CN106350571A

CN106350571A - 一种快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法

Info

Publication number: CN106350571A
Application number: CN201610765198.1A
Authority: CN
Inventors: 李永清; 黄秀芬; 许健; 徐福洲; 郭芳芳
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106350571B

Abstract

本发明公开了一种快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法，该方法包括采集奶样、增菌培养、药敏试验。本发明自行配制了两种奶牛乳房炎主要致病菌生长的培养基,通过细菌生长曲线试验证明,与奶牛乳房炎相关的10种主要致病菌在这两种培养基的生长速度无明显差异，然后在上述培养基上建立了快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法。该方法与常规方法相比，不仅时间上缩短至2‑3天，而且减少了细菌分离并逐个菌进行药敏试验的工作量和试验材料。更重要的是，该方法能够让所有致病菌同时在一起生长，即所筛选到的敏感抗生素能够对所有引起奶牛乳房炎的细菌起到抑制作用，为临床上提供更好的治疗效果。

Description

一种快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法

技术领域

本发明涉及奶牛乳房炎防治技术领域，具体涉及一种快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法。

背景技术

奶牛乳房炎是影响奶牛业发展的主要疾病之一。据世界奶牛协会统计，全世界约有1/3的奶牛患有各种类型的乳房炎，每年因乳房炎造成的经济损失达350亿美元。据报道，在美国，每年因乳房炎造成的经济损失达20亿美元，在新西兰，每年因乳房炎造成的经济损失超过3亿新西兰元。近期的研究发现，国外奶牛乳房炎的发病率平均25％～60％，不同国家每年每头奶牛因奶牛乳房炎而造成的经济损失达61-93英镑。日本奶牛乳房炎平均患病率45.1％。西欧部分经济发达国家奶牛隐性乳房炎发病率也高达25％。在我国，奶牛临床型乳房炎的平均发病率33.41％，隐性乳房炎的阳性率46.40％～85.70％，发病率均高于国外报道，每年造成的直接经济损失达30亿元人民币。

虽然引起奶牛乳房炎的因素很多，但病原性细菌感染是主要途径。目前发现，与奶牛乳房炎相关的常见菌大约有20多种，主要包括无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、化脓性棒状杆菌等。而抗生素一直以来是治疗奶牛细菌性乳房炎的主要手段,因为它具有快速、准确及费用低等优点。但由于耐药菌株的存在，往往会降低抗生素的使用效果，因此临床上进行乳房炎治疗之前，应该首先找到致病菌敏感的抗生素，然后针对性用药，以保证治疗效果。

迄今为止，人们获得治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法仍是先进行细菌的分离与鉴定，然后将利用鉴定后的细菌纯培养物进行药敏试验。这样不仅费时费力(从奶样采集-划线分离-增菌培养-形态观察-生化鉴定-药敏试验这一过程至少需要6-7天时间)，而且由于奶牛乳房炎的发生往往是由多种引起致病菌，而常规的细菌分离程序无法全部覆盖所有的病原菌，以至于药敏试验所筛选到的抗生素在治疗时仍具有局限性。同时，由于针对不同的细菌选用不同的培养基，虽然可以获得特定的细菌，但耗费了更多的材料，造成诊断和治疗的成本升高。

发明内容

针对现有方法的上述缺点，本发明通过制备适合奶牛乳房炎主要致病菌生长的通用培养基，然后将采集的奶样在液体通用培养基增菌后，直接涂布另一种固体通用培养基的平皿进行药敏试验。这样不仅时间上缩短至2-3天，而且减少了细菌分离并逐个菌进行药敏试验的工作量和试验材料。更重要的是，该方法能够让所有致病菌同时在一起生长，即所筛选到的敏感抗生素能够对所有引起奶牛乳房炎的细菌起到抑制作用，为临床上提供更好的治疗效果提供了有利依据。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案目是提供一种快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法，该方法首先对奶样进行增菌培养，然后进行药敏试验。其中所述增菌培养是将奶样中的奶牛乳房炎致病菌在一起同时培养，并且使奶样中的奶牛乳房炎致病菌的生长曲线无显著差异。该方法与现有方法比快速、简单、有效，节省了很多时间和经济成本，如图1所示。

优选的，所述增菌培养是将奶样在通用液体培养基中培养，该液体培养基为：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入1-2.5mM/L KCl，10-20mM/L MgCl₂，10-20mM/L MgSO₄，10-20mM/L葡萄糖，1-15％(v/v)的胎牛血清。本培养基在大部分引起奶牛乳房炎的细菌均能生长的胰蛋白胨大豆肉汤作为基础培养基进行改良，通过加入氯化钾、氯化镁以及硫酸镁来增强大肠杆菌生长，通过加入葡萄糖和牛血清增强沙门氏菌生长，此外加入牛血清，以利于巴氏杆菌和棒状杆菌属生长。在37℃培养条件下，不同细菌在本培养基生长速度基本一致。

