CN1814785A - 检测布鲁氏菌的方法和用于该方法的引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从样品如牛奶中检测流产布鲁氏菌OMP 25kd基因片段的方法。运用本方法可以从病原学上对奶牛布病作出诊断。本方法的步骤包括：从样品如奶样中提取总DNA作为模板，用自行设计的两套引物按优化的反应条件进行套式PCR检测，可以扩增到419bp目的基因片段，从而对布病作出定性诊断。本方法具有快速、特异、灵敏、取样方便等优点，既可以进行大面积奶牛群布鲁氏菌病普查和监测，又可以对个病例作出快速诊断，具有实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及检测样品如牛奶中布鲁氏菌或者布鲁氏菌DNA的方法和用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。运用本方法可以快速地从病原学上对牛布鲁氏菌病感染做出诊断。
背景技术
布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病，是国际兽疫局(OIE)和国家法定的传染病。该病可以引起怀孕奶牛的群发性流产，并导致产奶量锐减，给养牛业造成巨大经济损失，危害极大。近些年来，我国牛羊布鲁氏菌病发病有所抬头，有些地方甚至新发现人感染布鲁氏菌病病例不断增加。奶牛与人的生活关系密切，有效监测和控制奶牛布鲁氏菌病对促进我国奶牛业可持续性发展，对保护人民身体健康，维护社会秩序安定意义重大。流产布鲁氏菌OMP 25kd是目前国际上研究比较多的一种具有抗原性的外膜蛋白。该蛋白的编码基因OMP 25基因比较稳定，因此有效检测25kd外膜蛋白基因具有重要的病原学诊断价值。当前，布鲁氏菌病病原鉴定是用流产牛胎盘子叶、阴道排泄物和胎儿肺、肝、皱胃内容物涂片，用多种方法染色，或用荧光素或过氧化物酶标记抗体结合物染色，组织细胞内出现大量弱抗酸性布鲁氏菌形态的细菌或具有免疫特性着色的细胞，则可判定为布鲁氏菌病。也可用上述病料及水囊瘤液接种于血清葡萄糖琼脂板上培养；也可将含菌量较少的奶样接种于血清葡萄糖肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤等进行增菌培养(需要6周时间)，然后根据布鲁氏菌典型菌落形态、革兰氏或Stamp氏染色涂片检查以观察布鲁氏菌形态，再做布鲁氏菌抗血清试验，检查其凝集作用。最后做生化定种试验。全过程费时、费力、费用高、劳动量大。因此，国外在大力开展用PCR方法快速诊断布鲁氏菌病的研究，并进行实验室诊断效果评估工作，一旦标准化，将很快推广应用。动物布鲁氏菌病血清学诊断方法主要包括血清凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。我国目前对奶牛群实行不注射疫苗每年应用SAT普查，检出的阳性牛及时扑杀淘汰的政策。在本领域中，牛群检疫缺乏快速、敏感的病原学诊断技术。本发明满足了这种需要和其它需要。
发明内容
发明人通过研究，建立一种了在样品如牛奶中检测布鲁氏菌DNA的PCR方法。该方法快速(48h内出结果)、灵敏度高(50-100cfu/ml奶样)，以阳性质粒作为对照，不动活菌，装配成诊断试剂盒推广应用很安全。由此完成了本发明。
因此，在第一方面，本发明涉及通过例如使用DNAstar和OLIGO两种软件，针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物。
在一个具体实施方案中，所述寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：1、2、3或4所示的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及包含至少一个本发明所述寡核苷酸引物的寡核苷酸引物对。在一个具体实施方案中，所述的寡核苷酸引物对由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和2组成，或由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和4组成。
在再一方面，本发明涉及一种检测样品(如牛奶等)中布鲁氏菌或者布鲁氏菌DNA的方法，该方法包括：
(1)针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计至少一对(如几对，优选一对或者两对)特异性PCR扩增引物(例如使用DNAstar和OLIGO两种软件)，用于扩增外膜蛋白(OMP)25kd基因的至少一个(如几个，优选一个或者两个)片段；
(2)非必需地，从所述样品提取总DNA；
(3)采用(1)所述引物对，以所述样品或者(2)中获得的总DNA为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增；
(4)非必需地，针对(3)获得的PCR扩增产物设计至少一对(如几对，优选一对或者两对)嵌套引物(例如使用DNAstar和OLIGO两种软件)，并采用该嵌套引物，以未经纯化的或者经纯化的(3)获得的PCR扩增产物为模板，进行PCR扩增；
