CN1810989A - 一种等温反应检测具序列特异性的dna和rna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种等温反应检测具序列特异性的DNA和RNA的方法，通过在特异探针中设计DNA切刻内切酶的识别位点，在DNA探针与目标序列杂交后，DNA切刻内切酶将探针切刻为两段，从而降低了其与目标序列结合的稳定性并与目标序列分离。目标序列因此能与另一完整探针再次杂交并被切刻内切酶切刻。如此循环。切刻下的小片段可应用凝胶电泳的方法、荧光识别仪、颜色变化、传感器、质谱、检验层析试条或微阵列系统来检测特定产物的存在。该方法可以在等温情况下使待检基因呈线性或指数增加，使反应在短时间内就能完成，因而具有快速、灵敏、特异、应用范围广等特点。可应用于包括动物、植物和微生物的基因检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体的说，是一种检测具序列特异性的DNA和RNA的方法。再具体的说，其涉及应用限制性内刻酶及寡核苷酸的片断检测具序列特异性的DNA和RNA的方法。
背景技术
具序列特异性的DNA和RNA的检测是基因诊断的基础。基因诊断，是20世纪70年代末迅速发展起来的一项利用现代分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA/RNA水平检测、分析基因的存在和结构、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法。传统的基因诊断概念也早已发展到全面的RNA诊断和DNA诊断，统称分子诊断。基因诊断的问世给整个诊断学带来了一次革命，使人们对疾病的认识从传统的临床诊断、生化学诊断、血清学诊断的表型诊断步入基因诊断的新阶段，应用分子生物学技术进行常见疾病的诊断已成为许多国家医疗机构的常规项目，也是衡量一个城市和地区整体医疗水平的重要指标。由于多数现有的基因诊断技术较复杂，需要专门仪器，非普通使用者能够使用。因此，基因诊断的广泛应用需要开发更加价廉且方便使用的产品。
目前多数基因诊断技术是通过对目标序列的扩增来实现其灵敏性的。大多数DNA合成是通过使用DNA聚合酶的酶学方法完成的。核酸扩增根据是否需要温度循环主要分为两类：一类是非等温扩增，如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)等；另一类是等温扩增，如链替代扩增(SDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)等。
引物引导下的核酸扩增技术是使用最多的方法。此类扩增技术多使用DNA聚合酶的酶学方法完成。其中，最广泛应用的酶学方法是聚合酶链反应(PCR)。PCR以线性DNA为模版进行复制反应。该反应需要：DNA模版(templates)，位于模版两端的引物(primers)，脱氧核糖核酸(dNTP)，耐热DNA聚合酶(thermal stable DNA polymerase)及适宜的反应条件(离子浓度和酸度)。PCR反应通常在温度循环器(thermolcycler)中进行，为PCR反应提供所需的高温，低温和中温阶段。每次三个阶段构成一个循环。PCR反应每经过一个循环，目标基因的数目就扩增一倍。这样，在经过N次循环后，一个目标基因分子就可能被扩增到2N个。PCR的优点就是可以检测微量的核酸。
核酸扩增技术的特点如下表：
| 扩增分类 | 特点 | 灵敏度(对样品的扩增倍数) | |||
| DNA扩增 | RNA扩增 | 微阵列上扩增 | |||
| 非等温扩增 | PCR | + | + | - | 20-30循环扩增到106倍 |
| LCR | + | - | - | 20-30循环扩增到106倍 | |
| 等温扩增 | SDA | + | + | + | 灵敏度高，快速扩增DNA分子 |
| NASBA | + | + | - | 3小时内扩增107倍 | |
| TMA | + | + | - | 常温30分钟扩增达109倍 | |
除了以PCR为代表的序列特异性扩增技术以外，基因诊断也常采用下面几种非扩增的特异性序列识别技术：
