CN1420123A

CN1420123A - 用于诊断脑膜炎病原菌的核酸序列、方法及套组

Info

Publication number: CN1420123A
Application number: CN 01137478
Authority: CN
Inventors: 许博翔; 江雅铃; 黄献龙; 赵守宇
Original assignee: JINGQI BIOCHEMIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Tianjin Zhongbo animal husbandry Co. Ltd.
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: CN1232528C

Abstract

本发明提供用于诊断脑膜炎病原菌的核酸序列、方法及套组，能针对20种脑膜炎病原菌进行快速诊断，其原理是将各种病原菌的DNA序列进行比对，选定特殊片段，寻找出对应的共同引物，并设计出各种病原菌的专一性探针片段，每种病原菌设计3种专一性探针片段，再将这些探针点置于高分子聚合物上，制成脑膜炎应用芯片。用试剂抽取临床检体的病原菌DNA，经标定扩增，与本发明的脑膜炎病原菌诊断芯片进行反应后用肉眼即可辨识出所感染的菌类。与传统方式相比，本发明的芯片检测法，可快速检测出各种感染菌种，且成本至少节省一半以上。

Description

用于诊断脑膜炎病原菌的核酸序列、方法及套组

技术领域

本发明涉及用于诊断脑膜炎病原菌的核酸序列、方法及套组，能针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Streptococcus saprophyticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、发热链球菌(Streptococcus.Pyogens)、肺炎链球菌(Streptococcus.Pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、嗜肺性退伍军人杆菌(Legionellapneumophilia)、产单核细胞李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、黏质锯杆菌(Serratiamarcescens)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、Stenotrophomonas maltophilia、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、感冒嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)与脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)20种脑膜炎病原菌进行快速诊断，其原理是将各种病原菌的DNA序列进行比对，选定特殊片段，寻找出对应的共同引物，并设计出各种病原菌的专一性探针片段，每种病原菌设计3种专一性探针片段，再将这些探针点置于高分子聚合物上，制成脑膜炎应用芯片，之后用临床上取得的检体经试剂抽取出病原菌DNA后，经标定扩增后，与本发明的脑膜炎病原菌诊断芯片进行侦测反应，即可藉此判断出所感染的菌类。

背景技术

脑膜炎在台湾属于法定传染病，起因于病原菌，包括病毒、细菌、真菌等微生物侵犯蛛网膜、软脑膜及脑脊髓液。任何细菌，皆有可能成为细菌性脑膜炎的致病菌种，虽然致病的细菌种类很多，但有70~80％以上的细菌性脑膜炎都是由脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Strptococcus pneumoniae)及感冒嗜血杆菌(Hemophilus influenza)三种细菌所引起。脑膜炎好发于学校、军队等生活拥挤的环境。流行的季节，以春天(三至六月份)为主要流行季节。腰椎穿刺是诊断脑膜炎最重要的检查之一。当中枢神经系统发生有明显病理变化的感染症时，可经由计算机断层扫描或核磁共振扫描等非侵入性的影像检查作诊断。但若发生脑膜炎等病理变化不明显的感染症时，则一定要由腰椎穿刺取得脑脊髓液检测，才能作正确的诊断。

由脑脊髓液直接培养出感染的病原菌，是确定诊断所不可缺少的重要资料。然而直接培养细菌至少须费时三天至一星期以上，抗体辨识则多为一对一模式，利用此方式进行菌种辨识，所需成本较高，且易造成医疗资源的浪费。

基于现今对于脑膜炎病原菌诊断技术上之缺点，可以得知因成本高、侦测检验时间长等因素，无法达到快速而准确侦测脑膜炎病原菌的目的，因此为求提高医疗水准及效益，目前极须要一种可以克服上述缺点的高效益侦测脑膜炎病原菌的方法及套组。