(5)鉴定(3)或者(4)中特异性扩增产物的存在。
在本发明方法的一个实施方案中，所述样品是牛奶。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述布鲁氏菌是流产布鲁氏菌(Brucella abortus)。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述方法包括(2)的步骤。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述方法包括(4)的步骤。
在本发明方法的另一个实施方案中，(4)中的模板是未经纯化的(3)获得的PCR扩增产物。
在本发明方法的另一个实施方案中，(5)所述的鉴定包括将扩增产物进行电泳，优选琼脂糖凝胶电泳。
在本发明方法的另一个实施方案中，(1)和/或(4)中设计的引物对包含至少一个本发明上述引物。优选，包含SEQ ID NO：1、2、3和4中的至少一个。
在本发明方法的另一个实施方案中，(1)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对，而(4)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成的引物对。
在本发明方法的另一个实施方案中，其中本方法的灵敏度达到50-100cfu/ml奶样。
以下结合附图对本发明进行进一步的说明。通过这些说明，本领域技术人员将会理解本发明这些方面和其它方面。
附图简述
图1是实施例1中套式PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳照片。泳道1是DL 2000 DNA Marker；泳道2和3是omp25扩增片段；泳道4是阴性对照。
具体实施方式
除非特别说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
本发明通过检测布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))OMP 25kd基因片段来检测样品中的布鲁氏菌。由此，运用本方法可以快速地从病原学上对牛布鲁氏菌病感染做出诊断。
OMP 25kd基因片段的检测通过PCR扩增来实现。根据本发明，对OMP25kd基因至少一个片段(如几个，如1-5个，优选一个或者两个片段)进行检测/扩增。对于该PCR扩增，既可以采用单次PCR方法，也可以采用多次PCR方法。对于多次PCR方法，既可以在分开的反应容器中独立地进行多个PCR产物(即目的基因片段)的扩增，也可以在同一反应容器中同时或者先后进行多个PCR产物的扩增。多次PCR扩增可以是扩增目的基因的多个不同片段，或者也可以是套式PCR(或称嵌套式PCR，nested PCR)扩增。优选地，本发明的PCR扩增是多次PCR方法。在一个特别优选的实施方案中，首先扩增目的基因的一个片段，然后利用该PCR产物进行套式PCR扩增。
在一个优选实施方案中，本发明的PCR扩增是半定量的、或者是实时定量PCR。
本发明的PCR扩增优选是特异性扩增，即能够有效地扩增布鲁氏菌病病原体的目的基因片段，而基本上不扩增其它无关的基因片段。
为了上述目的，本发明提供针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物。
本发明的引物可以采用本领域已知的原则来设计。优选地，本发明的引物采用本领域已知的PCR引物设计软件来设计。这种PCR引物设计软件的优选例子是DNAstar和OLIGO软件。典型地，在设计时，采用引物设计软件推荐的或者默认的参数设置。
本发明的引物优选能够特异扩增目的基因片段。
本发明PCR扩增产物的长度通常为100碱基对(bp)到2000bp，但也可以更长或者更短。优选的扩增产物长度是150-1500bp，更优选200-1000bp，更优选300-800bp，更优选300-600bp，如400-500bp。
本发明PCR扩增引物的长度通常为10核苷酸(nt)到50nt，但也可以更长或者更短。优选的引物长度是15-40nt，更优选20-30nt。
在一个具体实施方案中，所述寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：1、2、3或4所示的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及包含至少一个本发明所述寡核苷酸引物(优选SEQ ID NO：1、2、3或4)的寡核苷酸引物对。优选地，寡核苷酸引物对的两个引物都是本发明所述寡核苷酸引物。在一个具体实施方案中，所述的寡核苷酸引物对由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和2组成，或由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和4组成。
