CN111548943B - 黄花棘豆内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供黄花棘豆内生真菌，所述黄花棘豆内生真菌为三线镰刀菌Fusarium tricinctum ZS‑1菌株，保藏编号：CGMCC 18596。本发明还提供该内生真菌提取物的提取方法及该提取物在抑菌中的应用。实验证明，黄花棘豆内生真菌提取物对耐甲氧西林表皮葡萄球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，霉菌均有良好的抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌活性最佳，在兽药临床上具有广阔的推广应用价值。

Description

黄花棘豆内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株黄花棘豆内生真菌，还涉及该内生真菌提取物在抑菌中的应用。
背景技术
黄花棘豆(Oxytropis flavescens)是豆科棘豆属(Oxytropos)植物，其内生真菌能够通过产生一种吲哚里西定类生物碱而使黄花棘豆带有毒性。内生真菌(Endophyticfungus)是指部分生活史或几乎全部、甚至整个生活史都在各种健康组织、器官的内部或者细胞间隙中寄生，却不使寄主表现出明显感染病害症状的一类真菌。
近年来，因微生物病原体引起的多种疾病已受到人们更多的关注。表皮葡萄球菌感染率和死亡率随着临床中使用生物材料(假体，心脏瓣膜，骨髓移植等)的增加而上升，因此，临床上广泛使用甚至滥用抗生素，最终使表皮葡萄球菌出现对甲氧西林具耐药性的耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus epidermis，MRSE)而成为一个巨大威胁；大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)存在于人类和动物的正常肠道微生物群中，有些菌株与人类关注的多种疾病有关；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)可以引起包括金黄色葡萄球菌烫伤皮肤综合症、败血性关节炎、心内膜炎和呼吸问题在内的多种疾病，同时它也是引起肺炎的病原体之一；霉菌(moulds)是对丝状真菌的其中一类的俗称，生长速度快，可造成污染带来经济损失，使产业发展受阻，部分菌种为植物病原菌使植物死亡，部分菌种可使人或畜患病，常见的霉菌有青霉，曲霉，链霉等等。
目前研究表明，已从植物内生真菌分离出多种的活性物质(抗病毒类，抗菌类等)，其中一些新物质具有特殊的生物活性。对植物内生真菌产生的次级代谢物的研究表明其作用近似寄主植物，其中一部分拥有药用的潜力，一部分在经过抗菌筛选实验后确定具有不同程度的抑制多种常见的致使动植物患病的病原菌生长的活性，可用于为病害生物防治进行微生物制剂的研发。目前针对植物内生真菌有效物质的提取，通常多为针对发酵液或菌丝体，通过浓缩或萃取的途径提取，提取物通常为水提取物或醇提取物。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一株黄花棘豆内生真菌ZS-1。
本发明获得了黄花棘豆内生真菌ZS-1，并通过ITS全序列分析鉴定其种属，通过固体培养和液态发酵观察形态学特征和培养条件，在设计并进行预实验的基础上获得有效物质提取的最佳方法，并以四种病原菌(表皮葡萄球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，霉菌)为供试进行有效提取物质的抑菌活性研究，探究以揭示黄花棘豆内生真菌ZS-1有效提取物质的抑菌活性及最低抑菌浓度(MIC)值，以期确定黄花棘豆内生真菌ZS-1种属及有效物质的提取方法、抑菌特性，并为日后对其进行深入研究提供理论基础及依据。
本发明提供黄花棘豆内生真菌，所述黄花棘豆内生真菌为三线镰刀菌Fusariumtricinctum ZS-1菌株，保藏编号为CGMCC 18596，保藏日期为2019年10月21日，保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供上述黄花棘豆内生真菌提取物的提取制备方法，将培养黄花棘豆内生真菌的的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加入超纯水超声后离心，取上清，利用旋转蒸发仪将水挥干，即为黄花棘豆内生真菌三线镰刀菌水提取物；