基因限制酶酶谱分析：当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，可以利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可做出分析诊断。
限制性片段长度多态性分析(RFLPs)：在人类基因组中，不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片段为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。但RFLP是对一特定酶切后DNA长度的分析，无法确定序列。同时，RFLP仅可用于对DNA进行分析，而不适于对RNA的分析。
等位基因特异寡核苷酸探针杂交法：这种方法可以用来检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。遗传疾病的遗传基础是基因序列中发生一种或多种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸；二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。该方法的优点是适用于DNA和RNA，也可反映目标序列的量。但由于无扩增机制，因而灵敏性较低。
荧光原位杂交技术(FISH)：这是一个强有力的基因评估工具，能对内层、外层细胞基因中的特定染色体畸变进行显微识别及定位。首先将细胞膜溶破，将细胞核固定在玻璃片上，再用探针进行FISH反应，然后配合荧光显微镜照相仪进行分析做出最后诊断。在临床主要用于检测染色体套数异常、染色体构造异常、受精卵内粒腺体之分布、核差别染色体评估胚胎的等级以及受精失败后，卵中精虫染色体形态的观察，还可用来进行膀胱肌瘤、乳房肿瘤、脑瘤的前期诊断。FISH是一个相当复杂的技术，因而较难普及推广应用。
发明内容
针对PCR等技术的反应条件要求苛刻的缺点，本发明的目的是提供一种在等温条件下检测具序列特异性的DNA和RNA的方法，它在无需价格昂贵的温度循环器及许多其它昂贵试剂的情况下，在等温条件下快速检测具序列特异性的DNA和RNA。
本发明所建立的在等温条件下的检测基因的方法，命名为RIDA(Rapid IsothermalDetection and Amplification)。
在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名内切酶(简称内切酶)。内切酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种内切酶，并且已经商品化，在基因工程中广泛使用。根据内切酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割(限制性内切酶)。这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在基因工程中使用的多数是后一类酶。限制酶在特定切割部位进行切割时，按照切割的方式，又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，切下后的两端形成一种回文式的单链末端，这个末端能与具有互补碱基的目标基因的DNA片段连结，故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
近几年来发现，生物体内存在着切刻内切酶(nicking enzyme)。该种核酸酶识别DNA双链或DNA-RNA杂合双链上的特异性识别位点，但仅“切刻”一条单链。以切刻内切酶N.BstNBI为例。该酶的识别位点为：
3’…CTCAGNNNNN…5’
在GAGTC3’后4个基切刻形成单链DNA的3’端。
本发明通过在特异探针中设计限制性切刻酶的识别位点，在DNA探针与目标序列杂交后，DNA内刻酶将探针切刻为两段，从而降低了其与目标序列结合的稳定性并与目标序列分离。目标序列因此能与另一完整探针再次杂交并被切刻酶切刻。如此循环。切刻下的小片段可应用凝胶电泳的方法，或荧光识别仪，或颜色变化，或传感器器(DNA/RNA sensor)，或质谱(LC-MS)，或检验层析试条(lateral flow)，或微阵列系统(microarray)来检测特定产物的存在。用RIDA方法检测目标序列，其关键的之处在于限制性内切酶的应用。该方法可以在等温情况下使待检基因呈线性或指数增加，使反应在短时间内就能完成，因而具有快速、灵敏、特异、应用范围广等特点。可应用于包括动物、植物和微生物的基因检测。
