CN109406345B - 一种药敏试验采样器及药敏试验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种药敏试验集采样器及药敏试验方法，包含专用的采样器，采样器容积约5mL，内盛装液体培养基1‑2mL,直径9cm的一次性平皿盛装的固体培养基1块，药敏试纸板1块。使用方法如下，用无菌的一次性采样器吸取动物活体或尸体的肝脏组织或病变组织，摇动采样器将组织与液体培养基混合恒温箱培养8‑12h，然后用采样器将培养物滴加到固体培养基表面，静置3‑10min，待培养基表面液体被吸干，再在培养基表面覆盖药敏试纸板，恒温培养箱培养12‑24h，根据抑菌圈的大小判定病料病原对药物的敏感性，指导临床选药和用药。本发明的简化了药敏试验操作过程和步骤，可在24小时内完成对细菌的抗菌药物筛选。更为重要的是降低了药敏试验对试验环境和操作人员的要求。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌检测技术领域，尤其涉及药敏试验采样器及药敏试验方法。
背景技术
在动物养殖产业中，尤其是随着集约化养殖程度的提高，各种细菌性疾病给养殖业造成的经济损失备受重视，因此使用抗生素防治细菌性疾病成为常态。但由于从业者的素质参差不齐，在养殖过程中存在大量不科学、盲目滥用抗生素的现象。造成很多致病性细菌产生了耐药性，导致抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，结果造成药物浪费，而且还延误病情，使死亡率升高，给养殖户带来很大的经济损失。同时，大量使用抗生素产生的耐药菌株还可能将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康造成潜在威胁，而抗生素药物在动物体内的蓄积与残留，导致食品安全问题，直接威胁到人类健康。
为了保证动物性食品安全，国内外提倡无抗养殖。如何避免滥用抗生素，科学地使用药物，药敏试验在临床诊断中的应用就显得非常重要。药敏试验旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验。利用药敏实验不仅可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，及时了解养殖场内病原微生物的耐药情况，更重要的是指导临床科学合理用药，避免盲目用药，养殖户可根据药敏试验结果自主的灵活选药，可以就地选出最经济有效的敏感药物，既能缩短病程，又能减少费用。
药敏实验有多种方法，其中纸片扩散法在临床上最常用。纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的固体培养基表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，在纸片的周围形成一种浓度梯度。而测试菌在纸片周围抑菌浓度范围内的培养基上不生长，在抑菌范围外的生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，抑菌圈越大说明测试菌对该药越敏感，该药对测试菌的最低抑菌浓度越小，临床上使用该药的效果可能更好。目前，药敏实验需要专门的实验环境、专业的设备和专业的技术培训。且存在以下三个缺点：1，周期长，药敏试验前必须完成病原微生物的分离鉴定，至少需要2天甚至数周；2.试验条件苛刻，一般要在“超净台”中用接种环进行划线接种。一般的养殖场和普通养殖户无法完成药敏实验，必须由专业人士实施。从采集样品到完成药敏实验至少需要2天，饲养员不能第一时间获得病原微生物对药物敏感性的结果，处于被动状态。3.试验对象种类非常有限，基本上是实验人员主观判断和挑选的微生物菌落，往往是病料中数量最多微生物种类，这可能会导致忽视病料中其他的微生物，尤其是在存在混合感染的病例中，而其他被忽视的微生物有可能疾病的原因所在。实际操作中即使省去鉴定病原微生物，从病原微生物分离到获得药敏试验结果也需要2～4天，且必须具备严苛的试验条件。而定期进行药敏试验有助于了解当地细菌对抗菌药的敏感性情况，现急需步骤简单，试验条件简单的药敏试验方法。专利CN1556217A虽然建立了一种“快速筛选病原微生物敏感药物的方法”，但不能避免“少量杂菌”污染，同时该方法提及的样本采取时需要一定的专业培训，如简单的无菌操作技术。
