CN110863060A - 一种用于检测炭疽杆菌的rpa引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种用于检测炭疽杆菌的RPA引物及方法。本发明基于炭疽杆菌(Bacillus anthracis)BA5345基因的保守序列，设计合成1对重组酶聚合酶扩增引物，如SEQ ID NO.1～2所示。本发明进一步通过对引物浓度、反应温度和反应时间的优化，发现50μL RPA反应体系中加入2.0μL10mmol/L的上、下游引物，在39℃水浴锅中恒温反应30min，能够特异性的检测炭疽杆菌，并获得更多的RPA扩增产物；本发明开发的RPA检测方法，比常规PCR方法敏感性高100倍，对污染皮毛临床样品的阳性检出率为65.71％，明显高于常规PCR的阳性检出率。本发明建立的RPA方法操作简单、反应快速，结果确实可靠，适用于炭疽杆菌的快速检测。

Description

一种用于检测炭疽杆菌的RPA引物及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于检测炭疽杆菌的RPA引物及方法。
背景技术
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，可引起人畜共患的炭疽病，是世界动物卫生组织(OIE)确立的必须通报的动物疫病。炭疽杆菌具有高致病性，对人和动物的健康和生命构成极大威胁，常被用作生物恐怖战剂，其快速而精确的检测一直备受重视。目前炭疽杆菌检测的常用方法，主要是对病原体进行培养、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些检测方法耗时较长，难以适应快速诊断和控制疫情的需要。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新型的等温扩增技术。RPA主要依赖于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白等实现对靶基因的等温扩增。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成。同PCR一样，两条引物可以启动对靶基因的对数级扩增。
若能够开发RPA技术来实现对炭疽杆菌快速、灵敏的特异性检测，将能够克服现有技术在检测炭疽杆菌中的上述缺陷。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明以炭疽杆菌BA5345基因为研究对象，设计特异性引物，建立了能够快速、有效检测炭疽杆菌的RPA等温检测方法，旨在为炭疽杆菌的防控和诊断提供一种新的、可靠的技术支持。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于检测炭疽杆菌的RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-GTCTGGCACATGGTACTACTCAAACAAGAT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-AATAATACTTGTAATTCACCATTGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.2)。
第二方面，本发明提供了一种检测炭疽杆菌的RPA试剂，包括前述RPA引物。
进一步地，含有本发明前述引物或试剂的试剂盒以及其他类似于试剂盒的检测材料，均属于本发明的保护范围。
第三方面，本发明提供了上述RPA引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测炭疽杆菌产品中的应用。
进一步地，本发明还提供了所述引物、试剂或试剂盒在检测炭疽杆菌中的应用，所述应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。
所述应用具体可体现为一种用于检测炭疽杆菌的RPA方法，更为具体地说，所述RPA方法包括以下步骤：
(1)DNA模板提取：提取待测样品中的DNA；
(2)RPA扩增反应：以步骤(1)提取的DNA为模板，并采用前述RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物；
与前述应用相同的是，所述的RPA方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。
其中，步骤(2)中的所述RPA引物可为现成引物产品或在进行上述检测前，根据本发明所提供的引物序列预先合成的引物。
进一步优选，RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
模板DNA 1.0μL
上游引物1.0～5.0μL
下游引物1.0～5.0μL
再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL
醋酸镁2.5μL
灭菌去离子水补至50μL；
其中，上游引物和下游引物的初始浓度均为10mmol/L，所述醋酸镁的初始浓度为280mmol/L。
经实验研究发现，当上游引物和下游引物在RPA扩增反应体系中的终浓度为0.4mmol/L时，扩增效果最佳。
因此，以上游引物和下游引物的初始浓度均为10mmol/L为例，更为优选，RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
模板DNA 1.0μL
上游引物2.0μL
下游引物2.0μL
再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL
醋酸镁2.5μL
灭菌去离子水补至50μL；
其中，上游引物和下游引物的初始浓度均为10mmol/L，所述醋酸镁的初始浓度为280mmol/L。