将培养黄花棘豆内生真菌的的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加入无水乙醇后离心，取上清，先用旋转蒸发仪浓缩，再用水浴加热浓缩，收集浓缩提取物，即为黄花棘豆内生真菌三线镰刀菌乙醇提取物。
作为优选，将培养黄花棘豆内生真菌的的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加超纯水，超声10-30min，超声后10000rpm反复离心2次，每次30s-60s，取上清置旋转蒸发仪进行旋蒸，转速为60～75rpm，温度为80～100℃,收集挥干后提取物，即为三线镰刀菌水提取物；
将培养黄花棘豆内生真菌的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加无水乙醇，超声10～30min，超声后10000rpm反复离心2次，每次30s-60s，取上清先用旋转蒸发仪浓缩，旋转蒸发仪转速为70rpm，温度为55-70℃，再用65～70℃水浴加热浓缩至浸膏，即为三线镰刀菌无水乙醇提取物。
本发明提供黄花棘豆内生真菌提取物，是应用上述方法制备得到的。
本发明提供上述黄花棘豆内生真菌提取物在制备抑菌药物中的应用；所述菌为耐甲氧西林表皮葡萄球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和/或霉菌。
作为优选，所述黄花棘豆内生真菌提取物对耐甲氧西林表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.434mg/ml。
作为优选，所述黄花棘豆内生真菌提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.434mg/ml。
作为优选，所述黄花棘豆内生真菌提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.944mg/ml。
本发明从青海采集的黄花棘豆中分离出一株内生真菌ZS-1，发现其具有良好的抑菌活性，为了明确其菌种种类和生物活性，对菌株进行固体培养与液态发酵后，运用显微镜观察分析菌株生长形态特征和培养特性，利用ITS全序列分析鉴定，确定该分离菌株为三线镰刀菌(Fusarium tricinctum.)，并采用药敏纸片法测定了对耐甲氧西林表皮葡萄球菌MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)，金黄色葡萄球菌(CICC10384)，霉菌的抑菌活性及最小抑菌浓度(MIC)值。结果表明，ZS-1为三线镰刀菌，对MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)，金黄色葡萄球菌(CICC10384)的MIC值分别为0.434mg/ml，0.944mg/ml，0.434mg/ml，对大肠杆菌的抑菌活性最佳，为后续进一步深入研究三线镰刀菌与其应用提供理论基础与依据。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为菌株ZS-1固体培养1-30d形态学特征。
图2为菌株ZS-1液体培养7d形态学特征。
图3为菌株ZS-1显微形态特征。
图4为三线镰刀菌ZS-1的基因序列。
图5为三线镰刀菌ZS-1对MRSE(ATCC43300)的药敏抑菌结果。
图6为三线镰刀菌ZS-1对大肠杆菌(CICC10389)的药敏抑菌结果。
图7为三线镰刀菌ZS-1对金黄色葡萄球菌(CICC10384)的药敏抑菌结果。
图8为三线镰刀菌ZS-1对霉菌的药敏抑菌结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1.黄花棘豆内生真菌ZS-1菌株的获得
从青海采集的黄花棘豆中分离出一株内生真菌(编号ZS-1)，具体获得方法为：将从青海省贵德县采集的黄花棘豆全草先用70％的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量为1％的次氯酸钠溶液浸泡3min，然后用灭菌去离子水清洗3次，每次1min，无菌滤纸吸干水分；将表面消毒的材料剪切成0.5cm2小块，放入分离培养基(PDA)的平板中28℃条件下恒温培养观察，待观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入PDA平板培养，观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一PDA平板培养，获得黄花棘豆内生真菌ZS-1。