在一个具体方面，本发明涉及一种检测样品(如牛奶等)中布鲁氏菌的方法，该方法包括：
(1)针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计至少一对(如几对，优选一对或者两对)特异性PCR扩增引物(例如使用DNAstar和OLIGO两种软件)，用于扩增外膜蛋白(OMP)25kd基因的至少一个片段；
(2)非必需地，从所述样品提取总DNA；
(3)采用(1)所述引物对，以所述样品或者(2)中获得的总DNA为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增；
(4)非必需地，针对(3)获得的PCR扩增产物设计至少一对(如几对，优选一对或者两对)嵌套引物(例如使用DNAstar和OLIGO两种软件)，并采用该嵌套引物，以未经纯化的或者经纯化的(3)获得的PCR扩增产物为模板，进行PCR扩增；和
(5)鉴定(3)或者(4)中特异性扩增产物的存在。
所述样品可以是任何离体的生物学样品或者非生物学样品，包括但不限于生物液体，如奶、尿、分泌物、血液、血液组分、精液，离体的组织，如生检样品、涂片，如动物如牛(如流产牛)胎盘子叶、阴道排泄物和胎儿肺、肝、皱胃内容物涂片等。在一个优选实施方案中，所述样品是牛奶。在另一个优选实施方案中，所述样品是牛群的混合奶样。在另一个优选实施方案中，所述样品是流产个例的奶样(怀孕7个月以上流产有奶)或阴道分泌物(怀孕不足7个月流产无奶)。
所述样品可以直接进行PCR扩增，也可以在PCR扩增前预先进行处理，如初步纯化或者提取总DNA。初步纯化和提取总DNA可以采用本领域公知的方法进行。
本发明方法中使用的引物可以按照本文的说明来设计，通过本领域已知的方法合成。在一个实施方案中，至少一个引物具有SEQ ID NO：1、2、3或4所示的核苷酸序列。
在本发明方法的一个实施方案中，(1)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对，或者包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成的引物对。
在本发明方法的另一个实施方案中，(1)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对，而(4)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成的引物对。这样，可以获得419bp目的基因片段。
在本发明方法的一个实施方案中，所述方法包括(2)的步骤。提取总DNA可以采用本领域公知的方法进行。
在本发明方法的步骤(3)和/或(4)中，对OMP 25kd基因至少一个片段(如几个，如1-5个，优选一个或者两个片段)进行扩增。对于多个片段的扩增，既可以在分开的反应容器中独立地进行多个PCR产物(即目的基因片段)的扩增，也可以在同一反应容器中同时或者先后进行多个PCR产物的扩增。在一个优选实施方案中，本发明的PCR扩增是半定量的、或者是实时定量PCR。
本发明方法的步骤(3)和(4)中PCR扩增的反应体系和反应条件(循环条件)可以采用本领域已知的原则通过常规的试验和/或分析来建立。
有关PCR技术的具体方法和参数可参考如下(但不限于这些)参考文献：Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，(1987)；Ehrlich(编)，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989；Ehrlich等，Science，252：1643-1650，(1990)；和“PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications”，Innis等编，Academic Press，纽约(1990)。
例如，可以利用可从许多供应商获得的试剂盒按照厂商的说明书来进行PCR扩增。优选地，可以根据具体的反应方案或者针对特定的样品或者样品批次，预先通过试验对PCR扩增的反应体系和反应条件进行优化。优选地，反应体系和反应条件的设置和优化以实现目的片段的特异性扩增为目的，扩增产物的量便于用适当的方法检测。
在本发明方法的一个实施方案中，所述方法包括(4)的步骤。在(4)的步骤中，从(3)获得的PCR扩增产物可通过本领域公知的方法(例如利用可从供应商获得的试剂盒)进行纯化，然后再用于嵌套PCR扩增。优选地，在(4)的步骤中，模板是未经纯化的从(3)获得的PCR扩增产物。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述方法包括(2)和(4)的步骤。
在一个特定的实施方案中，本发明方法包括步骤(2)和(4)，而且(1)中设计的引物对是由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对，(4)中设计的引物对是由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和SEQID NO：4组成的引物对，而PCR扩增的反应体系和反应条件采用实施例所述的反应体系和反应条件。