发明内容

本发明目的之一在于提供侦测脑膜炎病原菌核酸的核酸分子。本发明特别针对已知引起人类脑膜炎的20种病原菌，找到在各个病原菌本身亚种(或变异种及血清型)间之共通性序列(consensus sequence)，且这些各别病原菌之共通性序列与该病原菌本身以外之其它脑膜炎病原菌基因体序列具有很低的类似性(homology)或不具类似性。因此本发明根据这些共通性序列所设计出的探针(probe)，与来自脑膜炎患者检体之核酸进行杂交反应后，可以兼具灵敏度及专一性来侦测引起脑膜炎的病原菌种类。

因此，本发明的另一目的在于提供一种侦测脑膜炎病原菌核酸的方法，包括将脑膜炎病原菌核酸进行萃取；依需要将已萃取的脑膜炎病原菌核酸进行扩增；及将一种或多种前述本发明提供的核酸分子接触该脑膜炎病原菌核酸以进行杂交反应。

本发明的另一目的在于提供一种诊断脑膜炎的套组，其包含一种或多种前述本发明提供的核酸分子。

在较佳的实施方案中，本发明所使用的一种或多种核酸分子系固着于一基质上。在本发明较佳的具体事实中，该基质为一生物芯片。

传统医疗检测中，细菌培养较无时效性且辨识效率不佳，有鉴于生物芯片检测迅速、操作简便、成本降低之特性，不但效率大大提升，且符合市场的需要，因此本发明人针对脑膜炎的诊断程序积极开发出脑膜炎病原菌诊断探针及其应用套组，如检测用生物芯片等，以提高脑膜炎病原菌医疗检测之品质。

本发明的用于诊断脑膜炎病原菌的套组在制作程序方面，首先选定20种常见的脑膜炎致病菌为芯片检测的标的菌种。其菌种种类如下表所列：

No.	菌种名称	本发明提供共通性序列之代号
No.	菌种名称	本发明提供共通性序列之代号	1	金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus	1-1，1-2及1-3
2	表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis	2-1，2-2及2-3	1	金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus	1-1，1-2及1-3
2	表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis	2-1，2-2及2-3	3	腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus	3-1，3-2及3-3
4	无乳链球菌Streptococcus agalactiae	4-1，4-2及4-3	3	腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus	3-1，3-2及3-3
4	无乳链球菌Streptococcus agalactiae	4-1，4-2及4-3	5	发热链球菌Streptococcus.Pyogens	5-1，5-2及5-3
6	肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae	6-1，6-2及6-3	5	发热链球菌Streptococcus.Pyogens	5-1，5-2及5-3
6	肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae	6-1，6-2及6-3	7	粪肠球菌Enterococcus faecium	7-1，7-2及7-3
8	粪肠球菌Enterococcus faecalis	8-1，8-2及8-3	7	粪肠球菌Enterococcus faecium	7-1，7-2及7-3
8	粪肠球菌Enterococcus faecalis	8-1，8-2及8-3	9	结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis	9-1，9-2及9-3
10	嗜肺性退伍军人杆菌Legionella pneumophilia	10-1，10-2及10-3	9	结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis	9-1，9-2及9-3
10	嗜肺性退伍军人杆菌Legionella pneumophilia	10-1，10-2及10-3	11	产单核细胞李斯特氏菌Listeria monocytogenes	11-1，11-2及11-3
12	大肠杆菌E.coli	12-1，12-2及12-3	11	产单核细胞李斯特氏菌Listeria monocytogenes	11-1，11-2及11-3