2.材料
2.1菌株
步骤1获得的黄花棘豆内生真菌ZS-1。
供试菌株为：耐甲氧西林表皮葡萄球菌MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)，金黄色葡萄球菌(CICC10384)，霉菌(实验室杂菌制备)。
2.2培养基
用于培养菌株ZS-1：PDA培养基，制备方法为马铃薯(去皮)200g加1000ml超纯水煎煮30min，过滤后滤液中加入葡萄糖20g，琼脂15g，补液至1000ml，121℃高压灭菌15min,调节pH＝6.0，加入氯霉素0.2g。PDB培养基，制备方法为马铃薯(去皮)200g，加1000ml超纯水煎煮30min，过滤后滤液中加入葡萄糖20g，补液至1000ml，121℃高压灭菌20min，调节pH＝5.6，加入金霉素1mL(25mg/mL)。
用于培养供试菌株：MHA培养基、MHB培养基、NA培养基。
2.3试剂与仪器
主要试剂有：无菌水，超纯水，无水乙醇，吐温80，DMSO购自莱阳化工试验厂，TTC溶液，液体石蜡，固体石蜡。
主要仪器有：超纯水机购自四川沃特尔，生物安全柜购自上海力申，超净操作台，立式高压蒸汽灭菌锅购自上海申安，CO2培养箱与恒温培养箱购自上海鸿都电子科技有限公司，恒温培养振荡器购自天津欧诺仪器股份有限公司，超声波提取器购自昆山市超声仪器有限公司，高速冷冻离心机购自贝克曼库尔特，电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，旋转蒸发仪购自深圳市华测计量，干燥箱购自沪南电炉烘箱厂，96孔细胞培养板。
3.方法
3.1分离纯化
3.1.1接种
接种时，取菌株ZS-1的PDA培养平板，用75％酒精喷雾消毒，放入生物安全柜后棉球搽拭平板培养基表面进行灭菌，在组织研磨器中加入5ml无菌水，用镊子撕取原始菌株ZS-1的菌丝，放入组织研磨器中研磨成菌悬液(组织研磨器接触空气后需火焰灼烧并在内壁等待冷却再进行研磨)。用移液枪吸取1ml研磨好的菌悬液接种于PDA平板培养基上，使用一次性涂布器涂布均匀，菌株编号标记放入25℃恒温培养箱培养20-30d。取出已接种培养生长有菌丝的PDA平板，采用菌丝尖端挑取法挑取菌丝接种于多个PDA培养基上，用一次性接种环“z”字形划线接种，放入25℃恒温培养箱进行扩大培养20-30d；用一次性接种环刮取菌丝接种于PDB培养基并搅拌混匀、封口并标记，放入25℃，130r/min摇床进行液体培养7-10d。液体培养后，使用移液枪吸取1ml发酵液及菌丝球接种于PDA培养基以验证发酵液中是否是杂菌(移液枪枪头可用灭菌后的剪刀剪去一部分以方便吸取菌丝球)。
3.1.2形态学观察
在ZS-1菌株PDA平板培养中，肉眼观察菌株生长变化，包括生长速度，菌落形状，菌落大小，菌落颜色等。在液体培养中，肉眼观察菌丝球、发酵液形态，颜色，并进行记录。
显微镜观察：滴一滴无菌水于载玻片中央，用镊子夹取菌丝，盖片后轻压盖玻片使菌丝散开，于光学显微镜下观察并拍照记录显微形态特征。
3.1.3菌种鉴定
ITS全序列分析鉴定测序鉴定：取3.1.1平板培养后的ZS-1菌株以封口膜封口后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
3.2ZS-1内生真菌发酵产物提取
3.2.1水提取物的制备
取出PDA平板培养的ZS-1菌株，75％酒精灭菌，刮菌铲灼烧后，刮取平板表面菌丝和与菌丝粘连的部分培养基(捣碎)置于离心管中，加超纯化水，置超声波提取器中超声20min，期间保持离心管在超声波提取器中直立，超声后，10000rpm反复离心2次，每次60s，取上清，利用旋转蒸发仪将水挥干，旋转蒸发仪转速为75rpm，温度为95℃，收集挥干后提取物，用电子天平进行称重，得到水提取物A，再用1ml超纯水溶解，置于1.5ml离心管中备用，并计算水提取物A的浓度，水提取物浓度为13.90mg/ml。
3.2.2无水乙醇提取物的制备
取出PDA平板培养的ZS-1菌株，75％酒精灭菌，刮菌铲灼烧后，刮取平板表面菌丝和与菌丝粘连的部分培养基(捣碎)置于离心管中，加无水乙醇，置超声波提取器中超声20min，期间保持离心管在超声波提取器中直立，超声后，10000rpm反复离心2次，每次60s，将无水乙醇超声提取物上清先用旋转蒸发仪浓缩，旋转蒸发仪转速为70rpm，温度为70℃，再用70℃水浴加热浓缩至浸膏，即得到无水乙醇提取物B，称重后，加入吐温80:DMSO:超纯水(体积比例为1:1:18)进行溶解，并计算无水乙醇提取物B的浓度，无水乙醇提取物浓度为33.70mg/ml，4℃标记备用。