本发明方法步骤(5)所述的鉴定可以采用本领域已知的任何鉴定方法。
PCR扩增产物可以采用各种方法检测。例如，PCR产物可以通过凝胶电泳分级分离，并通过溴化乙啶染色观察。或者，可以将分级分离的PCR产物转移到膜上，用可检测的标记探针杂交，并通过放射自显影检查。其它的可替代方法包括应用地高辛配基标记的脱氧核糖核酸三磷酸以提供化学发光检测，和C-TRAK比色分析。
另一种方法是实时定量PCR(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Ct.)。使由寡核苷酸和附着的报道及猝灭染料组成的荧光探针在正向和反向引物之间特异退火。利用Taq DNA聚合酶的5’内切核酸酶活性，从该猝灭染料中分离出报道染料，并产生序列特异性信号而且随着扩增的增加该信号增强。可以在PCR反应期间持续地监测和定量该荧光强度。
因此，本发明还提供用于检测本发明PCR扩增产物的上述荧光探针。
本发明的PCR扩增可以与上述检测方法之一或多种相结合。
在本发明方法的另一个实施方案中，本发明采用琼脂糖凝胶电泳、EB染色进行PCR产物的鉴定，本方法的灵敏度达到50-100cfu/ml奶样。
在一个具体实施方案中，本发明提供一种检测牛奶中布鲁氏菌DNA的方法，包括以下步骤：使用DNAstar和OLIGO两种软件，针对流产布鲁氏菌(Brucella abortus)外膜蛋白(OMP)25kd基因设计两套引物；从奶样中提取布鲁氏菌总DNA作为模板，用套式PCR(多聚酶联反应)扩增到目的基因片段。本方法的灵敏度达到50-100cfu/ml奶样。
在一个具体方面，本发明提供一种以牛奶乳汁为样本敏感、快速检测布鲁氏菌DNA的方法，本发明的方法包括步骤：
将送检的奶样按照本发明所设计的程序处理后提取总DNA作为模板，然后用本发明所设计合成的两组引物(SEQ ID NO：1和2，SEQ ID NO：3和4)，按本发明实施例所设定的最佳反应条件进行套式PCR试验，然后对扩增产物进行电泳显色，优选在PCR试验中同时设立阳性对照和空白对照，全部成立后可以对PCR检测结果进行判定：在被检样品道出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阳性；在被检样品道没有出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阴性。
在另一方面，本发明还涉及诊断动物的布鲁氏菌病的方法，该方法包括采用本发明的方法检测来自该动物的样品中的布鲁氏菌。
在另一方面，本发明还涉及针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物在制备用于检测样品中布鲁氏菌或者诊断动物的布鲁氏菌病的试剂中的用途。所述引物优选SEQ ID NO：1-4中的一种或者多种。
在另一方面，本发明还涉及用于检测样品中布鲁氏菌或者诊断动物的布鲁氏菌病的试剂盒，该试剂盒包括针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物。所述引物优选SEQ ID NO：1-4中的一种或者多种。所述试剂盒任选地还包括阳性对照，如质粒阳性对照，其它用于PCR扩增的试剂，如耐热DNA聚合酶等。
本发明还涉及对整个牛群进行布鲁氏菌病的定期或不定期监测的方法，包括采用本发明方法检测泌乳奶牛群的混合奶样中的布鲁氏菌病病原体。
本发明还涉及检查流产的个例发生流产是否与布鲁氏菌感染有关的方法，包括采用本发明方法检测奶样(怀孕7个月以上流产有奶)或阴道分泌物(怀孕不足7个月流产无奶)中的布鲁氏菌病病原体。
在本发明的所有方面，如果适用的话，布鲁氏菌优选是流产布鲁氏菌(Brucella abortus)。
本发明的有益效果包括：
(i)用现行家畜布鲁氏菌病病原学常规分离鉴定技术进行诊断，至少需要数周时间才能出结果，而用本发明方法诊断只要48h，大大节约了时间。
(ii)本发明的灵敏度高，可以用于检测泌乳奶牛群的混合奶样，取样方便，便于对整个牛群布鲁氏菌病进行定期或不定期监测，劳动量小，成本低，操作简单，便于大面积牛群普查。
(iii)对发生流产的个例，用本方法检测奶样(怀孕7个月以上流产有奶)或阴道分泌物(怀孕不足7个月流产无奶)，可以及时获得诊断结果，明确发生流产是否与布鲁氏菌感染有关，以便及时采取有效措施进行处理，以防疫情扩散。
(iv)我国目前对奶牛布鲁氏菌病诊断标准是采用平板凝集试验和试管凝集试验的血清学诊断技术。发明人(兰州兽医研究所)曾经对两批(16头)用凝集试验(SAT)检测为阳性奶牛的奶样和一批(307头)用凝集试验检测为阴性奶牛的奶样用本发明实施例的方法进行符合性试验，结果前2批奶样PCR检测全部为阳性；第三批奶样PCR检测全部为阴性，3批试验结果的符合率均为100％(见表1)。本发明具有病原学诊断实用价值。
表1奶牛布鲁氏菌病凝集试验与PCR试验诊断结果的符合率
| 地名 | 奶牛数 | 被检血清数 | SAT结果 | 被检奶样数 | PCR结果 | SAT和PCR符合率％ | ||