本发明所提供的检测具序列特异性的DNA和RNA的方法，包括以下两种技术方案：
第一种技术方案的特点如下：
设计单链DNA“报告探针”，所说的“报告探针”与目标基因序列的核酸切刻内切酶识别序列及及其周围序列部分互补，并可使切刻内切酶在报告探针切刻；
按以下步骤进行目标基因检测：
1.1、在待检测样品的DNA或RNA中加入“报告探针”及切刻内切酶，“报告探针”与含有切刻内切酶识别序列的目标基因序列杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段，在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与目标基因脱离，成为5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
1.2、与被切刻的“报告探针”分离的目标基因，又与另一完整的“报告探针”杂交，重复1.1所述反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
1.3、通过检测产生的3’部分“报告探针”和/或5’部分“报告探针”显示是否有目标基因序列存在。
第二种技术方案的特点如下：
设计以下探针，包括：
单链DNA“捕获探针”，所说的“捕获探针”不仅对待检测的目标基因序列有碱基互补特异性，而且与介质(生物素，微珠，玻片，滤纸，等等)连接；
单链DNA“核验探针”，所说的“核验探针”一部分对待检测的目标基因的另一段序列(有别于“捕获探针”互补序列)有碱基互补特异性，另一部分包含核酸切刻内切酶识别序列及两边的非特异性序列；
单链DNA“报告探针”，所说的“报告探针”与“核验探针”的核酸切刻内切酶识别序列及其周围序列部分互补，并可使切刻内切酶在报告探针切刻；
如图2所示，按以下步骤进行目标基因检测：
2.1、将固定于介质上的“捕获探针”与待检测样品的DNA或RNA混合，使“捕获探针”与目标基因杂交，未被“捕获探针”捕获的DNA或RNA经洗涤等方式与被捕获的序列分离；
2.2、加入“核验探针”，如果被捕获得到的是目标基因，“核验探针”的一部分将与目标基因的另一部分序列杂交，形成“捕获探针-目标基因-核验探针复合体”，未与目标基因杂交的核验探针通过洗涤与“捕获探针-目标基因-核验探针复合体”分离；
2.3、加入“报告探针”和切刻内切酶，“报告探针”与“核验探针”杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段，在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与“核验探针”脱落，成为5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
2.4、与被切刻的“报告探针”分离的“核验探针”又与另一完整的“报告探针”杂交，重复2.3所述反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
2.5、通过检测产生的3’部分“报告探针”和/或5’部分“报告探针”显示是否有目标基因序列存在。
在本发明技术方案中，还可通过再设计及应用一种单链DNA“复制探针”来进一步提高检测的灵敏度，所说的“复制探针”的5’端与3’端包含与3’部分“报告探针”序列互补，且中间包含切刻内切酶识别序列和间隔序列；
“复制探针”的应用方法是：
对于第一种技术方案，在步骤1.1同时加入所说的“复制探针”和DNA复制酶，以3’部分“报告探针”为引物，以“复制探针”为模版，在DNA聚合酶的催化下，合成双链DNA，该双链DNA包含有切刻内切酶识别位点并由切刻内切酶切刻产生更多的3’部分“报告探针”，从而提高灵敏度。
对于第二种技术方案，在步骤2.3同时加入所说的“复制探针”和DNA聚合酶，以3’部分“报告探针”为引物，以“复制探针”为模版，在DNA聚合酶的催化下，合成双链DNA，该双链DNA包含有切刻内切酶识别位点并由切刻内切酶切刻产生更多的3’部分“报告探针”，从而提高灵敏度。
可以通过设计具有荧光或生物素标记的“报告探针”，来达到快速检测的目的。
