CN101051026A - 耐万古霉素肠球菌双重实时荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测方法以及试剂盒的组成，根据待测耐万古霉素肠球菌VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增待测两种万古霉素抗性基因的特异性核苷酸序列。本发明采用荧光双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长，波长1检测探针FPVanA标记的荧光染料强度，波长2检测探针FPVanB标记的荧光染料强度，Ct值为0或大于37：阴性，Ct值小于36：阳性。本试剂盒针对耐万古霉素肠球菌而设计，具有特异性高、灵敏、快速等特点，可准确、快速、特异、方便的检出耐万古霉素肠球菌，并能够准确判断其耐药的遗传学机制。
Description
技术领域
本发明涉及双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法。
背景技术
上世纪50年代发现的糖肽类抗生素万古霉素由于其独特的作用机制而被用作治疗多重耐药G+菌感染的首选药物，曾一度被誉为“人类对付顽固性多重耐药G+菌感染的最后一道防线”。但随着耐万古霉素肠球菌Vancomycin Resistant Entorecoccus(VRE)的出现，这最后一道防线也面临着崩溃的危险。VRE在临床上不仅能引起尿路感染、腹腔、盆腔感染及外科手术伤口感染、菌血症、心内膜炎、脑膜炎等等，而且还能将其抗性转移到其他病原微生物。因此，对人类构成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括它们的耐药因子的转移将产生一些难以治疗的新耐药菌株。加强VRE检测不仅有利于指导临床用药，而且有利于VRE抗性转移检测、控制。目前，临床上VRE检测主要方法是通过抑菌试验来检测，这种检测方法不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性低，而且无法了解抗性引起的分子生物学机制。
随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光PCR技术(real-timefluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测，也包括多种病毒、细菌耐药性检测。实时荧光PCR(real-time fluorescencepolymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。目前临床用的PCR检测技术基本全部采用实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有以下优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。
目前应用于临床检验的实时荧光PCR检测试剂盒，多数是单检试剂盒，少数为双检或三检试剂盒。引起临床病原微生物耐药的原因往往是多因素的，常常需要检测多个因素才能确定耐药原因，这就对检测试剂盒提出了更高的要求：又快又能同时检测多种耐药的原因。
发明内容
研究表明肠球菌耐万古霉素主要是由位于肠球菌基因组或质粒上的抗性基因引起，根据抗性基因差异分为VanA型、VanB型、VanC型、VanD型四种，其中只有VanA型、VanB型具有临床检测意义。目前VRE检测技术(抗生素抑菌试验)操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性低，而且无法检测到抗性引起的分子生物学机制。为了克服目前检测技术不足，本发明采用一种双重实时荧光PCR技术检测VRE。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种双重实时荧光PCR技术检测VRE方法。根据目前引起肠球菌耐万古霉素的主要因素VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增的方法，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，Ct值0或大于37：阴性；Ct值小于36：阳性。
本发明的双重实时荧光PCR方法包括以下步骤：
1、确定代检测的特异性基因---即扩增序列VanA、VanB基因序列；
2、根据扩增序列VanA、VanB基因分别设计引物、探针，VanA设计一对引物1，探针1，VanB基因设计一对引物2，探针2；其中探针1，2标记不同的荧光物质；
3、双重实时荧光PCR反应体系组成：PCR缓冲液，两对引物、两条探针，反应用Taq酶、UNG酶，DNA模板。
VRE双重实时荧光PCR扩增反应体系：
5×PCR缓冲液(mix) 8μl
P VanA(80pmol/μl) 0.5μl
P VanB(80pmol/μl) 0.5μl
FP VanA(60pmol/μl) 0.5μl
FP VanB(60pmol/μl) 0.5μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
UNG酶(0.1U/μl) 1μl
模板 2～5μl
ddH2O 26～29μl
总反应体积：40μl
5×PCR缓冲液组成成分：
250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl2、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uMdGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。