13	肺炎克雷白氏杆菌Klebsiella pneumoniae	13-1，13-2及13-3
13	肺炎克雷白氏杆菌Klebsiella pneumoniae	13-1，13-2及13-3	14	黏质锯杆菌Serratia marcescens	14-1，14-2及14-3
15	阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae	15-1，15-2及15-3	14	黏质锯杆菌Serratia marcescens	14-1，14-2及14-3
15	阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae	15-1，15-2及15-3	16	绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa	16-1，16-2及16-3
17	Stenotrophomonas maltophilia	17-1，17-2及17-3	16	绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa	16-1，16-2及16-3
17	Stenotrophomonas maltophilia	17-1，17-2及17-3	18	奇异变形杆菌Proteus mirabilis	18-1，18-2及18-3
19	感冒嗜血杆菌Haemophilus influenzae	19-1，19-2及19-3	18	奇异变形杆菌Proteus mirabilis	18-1，18-2及18-3
19	感冒嗜血杆菌Haemophilus influenzae	19-1，19-2及19-3	20	脑膜炎双球菌Neisseria meningitidis	20-1，20-2及20-3

其中20种脑膜炎病原菌具有下列的通用引物：

引物名称	序列5’到3’	碱基
引物名称	序列5’到3’	碱基	F	5’-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3’(M＝A+C)	20
R	5’-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3’	20	F	5’-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3’(M＝A+C)	20