3.3药敏实验
3.3.1菌种复苏
将供试菌种：MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)，金黄色葡萄球菌(CICC10384)的冷藏保存的冻存管放入0-4℃冰箱融化，所用材料及工具高压灭菌并于超净工作台紫外灭菌。取出菌液已融化的冻存管，75％酒精灭菌，点燃酒精灯，取一次性接种针平板划线法接种供试菌株菌液于NA培养基上进行菌种复苏，三种供试菌种各接两个平板，标记后置于CO2培养箱37℃培养16h后取出。取一次性摇菌管，每管加5ml MHB培养基，自NA平板上挑取供试菌株单菌落于摇菌管中混匀以制备菌悬液，每种供试菌株接两个摇菌管，一管空白对照。NA固体平板放冰箱-4℃冷冻保存，摇菌管标记后放入摇床培养16h，摇床温度为37℃，转速为160r/min。
3.3.2药敏抑菌
使用打孔器与滤纸片制作药敏纸片，装入玻璃平板中，牛皮纸密封，高压蒸汽灭菌后放入超净工作台备用。一个平板至多检测三个样品。取一次性接种环与一次性涂布器分别用平板划线法与平板涂布法在做好标记的MHA培养基上接种复苏的供试菌菌悬液，平板划线法中以"z"字形对全平板培养基行"#"字形划线，平板涂布法中每平板接种200μl菌悬液。灼烧镊子，夹取2-3片高压灭菌过的药敏纸片放置在对应标记的位置上，用移液枪在药敏纸片上各滴加20μl标记对应的步骤3.2.1和3.2.2制备的水/醇提取物，滴加时注意滴加在药敏纸片正中间，使提取物质在药敏纸片上均匀吸收散开，前一滴吸收散开后再滴下一滴直至滴加完毕，防止提取物质溢出在药敏纸片外。置于CO2培养箱37℃下培养16h。
3.3.3霉菌抑菌测定
制备霉菌菌悬液：于实验室中选取被霉菌污染的固体平板，取一次性摇菌管加入5ml MHB培养基，灼烧刮菌铲，刮取霉菌加入MHB培养基中，使用匀浆器混匀。取MHA培养基，按照步骤3.3.2中的平板涂布法接种霉菌菌悬液并进行药敏抑菌实验。
3.3.4观察与测量
16-18h后取出平板观察抑菌圈并测量其大小，记录数据并拍照。
3.4MIC值测定
3.4.1菌种复苏
本实验在超净工作台中进行，按步骤3.3.1中方法进行供试菌种的复苏和菌悬液的制备。固体平板放冰箱-4℃冷冻保存，摇菌管标记后放37℃摇床培养16h，转速为160r/min。
3.4.2MIC测定
稀释供试菌悬液：取50ml灭菌离心管，加入25ml MHB培养基，各供试菌株分别加入50μl菌悬液，使用匀浆器混匀。
加样：将MHB培养基加入无菌96孔平板后敞口，不加盖；将枪头盒打开并保证竖向上无缺漏。使用时应与培养基约呈45°斜角确保每一个枪头取液平面一致。96孔细胞培养板第一列至第十列各加100μl MHB培养基。第一列分别加入水提取物、醇提取物各100μl，初始浓度分别为13.90mg/ml，33.70mg/ml，每96孔细胞培养板每种提取物加两个孔。
倍比稀释：用多道移液枪自第一列起进行吹打混匀，吹打次数应不少于五次，混匀后取100μl加入第二列，以此类推至第十列，第十列取出的100μl弃去不用。
接种：将稀释的供试菌菌悬液倒入一空平板，用多道移液枪在96孔细胞培养板第一至第十列各加100μl稀释后的供试菌悬液，每板加一种供试菌株。
侧面观察每孔是否在同一水平面以检查是否漏加或跳孔，标记后置于CO2培养箱37℃下培养16h。
对照组：96孔细胞培养板第十一列加200μl菌悬液，第十二列加200μl MHB培养基作为对照组。
3.4.3观察与测量
16h培养结束后取出96孔细胞培养板进行观察，先观察对照组是否正常(即第十一列全有供试菌生长，第十二列则全无)，再观察前十列。
判定标准：若孔内液体浑浊则有供试菌生长，即提取物无抑菌作用。如直接观察困难，可将TTC溶液倒入一空平板，使用多道移液枪在第一列至第十列加30μl TTC溶液，放入37℃的CO2培养箱孵育30min，如孔内出现红色变化则是有供试菌生长，即提取物无抑菌作用。
拍照并记录96孔细胞培养板中每个提取物质最后一个未浑浊或未变色的孔数，此为提取物质最低抑菌位置，并根据步骤3.2中浓度计算出MIC值。
4.结果与分析
4.1形态学观察
4.1.1菌体形态特征