| + | - | + | - | |||||
| 宁夏 | 10 | 10 | 10 | 0 | 10 | 10 | 0 | 100.0 |
| 甘肃1 | 6 | 6 | 6 | 0 | 6 | 6 | 0 | 100.0 |
| 甘肃2 | 307 | 307 | 0 | 307 | 307 | 0 | 307 | 100.0 |
+：阳性
-：阴性
(v)该方法以阳性质粒作为对照，不动活菌(为了安全、不散毒，不能用布鲁氏菌标准菌株的培养物作试剂盒的阳性对照)，装配成诊断试剂盒推广应用很安全。
通过本发明方法，可以在48小时内对布鲁氏菌病作出定性诊断。本方法具有快速、特异、灵敏、取样方便等优点，既可以进行大面积奶牛群布鲁氏菌病普查和监测，又可以对个病例作出快速诊断，具有实用价值。
本发明通过以下实施例进行进一步说明。应当理解，这些实施例是对本发明的举例说明，不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一.引物设计
使用DNAstar和OLIGO两种软件针对OMP25设计两套引物。
第一套引物：
BP1：5’-CGT GCC GCA ATT ACC CTC-3’(SEQ ID NO：1)
BP2：5’-CCG TCA GCT TGG CTT CGA-3’(SEQ ID NO：2)
第二套引物：
BP3：5’-GAT GCT GCC CGC CCG ATA A-3’(SEQ ID NO：3)
BP4：5’-GCA CCG AGC GAG CCT TCA AA-3’(SEQ ID NO：4)
引物按照本领域公知方法合成。稀释浓度至50pM使用。
二.操作程序
1.从奶样中布鲁氏菌总DNA的提取
1.1在室温下溶解冻存奶样(奶样长期保存应置于-20℃，如尽快检测可置于4℃)，取400μl上层奶样于2ml离心管中，加入100μl NETbuffer。NET buffer的配方：NaCl 50mM，EDTA 125mM，Tris 50mM。
1.2加入100μl 20％的SDS(终浓度3.5％)，混匀。在95-100℃孵育8-10min后，迅速放置于-20℃冷却10min。
1.3在样品中加入Rnase A酶至终浓度为75μg/μl，50℃作用2h。然后加入proteinase K至终浓度为325μg/μl，50℃作用2h。在裂解消化过程中颠倒摇匀数次。
1.4在消化处理的样品液中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，颠倒摇匀2-3次，4℃下7500转离心10min。
1.5转移上清液于另一离心管中。
1.6重复1.4和1.5操作过程(如仍有较多蛋白或其它杂质存在，可在重复提纯一次)，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，同时加入1/10体积3M的乙酸钠溶液，-20℃沉淀20min，12000转离心10min，弃去所有液相。沉淀物即为总DNA。
1.7用1ml 70％(v/v)乙醇漂洗总DNA，12000转离心2min。弃去漂洗液。重复漂洗2-3次(在漂洗离心后应尽可能除去残留的液体，以免因SDS等的残留而影响PCR反应)。
1.8真空或室温干燥，DNA沉淀物用20μl无菌双蒸水或2.5nMTris-HCl(pH8.5)溶解(最好选用后者使DNA沉淀溶解彻底)，-20℃保存备用。
2.PCR反应体系及条件
2.1反应体系
| 一扩： | 二扩： | ||
| 10×PCR buffer(含Mg2+) | 5μl | 10×PCR buffer(含Mg2+) | 5μl |
| dNTPs(2.5mM) | 4μl | dNTPs(2.5mM) | 4μl |
| BP1(50pM)和BP2(50pM)引物 | 各1μl | BP3(50pM)和BP4(50pM)引物 | 各1μl |
| 模板(为提取的总DNA) | 4μl | 模板(为一扩产物) | 2μl |
| 双蒸水 | 35μl | 双蒸水 | 37μl |
反应时在体系中加入0.25μl EXTaq DNA聚合酶。
注：EXTaq DNA聚合酶、10×PCR buffer和dNTPs由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司生产。
2.2反应条件
一扩：模板为上文提取的总DNA；首先95℃充分变性5min，然后35个循环，分别为：94℃变性1min；49℃退火1min；72℃延伸1min。72℃延伸10min。
二扩：模板为一扩反应的产物；30个循环，分别为：94℃变性30sec；50℃退火1min；72℃延伸1min。72℃延伸10min。
2.3电泳
取二扩PCR反应产物5μl加在1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭，EB)板上，在TAE电泳液中电泳观察结果。
3.结果和判定