例如，“报告探针”的一端用荧光染料标记，另一端由荧光淬灭染料标记。由于在完整的“报告探针”中荧光标记与淬灭染料相距较近，荧光被淬灭染料淬灭，故无荧光发出。
“报告探针”探针与互补序列结合后，“报告探针”被切刻酶切为两段并从目标基因上分离，荧光染料和淬灭染料也因此分离。荧光染料发出荧光。荧光及其强弱可由荧光检测器检测。
在本发明所述的各种技术方案中：可以通过荧光识别仪、质谱、凝胶电泳、分子夹、序列分析、DNA/RNA传感器、检验层析试条、微阵列系统或变色反应等方式检测产生的3’部分“报告探针”和/或5’部分“报告探针”。
本发明所述的方法，除了作为检测具序列特异性的DNA和RNA的应用外，还可作为筛选具有新的切刻识别位点或切刻活性的切刻内切酶的应用。
本发明提供了一个新型的等温特异性序列检测和信号放大的方法。其具有以下特点：第一，扩增的目标序列即可以是DNA也可以是RNA，同时还可在微阵列等介质上完成反应。第二，反应过程十分简单，比起RCA等其它等温扩增过程来说，反应过程中不需要反复的更换反应体系，只需将特定探针、切刻内切酶加入到含有目标序列的反应体系中温育一段时间即可。第三，反应过程快速、特异，只需5-30分钟。第四，反应检测手段多样化，即可通过电泳来检测特异性条带，也可通过荧光探针来实时检测反应的进程。
附图说明
图1为本发明第一种技术方案的检测反应步骤流程示意图；
图2为本发明第二种技术方案的检测反应步骤流程示意图；
图3为本发明使用“复制探针”的检测反应步骤流程示意图；
图4为本发明第一种技术方案中使用具有荧光标记的“报告探针”的检测反应步骤流程示意图；
图5为本发明第一种技术方案运用荧光标记“报告探针”并针对DNA的检测结果；
图6为本发明第一种技术方案运用荧光标记“报告探针”并针对RNA的检测结果；
图7为本发明第二种技术方案；运用“捕获探针”，“核验探针”及“报告探针”检测人巨细胞病毒(HCMV)DNA的结果；
图8为运用“复制探针”对3’部分“报告探针”扩增并运用聚凝脂胶对扩增产物检测结果；
图9为运用“复制探针”对3’部分“报告探针”扩增并运用质谱对扩增产物检测结果。
以下为对上述各图的说明：
在图1-4中，1表示目标单链DNA或RNA序列；2表示捕获探针；3表示介质；4表示核验探针；5表示报告探针；6表示复制探针；7表示切刻酶识别序列；8表示切刻内切酶识别位点；9表示5’部分报告探针；10表示3’部分报告探针；11表示荧光染料标记；12表示荧光淬灭染料标记。
对图1的A-D的图示过程说明如下：
A-B：含有切刻酶识别序列7的“报告探针”5与含有切刻内切酶识别序列的目标基因序列1杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点8；C：该切刻内切酶识别位点8可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段；D：在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与目标基因1脱离，成为5’部分“报告探针”9和3’部分“报告探针”10；目标基因1又与另一完整的“报告探针”杂交，重复A-C的反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”。
对图2的A-E的图示过程说明如下：
A-C：固定在介质3上的“捕获探针”2与目标基因1杂交，“核验探针”4的一部分与目标基因1的另一部分序列杂交，形成“捕获探针-目标基因-核验探针复合体”；D-E：“报告探针”5与“核验探针”4杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点8，该位点仅可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段，在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与“核验探针”4脱离，成为5’部分“报告探针”9和3’部分“报告探针”10；与被切刻的“报告探针”分离的“核验探针”4，又与另一完整的“报告探针”杂交，重复C-E所述反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”.
