CN108587971A - 一种短小芽孢杆菌s35及其应用 - Google Patents

一种短小芽孢杆菌s35及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)S35及其应用，该菌株已于2016年9月12日保存在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60077。该菌株对镰刀菌引起的病害具有显著拮抗作用，且菌悬液和次级代谢产物均有较好的防效，材料来源广泛，成本低，对环境安全。

Description

一种短小芽孢杆菌s35及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株来源于察尔汗盐湖的嗜盐菌及其生防应用，具体为一种短小芽孢杆菌s35及其应用。
背景技术
马铃薯属于茄科茄属一年生草本植物，营养丰富，含有较高的蛋白质、维生素和无机盐。随着2015年我国马铃薯主粮化战略的启动，马铃薯种植面积不断扩大，病害的发生也越来越严重。其中，镰刀菌干腐病是一种重要的马铃薯贮藏期病害之一，常导致马铃薯块茎品质降低和商品薯率大幅下降，严重影响其食用价值和经济价值，成为限制马铃薯产业发展的主要因素。目前主要采用化学杀菌剂对其进行控制，但以化学防治为主的措施不但不能遏制土传病害上升的趋势，而且还会抑制土壤中的有益微生物；化学药剂的频繁使用会导致病原菌产生抗药性、污染环境和危害人类健康。生物防治因其对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用。寻找生防菌资源，利用植物根际有益促生细菌的拮抗作用，探索控制土传病害的生物防治途径，对农业可持续发展具有重大意义。
目前国内学者所研究获得的马铃薯干腐病生防菌株包括：萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus)、多产色链霉菌1(Streptomyces polyc hromogenes 1)、球孢链霉菌球孢亚种(Streptomyces globisporus sub sp.Globisporus)、锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvlus)、放线菌DO1、一株枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、俄罗斯木霉(T richoderma rossicum)、球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)。此外，部分学者就马铃薯非亲和菌株粉红单端孢(Trichothecium roseum)菌丝细胞壁提取物对马铃薯干腐病的拮抗作用进行了研究。同时，部分学者对拮抗马铃薯干腐病的机理机制进行了进一步的研究，研究表明寡雄蛋白处理能提高与马铃薯块茎组织苯丙烷代谢相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸脱氢酶(CAD)、肉桂酸羟化酶(C4H)和4－香豆酰－辅酶A连接酶(4CL)的活性及相关基因的表达；同时抗性物质总酚、类黄酮及木质素含量也因寡雄蛋白处理而提高。
近年来，大多数学者从土壤中分离、纯化得到短小芽孢杆菌，并就其对烟草赤黑腥病、烟草白粉病菌、烟草黑胫病和大豆疫病等植物病害的防治进行了研究，甚至涉及到抑菌物质的提取、抑菌物质理化性质等的研究。然而，本申请从盐湖湖泥极端环境中分离、纯化得到短小芽孢杆菌，并将其运用于马铃薯窖藏病害的防治的突破，使得生物防治马铃薯窖藏病害成为可能，同时为盐湖等极端环境资源的利用提供了依据，奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株从察尔汗盐湖湖泥中分离纯化得到的短小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)及其生防应用，旨在解决的技术问题是针对目前马铃薯干腐病生物防治技术的不足。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供的一种短小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)S35，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼；保藏日期：2016年9月12日；保藏编号：GDMCC NO：60077。
本发明短小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)S35采用稀释平板富集培养法进行分离和纯化得到。革兰氏阳性菌,细杆状,有荚膜,有鞭毛,大小为0.6-0.8μm×0.5-0.6μm。
本发明短小芽孢杆菌S35的16S rDNA的序列为：SEQ ID NO：1。
本发明所述的短小芽孢杆菌S35在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为镰刀菌引起的病害，所述的病害具体为干腐病、枯萎病、根腐病等，所述的植物为茄科或禾本科作物，优选为马铃薯。
优选的，所述的短小芽孢杆菌S35的菌悬液和次级代谢产物在植物病害生物防治中的应用也在本发明的保护范围内。
所述的短小芽孢杆菌S35的菌悬液的制备方法为：在培养1d后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100mlATCC213改良培养液的培养瓶中，37℃、200r/min培养2h，用血球计数板计数为：1.0×108cfu/ml。