又，从20种已知的脑膜炎病原菌DNA中，分别从每一种病原菌中确定3种可作为判断依据、与脑膜炎病原菌互补的杂交探针核酸序列，成为20组套组检验组：

1-1 CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCG

1-2 TTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGG

1-3 TTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGC

2-1 AACAGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGACGTTAGC

2-2 GGATAATATATTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGG

2-3 GTGAAAGACGGTTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCG

3-1 TAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGC

3-2 CATTTGGACCCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATG

3-3 ATGGTTTTGCTATCACTTATAGATGGACCCGCGC

4-1 CTGAGGTTTGGTGTTTACACTAGACTGATGAGTTGCGA

4-2 GTAATTAACACATGTTGGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTG

4-3 GGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTGTGAGATGGAC

5-1 CTGAGAACTGGTGCTTGCACCGGTTCAAGG

5-2 AAGAGAGACTAACGCATGTTAGTAATTTAAAAGGGGCAA

5-3 GCATGTTAGTAATTTAAAAGGGGCAATTGCTCCACTATG

6-1 AGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGAT

6-2 AAGAGTGGATGTTGCATGACATTTGCTTAAAAGGTGC

6-3 GACATTTGCTTAAAAGGTGCACTTGCATCACTACCAG

7-1 CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAA

7-2 TATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGG

7-3 TTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCG

8-1 TCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGG

8-2 CAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGC

8-3 TTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCG

9-1 GAAAGGTCTCTTCGGAGATACTCGAGTGGCGAAC

9-2 GGACCACGGGATGCATGTCTTGTGGTG

9-3 TCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTG

10-1 GCAGCATTGTCTAGCTTGCTAGACAGATGGCGA

10-2 ATGTCTGAGGACGAAAGCTGGGGACCTTCG

10-3 CTGGGGACCTTCGGGCCTGGCGCTTTAAGATTA

11-1 AACGGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGG

11-2 AATGATAAAGTGTGGCGCATGCCACGCTTT

11-3 CCACGCTTTTGAAAGATGGTTTCGGCTATCG

12-1 CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACG

12-2 ACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC

12-3 GGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCC

13-1 GCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGG

13-2 TGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTC

13-3 CAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCAT

14-1 AGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGT

14-2 AACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC

14-3 CAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTG

15-1 GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGAC

15-2 CGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC

15-3 CTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGG

16-1 GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGG

16-2 GTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGG

16-3 TTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTC

17-1 GCAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTG

17-2 ACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACG

17-3 CGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTC

18-1 GCGGTAACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGA

18-2 CCGATAGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGG

18-3 GCTCTTCGGACCTTGCACTATCGGATGAACC

19-1 GTAGCAGGAGGAAGCTTGCTTTCTTGCTGACG

19-2 CGAGAGACGAAAGTGCGGGACTGTAAGGCC

19-3 CGCATGCCATAGGATGAGCCCAAGTGG

20-1 GCAGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTG

20-2 CGTCTTGAGAGAGAAAGCAGGGGACCTTCGG

20-3 CTTGCGCTATTCGAGCGGCCGATATCTG

其中每一组脑膜炎病原菌诊断探针包括至少一或二或三种专一性杂交探针核酸序列。

将脑膜炎病原菌探针以至少一株的数量种植于适当的基质上，每一探针包含与欲侦测的病原菌核酸序列之一部份互补的序列且该等探针中与欲侦测的病原菌核酸序列的一部份互补的序列彼此不同，其中探针以物理性或化学性方式固着于基质上。其中化学性是以原位合成(in situ synthesis)或化学性固着连结(chemical-link)为主：物理性以异位合成(ex situ synthesis)后，再用打点式、喷墨式、压电式等其它方式将探针固着于基质上。其中基质可为尼龙薄膜(nylonmembrane)、玻璃(glass)、高分子材质(polymer)等固相表面材质。

另外，将不同种类的探针分别种植于不同区域，以利于辨视病原菌的种类。种植方法为一小面积标的探针外的区域种满多数非标的探针，或者将区域划分为多个特定标的区域、种植多种侦测探针，以利于同时检验数种不同标的。本发明中脑膜炎诊断芯片最佳实施例为同时将20种脑膜炎病原菌专一性探针种植于同一芯片上，以确认脑膜炎病原菌的种类，使诊断用药更为精确。

其中基质可为玻璃、硝化纤维膜、尼龙薄膜、硅片及高分子材质等。基质上种植探针方式可为常用的种植方法，将目标或探针连接于固体支持物上，而能够在溶液中与脑膜炎病原菌的互补性核酸进行片断杂交反应。示范性固体相模式包含Southern氏杂交反应，点渍法及类似方法。杂交反应的侦测可于固体支持物上进行，如微效价盘，滤膜(如硝基纤维)或微球体(小珠)或一芯片及任何可行的杂交反应缓冲液系统。

另外在脑膜炎病原菌处理方面将脑膜炎病原菌核酸经过萃取后以聚合酶链扩增并同时标记，以增强与探针杂交的结合力，其中病原菌PCR序列分别为：

1.Staphylococcus aureus

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG

GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATA

C ATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

2.Staphylococcus epidermidis

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG

GGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACC

CGCCGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

3.Staphylococcus saprophyticus

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCAGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACAGA

GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAA

CGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

4.Streptococcus agalactiae

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACG

ACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGA

CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

5.Streptococcus.Pyogens

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACG

AGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT

AGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

6.Streptococcus pneumoniae

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT

GAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTGGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT

ATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGKCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

7.Enterococcus faecium

GAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCTTAAGARGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCG CTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

8.Enterococcus faecalis

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCT

AAAGAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAA

GCT CGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

9.Mycobacterium tuberculosis

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACG GGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATA

GGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

10.Legionella pneumophilia

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG

GTGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGCCTTGAAGAGGGGGACAACTTGGGGAAACTCAAGCTAATACCGCATA

GCCTGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGGGCCTACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

11.Listeria monocytogenes

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACG CGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGTTGGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG CTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAATGGCCTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

12.E.coli

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATA

CAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

13.Klebsiella pneumoniae

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGA

TGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAA

GCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

14.Serratia marcescens

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGT

GACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCAT

CCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

15.Enterobacter cloacae

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACG GAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAA

GGGCCT ATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

16.Pseudomonas aeruginosa

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATAC GGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG

17.Stenotrophomonas maltophilia

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGTAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACG GCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCT

CTAATACCGCATA GGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

18.Proteus mirabilis

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGA

CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGC

CTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGCAGGG

CATATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAAAGGCTCACCTAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

19.Haemophilus influenzae

GAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACG AGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATCTGGCTTATGGAGGGGGATAACGACGGGAAACTGTCGCTAATACCGCGTAGTGT

GATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCTGCGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT

20.Neisseria meningitidis

GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTTGAACGCTGGCGGCATGCTTTACACATGCAAGTCGGACG GCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACATATCGGAACGTACCGAGTAGTGGGGGATAACTGATCGAAAGATCAGCTAATACCGCATA

GC ATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCYTACGGGAGGCAGCAGT

其中，标示底线(单、双线者为)每一种脑膜炎病原菌可作为判断依据、与标的杂交探针互补的核酸序列片段，加底纹之区段为两互补核酸序列片段重叠的部份。

附图说明

(a)本发明具体实施例的脑膜炎病原菌诊断芯片之一诊测实施结果图片。

(b)本发明具体实施例的脑膜炎病原菌的另一诊断芯片诊测实施结果图片。

本发明其它的特征及优点将可明显见于下列较佳实施方案及权利要求范围。

实施例

下列实施例用于示范说明本发明。这些实施例不以任何方式意欲限制本发明的范围，但用于指示如何实施本发明的材料及方法。本发明的脑膜炎病原菌诊断芯片的最佳实施状态包含下列步骤：

A.病原菌DNA的萃取：

(1)一病原菌菌落以500ul溶液I筛选，其中溶液I为：

50mM 葡萄糖

10mM EDTA

25mM Tris-HCl pH＝8.0

之混合溶液。

(2)对G(+)病原菌，添加1mg/ml溶菌酶，并于37℃下温育30-60分钟；对G(-)病原菌，直接跳至步骤(3)。

(3)加入10％SDS 50μl，在65℃下温育30-60分钟。

(4)加入RNase 4mg/mL，在37℃下温育30-60分钟。

(5)添加100μl的5M KAc与300μl的CHCl₃。

(6)搅拌混合15秒后以12,000 RPM转速旋转离心5分钟。

(7)将悬浮物移至新试管，并添加2倍体积的95％乙醇。

(8)均匀混合并再快速旋转离心。

(9)移出悬浮物，以600μl的70％乙醇清洗沉淀物。

(10)移出悬浮物后风干沉淀物.。

(11)以500μl的ddH₂O或TE缓冲液溶解，其中TE为10mM Tris-HCl与1mMEDTA pH＝8.0的混合溶液。

(12)以OD-260量测DNA浓度。

(13)稀释DNA浓度至约为2ng/μl以进行PCR。

B.聚合酶链反应：

准备下列物品：

1.模板 2λ；

2.缓冲液 25mM10X缓冲液5λ；

3.F引子 1λ；

4.R引子 1λ；

5.Taq 1U；

6.DIG(digoxigenin)-dUTP 2λ；

将上述6项物品置于PCR机器上，经95℃，10分钟的变性，再进行30次的循环反应(95℃1分钟；58℃1分钟；72℃2分钟)。最后以72℃10分钟进行延展。之后取3μl与芯片反应。

C.芯片反应：

脑膜炎诊断芯片的测试流程如下：

1.3μl PCR产物与脑膜炎芯片反应。

2.预先杂交(阻断反应)30分钟，之后加入标示性探针进行杂交反应6小时。

3.除去非专一性部份反应3小时。

4.进行感光或其它讯号辨识发展20分钟。

之后，判读脑膜炎诊断芯片上的讯息，对应专一性探针的种植位置，有显示讯号者即为感染的病原菌。如图片(a)、(b)所示，本实施例中的芯片内容主要分为三大部分：病原菌专一性探针、聚合酶链反应正向控制探针以及呈色正向控制探针。其主要目的分述于下：

1.病原菌专一性探针：芯片同时种植有20种脑膜炎病原菌诊断探针，依序如图中标示1-20的顺序，每种菌3支探针，每一探针2重复(共六个位置)，由上而下，由左至右，由呈色的行别，即可辨识出感染的病原菌菌种。