从具体操作层面来说，RPA扩增反应体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)、去离子水、上游引物、下游引物，充分混匀后，加入模板DNA，最后加入醋酸镁溶液。
更进一步地，所述RPA扩增反应的温度为36℃～40℃，扩增时间为20～30min，经大量对比实验对比后优选在39℃的水浴条件下反应30min为最佳扩增反应条件。
在本发明所述的RPA方法中，所述步骤(3)使用DNA纯化试剂盒对RPA扩增产物进行纯化，取RPA扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像系统中观察分析电泳结果。
若RPA扩增产物含有大小为250bp的片段，则待测样品为炭疽杆菌或含有炭疽杆菌；若所述RPA扩增产物不含有大小为250bp的片段，则待测样品不为炭疽杆菌或不含有炭疽杆菌。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明基于炭疽杆菌(Bacillus anthracis)BA5345基因的保守序列，设计合成1对重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)引物，通过对引物浓度、反应温度和反应时间的优化，发现50μL RPA反应体系中加入2.0μL10 mmol/L的上、下游引物，在39℃水浴锅中恒温反应30min，能够特异性的检测炭疽杆菌，并获得更多的RPA扩增产物；以重组质粒pUC57-BA5345作为模板，RPA方法对其的检测限为102拷贝/μL，与实时荧光定量PCR检测试剂盒检测限一致，比常规PCR方法敏感性高100倍；RPA方法对污染皮毛临床样品的阳性检出率为65.71％，略低于实时荧光定量PCR试剂盒的检出率(71.43％)，明显高于常规PCR的阳性检出率(42.86％)。本发明建立的RPA方法操作简单、反应快速，结果确实可靠，适用于炭疽杆菌的快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同RPA引物终浓度(通过不同的RPA引物使用量体现)对炭疽杆菌的检测结果；其中，M：DNA Marker(DL500)，1：1.0μL，2：2.0μL，3：3.0μL，4：4.0μL，5：5.0μL。
图2为本发明实施例1中不同RPA反应温度对炭疽杆菌的检测结果；其中，M：DNAMarker(DL500)，1：36℃，2：37℃，3：38℃，4：39℃，5：40℃。
图3为本发明实施例1中不同RPA反应时间对炭疽杆菌的检测结果；其中，M：DNAMarker(DL500)，1：10min，2：20min，3：30min，4：40min。
图4为本发明所述RPA扩增反应针对炭疽杆菌的特异性试验结果；其中，M：DNAMarker(DL500)，1：炭疽杆菌疫苗株，2：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，3：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，4：蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，5：魏氏芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)，6：变形杆菌(Bacillusproteus)，7：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，8：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，9：阴性对照。
图5为本发明所述RPA扩增反应的敏感性试验结果；其中，M：DNAMarker(DL500)，1：106拷贝/μL的pUC57-BA5345，2：105拷贝/μL的pUC57-BA5345，3：104拷贝/μL的pUC57-BA5345，4：103拷贝/μL的pUC57-BA5345，5：102拷贝/μL的pUC57-BA5345，6：101拷贝/μL的pUC57-BA5345，7：100拷贝/μL的pUC57-BA5345。
图6为常规PCR的敏感性试验结果；其中，M：DNA Marker(DL5000)，1：106拷贝/μL的pUC57-BA5345，2：105拷贝/μL的pUC57-BA5345，3：104拷贝/μL的pUC57-BA5345，4：103拷贝/μL的pUC57-BA5345，5：102拷贝/μL的pUC57-BA5345，6：101拷贝/μL的pUC57-BA5345，7：100拷贝/μL的pUC57-BA5345。
图7为实时荧光定量PCR的敏感性试验结果；其中，1：106拷贝/μL的pUC57-BA5345，2：105拷贝/μL的pUC57-BA5345，3：104拷贝/μL的pUC57-BA5345，4：103拷贝/μL的pUC57-BA5345，5：102拷贝/μL的pUC57-BA5345，6：101拷贝/μL的pUC57-BA5345，7：100拷贝/μL的pUC57-BA5345。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1材料与方法
1.1细菌菌株及临床样品
炭疽杆菌疫苗株(A16R)购自兰州生物制品有限公司；蜡样芽孢杆菌(BNCC124613)、苏云金芽孢杆菌(BNCC221700)、蕈状芽孢杆菌(BNCC184427)和魏氏芽孢杆菌(BNCC189983)购自国家兽医微生物菌种保藏中心；变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌由杭州海关技术中心惠赠。炭疽杆菌基因组DNA由本实验室保存。临床样品为实验室自制污染生皮毛样品。
1.2主要试剂