所述的短小芽孢杆菌S35的次级代谢产物的制备方法为：在培养1d后的菌落边缘取菌苔接种到有800mlATCC213改良培养液的培养瓶中，37℃200r/min培养5d，培养液经4000r/min离心15min得上清液，萃取有机相旋转蒸发得浸膏，用无菌水将浸膏配制为20mg/ml，用0.25μm微孔水性滤膜过滤得母液。
所述的ATCC213改良培养液为：MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH 7.2-7.4。
本发明所述的短小芽孢杆菌S35在作为制备防治作物病害药物中的应用，通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂；所述的作物包括茄科和禾本科作物，优选为马铃薯。
当然本发明所述的短小芽孢杆菌S35的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治作物病害药物中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明短小芽孢杆菌S35防治作物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为该短小芽孢杆菌S35的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。
本发明的有益效果为：
本发明针对马铃薯收获后窖藏过程中严重影响马铃薯品质的干腐病为靶标，从察尔汗盐湖湖泥中分离筛选到一种短小芽孢杆菌属菌株S35，其本身可显著拮抗马铃薯干腐病病原菌，且菌悬液和次级代谢产物均对马铃薯干腐病病原菌有较好的防效，同时对马铃薯安全。本发明能够有效拮抗和控制马铃薯干腐病病原菌，且原料来源广泛，成本低，对环境安全。
附图说明
图1是本发明实施例短小芽孢杆菌s35经Biolog系统鉴定的结果；
图2是本发明实施例短小芽孢杆菌s35本身与马铃薯干腐病病原真菌的培养皿对峙培养结果；
图3是本发明实施例短小芽孢杆菌s35次级代谢产物正丁醇萃取物拮抗病原真菌青9A-5-2的结果；
图4是本发明实施例短小芽孢杆菌s35次级代谢产物正丁醇萃取物拮抗病原真菌青9A-5-10的结果；
图5是本发明实施例短小芽孢杆菌s35次级代谢产物正丁醇萃取物拮抗病原真菌青65B-2-6的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1短小芽孢杆菌S35的分离与鉴定
1.1短小芽孢杆菌S35的分离纯化
1)水样前处理：在无菌条件下，将水样混匀，用装有0.22μm孔径的滤膜的滤器过滤，在滤膜上富集菌体。用于富集的水样量达到30ml时，取下滤膜，放入装有3ml无菌海水的玻璃试管中，为10-1水样。
2)土样前处理：取适量土样，风干(20d左右)，120℃处理1h。称取10g处理好的土样，加入90ml无菌海水，放入已灭菌好的装有玻璃球的三角瓶内，充分振荡30min，静置后吸取上清液，此上清液为10-1土样。将上述10-1样品依次稀释为10-2和10-3倍，吸取150μl各梯度样品，分别涂布于各培养基平板上，每个样品重复3次。涂布后的平板倒置于培养箱中，分别于28℃和37℃下倒置培养，观察到有菌落出现，挑取单菌落，纯化。纯化后的菌株保存于试管斜面，并放置在4℃冰箱中。培养基为ATCC213改良培养基：MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH 7.2-7.4。置于37℃光照培养箱中3d后，挑去单菌落培养。
1.2菌株的鉴定
1.2.1形态学鉴定
将菌株于培养基上进行培养，光学显微镜下观察其形状、大小、鞭毛和荚膜等形态学特征。
1.2.1.1革兰氏鉴定
通过革兰氏染色来确定革兰氏阳性和阴性，具体操作步骤如下：接菌针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，酒精灯灼热固定，固定完成后滴加结晶紫的混合液染色1min，无菌水冲洗，滴加碘液作用1min，无菌水冲洗，紧接着用95％的乙醇溶液脱色，直至洗脱液无色，最后用番红染液染色2～3min，冲洗干净后进行镜检。结果如表1所示。
1.2.1.2鞭毛鉴定
接种针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，酒精灯灼热固定，固定完成后滴加混合染液(丹宁酸5.0g、FeCl31.5g、福尔马林(15％)2.0ml、NaOH(1％)1.0ml、蒸馏水100ml)染色10min，无菌水冲洗，滴加2g/ml的AgNO3溶液染色30～60s，冲洗干净后进行镜检。结果如表1所示。
1.2.1.3荚膜鉴定
接种针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，滴加一滴墨汁与菌液完全混匀，盖玻片将混合液刮成薄膜，空气中风干，甲醇固定1min，滴加0.5％的番红染液冲去残余甲醇的同时染色30s，风干后镜检。结果如表1所示。
表1 菌株s35形态学鉴定结果
由此可见，菌株S35为革兰氏阳性菌,细杆状,有荚膜,有鞭毛,大小为0.6-0.8μm×0.5-0.6μm。
1.2.2生理生化测定
BIOLOG鉴定系统进行糖代谢的特性研究；API实验进行生理生化特性的获得。
1.2.2.1 BIOLOG系统分析鉴定