优选的，所述药敏试验是将经增菌培养后培养物在固体培养基上进行药敏试验，该固体通用培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入1-15％(v/v)胎牛血清，0.005-0.02g/LNAD。TSA血清平板能适合临床常见的多种微生物的生长，加入适量NAD后有利于巴氏杆菌和嗜血杆菌的生长，这样极大限度地保障了奶牛乳房炎主要致病菌的生长。

具体地，所述方法包括如下步骤：

(1)采集奶样：先用温水，后用消毒水(0.2％新洁尔灭等)洗净奶牛乳房和乳头，再以75％酒精棉球擦拭乳头和操作者手指，挤出前二把奶摒弃，然后用一次性无菌试管收集2-3毫升奶样，密封并标明牛号和采血日期；

(2)增菌培养：采集好的奶样接种于奶牛乳房炎通用液体培养基中培养，观察各试管混浊程度，挑选出已混浊的样品；所述通用液体培养基为：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入1-2.5mM/L KCl，10-20mM/L MgCl₂，10-20mM/L MgSO₄，10-20mM/L葡萄糖，1-15％(v/v)的胎牛血清；

(3)药敏试验：将混浊的增菌培养物涂抹于奶牛乳房炎通用药敏试验固体培养基平板上并吹干,以灭菌的小镊子将药敏纸片粘到琼脂表面37℃培养过夜，观察和测量抑菌圈直径大小，根据抑菌圈的直径判定耐药、中度敏感和高度敏感；所述固体通用培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入1-15％(v/v)胎牛血清，0.005-0.02g/L NAD。

进一步地，所述方法还包括细菌生长曲线测定的步骤。

本发明通过细菌生长曲线测定以及联合药敏试验表明，本方法利用奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基培养后，直接在奶牛乳房炎主要致病菌通用固体培养基平板进行药敏试验，能够筛选出治疗用的敏感抗菌药物。该方法不仅大大地缩短了检测时间，而且能够覆盖更多的致病菌，比现有方法更适合临床使用。

更进一步地，本发明还提供了一种通用液体培养基，所述通用液体培养基为：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入1-2.5mM/L KCl，10-20mM/L MgCl₂，10-20mM/L MgSO₄，10-20mM/L葡萄糖，1-15％(v/v)的胎牛血清。

优选的，所述通用液体培养基为：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入2.5mM/L KCl，10mM/L MgCl₂，10mM/L MgSO₄，20mM/L葡萄糖，5％(v/v)的胎牛血清。

本发明还提供了所述通用液体培养基在增菌培养中的应用。

本发明还提供了所述通用液体培养基在筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素中的应用。

再进一步地，本发明还提供了一种通用固体通用培养基，该培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入1-15％(v/v)胎牛血清，0.005-0.02g/L NAD。

优选的，所述固体通用培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入5％(v/v)胎牛血清，0.01g/L NAD。

本发明还提供了所述通用固体培养基在药敏试验中的应用。

本发明还提供了所述通用固体培养基在筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素中的应用。

有益效果

本发明自行配制了两种奶牛乳房炎主要致病菌生长的培养基,通过细菌生长曲线试验证明,与奶牛乳房炎相关的10种主要致病菌在这两种培养基的生长速度无明显差异，然后在上述培养基上建立了快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法。该方法与常规方法相比，不仅时间上缩短至2-3天，而且减少了细菌分离并逐个菌进行药敏试验的工作量和试验材料。更重要的是，该方法能够让所有致病菌同时在一起生长，即所筛选到的敏感抗生素能够对所有引起奶牛乳房炎的细菌起到抑制作用，为临床上提供更好的治疗效果。

附图说明

图1快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的示意图；

图2奶牛乳房炎主要致病菌在通用液体增菌培养基内的生长曲线；

图3金黄色葡萄球菌在通用固体培养基上的药敏试验；

图4奶牛乳房炎相关细菌及其混合物在通用固体培养基进行的药敏试验。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实验材料准备和说明：

奶牛乳房炎相关细菌:金黄色葡萄球菌,牛肠炎沙门氏菌,牛大肠杆菌，乳房链球菌,停乳链球菌,无乳链球菌，表皮葡萄球菌，牛化脓性隐秘杆菌，牛多杀性巴氏杆菌，牛短芽孢杆菌共10株菌种，均购自中国兽药监察所。

牛奶样品：河北奶牛场，其中临床乳房炎样品31份，隐性乳房炎19份。采奶时，先用温水，后用消毒水(0.2％新洁尔灭等)洗净奶牛乳房和乳头，再以75％酒精棉球擦拭乳头和操作者手指，挤出前二把奶摒弃，然后用一次性无菌试管收集2-3毫升奶样，密封并标明牛号和采血日期。奶样的保存和运输均在低温下进行并在6小时内进行实验。

