol/μl) 1μl
Taq酶(2U/μl) 2μl
UNG酶(0.1U/μl) 2μl
模板 5μl
ddH2O 27μl
总反应体积：50μl
PCR程序
1 37℃ 5min
2 93℃ 45s
3 55℃ 1min
4 Go to 2，10cycles
5 93℃ 30s
6 55℃ 45s
7 Go to 5 30cycles，
在第六步采集荧光。
8 end
(3)检测：使用ABI实时荧光PCR仪进行检测，检测采用两个不同波长(波长1，波长2)进行检测。结果判断：波长1检测探针FCT标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：沙眼衣原体阴性，Ct值小于26：沙眼衣原体阳性，病人沙眼衣原体感染；波长2检测探针FNG标记的荧光染料强度，Ct值0或大于27：淋病奈瑟菌阴性，Ct值小于26：淋病奈瑟菌阳性，病人淋病奈瑟菌感染。如果沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测同时为阳性，则病人合并感染沙眼衣原体、淋病奈瑟菌。
用上述方法对125例临床性病待测样品进行检测，其中沙眼衣原体35例、淋病奈瑟菌17例，合并感染2例，阳性率45.6％；准确率98％，远远高于淋病奈瑟菌、沙眼衣原体培养法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。此外，沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本。
沙眼衣原体、淋病奈瑟菌扩增用基因序列、引物、探针
本发明扩增的沙眼衣原体基因序列、引物、探针如下所示：
扩增模板序列：(109bp)
1AGCTTTTGCG GCGTCGTATC AAAGATATGG ACAAATCGTA
21TCTCGGGTTA ATGTTGCATG ATGCTTTATC AAATGACAAG
81CTTAGATCCG TTTCTCATAC GGTTTTCCT
特异性引物：
PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT---3‘23bp
PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3‘25bp
FCT特异性探针：
5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3‘27bp
本发明扩增的淋病奈瑟菌基因序列、引物、探针如下所示：
扩增特异性模板(88bp)：
1CTGAACCGCG TGCTTTTACT AATAGAGAAC GAGCAAGGCT
41TCAAAGTTTT CCTGATGATT TTGAGTTTGT CGGATCAACA
81ACTGAAGT
特异性引物：
PNG1：5’--CTGAACCGCGTGCTTTTACTAA--3’22bp
PNG2：5’--ACTTCAGTTGTTGATCCGACAAAC--3’24bp
特异性探针：
FNG：5’--CGAGCAAGGCTTCAAAGTTTTCCTGATG--3’28bp
Claims (7)
1、一种沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法以及试剂盒组成。本发明分别针对沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR方法扩增目的基因。本发明采用两种互不干扰的波长检测荧光，波长1检测探针FCT标记的荧光染料强度，Ct值0或大于27：沙眼衣原体阴性，Ct值小于26：阳性，病人沙眼衣原体感染；波长2检测探针FNG标记的荧光染料强度，Ct值0或大于27：淋病奈瑟菌阴性，Ct值小于26：阳性，病人淋病奈瑟菌感染。如果沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测同时为阳性，则病人合并感染沙眼衣原体、淋病奈瑟菌。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。此外，沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本。按照权利要求1所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述双重实时荧光PCR扩增基因序列的反应体系为：
双重实时荧光PCR扩增反应体系：
5xPCR缓冲液(mix) 10μl
PCT(80pmol/μl) 1μl
PNG(80pmol/μl) 1μl
FCT(60pmol/μl) 1μl
FNG(60pmol/μl) 1μl
Taq酶(2U/μl) 2μl
UNG酶(0.1U/μl) 2μl
模板 5μl
ddH2O 27μl
总反应体积：50μl
2、按照权利要求1所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：反应条件，
PCR程序
1 37℃ 5min
2 93℃ 45s
3 55℃ 1min
4 Go to 2，10cycles
5 93℃ 30s
6 55℃ 45s
7 Go to 5 30 cycles，
在第六步采集荧光。
8 end
3、按照权利要求1所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：试剂盒由PCR缓冲液(mix)，两对引物PCT、PNG，两条探针FCT、FNG，Taq酶，UNG酶组成，包括沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因两种阳性对照、阴性对照。
4、按照权利要求3所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：沙眼衣原体特异性扩增基因序列为，
1AGCTTTTGCG GCGTCGTATC AAAGATATGG ACAAATCGTA
21TCTCGGGTTA ATGTTGCATG ATGCTTTATC AAATGACAAG
81CTTAGATCCG TTTCTCATAC GGTTTTCCT
5、按照权利要求4所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：针对沙眼衣原体特异性扩增序列设计的引物与探针序列为，
PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT----3’23bp
PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3’25bp
FCT特异性探针：
5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3’27bp
6、按照权利要求3所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：淋病奈瑟菌特异性扩增基因序列为
1CTGAACCGCG TGCTTTTACT AATAGAGAAC GAGCAAGGCT
41TCAAAGTTTT CCTGATGATT TTGAGTTTGT CGGATCAACA
81ACTGAAGT
7、按照权利要求6所述的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：针对淋病奈瑟菌特异性扩增序列设计的引物与探针序列为
特异性引物：
PNG1：5’--CTG AAC CGC GTG CTT TTA CTA A--3’22bp
PNG2：5’--ACT TCA GTT GTT GAT CCG ACA AAC--3’24bp
特异性探针：
FNG：5’--CGA GCA AGG CTT CAA AGT TTT CCT GAT G--3’28bp
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200710079728 CN101041864A (zh) | 2007-03-06 | 2007-03-06 | 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光pcr检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200710079728 CN101041864A (zh) | 2007-03-06 | 2007-03-06 | 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光pcr检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101041864A true CN101041864A (zh) | 2007-09-26 |
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|---|---|---|---|
| CN 200710079728 Pending CN101041864A (zh) | 2007-03-06 | 2007-03-06 | 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光pcr检测方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN101041864A (zh) |
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