Biolog自动微生物分析系统主要根据细菌利用95种碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(显色反应)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度反应)进行鉴定。系统测定细菌鉴定微平板上的两套数据,即显色反应的吸光度和浊度反应的浊度,基于这些特征性的反应模式或“指纹图谱”,通过智能软件Microlog 3(5.2)将待鉴定菌种的图谱与数据库参比,获得最大限度的匹配，鉴定结果如图1(a,b)所示。
Biolog软件将读取的96孔微平板反应结果如图1a所示。系统软件与数据库的匹配程度列出4个结果,每个结果均显示3种重要的参数,即可能性Probability(PROB),相似性Similarity(SIM)和位距Distance(DIS)(图1b)。系统得到的3个参数与数据库匹配后在ID地址栏里显示出有一个最佳的匹配名称:Bacillus subtilis ss s ubtilis。
1.2.2.2 API生理生化鉴定
将菌株s35的新鲜菌苔接种于培养液中,37℃培养1～2h,吸取0.05～0.08ml加到盛装有相应底物的微量生化管中；其中硝酸盐还原参照《微生物学实验技术》配制溶液A和B,菌株s35培养后加硝酸盐还原试剂溶液A和B各2滴,混匀,立即观察结果。其余生化管均采取穿刺法,将已接种的生化管套上无菌塑料帽,直立于三折吸塑短架内,于37℃培养箱中培养,其中淀粉的生化管培养后加lugal氏碘液2滴,观察结果。
表2 菌株s35的生理生化特征
利用生化鉴定管检查菌株s35的生理生化反应,鉴定结果见表2。从表2可以看出:培养物可水解明胶,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能利用半乳糖、淀粉和酪蛋白。
1.2.3分子鉴定
DNA提取按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选用细菌通用引物对F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′，P1541：5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCG CA-3′。选取特定的引物，反应条件为94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸75s，50μl反应体系30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，经克隆测序得到序列结果。所得到的16S rDNA全序列上传到网站https://www.ezbiocloud.net进行序列对比，进而确定其属名。
对菌株s35进行16S rDNA序列测定，序列测定结果为：SEQ ID NO：1。将此序列上传至https://www.ezbiocloud.net进行序列比对，确定其属名为：Bacillus.pumilus。
基于以上特征，将菌株S35鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus.pumilus)。该菌株已于2016年9月12日保存在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60077。
实施例2短小芽孢杆菌S35对病原真菌的拮抗作用
1.1菌培养
将4株病原真菌(青9A-4-13、青9A-5-2、青9A-5-10、65B-2-6)接种于PDA培养基，置于28℃的恒温培养箱培养一周；将短小芽孢杆菌S35接种于E培养基，置于37℃培养箱培养1d。
1.2对峙培养
采用“十字划线法”，将病原真菌打孔为直径5mm的菌饼放于距离中心短小芽孢杆菌(菌落直径为5mm)2.5cm处，在直径9cm的培养皿中进行对峙培养。结果如表3所示。
表3 s35与4株马铃薯干腐病病原真菌的对峙培养
由表3可知，对峙培养3d时，青9A-5-2、青9A-5-10和65B-2-6三株病原真菌的菌落半径和抑菌圈宽度之间无显著差异，与青9A-4-13病原真菌的菌落大小和抑菌圈大小相比，除青9A-5-2病原真菌的菌落半径外，均存在显著差异。随着培养时间的增加，青9A-4-13和65B-2-6菌落半径达到最大，无透明抑菌圈的形成；青9A-5-2和青9A-5-10菌落半径增大不明显，形成明显的抑菌圈，且较青9A-4-13和65B-2-6显著(图2)。说明在培养皿对峙培养中，短小芽孢杆菌s35对病原真菌青9A-5-2和青9A-5-10的抑制作用显著。
实施例3马铃薯活体复筛
1.1发酵液的制备
将实施例2培养的菌接种到盛装有无菌水的锥形瓶中，置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡培养5d后备用。
1.2菌悬液的制备
将实施例2培养的菌接种到盛装有无菌水的锥形瓶中，置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡2h，摇匀后备用。
1.3试验方法
用直径5mm的打孔器在消毒后的马铃薯果实上刺两个直径为5mm，深为3mm的伤口(马铃薯果实用2％NaClO溶液浸泡10min之后，用自来水冲洗干净，自然晾干)。先接种40μl病原菌悬浮液，随后接种同体积短小芽孢杆菌菌悬浮液。对照先接种40μl病原菌悬浮液，随后接相同体积的无菌水。将果实放在托盘上，并放入人工培养箱(28℃，黑暗、RH 40％-50％)培养两周，观察果实的发病情况。每个处理3个马铃薯，实验重复3次。
1.4实验指标的测定
在接种后7d、14d、21d后分别观察坏果率和测定失重率、病斑深度及宽度。失重率采用称重法测定；坏果率采用观察法测定，果实上出现病斑、腐烂、裂痕均为坏果。
失重率(％)＝贮藏期失重量/入贮时总重量×100
坏果率(％)＝坏果数/贮藏总果数×100