本发明所用培养基如下：

胰蛋白胨大豆肉汤，购自美国BD公司，产品批号：4090289

胰酶大豆琼脂，购自美国BD公司，批号：3252485

胎牛血请：美国Hyclone公司生产，批号：GYC0112

KCl：北京化工厂，分析纯，产品批号：20160108

MgSO₄:北京化工厂，分析纯，产品批号：20151109

MgCl₂:北京化工厂，分析纯，产品批号：20160202

葡萄糖：北京精求化工有限责任公司产品，批号：20140417

药敏纸片：英国OXOID公司产品，包括182种抗菌药物,每次选取20-30种常用抗菌药敏制片进行试验。

配制通用液体培养基：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入2.5mM/L KCl，10mM/LMgCl₂，10mM/L MgSO₄，20mM/L葡萄糖，5％(v/v)的胎牛血清。

配制通用固体通用培养基：所述固体通用培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入5％(v/v)胎牛血清，0.01g/L NAD。

实施例1奶牛乳房炎相关细菌的生长曲线测定

1.1以1μl接种环分别蘸取金黄色葡萄球菌,牛肠炎沙门氏菌,牛大肠杆菌，乳房链球菌,停乳链球菌,无乳链球菌，表皮葡萄球菌，牛化脓性隐秘杆菌，牛多杀性巴氏杆菌，牛短芽孢杆菌等10株菌种的菌液，于TSA+5％FBS培养基上划线纯培养。

1.2分别挑取单个菌落接种到奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基中，然后37℃，200rpm摇菌过夜。

1.3重复上述步骤2次，以获得稳定生长的菌落

1.4再分别挑取上述菌种的单个菌落接种到奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基中，37℃，200rpm摇菌12小时。

1.5观察上述细菌培养物的混浊程度，并以分光光度计分别测定OD600值。

1.6利用奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基，分别将上述细菌培养物稀释到OD600值＝1.0

1.7对已调整至OD600＝1.0的各管细菌分别按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4进行系列稀释，并且每个稀释度作3个重复，然后将各稀释好的样品分别加到全自动生长曲线分析仪(BIOSCREEN公司)测定板的对应孔中。

1.8结果

选取10种稳定生长奶牛乳房炎相关细菌，以相同的初始浓度在上述通用增菌培养基中培养，全自动细菌生长曲线仪测定各细菌生长动态。结果发现，10000稀释后的各细菌的对数生长期均在6-24小时内，而且不同细菌之间生长速度没有明显差异(图2)。

实施例2奶牛乳房炎相关细菌的药敏试验

2.1分别吸取100μL实施例1中9种细菌培养物及其混合培养物及其细菌的混合物(之前加入等量的通用培养基使OD600＝0.5)于奶牛乳房炎通用药敏试验固体培养基平板涂抹,稍微吹干后,以灭菌的小镊子将药敏纸片粘到琼脂表面。每个平板贴7块纸片，即中心一片，周围等距离范围6片。每个样品3块平板，共21种抗菌药物。为了使药敏片与培养基紧密相贴，用镊子轻轻按压药敏片。将药敏片置37℃培养箱过夜，观察和测量抑菌圈直径大小。

2.2增菌培养：取100μL奶样接种于3ml的奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基中，置37℃，200rpm摇菌过夜。观察各试管混浊程度，挑选出已混浊的样品进行下一步试验。

2.3测定样品：取100μL增菌培养物(混浊)于奶牛乳房炎主要致病菌通用药敏试验固体培养基平板涂抹,稍微吹干后,以灭菌的小镊子将药敏纸片粘到琼脂表面。每个平板贴7块纸片，即中心一片，周围等距离范围6片。每个样品3块平板，共21种抗菌药物。为了使药敏片与培养基紧密相贴，用镊子轻轻按压药敏片。置37℃培养箱过夜，观察和测量抑菌圈直径大小。抑菌圈为药敏纸片为中心的透明范围，测定其直径后，根据OXOID公司提供的参考，判定耐药、中度敏感和高度敏感。

2.4结果

首先金黄色葡萄球菌,牛肠炎沙门氏菌,牛大肠杆菌，乳房链球菌,停乳链球菌,无乳链球菌，牛化脓性隐秘杆菌，牛多杀性巴氏杆菌，牛短芽孢杆菌等9种不同奶牛乳房炎相关细菌纯培养物分别在通用固体培养基对21种抗生素表现了不同的敏感性。例如金黄色葡萄球菌对除萘定酸外的抗菌药物均敏感，如图3所示。但上述各细菌的混合物对抗生素的敏感性则取决于耐药细菌的情况，即只有对上述各细菌具有中度以上的抑制作用的抗菌药物才能使混合培养物表现出高度敏感，而若有2种以上细菌单独发生耐药现象的药物，则对混合物没有明显抑制作用，如图4所示。唯一例外的是卡那霉素，虽然出现牛化脓性隐秘杆菌的耐药现象，但依然高度抑制了混合培养物的生长，这可能与牛化脓性隐秘杆菌生长速度相对稍慢有关(表1)。