培养箱25℃下，菌株ZS-1在pH＝6.0的PDA培养基上培养20-30d后观察菌落及培养基形态，从左上到右下分别为培养了4d，7d，10d，15d，20d，30d后的结果(图1)，菌落生长速度较慢；先是基内菌丝在培养基内生长使得整个培养基变为玫红色后，气生菌丝再在培养基全部表面上生长形成菌落，单一菌落覆盖范围小，菌落成片连接遍布整个培养基，部分呈类圆形凸起；呈网状，絮状，绒毛状；边缘啮齿状；浓密，丰厚，不易挑起；高约2-4mm；透明度低；有色素存在；正面初期白色，后期呈黄褐色、粉红色，背面初期玫红色，后期棕红色、深褐色。
图1为菌株ZS-1固体培养1-30d形态学特征。
摇床25℃，130r/min下，菌株ZS-1在pH＝6.0的PDB培养基上液体培养7-10d获得两瓶无杂菌生长的结果(图2)，菌丝球呈圆形，光滑或表面绒毛状，发酵液颜色变深(由橙黄色变为橙红色)，抽滤后菌丝球呈橙红色，具有芳香性气味。
图2为菌株ZS-1液体培养7d形态学特征。
4.1.2显微形态特征
光学显微镜下观察所制装片，平行三组(图3)，菌丝体红色或无色；透明，光滑；呈网状分枝；有横隔膜；未观察到孢子存在。
图3为菌株ZS-1显微形态特征。
4.2分子生物学鉴定
菌株ZS-1经由分子生物学测序后结果为三线镰刀菌Fusarium tricinctum，序列长度547bp，具体基因序列如下：
TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGTTTTACGGCATGGCCGCGCCGCGTTCCAGTTGCGAGGTGTTAGCTACTACGCAATGGAGGCTGCAGCGAGACCGCCAATGTATTTCGGGGGCGGCACCGCCCAGAAGGGCAGAGCCGATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCGGAATACCAGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTGTTTGTTTTACTCAGAAGTTACAATAAGAAACATTAGAGTTTGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACGGGGCGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACATTAAGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAG
图4为三线镰刀菌ZS-1的基因序列。
表1本发明的三线镰刀菌ZS-1的Blast序列比对结果
Figure BDA0002525548020000101
Figure BDA0002525548020000111
4.3菌种保藏
4.3.1斜面培养
此部分实验在生物安全柜中进行。高压灭菌后用试管分装PDA培养基，塞上试管塞，将试管斜架使培养基呈斜面凝固(斜面不宜过长)，使用一次性接种环将步骤3.1.1中的固体平板菌种与液体发酵液分别接种于斜面上，塞上试管塞后用牛皮纸封口，放入电热恒温培养箱25℃培养至菌落丰厚。
4.3.2制备液体石蜡菌种
选用CP级的液体石蜡，倒入锥形瓶中(不超过锥形瓶的2/3)，用未脱脂棉塞住瓶口进行密封，准备固体石蜡放入搪瓷杯中，二者均用牛皮纸包住并用绳子扎紧后放入145℃烘箱中进行干热灭菌2h，取出后迅速放入生物安全柜，打开紫外冷却备用。液体石蜡需冷却至室温以免温度过高使菌种死亡，固体石蜡需呈液体，防止冷却至凝固。
取出步骤4.3.1中斜面菌种，75％酒精灭菌，解开牛皮纸，垂直捏住试管(取塞手法不变，取下后更换新的无菌试管塞)，使用灭菌滴管将液体石蜡滴灌至斜面试管菌种中，液体石蜡滴位需高出竖直试管后斜面最上端所在水平面以上1cm，灌滴后迅速塞上试管塞，然后使用药匙取固体石蜡将试管塞边缘密封，标记后于2019年10月21日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC 18596，菌株ZS-1的分类命名为：三线镰刀菌Fusariumtricinctum。
4.4药敏抑菌
药敏抑菌实验即将供试菌株：MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)，金黄色葡萄球菌(CICC10384)，霉菌以涂布法及平板划线法进行接种，通过在接种后的平板上使用药敏片检测三线镰刀菌ZS-1提取物是否出现抑菌圈及出现的抑菌圈的大小而对三线镰刀菌进行抑菌效果判定。