对图3的A-D的图示过程说明如下：
A-B：以图1的D步骤及图2的E步骤中产生的3’部分“报告探针”10为引物，以“复制探针”6为模版，在DNA聚合酶的催化下，合成双链DNA；C：该双链DNA包含有切刻内切酶识别位点8并由切刻内切酶切刻产生更多的3’部分“报告探针”；D：在此反应温度下，新产生的3’部分“报告探针”将从“复制探针”6脱离并成为引物重复A-C的反应。
对图4的A-D的图示过程说明如下：
A-B：含有切刻酶识别序列7的“报告探针”5与含有切刻内切酶识别序列的目标基因序列1杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点8，其“报告探针”5的5’一端有荧光染料标记11，3’一端有荧光淬灭染料标记12；C：该切刻内切酶识别位点8可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段；D：在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与目标基因1脱离，成为有荧光染料标记11的5’部分“报告探针”和有荧光淬灭染料标记12的3’部分“报告探针”；目标基因1又与另一完整的“报告探针”杂交，重复A-C的反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”。
具体实施方式
以下通过应用RIDA方法检测HCV病毒对本发明的具体实施细节作进一步的说明。
丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎和肝硬化的主要病原体之一，感染率一般在0.5％～2.0％之间，我国为3.2％。感染者的肝病程度和治疗效果存在较大差异。究其原因，由于HCV复制时所依赖的多聚酶缺乏校对功能，加上其本身为适应环境和逃避宿主的免疫监视作用而易发生突变，所以HCV的基因型的改变是导致这些差异的主要因素之一。HCV为单股正链RNA病毒，其全基因序列已基本被阐明，全长9416bp，由编码区(9030bp)，5’-非编码区(332bp)和3’-非编码区(54bp)组成。结构基因分为C区、M区和E区，分别编码核心(core)蛋白、内膜(menbrane)蛋白和囊膜(envelope)蛋白。非结构蛋白分别为NS1、NS2、NS3、NS4和NS5，而我们的检测是针对其NS3的保守序列进行的，因而可以达到检测的要求。
我们先后针对HCV-RNA病毒基因的一段特异区域相对应的cDNA和RNA序列进行检测。以下为检测过程的实施例。
实施例一：本发明第一种技术方案针对DNA的检测
实施例一的目的在于演示RIDA对DNA目标基因检测的可行性及其灵敏性。本方法检测过程如图1及图3所示。“目标基因序列”(T-1)是和HCV的RNA病毒基因的一段特异区域相对应的DNA序列。根据该目标基因序列，设计一单链DNA“报告探针”(0-1)。在T-1的5′计一个N.BstNBI识别序列，并且5’末端用6-FAM(6-羧基-荧光素，报告染料)标记，在3’末端用TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明，淬灭剂染料)标记，在下述反应条件下，0-1和T-1结合，在N.BstNBI酶作用下，0-1被切刻开来，从而发出荧光，通过荧光定量PCR仪(MJR Chromo4)实现对反应产物的实时动态检测.
以下为T-1和0-1反应结合的形式：
5′-GCTCGCTGCATAGCTGTCATCCCTCGGACTCACACGCT-3′目标基因(T-1)
|||||||||||||||||||||
3′CGACAGTAGGGAGC
CTGAGT 5′ 报告探针(O-1)
↑
N.BstNI切刻位点
检测步骤：
(1)、在25ul反应体系中分别加入不同摩尔浓度的T-1和2uM O-1，2.5μl 10×NEB 3号缓冲液(New England Biolabs)，5个单位N.BstNI酶(New England Biolabs)
(2)、在荧光定量PCR仪(MJ Research，Chromo4)上，55℃反应15分钟，读板1次/1分钟。
结果如图5所示。
实施例二：本发明第一种技术方案针对RNA的检测
实施例一的目的在于演示RIDA对RNA目标基因检测的可行性及其特异性。为此，化学合成了4条RNA，其序列如下：
T-1RNA： 5′GCUCGCUGCAUAGCUGUCAUCCCUCGGACUCAACGCU 3′
T-1RNA-A：5′GCUCGCUGCAUAG
GUGUCAUCCCUCGGACUCAACGCU 3′
T-1RNA-B：5′GCUCGCUGCAUAGCUGUCAUC
GCUCGGACUCAACGCU 3′