表1奶牛乳房炎主要致病菌在通用固体培养基上的药敏试验结果

注:表中文字表示细菌对药物的敏感性,”高”为高度敏感,“中”为中度敏感,“耐”为耐药；数字表示抑菌圈的直径(cm)

应用例1北京顺义某奶牛场

共检测的样品包括奶牛临床乳房炎样品11份,其中9份样品经奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基增菌后在奶牛乳房炎主要致病菌通用药敏试验固体培养基平板上长出大量的各种形态的菌落，即细菌感染率为81.82％；干奶期样品共33份，其中中段奶20份，18份含有细菌，而后段奶13份，长菌11份，干奶期奶样细菌污染率为87.88％(29/33)。

21种抗生素的药敏试验结果表明:在乳房炎样品中高度抑菌药物分别为庆大霉素(100％)，左氧氟沙星(77.7％)以及氯霉素(77.7％)；在干奶期中段奶样品中表现高度抑菌的抗生素分别为庆大霉素(100％)，左氧氟沙星(100％)以及恩诺沙星(100％)，后段奶样为庆大霉素(100％)，氯霉素(100％)，左氧氟沙星(93.1％)以及恩诺沙星(93.1％)，由此可见治疗临床乳房炎的最好抗生素为庆大霉素以及左氧氟沙星；而用于干奶的抗生素应为庆大霉素、左氧氟沙星以及恩诺沙星(见表2)。

表2北京顺义某奶牛场临床乳房炎药敏试验结果

应用例2河北定兴某奶牛场

共检测奶牛隐性乳房炎样品15份，所有样品经奶牛乳房炎主要致病菌通用液体增菌培养基增菌后在奶牛乳房炎主要致病菌通用固体培养基平板上长出大量的各种形态的菌落，即细菌感染率为100％；29种抗菌药物的药敏试验结果表明：引起该牛群乳房炎的细菌对29种药物的耐药率20-92.90％,中度敏感率为0-30％，而高度敏感率为0-80％；敏感性最高的三种药物为：氯霉素、头孢噻肟、阿莫西林。它们对细菌的高度敏感率分别为80％，80％以及66.7％。(见表3和表3附表)。说明该牛群乳房炎的致病菌群存在着严重耐药现象。

●表3河北定兴奶牛场隐性乳房炎药敏试验结果

注：表中文字表示细菌对药物的敏感性,”高敏”为高度敏感,“中敏”为中度敏感,“耐药”为细菌对该抗生素不敏感

●表3附表河北定兴奶牛场隐性乳房炎药敏试验结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种快速筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素的方法，其特征在于，该方法首先对奶样进行增菌培养，然后进行药敏试验；

其中所述增菌培养是将奶样中的奶牛乳房炎致病菌在一起同时培养，并且使奶样中的奶牛乳房炎致病菌的生长曲线无显著差异。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增菌培养是将奶样在液体通用培养基中培养；所述液体通用培养基为：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入1-2.5mM/L KCl，10-20mM/LMgCl₂，10-20mM/L MgSO₄，10-20mM/L葡萄糖，1-15％(v/v)的胎牛血清。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药敏试验是将经增菌培养后培养物在固体通用培养基上进行药敏试验，该固体通用培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入1-15％(v/v)胎牛血清，0.005-0.02g/L NAD。

4.如权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)采集奶样：先用温水，后用消毒水洗净奶牛乳房和乳头，再以75％酒精棉球擦拭乳头和操作者手指，挤出前二把奶摒弃，然后用一次性无菌试管收集2-3毫升奶样，密封并标明牛号和采血日期；

5.一种通用液体培养基，其特征在于，该培养基为：向每升胰蛋白胨大豆肉汤中加入1-2.5mM/L KCl，10-20mM/L MgCl₂，10-20mM/L MgSO₄，10-20mM/L葡萄糖，1-15％(v/v)的胎牛血清。

6.如权利要求5所述的培养基在增菌培养中的应用。

7.如权利要求5所述的培养基在筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素中的应用。

8.一种通用固体通用培养基，其特征在于，该培养基为：向每升胰酶大豆琼脂中加入1-15％(v/v)胎牛血清，0.005-0.02g/L NAD。

9.如权利要求8所述的培养基在药敏试验中的应用。

10.如权利要求8所述的培养基在筛选治疗奶牛乳房炎的敏感性抗生素中的应用。