4、阳性、阴性质控样品组成，阳性样品是经过基因工程克隆、纯化的VanA、VanB基因；阴性质控样品包括阴性临床样品、ddH2O；
5、反应条件：93℃/45s，58℃/60s，10循环；93℃/30s，58℃/45s；40循环；
6、检测：本发明采用双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长。使用ABI实时荧光PCR仪进行检测，检测采用两个不同波长(波长1，波长2)进行检测。
7、结果判断：波长1检测探针FPVanA标记的荧光染料度，Ct值0或大于37：VanA阴性，Ct值小于36：VanA阳性；波长2检测探针FPVanB标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanB阴性，Ct值小于36：VanB阳性。检测结果VanA或VanB阳性，表明肠球菌耐万古霉素。
本发明针对耐万古霉素肠球菌具有临床检测意义的VanA、VanB型进行特异性设计，根据已有的抗性基因系列，经过基因库检索、分析，选择了特异、高效的目的基因片段作为扩增对象。
本发明扩增的VanA基因序列、引物、探针如下所示：
扩增模板序列：
1 GCAGCTTGCA TGGACAAATC ACTGGCCTAC ATTCTTACAA
41 AAAATGCGGG CATCGCCGTT CCCGAATTTC AAATGATTGA
81 TAAAGGTGAC AAGCCGGAGG CGGGTGCGCT TACCTACCCT
121 GTCTTTGTGA AGAGCAGGCT GTTTCGGGCT GTGAGGTCGG
161 TTGTGCGGTA T
特异性引物：
P VanA 1：5‘-CGC AGC TTG CAT GGA CAAAT-3‘20bp
P VanA 2：5‘-CAC TCC AGC CAA CAC GCC AT--3‘20bp
特异性探针：
FP VanA：5‘---ATT GAT AAA GGT GAC AAG CCG GAG GC---3‘26bp
本发明扩增的VanB基因序列、引物、探针如下所示：
扩增特异性模板：
1 GTTTGTATTG TCTGGTATCC CCTATGTGGG CTGTGATATT
41 CAAAGCTCCG CAGCTTGCAT GGACAAATCA CTGGCCTACA
81 TTCTTACAAA AAATGCGGGC ATCGCCGTTC CCGAATTTCA
121 AATGATTGAT AAAGGTGACA AGCCGGAGGC GGGTGCGCTT
161 ACCTACCCTG TCTTTGTGAA G
特异性引物：
P VanA 1：5‘-GTT TGT ATT GTC TGG TAT CCC CTA T-3‘25bp
P VanA 2：5‘-CGA ATG GAT GGG ACA GAA ACA CTT C-3‘25bp
特异性探针：
FP VanA：5‘---GCA GCT TGC ATG GAC AAA TCA CTG G---3‘26bp
本发明使用的试剂、反应体系经过一系列的优化改进，具有很强的PCR扩增能力、更高的扩增效率。本试剂盒针对耐万古霉素肠球菌而设计，具有特异性高、灵敏、抗污染、快速等特点。本试剂盒在临床上使用，可以准确、快速、特异、方便的检出耐万古霉素肠球菌，并且能够准确判断引起耐药的遗传学机制。
具体实施方式
实施例----耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测及其试剂盒
1、耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR诊断试剂盒组成
试剂盒由PCR缓冲液(mix)、引物1、引物2、两条探针、Taq酶、UNG酶组成，包括两种VanA、VanB阳性对照、阴性对照。
根据临床肠球菌耐万古霉素的主要因素是VanA、VanB两种抗性基因引起的，我们分别选择VanA、VanB基因的保守序列设计两对引物、两条探针，其中探针分别标记不同波长的荧光染料。两对引物、两条探针设计的Tm值接近，相差不到2℃，因此反应程序可设置同样的参数。
针对VanA基因设计的特异性引物、探针：
特异性引物：
P VanA 1：5‘-CGC AGC TTG CAT GGA CAA AT 3‘20bp
Tm＝61.5
P VanA 2：5‘-CAC TCC AGC CAA CAC GCC AT--3‘20bp
Tm＝61.4
FP VanA：5‘---ATT GAT AAA GGT GAC AAG CCG GAG GC---3‘26bp
Tm＝69.7
针对VanB基因设计的特异性引物、探针：
特异性引物：
P VanA 1：5‘-GTT TGT ATT GTC TGG TAT CCC CTA T-3‘25bp
Tm＝59.5
P VanA 2：5‘-CGA ATG GAT GGG ACA GAA ACA CTT C-3‘25bp
Tm＝61.0
特异性探针：
FP VanA：5‘---GCA GCT TGC ATG GAC AAA TCA CTG G---3‘26bp
Tm＝69.7
VanA基因扩增序列为一段编码序列，全长171bp，在基因组中是单拷贝序列；VanB基因扩增序列为一段编码序列，全长181bp，在基因组中是单拷贝序列。
试剂盒的配置过程如下：
5×PCR缓冲液(mix) 8μl
P VanA(80pmol/μl) 0.5μl
P VanB(80pmol/μl) 0.5μl
FP VanA(60pmol/μl) 0.5μl