T-1RNA-C：5′GCUCGCUGCAUAGCUGU
GAUCCCUCGGACUCAACGCU 3′
其中，T-1RNA-A、B、C仅于T-1RNA相差一个碱基(下横“_”所示)。T-1RNA与“报告探针”O-1互补，因而可用O-1检测。
检测步骤：
(1)20ul反应体系的组成：
| 10M目标序列T-1RNA | 1μl |
| 10M报告探针O-1 | 2μl |
| 10X NEB3号反应液 | 2μl |
| 去离子水 | 14.7μl |
| N.NBstNI切刻内切酶 | 0.3μl |
(2)、在荧光定量PCR仪(MJ Research，Chromo4)上，55℃反应20分钟，读板1次/1分钟。结果如图6。
实施例三：本发明第二种技术方案；运用“捕获探针”，“核验探针”及“报告探针”检测人巨细胞病毒(HCMV)DNA。
所检测的目标序列选用HCMVUL89基因的编码序列。其序列如下(Genebank号：AF047525)：
1 gttggtgttg tagcaactgg caaaaagcgc cgtgctcttg gcgccgcggt ggtcgatgct
61 gatcacgttg tccttgttct cgaccacgta gtcgcgcgcg aaggtgtggc ggcagcggaa
121 ctcgacctct ttgagcacaa actgcgacac gtgcttttgg tgcgccacgt agccgatgct
181 gatgccgatc atgtgcttaa gcagaaacga gataatgggg atgatgaacc aagtcttgcc
241 gtgacgtcgc ggcaccagga acacggtggc tttctgctta aagatgtcga tggaggtctg
301 cgagagg
aag tcgatctgga aggcgtggat gaggta
ctgc agcacgcgat tggccagcac
反向捕获探针目标序列 正向捕获探针目标序列
361 ggggatcttg gtcacggcta taaaaaagat gacgtgtatc aataaattct tttgaaacgg
421 ttcgagtcgg atggcttttg cgtcgccctc gacggcggta ctgaagccgc cgtcgagcca
481 ctttttaaag tcggtcatga agttgttgat ctgctgaaac tgcggatcgc ggtagagctc
541 ggtcaacgcg tccagcttct ggtaggaggc gcgctgctcc tcggagcacg ggcgaaacgt
601 cagttcatcg agcgcgctct tgaggcgctc gtgaaacagc agctcgcgct
ggctttcctc
反向验核探
661
gggcgagttg tagtcg
cggt ggcggccgca gaaggccatg agcggcagga aggcctcgtt
针目标序列 正向验核探针目标序列
721 gcacgagtgg gccagcccga gttcggggtg catcatctgg tagcgcttgc ggcacagcgc
781 cgccacattg gtgaaggccg tggagatgca ggaggtgggg tggctcttgc gcttctgcag
841 ctccgcgtag cgctcctgga tcttggcggc cgagtctccg cgcaacat
为了能提高检测的灵敏性，设计了针对正向序列和反向序列的捕获及验核探针。同时，正向探针也可以同时检测UL89的RNA。
正向捕获探针：
5’Biotin-CAGTTTTTT
GTGCTGGCCAATCGCGTGCTGCAG3’
反向捕获探针：
5’Biotin-CAGTTTTTT
AAGTCGATCTGGAAGGCGTGGATG 3’
正向验核探针：
5’GCTGTCATCCCTCGGACTCAAA
GCATGGCCTTCTGCGGCCGCCACCG 3’
反向验核探针：
5’GCTGTCATCCCTCGGACTCAAA
GGCTTTCCTCGGGCGAGTTGTAGT 3’
如图3所示，检测以如下方法进行：
(1)UL89基因序列的克隆：
HCMV UL89基因序列由HCMV(Towne)基因组文库中扩增并克隆于pcDNA3质粒载体中。
(2)带捕获探针的微珠的处理：
1.取100μl链霉亲和素包被的琼脂糖微珠，加入500μl TE缓冲液，离心去上清，重复2遍
2.加入20μl的捕获探针，在终浓度为1M Nacl，10mMTris.cl，1mMEDTA中杂交20分钟，离心去上清，加入500μl TE缓冲液，离心去上清，重复2遍。