Microsoft excel 2010版和Spss 19.0进行数据统计与分析。
表4 s35与4株病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用
由表4可知，就同一病原真菌而言，除失重率外，接种4株病原真菌后，所有接种马铃薯均发病，发病马铃薯的坏果率和病斑深度之间呈现显著差异，且较对照(S35浓度梯度为零)而言，短小芽孢杆菌S35处理后对马铃薯的失重率、坏果率以及病斑深度均呈现一定程度的抑制作用。对4株病原真菌进行比较可知，失重率之间无显著差异，坏果率程度表现为：处理组(1.0×108)较对照组(0)严重；处理组中严重程度由重到轻依次为：青9A-4-13、青9A-5-10、65B-2-6、青9A-5-2；病斑深度表现为：处理组(1.0×108)较对照组(0)严重；处理组中严重程度由重到轻依次为：青9A-4-13、65B-2-6、青9A-5-2和青9A-5-10。说明在马铃薯活体实验中，s35对病原真菌的拮抗作用由强到弱表现为：青9A-5-10、青9A-5-2、65B-2-6，对病原真菌青9A-4-13无显著拮抗作用。
实施例4短小芽孢杆菌S35次级代谢产物对病原真菌的拮抗作用
短小芽孢杆菌次级代谢产物制备：将实施例2培养的短小芽孢杆菌接种于液体培养基中，置于28℃、200r/min的恒温摇床中振荡培养5～7d后，在大型离心机中4000r/min离心15min，取上清液与正丁醇等体积盛装于分液漏斗中摇匀，进行分液萃取。将萃取得到分层液体分别进行旋转蒸发，用甲醇溶解出旋蒸瓶中的浸膏，制得的粉末状物质保存与4℃冰箱中备用。
将制备得到的短小芽孢杆菌S35次级代谢产物粉末用无菌水配置成浓度为20mg/ml的原液，置于20000r/min、4℃的低温离心机中离心15min，然后抽滤灭菌，最终梯度稀释为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml和1mg/ml四个浓度梯度备用。采用“牛津杯”法进行嗜盐菌次级代谢产物与病原真菌的对峙培养，牛津杯中次级代谢产物溶液的量为200μl。结果如表5所示。
表5 s35次级代谢产物与4株病原真菌的拮抗作用
由表5可知，随着培养时间的逐渐增加，4株病原真菌菌落半径逐渐增大，短小芽孢杆菌s35透明抑菌圈宽度逐渐缩小。培养一周后，短小芽孢杆菌s35次级代谢产物正丁醇萃取物对4株病原真菌均呈现出明显的拮抗作用(图3-5)。随着短小芽孢杆菌s35次级代谢产物有机溶剂萃取物浓度梯度的减小，其对4株病原真菌的拮抗作用呈逐渐减弱趋势。
实施例5s35次级代谢产物马铃薯活体复筛
在上述实施例的基础上，进一步利用短小芽孢杆菌s35次级代谢产物进行马铃薯活体复筛实验，区别在于取上清液分别与乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等体积盛装于分液漏斗中摇匀，进行分液萃取。结果见表6。
表6 s35与4株病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用
由表6可知，短小芽孢杆菌S35次级代谢产物的3种有机溶剂萃取物对4株马铃薯干腐病病原真菌具有不同程度的拮抗作用，且随着萃取物浓度梯度的增大，失重率差异不显著，病斑深度和宽度增加，坏果率增大，拮抗作用加强。具体而言，短小芽孢杆菌S35次级代谢产物乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物在20mg/ml和10mg/ml浓度梯度下，对青9A-4-13表现出完全抑制，坏果率均为零。较9A-5-2病原真菌阳性对照而言(坏果率为78％)，短小芽孢杆菌S35次级代谢产物3种有机溶剂对青9A-5-2的拮抗作用较弱，在20mg/ml浓度梯度下的坏果率分别为50％、100％和75％。短小芽孢杆菌S35次级代谢产物3种有机溶剂对青9A-5-10的拮抗作用较强，在1mg/ml浓度梯度下的坏果率均为零(阳性对照坏果率为100％)。短小芽孢杆菌S35次级代谢产物3种有机溶剂对65B-2-6具有不同程度的拮抗作用，甚至表现出低促高抑的特征。
实施例6对马铃薯安全性评价实验
表7 一种短小芽孢杆菌s35对马铃薯的安全性评价
由表7可知，只接无菌水的空白对照(CK)与只接短小芽孢杆菌s35的阴性对照的失重率之间无显著差异，且病斑深度、病斑宽度以及发病率等衡量指标指标值均为零，即说明本发明短小芽孢杆菌s35对马铃薯安全。
序列表
<110> 青海省农林科学院
<120> 一种短小芽孢杆菌s35及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1389
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌(Bacillus. pumilus)
<400> 1
taaaggttac ctcaccgact tcgggtgttg caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt 60
acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccagc 120
ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagaa cagatttatg ggattggcta 180
aaccttgcgg tctcgcagcc ctttgttctg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 240
taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac 300
cttagagtgc ccaactaaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact 360
taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgtccc 420
cgaagggaaa gccctatctc tagggttgtc agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc 480
gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt 540
gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac 600
taaggggcgg aaacccccta acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt 660
atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagttacag accagagagt 720
cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc 780
cactctcctc ttctgcactc aagtttccca gtttccaatg accctccccg gttgagccgg 840
gggctttcac atcagactta agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga 900
caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg 960
gttaggtacc gtcaaggtgc gagcagttac tctcgcactt gttcttccct aacaacagag 1020
ctttacgatc cgaaaacctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat 1080
tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140
tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct tggtgagcca ttaccccacc 1200
aactagctaa tgcgccgcgg gtccatctgt aagtgacagc cgaaaccgtc tttcatcctt 1260
gaaccatgcg gttcaaggaa ctatccggta ttagctccgg tttcccggag ttatcccagt 1320
cttacaggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacatcc gggagcaagc 1380
tcccttctg 1389

Claims (10)

1.一种短小芽孢杆菌S35，其特征在于，该菌株已于2016年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60077。
2.根据权利要求1所述的一种短小芽孢杆菌S35，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌S35的16S rDNA的序列为：SEQ ID NO：1。
3.权利要求1所述的一种短小芽孢杆菌S35在植物病害生物防治中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为镰刀菌引起的病害，所述的病害为干腐病、枯萎病或根腐病。
5.权利要求1所述的短小芽孢杆菌S35的菌悬液或次级代谢产物在植物病害生物防治中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌S35的菌悬液的制备方法为：在培养1d后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100mlATCC213改良培养液的培养瓶中，37℃、200r/min培养2h，用血球计数板计数为：1.0×108cfu/ml。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌S35的次级代谢产物的制备方法为：在培养1d后的菌落边缘取菌苔接种到有800mlATCC213改良培养液的培养瓶中，37℃200r/min培养5d，培养液经4000r/min离心15min得上清液，萃取有机相旋转蒸发得浸膏，用无菌水将浸膏配制为20mg/ml，用0.25μm微孔水性滤膜过滤得母液。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的ATCC213改良培养液为：MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH 7.2-7.4。
9.权利要求1所述的短小芽孢杆菌S35在作为制备防治作物病害药物中的应用。
10.权利要求1所述的短小芽孢杆菌S35的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治作物病害药物中的应用。
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