2.聚合酶链反应正向控制探针：在A区、B区均有呈色，则表示聚合酶链反应的过程无误。

3.呈色正向控制探针：在C、D、E、F区均有反应，则表示呈色反应的过程无误。

在本实施例中，可以肉眼判读所感染的脑膜炎病原菌菌种，如图标：(a)图中感染的菌种为Staphylococcus saprophyticus，而(b)图中感染的菌种为Neisseria meningitidis。

另外，其它种类的讯号辨视方式配合标定的讯号标计，可以为光检验或扫描侦测系统，能够专一性与一目标进行杂交的核酸探针的标记(labeling)，用任何一种典型用于侦测被杂交的核酸存在的方法进行，其中光检验可为萤光标记、放射线标记、化学标记、或分光光度计分析。此外，整体性的光电与电子感应成分也可。

由于本发明中脑膜炎病原菌诊断探针可检测的20种细菌种类已涵盖80～90％的脑膜炎患者可能感染的菌种，其中更包含近日流行性脑脊髓膜炎的脑膜炎双球菌。且整合了多项生物技术，利用生物信息找出其专一性探针，制成脑膜炎诊断芯片，使用者只需将从检体取得的细菌DNA，进行简单的聚合酶链反应将讯号扩增，即可与芯片进行杂交，反应后用肉眼即可辨识出感染的菌种，无需其它辨识系统，与传统的一对一检测方式相比，芯片的一对多检测法，可在24小时内检测出感染的菌种，且至少节省一半以上的成本，芯片技术运用于医疗检测上的突破，对于患者而言，无疑是一大福音。

根据本发明可作的不同修正及变化对于本领域技术人员而言显然均不会偏离本发明的范围与精神。虽然本发明已叙述具体的较佳实施方式，但必须了解的是本发明不应被不恰当地限制于这些具体实施方式上。事实上，在实施本发明的上述模式方面，对于本领域技术人员而言，显然不同修改亦被涵盖于下列权利要求范围之内。

Claims

1.一种侦测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组和序列：

1-1

CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCG

1-2

TTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGG及

1-3

TTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCTGC。

2.一种侦测表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)核酸和核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组和序列：

2-1

AACAGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGACGTTAGC

2-2

GGATAATATATTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGG及

2-3

GTGAAAGACGGTTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCG。

3.一种侦测腐生葡萄球菌(Streptococcus saprophyticus)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

3-1

TAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGC

3-2

CATTTGGACCCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATG及

3-3

ATGGTTTTGCTATCACTTATAGATGGACCCGCGC。

4.一种侦测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

4-1

CTGAGGTTTGGTGTTTACACTAGACTGATGAGTTGCGA

4-2

GTAATTAACACATGTTGGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTG及

4-3

GGTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTGTGAGATGGAC。

5.一种侦测发热链球菌(Streptococcus.Pyogens)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

5-1

CTGAGAACTGGTGCTTGCACCGGTTCAAGG

5-2

AAGAGAGACTAACGCATGTTAGTAATTTAAAAGGGGCAA及

5-3

GCATGTTAGTAATTTAAAAGGGGCAATTGCTCCACTATG。

6.一种侦测肺炎链球菌(Streptococcus.Pneumoniae)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

6-1

AGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGAT

6-2

AAGAGTGGATGTTGCATGACATTTGCTTAAAAGGTGC及

6-3

GACATTTGCTTAAAAGGTGCACTTGCATCACTACCAG。

7.一种侦测粪肠球菌(Enterococcus faecium)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

7-1

CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAA

7-2

TATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGG及

7-3

TTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCG。

8.一种侦测粪肠球菌(Enterococcus faecalis)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

8-1

TCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGG

8-2

CAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGC及

8-3

TTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCG。

9.一种侦测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

9-1

GAAAGGTCTCTTCGGAGATACTCGAGTGGCGAAC

9-2

GGACCACGGGATGCATGTCTTGTGGTG及

9-3

TCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTG。

10.一种侦测嗜肺性退伍军人杆菌(Legionella pneumophilia)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