3.取包被有捕获探针的微珠40μl，加入100μl的Church缓冲液(pH7.2的磷酸氢钠缓冲液，1mM EDTA，1％的小牛血清蛋白，7％的SDS)，在68℃预杂交30分钟后，离心去上清，加入500μl TE，离心去上清，重复2遍
(3)杂交：
取40μl预杂交的带有捕获探针的微珠，用40μlTE悬浮，分在4个离心管中，每管10μl杂交体系：
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | |
| 带捕获探针的微珠 | 10μl | 10μl | 10μl |
| 目标DNA | ---- | pcDNA3(HindIII)5μg | pcDNA3-UL89(HindIII)5μg |
| 验核探针(1μM) | 5μl | 5μl | 5μl |
| 20X SSPE | 4μl | 4μl | 4μl |
| 去离子水 | 21μl | 16μl | 16μl |
在50℃杂交90分钟后，加入200μl TE，离心去上清，重复6遍，最后样品悬浮在10μl的去离子水中
(4)、RIDA：
反应体系：
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | |
| 反应样品 | 来自杂交体系中的样品1 10μl | 来自杂交体系中的样品2 10μl | 来自杂交体系中的样品3 10μl |
| 报告探针(10μM) | 2μl | 2μl | 2μl |
| 10X反应缓冲液 | 2μl | 2μl | 2μl |
| 0.1％BSA | 2μl | 2μl | 2μl |
| ddH2O | 4μl | 4μl | 4μl |
| N.BstNI切刻内切酶 | 0.3μl l | 0.3μl | 0.3μl |
反应于50℃下完成。
实验结果如图7，该图中：
曲线A代表：进行RIDA反应的样品3
曲线B代表：进行RIDA反应的样品2
曲线C代表：进行RIDA反应的样品1
实施例四：运用“复制探针”对3’部分“报告探针”扩增并运用聚凝脂胶及质谱对扩增产物检测。
在实施例三的RIDA反应体系中，加入“复制探针”，2单位BstDNA聚合酶及2.5mMdNTP，在50℃下反应30分钟。
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | |
| 来自杂交体系中的样品1 | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| 复制探针(10μM) | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
| 10X反应缓冲液 | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
| 0.1％BSA | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
| ddH2O | 4μl | 3.8μl | 3.7μl | 3.5μl |
| N.BstNI切刻内切酶 | 0 | 0 | 0.3μl | 0.3μl |
| Bst DNA聚合酶 | 0 | 0.2μl | 0 | 0.2μl |
“复制探针”序列：
5’GCTGTCATCCCGCTGACTCGCTGTCATCCC
反应产物以1.5％聚凝脂胶检测，结果如图8所示：1-4各反应体系中加入DNA聚合酶和切刻内切酶的情况如下：1为无DNA聚合酶，无切刻内切酶；2为有DNA聚合酶，无切刻内切酶；3为无DNA聚合酶，有切刻内切酶；4为有DNA聚合酶，有切刻内切酶；5为DNA ladder.箭头所示为3’部分“报告探针”。
反应产物用质谱检测，结果如图9所示：A-D各反应体系中加入DNA聚合酶和切刻内切酶的情况如下：A为无DNA聚合酶，无切刻内切酶；B为有DNA聚合酶，无切刻内切酶；C为无DNA聚合酶，有切刻内切酶；D为有DNA聚合酶，有切刻内切酶。箭头所示为3’部分“报告探针”。
Claims (7)
1.一种等温反应检测目的基因方法，在恒温条件下探针与目标基因结合，后通过切刻内切酶作用来检测目的基因，其特征在于：
设计单链DNA“报告探针”，所说的“报告探针”与目标基因序列的核酸切刻内切酶识别序列及及其周围序列部分互补，并可使切刻内切酶在报告探针切刻；
按以下步骤进行目的基因检测：
1.1、在待检测样品的DNA或RNA中加入“报告探针”及切刻内切酶，“报告探针”与含有切刻内切酶识别序列的目标基因序列杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段，在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与“核验探针”脱落，成为5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