发明内容
为了克服现有的药敏试验对实验条件的限制，本发明的目的在于提供一种药敏试验采样器，改进药敏试验的取样方法，简化药敏试验的苛刻操作条件，提高药敏试验选药的准确性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种药敏试验采样器，包括滴管,滴管两端分别连接针座接头和盲管，盲管外依附有盖体，其特征在于，针座接头与采样针插拔连接，采样针包括针梗和针栓，针梗尖端为实心体，远离针梗尖端，针梗侧面设有与空腔连通的豁口，豁口内缘打磨成刃部，采样针内设有自针栓延伸至豁口的空腔，滴管采用透明的弹性塑料制成，针座接头采用塑料材质，盲管采用脆性塑料或有机玻璃。
以上采样器的药敏试验方法，优选地，包括以下步骤：J01.组装所述的采样器，捏压所述滴管，排除采样器内的部分空气；J02.将所述采样器刺入动物活体或尸体的肝脏组织或病变组织内，旋转所述采样器切割或吸取动物活体或尸体的肝脏组织或病变组织或体液，拔出采样针，再灼烫所述针座接头，使针座接头密封；J03.将采集的样品与液体培养基混匀，置于微型恒温培养箱培养8-12h；J04.然后掰断所述采样器的盲管末端，将采样器内样品逐滴均匀滴加到药敏试剂盒内的固体培养基表面，静置3-10min，待培养基表面液体被吸干，再在培养基表面覆盖药敏试纸板，将覆盖有药敏试纸板的培养基置于微型恒温培养箱培养12-24h，根据抑菌圈的大小判断病原微生物对药物的敏感性，指导临床用药，实现适时现场进行药敏试验。
以上采样器的药敏试验方法，优选地，所述的药敏试剂盒包括平皿和平皿盖，平皿内盛有固体培养基，平皿盖依附有塑料管，塑料管的盲端封闭，塑料管的开口端靠近平皿盖的盖缘布置，与棉绳连接的塑料膜封堵开口端，塑料管内装3-5颗玻璃珠，平皿盖扣合在平皿上；在步骤J04中，在药敏试剂盒内的固体培养基表面滴加采样器内的样品后，拉掉棉绳，扯下与塑料膜，倾斜平皿盖倒出玻璃珠，晃动平皿利用玻璃珠将样品涂布于固体培养基表面。
本发明的优点是能在复杂的环境中保证无菌采集病料样品进行药敏试验，对细菌的抗菌药物筛选一般可在24小时内完成。与传统的药敏试验方法相比，本方法选用采样器采集病例的深部组织进行增菌培养，简化和保证无菌操作，无需逐个对病料中的病原细菌进行分离、鉴定和药敏试验，而是将含有所有病原细菌的样本进行增菌培养后直接进行药敏试验，减少了细菌分离这一环节，大大缩短了试验周期，同时也降低了对试验环境和操作人员的要求。本方法虽然简单， 但在实际应用中却取得了难以预料的准确结果。
本发明与现有技术的区别在于：1.药敏片实验前采用采样器采集样品，并在采样器内进行增菌培养，然后经盲管将细菌培养物滴加到琼脂固体培养基表面，避免了细菌分离培养和纯培养等专业操作，减少了病料污染环节，而现有技术是必须经历分离细菌这一环节，挑取细菌培养物，以划线方式将细菌涂布在平皿培养基上，再逐一贴加药物试纸片进行药敏试验。本发明与现有的技术所采用的接种工具，接种的计量不同,接种后恒温培养的时间不同，实验不需要无菌环境，但采用了一次性实验工具，相当于将实验条件简化，将原本需要专业无菌操作的技术和实验环境才能进行的实验挪到了现场实施，节约了实验过程的时间，将样本采集和接种工具改为采样器，更易操作，消毒过程简化了。
本发明与CN1556217A相比，二者的基本原理和最终的目的是一致，但具体实施方法和过程存在很大的区别。CN1556217A需要较专业的采样技术，需要必要的专业培训，如手术器械的消毒和无菌采集病料，同时根据“比较各个分隔区内病原群落分布情况”筛选敏感药物，影响药敏试验结果的判断，尤其是在菌液涂布不均和含菌量过少时，而且在二次培养时需要“倒去多余液体”存在二次扩散病原菌的安全隐患。本发明中利用采样器可避开病料表面易受到污染的组织，采集切割深部组织，直接将组织与培养液进行增菌培养，保证采样的准确性，保证样品不受外界的污染，然后用采集器的盲管将液体滴加在固体培养基上，利用玻璃珠滚动均匀的涂布液体培养基，使用多个药敏试纸片同时检测病原菌对不同药物的耐药性。