药敏抑菌实验结果如下，MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)及金黄色葡萄球菌(CICC10384)、霉菌均出现抑菌效果(图5-图8)。
图5为三线镰刀菌ZS-1对MRSE(ATCC43300)的药敏抑菌结果。
图6为三线镰刀菌ZS-1对大肠杆菌(CICC10389)的药敏抑菌结果。
图7为三线镰刀菌ZS-1对金黄色葡萄球菌(CICC10384)的药敏抑菌结果。
图8为三线镰刀菌ZS-1对霉菌的药敏抑菌结果。
以三线镰刀菌ZS-1提取物对MRSE(ATCC43300)，金黄色葡萄球菌(CICC10384)及大肠杆菌(CICC10389)进行药敏实验时，均有抑菌效果，供试菌中对大肠杆菌抑菌效果最佳，抑菌圈直径出现2.0cm以上，其中以无水乙醇提取的提取物抑菌效果优于以水提取的提取物，醇提取物质抑菌圈直接均在2cm以上(表2)。
以平板涂布法接种霉菌进行药敏抑菌实验时，均有抑菌效果，以醇提取的提取物抑菌效果最优，抑菌圈直径最大可有28mm(表2)。
平板划线法处理霉菌及抑菌实验部分在实验中基本未产生抑菌圈。
表2药敏抑菌实验的抑菌圈直径结果
Figure BDA0002525548020000121
其中，"—"：未出现抑菌效果。
4.5MIC值测定
MIC即最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration)，用于探究三线镰刀菌提取物能够抑制培养基中供试菌MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)及金黄色葡萄球菌(CICC10384)生长的最低抑菌浓度，以最低抑菌浓度确定三线镰刀菌提取物抗菌活性大小。
实验分2组，分别为步骤3.2.1和3.2.2制备的水提取物和无水乙醇提取物。
使用电子天平称取法计算提取物质的浓度，提取物质加入96孔细胞培养板第一列时稀释为原来的两倍，此后每一列皆在前一列浓度基础上进行倍比稀释，即每一列浓度都是前一列浓度的1/2，96孔细胞培养板中每个提取物质最后一个未浑浊或未变色的孔数即为求提取物质浓度至提取物质最低抑菌浓度的稀释倍数。最低抑菌浓度MIC值如表4所示。
由测定结果可知金黄色葡萄球菌(CICC10384)的MIC值为0.434mg/ml(水提取物)，大肠杆菌(CICC10389)的MIC值为0.944mg/ml(对醇提取物)，MRSE(ATCC43300)的MIC值为0.434mg/ml(水提取物)。
表3水/醇提取物浓度
水提取物 醇提取物
提取物浓度(mg/ml) 13.90 33.70
第一孔浓度(mg/ml) 6.950 16.85
表4水/醇提取物MIC值
Figure BDA0002525548020000131
5.讨论
本发明对一株黄花棘豆内生真菌进行分离鉴定研究。通过ITS全序列分析鉴定为三线镰刀菌(Fusarium tricinctum.)，属于瘤座孢科镰刀菌属三线镰刀菌(Fusariumtricinctum.)。
通过扩大培养确定三线镰刀菌固体培养的最佳培养基为PDA培养基，液体发酵的培养基为PDB培养基，最适温度为25℃，最适pH为6.0，具芳香性气味。培养期间观察其形态学特征为：菌落生长速度较慢；单一菌落覆盖范围小，菌落呈网状，絮状，绒毛状，部分呈类圆形凸起，成片连接遍布整个培养基；平板正面气生菌丝初期白色，后期呈黄褐色、粉红色，背面基内菌丝初期玫红色，后期棕红色、深褐色。显微观察为：菌丝体无色或红色；透明且光滑；呈网状分枝；有横隔膜。
对三线镰刀菌有效物质的提取实验中设计预实验，计划从固体平板，液体发酵菌丝体，发酵液中提取有效物质。对固体培养基以捣碎蒸发浓缩进行处理，对发酵液以蒸发浓缩或按有机溶剂极性大小萃取处理，对液体发酵菌丝体以抽滤干燥后研磨溶解浓缩进行处理。提取溶剂选用超纯水及无水乙醇。最终确定可提取出有效提取物的最优途径为处理固体平板培养基，捣碎后先加超纯水超声、离心、旋蒸浓缩获得水提取物质，或者将处理固体平板培养基，捣碎后加入无水乙醇超声、离心、旋蒸浓缩、水浓缩获得醇提取物质。
对三线镰刀菌有效物质的抑菌特性研究实验中选用药敏抑菌方法确定抑菌能力，选取典型菌株：耐甲氧西林表皮葡萄球菌MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)及金黄色葡萄球菌(CICC10384)，霉菌进行测定。测定结果显示对MRSE(ATCC43300)，大肠杆菌(CICC10389)及金黄色葡萄球菌(CICC10384)有抑菌效果，供试菌株中均出现抑菌活性，效果最好的为大肠杆菌(CICC10389)，对霉菌存在抑菌效果但不稳定，有效物质中抑菌效果最好的为醇提取物。