FP VanB(60pmol/μl) 0.5μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
UNG酶(0.1U/μl) 1μl
模板 2～5μl
ddH2O 26～29μl
总反应体积：40μl
5×PCR缓冲液组成成分：
250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl2、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uMdGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。
DNA裂解液分为两部分：
DNA提取液1：20％PEG6000、1MNaCl、1％SiO2。
DNA提取液2：20mmol/LNaOH、10mmol/LTris-HCl(pH 8.0)、0.1mmol/L EDTA、1％TritonX-100和1％NP-40。
阴性样品：不具有抗性的肠球菌；ddH2O；
阳性样品：是经过基因工程克隆、纯化的VanA、VanB基因；
2、使用耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR诊断试剂盒进行检测
(1)样品处理和模板提取
收集粪便、尿道分泌物，根据收集样品的量，用100--500μl生理盐水处理，取100μl生理盐水处理的上清液用于DNA提取。
DNA提取方法
1)取待测样本以及试剂盒中的质控品(阴性质控品、强阳性质控品及临界阳性质控品)各100μl，分别加到0.5mL的离心管中，加入100μl DNA提取液I，
2)旋涡振荡器振荡5秒钟，充分混匀，室温放置5分钟；
3)13,000rpm，4℃离心10分钟，之后仔细吸弃上清，注意不要碰到沉淀。
4)沉淀加20μl DNA提取液II，用旋涡振荡器充分混匀，
5)在100℃保温10分钟，误差不超过1分钟。
6)在13,000rpm，4℃离心10分钟，保留上清备用。
(2)荧光PCR扩增
配制双重实时荧光PCR反应体系：
5×PCR缓冲液(mix) 8μl
P VanA(80pmol/μl) 0.5μl
P VanB(80pmol/μl) 0.5μl
FP VanA(60pmol/μl) 0.5μl
FP VanB(60pmol/μl) 0.5μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
UNG酶(0.1U/μl) 1μl
模板 5μl
ddH2O 26μl
总反应体积：40μl
反应条件：93℃/45s，58℃/60s，10循环；93℃/30s，58℃/45s；40循环；
(3)检测：使用ABI实时荧光PCR仪进行检测，检测采用两个不同波长(波长1，波长2)进行检测。结果判断：波长1检测探针FPVanA标记的荧光物质强度，Ct值0或大于37：VanA阴性，Ct值小于36：VanA阳性；波长2检测探针FPVanB标记的荧光物质强度，Ct值0或大于37：VanB阴性，Ct值小于36：VanB阳性。检测结果VanA或VanB阳性，表明肠球菌耐万古霉素。
用上述方法对50例长期使用万古霉素治疗的院内尿路感染患者进行试验，检测到23例患者耐万古霉素，11例为VanA，12例为VanB，阳性率为46％，检测发现同一患者体内耐万古霉素肠球菌不可能同时拥有VanA、VanB两种抗性基因。与传统的抗生素抑菌试验相比，耐万古霉素肠球菌双重实时荧光PCR检测方法具有省时省力，准确性高的特点。
耐万古霉素肠球菌扩增用基因序列、引物、探针
本发明扩增的VanA基因序列、引物、探针如下所示：
扩增模板序列：
1 GCAGCTTGCA TGGACAAATC ACTGGCCTAC ATTCTTACAA
41 AAAATGCGGG CATCGCCGTT CCCGAATTTC AAATGATTGA
81 TAAAGGTGAC AAGCCGGAGG CGGGTGCGCT TACCTACCCT
121 GTCTTTGTGA AGAGCAGGCT GTTTCGGGCT GTGAGGTCGG
161 TTGTGCGGTA T
特异性引物：
P VanA 1：5‘-CGC AGC TTG CAT GGA CAA AT-3‘20bp
P VanA 2：5‘-CAC TCC AGC CAA CAC GCC AT--3‘20bp
特异性探针：
FP VanA：5‘---ATT GAT AAA GGT GAC AAG CCG GAG GC---3‘26bp
本发明扩增的VanB基因序列、引物、探针如下所示：
扩增特异性模板：
1 GTTTGTATTG TCTGGTATCC CCTATGTGGG CTGTGATATT
41 CAAAGCTCCG CAGCTTGCAT GGACAAATCA CTGGCCTACA
81 TTCTTACAAA AAATGCGGGC ATCGCCGTTC CCGAATTTCA
121 AATGATTGAT AAAGGTGACA AGCCGGAGGC GGGTGCGCTT
161 ACCTACCCTG TCTTTGTGAA G
P VanA 1：5‘-GTT TGT ATT GTC TGG TAT CCC CTA T-3‘25bp
P VanA 2：5‘-CGA ATG GAT GGG ACA GAA ACA CTT C-3‘25bp
特异性探针：
FP VanA：5‘---GCA GCT TGC ATG GAC AAA TCA CTG G---3‘26bp
Claims (7)