10-1

GCAGCATTGTCTAGCTTGCTAGACAGATGGCGA

10-2

ATGTCTGAGGACGAAAGCTGGGGACCTTCG及

10-3

CTGGGGACCTTCGGGCCTGGCGCTTTAAGATTA。

11.一种侦测产单核细胞李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

11-1

AACGGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGG

11-2

AATGATAAAGTGTGGCGCATGCCACGCTTT及

11-3

CCACGCTTTTGAAAGATGGTTTCGGCTATCG。

12.一种侦测大肠杆菌(E.coli)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

12-1

CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACG

12-2

ACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC及

12-3

GGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCC。

13.一种侦测肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

13-1

GCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGG

13-2

TGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTC及

13-3

CAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCAT。

14.一种侦测黏质锯杆菌(Serratia marcescens)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

14-1

AGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGT

14-2

AACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC及

14-3

CAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTG。

15.一种侦测阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

15-1

GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGAC

15-2

CGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTC及

15-3

CTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGG。

16.一种侦测绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

16-1

GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGG

16-2

GTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGG及

16-3

TTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTC。

17.一种侦测脑膜炎病原菌Stenotrophomonas maltophilia核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

17-1

GCAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTG

17-2

ACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACG及

17-3

CGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTC。

18.一种侦测奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

18-1

GCGGTAACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGA

18-2

CCGATAGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGG及

18-3

GCTCTTCGGACCTTGCACTATCGGATGAACC。

19.一种侦测感冒嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

19-1

GTAGCAGGAGGAAGCTTGCTTTCTTGCTGACG

19-2

CGAGAGACGAAAGTGCGGGACTGTAAGGCC及

19-3

CGCATGCCATAGGATGAGCCCAAGTGG。

20.一种侦测脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)核酸的核酸分子，该核酸分子包括选自下列群组的序列：

20-1

GCAGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTG

20-2

CGTCTTGAGAGAGAAAGCAGGGGACCTTCGG及

20-3

CTTGCGCT8ATTCGAGCGGCCGATATCTG。

21.一种用于增幅检体中脑膜炎病原菌核酸之引物对，其分别包含以下序列

5’-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3’，其中M为A或C；及

5’-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3’。

22.一种探针套组，其包含一种或多种如权利要求1至20中任一项所述的核酸分子。

23.一种诊断脑膜炎的套组，其包含一种或多种如权利要求1至20中任一项所述的核酸分子。

24.如权利要求23所述的套组，其中所述一种或多种核酸分子固着于一基质上。

25.如权利要求24所述的套组，其中所述基质为一生物芯片。

26.如权利要求25所述的套组，其中所述芯片上含有如权利要求1至20中任一项所定义的一种或多种核酸分子。

27.如权利要求25所述的套组，其中所述芯片上含有所有如权利要求1至20中任一项所定义的核酸分子。

28.如权利要求23所述的套组，其中还含有如权利要求21所述的引物对。

29.一种侦测脑膜炎病原菌核酸的方法，其包含下列步骤：

将脑膜炎病原菌核酸进行萃取；

依需要将已纯化的脑膜炎病原菌核酸进行扩增；及

将一种或多种如权利要求1至20项中任一项所述的核酸分子接触该脑膜炎病原菌核酸以进行杂交反应。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述一种或多种核酸分子固着于一基质上。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述基质为一生物芯片。

32.如权利要求29所述的方法，其中所述芯片上含有如权利要求1至20项中任一项所定义之一种或多种核酸分子。

33.如权利要求29所述的方法，其中所述芯片上含有所有如权利要求1至20项中任一项所定义的核酸分子。

34.如权利要求29所述的方法，其中所述已纯化的脑膜炎病原菌核酸系利用聚合酶链反应进行扩增并标定。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述聚合酶链反应利用如权利要求21所述的引物对。