1.2、被切刻的“报告探针”分离的目的基因，又与另一完整的“报告探针”杂交，重复1.1所述反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
1.3、通过检测产生的3’部分“报告探针”和/或5’部分“报告探针”显示是否有目的基因序列存在。
2.根据权利要求1所述的等温反应检测目的基因方法，其特征在于还设计了单链DNA“复制探针”，所说的“复制探针”的5’端与3’端包含与3’部分“报告探针”序列互补，且中间包含切刻内切酶识别序列和间隔序列；在步骤1.1同时加入所说的“复制探针”和DNA复制酶，以3’部分“报告探针”为引物，以“复制探针”为模版，在DNA聚合酶的催化下，合成双链DNA，该双链DNA包含有切刻内切酶识别位点并由切刻内切酶切刻产生3’部分“报告探针”。
3.一种等温反应检测目的基因方法，在恒温条件下探针与目标基因结合，后通过切刻内切酶作用来检测目的基因，其特征在于：设计以下探针，包括：
单链DNA捕获探针，所说的捕获探针不仅对待检测的目的基因序列有碱基互补特异性，而且与介质连接；
单链DNA“核验探针”，所说的“核验探针”一部分对待检测的目的基因的另一段序列有碱基互补特异性，另一部分包含核酸切刻内切酶识别序列及两边的非特异性序列；
单链DNA“报告探针”，所说的“报告探针”与核验探针的核酸切刻内切酶识别序列及及其周围序列部分互补，并可使切刻内切酶在报告探针切刻；
按以下步骤进行目的基因检测：
3.1、将固定于介质上的“捕获探针”与待检测样品的DNA或RNA混合，使“捕获探针”与目的基因杂交，未被“捕获探针”捕获的DNA或RNA经洗涤等方式与被捕获的序列分离；
3.2、加入“核验探针”，如果被捕获得到的是目的基因，“核验探针”的一部分将与目的基因的另一部分序列杂交，形成“捕获探针-目的基因-核验探针复合体”，未与目的基因杂交的核验探针通过洗涤与“捕获探针-目的基因-核验探针复合体”分离；
3.3、加入“报告探针”和切刻内切酶，“报告探针”与“核验探针”杂交后两识别序列结合形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在“报告探针”链切刻，形成两段较短的片段，在此反应温度下，短片段形成的双链不稳定，会与“核验探针”脱落，成为5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
3.4、与被切刻的“报告探针”分离的目的基因，又与另一完整的“报告探针”杂交，重复1.4所述反应，产生新的5’部分“报告探针”和3’部分“报告探针”；
3.5、通过检测产生的3’部分“报告探针”和/或5’部分“报告探针”显示是否有目的基因序列存在。
4.根据权利要求3所述的等温反应检测目的基因方法，其特征在于还设计了单链DNA“复制探针”，所说的“复制探针”的5’端与3’端包含与3’部分“报告探针”序列互补，且中间包含切刻内切酶识别序列和间隔序列；在步骤3.3同时加入所说的“复制探针”和DNA复制酶，以3’部分“报告探针”为引物，以“复制探针”为模版，在DNA聚合酶的催化下，合成双链DNA，该双链DNA包含有切刻内切酶识别位点并由切刻内切酶切刻产生3’部分“报告探针”。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于所设计的“报告探针”具有荧光或生物素标记。
6.根据权利要求1至4任一项的所述的方法，其特征是：通过荧光识别仪、质谱、凝胶电泳、分子夹、序列分析、DNA/RNA传感器、检验层析试条、微阵列系统或变色反应方式检测产生的3’部分“报告探针”和/或5’部分“报告探针”。
7.根据权利要求1至4任一项的所述的方法，其特征是：作为筛选具有新的切刻识别位点或切刻活性的切刻内切酶的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510036871 CN1810989B (zh) | 2005-08-31 | 2005-08-31 | 一种等温反应检测具序列特异性的dna和rna的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN 200510036871 CN1810989B (zh) | 2005-08-31 | 2005-08-31 | 一种等温反应检测具序列特异性的dna和rna的方法 |
Publications (2)
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