对三线镰刀菌测定最低抑菌浓度(MIC)值，测定结果表明金黄色葡萄球菌(CICC10384)的MIC值为0.434mg/ml(对水提取物)，大肠杆菌(CICC10389)的MIC值为0.944mg/ml(醇提取物)，MRSE(ATCC43300)的MIC值为0.434mg/ml(对水提取物)。综上所述，本研究已确定该植物内生真菌种属，培养特性，形态特征与抑菌活性。
国内外目前对三线镰刀菌的研究主要集中在其对植物致病机理、分子生物学和生物防治方面，有研究表明三线镰刀菌多糖具有抗氧化活性，水提取物及其多糖具有显著免疫增强作用。还未见三线镰刀菌醇提取物的相关研究，前人研究中也并未出现三线镰刀菌，本研究既确认三线镰刀菌有一新菌种，肯定了处理培养基提取有效物质方法的可行性并获得了三线镰刀菌的抑菌特性。对日后三线镰刀菌的鉴定具有参考价值，为提取植物内生真菌中有效物质方法提供新思路，为后续进一步深入研究三线镰刀菌的实际应用提供理论基础及依据。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：
步骤3.2中，
水提取物的制备：
取出PDA平板培养的ZS-1菌株，75％酒精灭菌，刮菌铲灼烧后，刮取平板表面菌丝和与菌丝粘连的部分培养基(捣碎)置于离心管中，加超纯化水，置超声波提取器中超声10min，期间保持离心管在超声波提取器中直立，超声后，10000rpm反复离心2次，每次60s，取上清，利用旋转蒸发仪将水挥干，旋转蒸发仪转速为60rpm，温度为100℃，收集挥干后提取物，用电子天平进行称重，得到水提取物A，再用1ml超纯水溶解，置于1.5ml离心管中备用，并计算水提取物A的浓度，水提取物浓度为37.90mg/ml。
无水乙醇提取物的制备：
取出PDA平板培养的ZS-1菌株，75％酒精灭菌，刮菌铲灼烧后，刮取平板表面菌丝和与菌丝粘连的部分培养基(捣碎)置于离心管中，加无水乙醇，置超声波提取器中超声10min，期间保持离心管在超声波提取器中直立，超声后，10000rpm反复离心2次，每次60s，将无水乙醇超声提取物上清先用旋转蒸发仪浓缩，旋转蒸发仪转速为70rpm，温度为60℃，再用65℃水浴加热浓缩至浸膏，即得到无水乙醇提取物B，称重后，加入吐温80:DMSO:超纯水(体积比例为1:1:16)进行溶解，并计算无水乙醇提取物B的浓度，无水乙醇提取物浓度为30.20mg/ml，4℃标记备用。
其余步骤均与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：
步骤3.2中，
水提取物的制备：
取出PDA平板培养的ZS-1菌株，75％酒精灭菌，刮菌铲灼烧后，刮取平板表面菌丝和与菌丝粘连的部分培养基(捣碎)置于离心管中，加超纯化水，置超声波提取器中超声30min，期间保持离心管在超声波提取器中直立，超声后，10000rpm反复离心2次，每次30s，取上清，利用旋转蒸发仪将水挥干，旋转蒸发仪转速为75rpm，温度为80℃，收集挥干后提取物，用电子天平进行称重，得到水提取物A，再用1ml超纯水溶解，置于1.5ml离心管中备用，并计算水提取物A的浓度，水提取物浓度为18.95mg/ml。
无水乙醇提取物的制备：
取出PDA平板培养的ZS-1菌株，75％酒精灭菌，刮菌铲灼烧后，刮取平板表面菌丝和与菌丝粘连的部分培养基(捣碎)置于离心管中，加无水乙醇，置超声波提取器中超声30min，期间保持离心管在超声波提取器中直立，超声后，10000rpm反复离心2次，每次30s，将无水乙醇超声提取物上清先用旋转蒸发仪浓缩，旋转蒸发仪转速为70rpm，温度为55℃，再用70℃水浴加热浓缩至浸膏，即得到无水乙醇提取物B，称重后，加入吐温80:DMSO:超纯水(体积比例为1:1:19)进行溶解，并计算无水乙醇提取物B的浓度，无水乙醇提取物浓度为24.40mg/ml，4℃标记备用。
其余步骤均与实施例1相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
<120> 黄花棘豆内生真菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 547
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgcttatt gatatgctta agttcagcgg gtattcctac ctgatccgag gtcaacattc 60