1、一种双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法以及试剂盒的组成，根据待测耐万古霉素肠球菌VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增待测两种万古霉素抗性基因的特异性核苷酸序列。本发明采用荧光双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长，波长1检测探针FPVanA标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanA阴性，Ct值小于36：VanA阳性；波长2检测探针FPVanB标记的荧光染料强度，Ct值0或大于37：VanB阴性，Ct值小于36：VanB阳性。本试剂盒针对耐万古霉素肠球菌而设计，具有特异性高、灵敏、抗污染、快速等特点，可准确、快速、特异、方便的检出耐万古霉素肠球菌，并能够准确判断其耐药的遗传学机制。按照权利要求1所述的双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法，其特征在于：所述双重实时荧光PCR扩增基因序列的反应体系为：
5xPCR缓冲液(mix) 8μl
P VanA(80pmol/μl) 0.5μl
P VanB(80pmol/μl) 0.5μl
FP VanA(60pmol/μl) 0.5μl
FP VanB(60pmol/μl) 0.5μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
UNG酶(0.1U/μl) 1μl
模板 2～5μl
ddH2O 26～29μl
总反应体积：40μl
5XPCR缓冲液组成成分：
250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl2、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uM dGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。
2、按照权利要求1所述双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法，其特征在于：
所述DNA提取液由两部分组成
DNA提取液1：20％PEG6000、1MNaCl、1％SiO2。
DNA提取液2：20mmol/LNaOH、10mmol/LTris-HCl(pH 8.0)、0.1mmol/L EDTA、1％TritonX-100和1％NP-40。
3、按照权利要求1所述双重实时荧光PCR检测耐万古霉素肠球菌试剂盒组成，其特征在于：根据临床肠球菌耐万古霉素的主要因素是VanA、VanB两种抗性基因引起的，我们分别选择VanA、VanB基因的保守序列设计两对引物、两条探针，其中探针分别标记不同荧光染料，采用互不干扰的两种波长进行荧光强度检测。两对引物、两条探针设计的Tm值接近，相差不到2℃。
4、按照权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述待测核酸是肠球菌抗性基因VanA，所述特异性核酸序列为：
1 GCAGCTTGCA TGGACAAATC ACTGGCCTAC ATTCTTACAA
41 AAAATGCGGG CATCGCCGTT CCCGAATTTC AAATGATTGA
81 TAAAGGTGAC AAGCCGGAGG CGGGTGCGCT TACCTACCCT
121 GTCTTTGTGA AGAGCAGGCT GTTTCGGGCT GTGAGGTCGG
161 TTGTGCGGTA T
5、按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于设计的引物、探针序列为：
特异性引物：
P VanA 1：5‘-CGC AGC TTG CAT GGA CAA AT-3‘20bp
P VanA 2：5‘-CAC TCC AGC CAA CAC GCC AT--3‘20bp
特异性探针：
FP VanA：5‘---ATT GAT AAA GGT GAC AAG CCG GAG GC---3‘26bp
7、按照权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述待测核酸是肠球菌抗性基因VanB，所述特异性核酸序列为：
1 GTTTGTATTG TCTGGTATCC CCTATGTGGG CTGTGATATT
41 CAAAGCTCCG CAGCTTGCAT GGACAAATCA CTGGCCTACA
81 TTCTTACAAA AAATGCGGGC ATCGCCGTTC CCGAATTTCA
121 AATGATTGAT AAAGGTGACA AGCCGGAGGC GGGTGCGCTT
161 ACCTACCCTG TCTTTGTGAA G
8、按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于设计的引物、探针序列为：
特异性引物：
P VanA 1：5‘-GTT TGT ATT GTC TGG TAT CCC CTA T-3‘25bp
P VanA 2：5‘-CGA ATG GAT GGG ACA GAA ACA CTT C-3‘25bp
特异性探针：
FP VanA：5‘---GCA GCT TGC ATG GAC AAA TCA CTG G---3‘26bp
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|---|---|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |