CN1300337C - 一种细胞因子基因型检测芯片及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测TNF和IL-6基因型的基因芯片，包含该基因芯片的试剂盒和使用该芯片或试剂盒检测TNF和IL-6基因型的方法。本发明的产品和方法可用于检测上述基因的基因型，为预测与上述基因有关的疾病发生危险提供必要信息，同时也为相关药物的开发和评价提供必要手段。
Description
(一)技术领域
本发明涉及基因分析检测产品，具体地说是基因检测芯片，更具体的说是适用于检测肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL-6)基因型的基因检测芯片。本发明还涉及检测TNF和IL-6基因型的方法。
(二)背景技术
本世纪80年代以来，随着分子生物学的飞速发展，对TNF、IL-6研究不断深入，人们发现其具有多种生物学活性，除对免疫细胞有活化、促增殖和分化等作用外，对某些非肿瘤细胞和大多数肿瘤细胞具有诱导凋亡(Apoptosis)的作用。当机体处于炎症如病毒、细菌、寄生虫感染，或创伤等病理状态时，这些作用对清除受损细胞、维持机体内环境平衡，起着重要的作用。而TNF和IL-6基因型不同，肿瘤坏死因子、白介素6等细胞因子的分泌量明显不同，这对医学研究和新药开发、评价以及个体化治疗等具有重要意义(Anesth Analg 2003；97：944-949)。因此对检测TNF和IL-6基因型方法的研究备受关注。但目前测定TNF和IL-6基因型的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法，不仅操作繁琐，检测周期长，而且影响检测结果的因素多，不易控制，难以满足实际应用的要求，使药物研究单位和临床至今还无法广泛开展有关TNF和IL-6基因型的检测。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验，就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态性检测等方面的应用受到广泛重视。用基因芯片检测TNF和IL-6基因型，发挥基因芯片检测操作简单、结果准确的特点，对于药物研究单位和临床的相关应用具有重要的现实意义。
(三)发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL-6)基因型的基因检测芯片。
本发明提供一种用基因检测芯片检测肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL-6)基因型的检测方法
本发明提供的基因芯片，包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含以下序列或其互补序列中的包括TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)突变位点在内的14-20个连续核苷酸：
TNF-α/-308G：ataggttttgaggggcatgGggacggggttcagcctcca
(SEQ ID NO：1)
TNF-α/-308A：ataggttttgaggggcatgAggacggggttcagcctcca
(SEQ ID NO：2)
TNF-α/-238G：cagaagacccccctcggaatcGgagcagggaggatggggagt
(SEQ ID NO：3)
TNF-α/-238A：cagaagacccccctcggaatcAgagcagggaggatggggagt
(SEQ ID NO：4)
IL-6/-597G：aactgcacgaaatttgaggGtggccaggcagttctacaac
(SEQ ID NO：5)
IL-6/-597A：aactgcacgaaatttgaggAtggccaggcagttctacaac
(SEQ ID NO：6)
IL-6/-572G：ccaggcagttctacaacagccGctcacagggagagccagaac
(SEQ ID NO：7)
IL-6/-572C：ccaggcagttctacaacagccCctcacagggagagccagaac
(SEQ ID NO：8)
IL-6/-174G：cttttccccctagttgtgtcttgcGatgctaaaggacgtcacatt
(SEQ ID NO：9)
IL-6/-174C：cttttccccctagttgtgtcttgcCatgctaaaggacgtcacatt
(SEQ ID NO：10)
为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，所述TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)突变位点序列中大写字母表示的碱基最好位于所述探针的中部。
所述探针还可以在其5′端包含一段氨基修饰的16聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)。
所述固相支持物可采用各种基因芯片领域的常用材料，如但不限于尼龙膜，经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
上述修饰的玻片或硅片的活性基团如但不限于醛基、氨基、异硫氰酸基等，优选醛基修饰的玻片或硅片。
本发明基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5′端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.Derisi，V.R.Iyer，P.O.Brown.Exploring themetablic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997，278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明还提供了一种非以诊断为目的检测TNF-α和IL-6基因型的方法，包括以下步骤：
(1)制备染色体DNA；
(2)用聚合酶链反应(PCR)方法扩增TNF和IL-6基因中包含TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)等的基因片段；
(3)标记上述扩增产物；
(4)将上述标记的扩增产物与基因芯片杂交；
(5)检测基因芯片的杂交信号。
制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法有很多，可以从全血中制备、也可以从发根中制备，还可以从口腔粘膜的脱落物中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺，苏明权主编.《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术。其中的关键在于引物设计，有关引物设计的方法、软件均可以从商业途径获得。本发明涉及的TNF和IL-6基因的扩增引物和体系可根据以上方法及有关文献(KB穆里斯，F.费里，R.吉布斯等主编《PCR聚合酶链式反应》，科学出版社)方法由使用者独立完成。
对扩增产物进行标记可以通过采用5′端带标记基团的引物进行扩增的方法，也可通过在扩增过程中掺入带标记基团的单核苷酸的方法加以实现，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年；马立人，蒋中华主编，《生物芯片》，北京：化学工业出版社，2000，1-130。
扩增产物的变性可采用常规变性方法如加热至94～98℃，并保温2～10min，然后迅速置冰上。
取适量变性的扩增产物加入杂交缓冲液中与基因芯片杂交。与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年。
然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲合素或链亲合素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可以直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
本发明还提供一种用于检测TNF和IL-6基因型的试剂盒，该试剂盒包含本发明所说的基因芯片和使用说明书，使用说明书包含非以诊断为目的检测TNF-α和IL-6基因型的方法及上述现有技术的相关内容。
本发明提供的基因芯片及其试剂盒，可用于检测TNF和IL-6基因型，这对于药物研究单位和临床有针对性的治疗等相关应用提供了一种简便易行的解决方案。
(四)附图说明
图1：本发明基因芯片上的一种点样列阵；
图2：用本发明基因芯片检测TNF和IL-6基因型所得结果的照片。
(五)具体实施方式
以下实施例是对本发明的更详细的说明，而不是对本发明范围的限定。
实施例1：基因芯片的制备
(1)购置醛基修饰的载玻片(产品编号：BSM03011，上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)以下探针，用水溶解成(100pmol/ul)浓度，然后用2×点样buffer(产品编号：BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接着，用Affymetrix公司的GMS417点样仪按说明书所述方法点制如图1的阵列。然后室温放置过夜。
其中各探针序列为：
TNF-α/-308G：NH2-5’-tttttttttttttttt-cccgtccCcatgcc-3’(14聚)
(SEQ ID NO：11)
TNF-α/-308A：NH2-5’-tttttttttttttttt-cccgtccTcatgccc-3’(15聚)
(SEQ ID NO：12)
TNF-α/-238G：NH2-5’-tttttttttttttttt-cctgctcCgattccga-3 (16聚)
(SEQ ID NO：13)
TNF-α/-238A：NH2-5’-tttttttttttttttt-ccctgctcTgattccga-3 (17聚)
(SEQ ID NO：14)
IL-6/-597G：NH2-5’-tttttttttttttttt-aaatttgaggGtggccag-3’(18聚)
(SEQ ID NO：15)
IL-6/-597A：NH2-5’-tttttttttttttttt-aatttgaggAtggccagg-3’(18聚)
(SEQ ID NO：16)
IL-6/-572G：NH2-5’-tttttttttttttttt-caacagccGctcacagg-3’(17聚)
(SEQ ID NO：17)
IL-6/-572C：NH2-5’-tttttttttttttttt-caacagccCctcacagg-3’(17聚)
(SEQ ID NO：18)
IL-6/-174G：NH2-5’-ttttttttttttttaa-tgtgtcttgcGatgctaaag-3’(20聚)
(SEQ ID NO：19)
IL-6/-174C：NH2-5’-ttttttttttttttaa-tgtgtcttgcCatgctaaag-3’(20聚)
(SEQ ID NO：20)
实施例2：染色体DNA的制备
取待检者全血500μl，用一次性无菌注射针头抽取，收集于含50ul的2％EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，将管盖盖上，上下颠倒数次，使混匀。取无菌的1.5ml离心管，向其中加入混匀的待检全血100μl和纯水300μl，充分混匀，室温静置8分钟；将离心管置离心机中，6000g离心1分钟；取出离心管，倾去上清液，离心管底部可见少量白色沉淀；向离心管中加入抽提液(产品编号：BST01010，上海百傲科技有限公司)60μl，充分振荡使沉淀溶解；沸水浴中15分钟；取出离心管，置离心机中，12,000g离心15分钟。离心后上清液可直接用于PCR扩增。
实施例3：用PCR方法扩增HLA-B基因片段
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物：
TNF上游引物：Biotin-5’-tccctccaaccccgttttct-3’
TNF下游引物：5’-catctggaggaagcggtagtgg-3’
IL-6上游引物：5’-cacactccacctggagacgcc-3’
IL-6下游引物：5’-Biotin-agcgggtggggctgattgga-3’
然后用水溶解并稀释至10pmol/μl。将购置的Taq酶(产品编号：Lot，CE 1101-1，TaKaRa)、10×缓冲液(产品编号：Lot，A2401-2，TaKaRa)、dNTP(产品编号：D0056，上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方配制PCR扩增体系：
| 反应体系 | 体积(μl) |
| 10×缓冲液 | 2.5 |
| dNTP(各2.5mM) | 2.5 |
| 引物1(10pmol/ul) | 1 |
| 引物2(10pmol/ul) | 1 |
| Taq酶(2.5U/ul) | 0.8 |
| H2O | 14.2 |
| 模板 | 3 |
| 总体积 | 25μl |
用PCR扩增仪Tc-25/H(杭州大和热磁电子有限公司)按以下程序扩增：94℃，5min，然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40个循环，最后72℃5min。
实施例4：PCR产物与基因芯片的杂交
采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行此杂交试验。所述芯片杂交试剂盒(产品编号：BST05010，上海百傲科技有限公司)包含：预杂交液，杂交缓冲液，洗液1，反应舱。所述芯片显色试剂盒(产品编号：BST06010，上海百傲科技有限公司)包含：抗体液，洗液2，洗液3，显色液。
(1)将实施例1的基因芯片用预杂交液预杂交5min，然后除去预杂交液。芯片的预杂交温度为39℃。
(2)将实施例3获得的PGR扩增产物混合后先98℃变性5min，然后取10μl加至190μl杂交缓冲液中混匀，与预杂交完毕的基因芯片进行30分钟杂交反应，杂交温度为39℃。
(3)将杂交完毕的基因芯片用已预热至杂交温度的洗液1洗两次，每次10分钟；
(4)然后用洗液2室温洗2分钟；
(5)将基因芯片与抗体液室温反应20分钟；
(6)然后将基因芯片用洗液2室温洗5分钟，再重复此步骤一次；再用洗液3室温洗2分钟。
(7)在基因芯片上加显色液200μl，39℃放置40分钟。然后用水冲洗干净，晾干。
实施例5：基因芯片杂交信号的检测
将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪(BSE01021，上海百傲科技有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果。结果表明受检者的TNF和IL-6基因型为：TNF-α/-238G/A，TNF-α/-308G，IL-6/-174C，IL-6/-572G，IL-6/-597G。检测结果经测序结果验证完全符合。
序列表
<110>济南市中心医院
<120>一种细胞因子基因型检测芯片及其用途
<140>
<141>
<160>20
<170>Patent In3.1
<210>1
<211>39
<212>DNA
TNF-α/-308G：ataggttttg aggggcatgg ggacggggtt cagcctcca 39
<210>2
<211>39
<212>DNA
TNF-α/-308A：ataggttttg aggggcatga ggacggggtt cagcctcca 39
<210>3
<211>42
<212>DNA
TNF-α/-238G：cagaagaccc ccctcggaat cggagcaggg aggatgggga gt 42
<210>4
<211>42
<212>DNA
TNF-α/-238A：cagaagaccc ccctcggaat cagagcaggg aggatgggga gt 42
<210>5
<211>40
<212>DNA
IL-6/-597G：aactgcacga aatttgaggg tggccaggca gttctacaac 40
<210>6
<211>40
<212>DNA
IL-6/-597A：aactgcacga aatttgagga tggccaggca gttctacaac 40
<210>7
<211>42
<212>DNA
IL-6/-572G：ccaggcagtt ctacaacagc cgctcacagg gagagccaga ac 42
<210>8
<211>42
<212>DNA
IL-6/-572C：ccaggcagtt ctacaacagc ccctcacagg gagagccaga ac 42
<210>9
<211>45
<212>DNA
IL-6/-174G：cttttccccc tagttgtgtc ttgcgatgct aaaggacgtc acatt 45
<210>10
<211>45
<212>DNA
IL-6/-174C：cttttccccc tagttgtgtc ttgccatgct aaaggacgtc acatt 45
<210>11
<211>30
<212>DNA
TNF-α/-308G：NH2-5’-tttttttttt ttttttcccg tccccatgcc-3’
<210>12
<211>31
<212>DNA