在PCR试验中同时设立阳性对照和空白对照，全部成立后对PCR检测结果进行判定：在被检样品道出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阳性；在被检样品道没有出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阴性。
上述PCR试验的一个典型结果(琼脂糖凝胶电泳、EB染色、紫外线下照相)见图1。在图1中，泳道1是DL 2000DNA Marker；泳道2和3是omp25扩增片段；泳道4是阴性对照。由图可知，通过上述方法实现了目的片段的特异性扩增，从而实现了奶样品中布鲁氏菌感染的有效检测。
本试验设立的阳性对照为用流产布鲁氏菌标准菌株培养物所提取的总DNA或用其制备的本发明目的基因片段(419bp)的质粒。在试剂盒中用该质粒作阳性对照，具有安全、稳定、不散毒等优点；空白对照为无菌双蒸水或2.5nM Tris-HCl(pH8.5)。
序列表
<110>兰州兽医研究所
<120>检测布鲁氏菌的方法和用于该方法的引物
<130>IDC040148
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物BP1
<400>1
cgtgccgcaa ttaccctc 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物BP2
<400>2
ccgtcagctt ggcttcga 18
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物BP3
<400>3
gatgctgccc gcccgataa 19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物BP4
<400>4
gcaccgagcg agccttcaaa 20
Claims (14)
1.针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物，该引物优选具有SEQ ID NO：1、2、3或4所示的核苷酸序列。
2.寡核苷酸引物对，其包含至少一个如权利要求1所述的寡核苷酸引物。
3.权利要求2的寡核苷酸引物对，其由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和2组成，或由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和4组成。
4.一种检测样品(如牛奶等)中布鲁氏菌的方法，包括：
(1)针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计至少一对特异性PCR扩增引物(例如使用DNAstar和OLIGO两种软件)；
(2)非必需地，从所述样品提取总DNA；
(3)采用(1)所述引物对，以所述样品或者(2)中获得的总DNA为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增；
(4)非必需地，针对(3)获得的PCR扩增产物设计至少一对嵌套引物(例如使用DNAstar和OLIGO两种软件)，并采用该嵌套引物，以未经纯化的或者经纯化的(3)获得的PCR扩增产物为模板，进行嵌套PCR扩增；
(5)鉴定(3)或者(4)中特异性扩增产物的存在。
5.权利要求4的方法，其中所述样品是牛奶。
6.权利要求4-5任一项的方法，其中所述布鲁氏菌是流产布鲁氏菌(Brucella abortus)。
7.权利要求4-6任一项的方法，其中所述方法包括(2)的步骤。
8.权利要求4-7任一项的方法，其中所述方法包括(4)的步骤。
9.权利要求4-8任一项的方法，其中(4)中的模板是未经纯化的(3)获得的PCR扩增产物。
10.权利要求4-9任一项的方法，其中(5)所述的鉴定包括将扩增产物进行电泳，优选琼脂糖凝胶电泳。
11.权利要求4-10任一项的方法，其中(1)或者(4)中设计的引物对包含权利要求2或者3所述的引物对。
12.权利要求4-11任一项的方法，其中(1)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对，而(4)中设计的引物对包含由寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成的引物对。
13.权利要求4-11任一项的方法，其中本方法的灵敏度达到50-100cfu/ml奶样。
14.用于检测样品中布鲁氏菌或者诊断动物的布鲁氏菌病的试剂盒，该试剂盒包括针对布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌(Brucellaabortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物，所述引物优选包括SEQ ID NO：1-4中的一种或者多种；所述试剂盒任选地还包括阳性对照，如质粒阳性对照，其它用于PCR扩增的试剂，如耐热DNA聚合酶等。
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