2.本发明通过液体培养基增殖患病动物的脏器中的病原，减少了人为挑取可疑病原的环节，保持了病原所处的环境的稳定性和病原的多样性，因此增菌后的培养物中包含患病动物体内的各种病原，其中的各种病原之间的比例将接近患病动物体内的实际情况。药敏试验的结果更能全面的反映动物病原对药物的敏感性，对临床指导用药更具有针对性。患病动物体内可能会存在多种病原微生物，传统的技术进行分离培养后，一般只会挑选其中的有1-2种可疑的病原进行药敏试验。选取的病原种类有限，试验结果存在一定的局限性和人为误差因素。
3.传统试验方法采用手术直接从动物肝脏组织中取样，或破碎小型动物的尸体，势必会在手术过程和破碎动物尸体时引入杂菌，故需借助严苛的试验室环境，消除污染的影响，而本发明采用一次性消毒工具采集病料的深部组织，避免取样污染的因素，采样针针梗尖端为实心体，这样采样针在刺入动物活体或尸体时，能防止表面被污染的组织被挤入针梗尖端，采样器在采完样品后可以通过加热密封针座接头，隔绝外界含有杂菌的空气，经增菌培养后通过盲管转接到固体培养基，减少取样环节，避免样本受环境中的杂菌污染，取样方式具有普适性，便于对非专业检测员培训操作。
4.专利CN1556217A中液体培养基在固体培养基上自由扩散时，因液体存在表面张力，固体培养基表面的液体在干燥过程中聚集成多个团块，或有较多液体残留在平皿边沿，导致含菌液体分布不均，需要30min甚至更长的时间干燥。本发明使用玻璃珠在固体培养基表面自由无序滚动会带动液体培养基分散，使细菌更均匀地涂布在固体培养基上，具有良好的操作可控性，含菌液体被固体培养基吸收得更快，仅需3～10min。本发明简化药敏试纸片试验操作环节和实验环境和条件，缩短药敏试验的周期，实现药敏试验的“傻瓜化”。本发明新型的有益效果是：技术简单、实验装置简单、齐全、可操作性强，无需系统的专业培训，实现现场实地及时观察判断药敏试验结果。根据抑菌圈的大小判断微生物样品对药物的敏感性，指导药物选择和用药。
附图说明
图1是本发明的采样器的结构示意图；
图2是本发明的平皿的示意图；
图3是本发明的平皿的局部放大示意图；
图4是本发明的药敏试验的药物试纸片的使用状态图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述：本发明进行药敏试验包括3个基本过程，即动物肝脏组织采集、液体培养基增菌和药敏试验。
实施例1
所述采样器1如附图1～3所示，包括滴管1.1,滴管内可容纳液体培养基2mL，滴管两端分别连接针座接头2和盲管3，滴管1.1形状为圆柱体或直四棱柱，采用透明的弹性塑料制成，盲管3可用带橡胶垫3.2的盖体6.3密封，针座接头2采用塑料材质，针座接头与采样针插拔连接，用于连接采样针4或注射器针头，采样针4针梗4.1材质为金属或硬质塑料，长3-5cm，包括针梗4.1、及针栓4.2，针栓呈帽状，针梗4.1嵌入于针栓并向内腔4.4延伸，针座接头2表面覆盖薄膜2.1，所述针栓4.2套入所述针座接头2时，针梗4.1刺穿所述针座接头表面的薄膜2.1，针梗4.1尖端为实心体，针梗侧面设有长0.05cm× 0.2-0.5cm豁口5，采样针4内设有自针栓4.2延伸至豁口5的空腔4.3，豁口5内缘设有刃部5.1，在采集组织样品过程中转动采样针4时可以切割组织，保证采样顺畅起到重要作用；盲管3长0.5-2cm，采用脆性塑料或有机玻璃，折断盲管3后可用于滴加滴管1.1内采集的样品；盲管3外依附有盖体6.3，保证盲管3在使用前保持无菌，盖体6.3内可垫一个胶垫3.2，用于密封盲管3；如图3所示，所述的固体培养基为盛装在直径为9.0cm的一次性塑料平皿8内，平皿盖7内侧依附有塑料管9，塑料管9长度为2cm左右，塑料管9的盲端6.1远离平皿盖7的盖缘7.1，塑料管9的开口端6.2靠近平皿盖7的盖缘7.1布置，与棉绳10连接的塑料膜12封堵开口端6.2，塑料管9内装3-5颗直径3mm至5mm的玻璃珠11，滴加液体培养基后拉掉棉绳10，扯下与塑料膜12，倾斜平皿盖7倒出玻璃珠11，然后再晃动平皿8利用玻璃珠11涂布样品；药敏试纸板贴有7-9种药物试纸片，真空干燥保存。