agaagttggg gttttacggc atggccgcgc cgcgttccag ttgcgaggtg ttagctacta 120
cgcaatggag gctgcagcga gaccgccaat gtatttcggg ggcggcaccg cccagaaggg 180
cagagccgat ccccaacacc aaacccgggg gcttgagggt tgaaatgacg ctcgaacagg 240
catgcccgcc ggaataccag cgggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa 300
ttctgcaatt cacattactt atcgcatttt gctgcgttct tcatcgatgc cagaaccaag 360
agatccgttg ttgaaagttt tgatttattt gtttgtttta ctcagaagtt acaataagaa 420
acattagagt ttgggtcctc tggcgggccg tcccgtttta cggggcgcgg gctgatccgc 480
cgaggcaaca ttaaggtatg ttcacagggg tttgggagtt gtaaactcgg taatgatccc 540
tccgcag 547

Claims (8)

1.花棘豆内生真菌，其特征在于：所述黄花棘豆内生真菌为三线镰刀菌（ Fusarium tricinctum） ZS-1菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 18596。
2.权利要求1所述的黄花棘豆内生真菌提取物的提取制备方法，其特征在于：将培养黄花棘豆内生真菌的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加入超纯水超声后离心，取上清，利用旋转蒸发仪将水挥干，即为黄花棘豆内生真菌三线镰刀菌水提取物；
将培养黄花棘豆内生真菌的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加入无水乙醇后离心，取上清，先用旋转蒸发仪浓缩，再用水浴加热浓缩，收集浓缩提取物，即为黄花棘豆内生真菌三线镰刀菌乙醇提取物。
3.根据权利要求2所述的黄花棘豆内生真菌提取物的提取制备方法，其特征在于：
将培养黄花棘豆内生真菌的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加超纯水，超声10-30min，超声后10000rpm反复离心2次，每次30s-60s，取上清置旋转蒸发仪进行旋蒸，转速为60~75rpm，温度为80~100℃，收集挥干后提取物，即为三线镰刀菌水提取物；
将培养黄花棘豆内生真菌的平板表面菌丝和与菌丝粘连的固体培养基捣碎，加无水乙醇，超声10~30min，超声后10000rpm反复离心2次，每次30s-60s，取上清先用旋转蒸发仪浓缩，旋转蒸发仪转速为70rpm，温度为55-70 ℃，再用65~70℃水浴加热浓缩至浸膏，即为三线镰刀菌无水乙醇提取物。
4.黄花棘豆内生真菌提取物，是应用权利要求2或3所述的方法制备得到的。
5.权利要求4所述的黄花棘豆内生真菌提取物在制备抑菌药物中的应用；所述菌为耐甲氧西林表皮葡萄球菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和/或霉菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述黄花棘豆内生真菌提取物对耐甲氧西林表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.434 mg/ml。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述黄花棘豆内生真菌提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.434 mg/ml。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述黄花棘豆内生真菌提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.944 mg/ml。
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