TNF-α/-308A：NH2-5’-tttttttttt ttttttcccg tcctcatgcc c-3’
<210>13
<211>32
<212>DNA
TNF-α/-238G：NH2-5’-tttttttttt ttttttcctg ctccgattcc ga-3
<210>14
<211>33
<212>DNA
TNF-α/-238A：NH2-5’-tttttttttt ttttttccct gctctgattc cga-3
<210>15
<211>34
<212>DNA
IL-6/-597G：NH2-5’-tttttttttt ttttttaaat ttgagggtgg ccag-3’
<210>16
<211>34
<212>DNA
IL-6/-597A：NH2-5’-tttttttttt ttttttaatt tgaggatggc cagg-3’
<210>17
<211>33
<212>DNA
IL-6/-572G：NH2-5’-tttttttttt ttttttcaac agccgctcac agg-3’
<210>18
<211>33
<212>DNA
IL-6/-572C：NH2-5’-tttttttttt ttttttcaac agcccctcac agg-3’
<210>19
<211>36
<212>DNA
IL-6/-174G：NH2-5’-tttttttttt ttttaatgtg tcttgcgatg ctaaag-3’
<210>20
<211>36
<212>DNA
IL-6/-174C：NH2-5’-tttttttttt ttttaatgtg tcttgccatg ctaaag-3’
Claims (7)
1.一种用于检测肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-6基因型的基因芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，其特征在于所述寡核苷酸探针序列如下：
TNF-α/-308G：ataggttttgaggggcatgGggacggggttcagcctcca
TNF-α/-308A：ataggttttgaggggcatgAggacggggttcagcctcca
TNF-α/-238G：cagaagacccccctcggaatcGgagcagggaggatggggagt
TNF-α/-238A：cagaagacccccctcggaatcAgagcagggaggatggggagt
IL-6/-597G：aactgcacgaaatttgaggGtggccaggcagttctacaac
IL-6/-597A：aactgcacgaaatttgaggAtggccaggcagttctacaac
IL-6/-572G：ccaggcagttctacaacagccGctcacagggagagccagaac
IL-6/-572C：ccaggcagttctacaacagccCctcacagggagagccagaac
IL-6/-174G：cttttccccctagttgtgtcttgcGatgctaaaggacgtcacatt
IL-6/-174C：cttttccccctagttgtgtcttgcCatgctaaaggacgtcacatt。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述TNF-α/-308 G/A、TNF-α/-238 G/A、IL-6/-597 G/A、IL-6/-572 G/C和IL-6/-174 G/C突变位点序列中大写字母表示的碱基位于所述探针的中部。
3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述探针的5′端还包含一段氨基修饰的16聚的聚脱氧胸苷酸。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述固相支持物是醛基修饰的玻片或硅片。
5.一种非以诊断为目的检测肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-6基因型的方法，包括以下步骤：
(1)制备染色体DNA；
(2)用聚合酶链反应方法扩增TNF-α和IL-6基因中包含TNF-α/-308G/A，TNF-α/-238G/A，IL-6/-597G/A，IL-6/-572G/C，IL-6/-174G/C的基因片段；
(3)标记上述扩增产物；
(4)将上述标记的扩增产物与权利要求1所述的基因芯片杂交；
(5)检测基因芯片的杂交信号。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐显色反应或辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺显色反应。
7.一种用于检测肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-6基因型的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的基因芯片和包含权利要求5所述方法的使用说明书。
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| CN103540675A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-01-29 | 上海百傲科技股份有限公司 | 用于aldh2基因芯片检测的特异性引物对和探针 |
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|---|---|
| CN1661086A (zh) | 2005-08-31 |
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