实施例2
2017年7月，在湖北恩施某蛋鸡场发生产蛋率下降和腹膜炎等症状，初步诊断与细菌感染有关。
首先用采样针4抽取鸡的肝脏组织，先组装完整采样针4，用手指捏压滴管1.1，排除部分空气，将采样针4深入肝脏内部，放松手指同时转动采样针3-5次并适当改变针梗4.1在组织中的深度，直至滴管1.1回复原来的形状或者观察到滴管1.1中出现少量肝脏组织，滴管1.1中液体培养基颜色变红。从针座接头2向滴管1.1内注入液体培养基，再用加热的金属将针座接头2密封。将采集的组织与液体培养基混匀。液体培养基由5g牛肉粉、5g氯化钠、20g蛋白胨、100mL牛血清，900ml蒸馏水、配置的pH为7.4-7.6的营养液。然后放于37℃恒温培养箱中培养8h。拔掉采样器盲管3处的盖体6.3，掰断盲管3末端，将采样器中的液体逐滴均匀滴加在琼脂固体培养基8.1表面。如图3～4，在加样后先拉掉棉绳10扯下塑料膜12，然后倾斜平皿盖使玻璃珠从塑料管开口端倒出。晃动盛装固体培养基8.1的平皿使玻璃珠无序滚动将液体培养基铺满整个固体培养基表面，静置3-5min，将玻璃珠晃动至平皿边缘，再将自制药敏试纸板13铺在培养基表面。药敏试纸板13是贴有7-9种药敏贴片14的无菌塑料片，药物试纸板接触培养基表面，仅贴一次药敏试纸板，减少了污染的次数。将贴有药敏贴片的固体培养基放于37℃恒温培养箱中静置培养12h（过夜培养）。肉眼观察药物抑菌圈大小，选择恩诺沙星、氟苯尼考作为抗感染口服药物，投喂氟苯尼考3天后产蛋量稳定，死亡情况得到有效控制。
药敏片的制作
药敏片一般可以由厂家提供，也可以自己制作，制作药敏片直接选用各药厂的成品药来做。
制作药敏片设备和器皿：需要恒温箱、平皿（直径90mm或更大一点的都行）、烧杯、蒸馏水、滤纸、打孔器。
具体的操作步骤：
1、将滤纸用打孔器打好适量直径为6mm的小圆纸片。
2、将所需培养皿或玻璃小瓶、玻璃棒、微量吸管、镊子、滤纸、滤纸片等进行高压灭菌，一般121℃，0.15帕斯卡，15～20min。
3、在烘干箱或恒温箱内37～60℃，放置12～24小时直至烘干。
4、将要选的药用蒸馏水按药品使用治疗量的比例配制成药液，按5ml药液30～40个小圆纸片浸泡。
5、将浸泡好的药敏片用镊子夹出，放到另一干燥平皿中，注意药敏做的多时，放湿药敏片不要完全重叠地放。这样会使有的药敏片在干燥过程中所沾的药量不一，影响您对药的评价。因为有的药不溶，药厂会加一些助溶剂，干燥过程中有的药会析出。这时药敏片叠放位置会影响所沾的药量的。
6、将盛湿药敏片的平皿放到恒温箱中，温度37℃，放置12～24小时，不同的药干的时间也可能不一样，所以自己需要视情况而定。在这个过程中要注意勤翻一下药敏片，尽量不要让它们沾在一起。
7、药敏片的储藏：将烘干的药敏片分装，标上药名和日期，储存要注意防潮。短期可4℃冷藏保存3～6个月，长期要-20℃冷冻保存。
8、药敏贴片板上一般各纸片中心相距应大于24mm，可在中央贴一片，外周等距离贴7－8片。记住每种药敏纸片的名称。
对比例1
用酒精灯灭菌接种环后，挑取肝脏组织，或用灭菌的手术剪刀或刀片移除部分肝脏组织，涂布到麦康凯培养基表面，然后将培养基放于37℃培养箱培养12小时以上，便可观察到适当大小的菌落，但对于混合感染，还需延长培养时间至16-24h，以便挑取混合菌落中数量最多的菌落。在麦康凯培养基表面有多种颜色不同的菌落，数量最多的呈红色，另一种呈灰白色。分别挑取2种不同的菌落涂布新的TSA培养基，再逐一贴放8-9种药敏试纸片，再将培养基放于37℃培养箱培养16-24h；2种细菌对同一种药物的敏感程度存在一定的差异，9种受试药物中对恩诺沙星、氟苯尼考比较敏感。
实施例3
2017年10月，广西某集约化猪场产仔房的7日龄内仔猪发生拉黄色湿粪，连用双黄连注射液3天未见好转，部分仔猪脱水。根据仔猪病情，怀疑与细菌感染有关，细菌对双环连有一定耐受性，决定进行药敏试验，筛选敏感药物。
提前将2mL普通肉汤培养基盛装入采样器中，用采样器抽取病猪小肠肠内容物或肝脏组织，用打火机火焰密封针座接头2，37℃摇床上培养6h。然后取1mL液体培养物，逐滴均匀接种普通营养琼脂进行药敏实验，将贴有药敏贴片板的固体培养基放于37℃恒温培养箱中静置培养12h（过夜培养）。操作方法同实施例1。根据药敏试验中抑菌圈的大小，选择选用庆大霉素和替米考星口服，2天后病情得到控制，仔猪黄痢消失，粪便成形。
对比例2
用灭菌棉签采集肛门拭子，或用灭菌的手术剪刀或刀片移除部分肝脏组织，涂布到麦康凯培养基表面，然后将培养基放于37℃培养箱培养16-24h；在麦康凯培养基表面长出众多红色菌落。用接种环挑取红色菌落涂布新的营养琼脂培养基上，再逐一贴放8-9种药敏试纸片，再将培养基放于37℃培养箱培养16-24h。9种受试药物中，庆大霉素和替米考星的抑菌圈比较大。由于一种取样方式下取样部位为肛门，该处受环境污染较大，取样后的培养时间为16-24h可以观察到明显的疑似菌落。
实施例中用采样器取样可以取病料组织深部的组织样本，减少样本污染的环节和机会，也可以实现活体取样。而对比例中用非采样器取样，如对病灶组织进行破碎，或棉签蘸取液体后进行培养，样本暴露空气中易受到环境污染，切取样过程若选用活体动物则需手术过程，非专业人士难以操作，在细菌分离后形成的菌落若受取样环节的污染，导致选错菌落，增加认为误差，则显著影响药敏试验结果；另外，在取样增菌过程中手续相对专业和繁琐，需要无菌的操作环境和专业技能训练。在试验周期上，实施例2是对比例的1/2；在方便性方面，实施例2可以实现现场无专业技术培训操作。
该发明阐述了一种在极端简陋与落后的条件下有效的完成药敏试验，技术简单，对人员素质和实验条件和设备要求低，非常适合临床基层的养殖单位。利用该发明，养殖者自己可以合理地选择并科学使用药物。该发明受国家重点研发计划项目“家禽重要疫病诊断与检测新技术研究2016YFD0500800”资助。
Claims (1)
1.一种基于药敏试验采样器的药敏试验方法，药敏试验采样器包括滴管,滴管两端分别连接针座接头和盲管，盲管外依附有盖体，其特征在于，针座接头与采样针插拔连接，采样针包括针梗和针栓，针梗尖端为实心体，远离针梗尖端，针梗侧面设有与空腔连通的豁口，豁口内缘打磨成刃部，采样针内设有自针栓延伸至豁口的空腔，滴管采用透明的弹性塑料制成，针座接头采用塑料材质，盲管采用脆性塑料或有机玻璃；
药敏试验方法，包括以下步骤：J01.组装所述的采样器，捏压所述滴管，排除采样器内的部分空气；J02.将所述采样器刺入动物尸体的肝脏组织或病变组织内，旋转所述采样器切割或吸取动物尸体的肝脏组织或病变组织或体液，拔出采样针，再灼烫所述针座接头，使针座接头密封；J03.将采集的样品与液体培养基混匀，置于微型恒温培养箱培养8-12h；J04.然后掰断所述采样器的盲管末端，将采样器内样品逐滴均匀滴加到药敏试剂盒内的固体培养基表面，静置3-10min，待培养基表面液体被吸干，再在培养基表面覆盖药敏试纸板，将覆盖有药敏试纸板的培养基置于微型恒温培养箱培养12-24h，根据抑菌圈的大小判断病原微生物对药物的敏感性，指导临床用药，实现适时现场进行药敏试验；
所述的药敏试剂盒包括平皿和平皿盖，平皿内盛有固体培养基，平皿盖依附有塑料管，塑料管的盲端封闭，塑料管的开口端靠近平皿盖的盖缘布置，与棉绳连接的塑料膜封堵开口端，塑料管内装3-5颗玻璃珠，平皿盖扣合在平皿上；在步骤J04中，在药敏试剂盒内的固体培养基表面滴加采样器内的样品后，拉掉棉绳，扯下与塑料膜，倾斜平皿盖倒出玻璃珠，晃动平皿利用玻璃珠将样品涂布于固体培养基表面。
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