Quick-DNATM提取和纯化试剂盒购自美国ZYMO RESEARCH公司；质粒DNA小量抽提试剂盒、pUC57 Vector、大肠杆菌DH5α和Amp购自上海生工生物工程有限公司；TwistAmpTM DNAamplificationKit购自英国Twist Dx公司；Taq DNA聚合酶(5U/μL)、dNTPs(10.0mmol/L)、MgCl2(25mmol/L)、DL500 DAN Marker、DL5000 DAN Marker、DNA胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒购自广州维伯鑫生物科技有限公司。
1.3引物设计
疽杆菌BA5345基因序列(FJ694154.1)常规PCR引物的设计与特异性位点的选择参考现有文献(王素华等.炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用[J].畜牧兽医学报，2019,50(8):1658-1665.)公开的方法，同时选择该基因特异性保守区域，设计RPA引物，引物序列见表1。引物由上海华大基因科技有限公司合成。
表1引物序列
Figure BDA0002333483030000071
1.4炭疽杆菌BA5345基因重组质粒标准品的制备
以炭疽杆菌基因组DNA为模板，以BA5345-F/BA5345-R为引物，参考现有文献(王素华等.炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用[J].畜牧兽医学报，2019,50(8):1658-1665.)建立的常规PCR方法扩增BA5345基因片段，扩增的BA5345基因大小为510bp。将扩增的目的片段回收纯化后与pUC57载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落经PCR和测序鉴定，获得pUC57-BA5345阳性质粒。通过NanoDrop2000测定质粒的DNA浓度，按照公式(6.02×1023拷贝/mol)×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(DNA长度×660)＝拷贝/μL换算为拷贝数，作为pUC57-BA5345质粒标准品备用。
1.5RPA方法的建立和优化
分别对10mmol/L的引物浓度、反应温度和反应时间进行优化。使用TwistAmpBasic Kit配制50μL RPA反应体系在如下范围内进行优化：10mmol/L BA5345-F1/BA5345-R1各1.0μL～5.0μL、Rehydration Buffer 29.5μL，MgAc(280mmol/L)2.5μL，模板1.0μL，加灭菌去离子水补至50.0μL。将模板和MgAc之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2mL反应管中，并充分混匀。将1.0μL模板和2.5μL MgAc加入反应管中，盖紧管盖，瞬时离心并旋涡后，分别放进36℃、37℃、38℃、39℃和40℃水浴锅中反应，反应时间设置为10min、20min、30min和40min。
使用DNA纯化试剂盒对RPA扩增产物进行纯化，取5μL RPA扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像系统观察分析电泳结果。
1.6常规PCR扩增
用于炭疽杆菌检测的常规PCR反应参照前述现有文献进行，引物序列见表1，PCR的反应体系为：10×PCRBuffer 5.0μL，dNTPs(10.0mmol/L)1.0μL，MgCl2(25mmol/L)2.0μL，正、反向引物(25pmol/μL)各1.0μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，模板DNA4.0μL，灭菌去离子水补至50.0μL。反应条件为：94℃3min；94℃30s，55.0℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。
1.7特异性和敏感性试验
将疫苗株炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、魏氏芽孢杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在绵羊血琼脂平板上37℃培养48～72小时，用灭菌的接种环从血琼脂平板上各挑取一环新鲜菌落，加入到盛有25.0μL灭菌去离子水的1.5mL离心管中制成菌落悬液，95℃作用2min后于冰浴中冷却至4℃左右，Quick-DNATM提取和纯化试剂盒提取基因组DNA。以提取的DNA作为模板，根据1.5建立的RPA方法进行特异性试验。将重组质粒pUC57-BA534510倍倍比稀释，使其浓度在106拷贝/μL至100拷贝/μL之间，并以此为模板进行RPA反应，确定该方法的敏感性。同时与1.6建立的常规PCR方法和实时荧光定量PCR试剂盒的敏感性进行比较。
1.8 RPA方法的应用
将3×106CFU/mL炭疽杆菌疫苗株芽孢悬液10倍倍比稀释为7个不同浓度(3×106CFU/mL～3×100CFU/mL)后各取200μL随机加入到1g生皮毛样品中，振荡混匀10min，4℃放置过夜，使芽孢与皮毛充分吸附，即为污染皮毛，共制备35份样品，分为7组，每组5份样品，每组样品炭疽杆菌的添加浓度分别为3×106CFU/mL～3×100CFU/mL；同时设置5份已知炭疽杆菌阴性的皮毛样品作为对照。污染皮毛样品中分别加入5mL 0.5％Triton X-100蔗糖PBS溶液，充分混匀，室温震荡10min，1000×g离心5min去除皮毛中大的颗粒，取上层悬液用PBS溶液进行10倍稀释后，12000×g离心5min，弃上清，再用PBS溶液洗涤2次，200μL PBS溶液重悬，悬液中即为炭疽芽孢。提取35份污染样品和5份阴性样品的DNA作为模板，分别采用本发明建立的RPA方法、1.6中的常规PCR方法、实时荧光定量PCR试剂盒同时检测，并比较三者的检测结果，计算三者的符合率。
2实验结果
2.1炭疽杆菌BA5345基因重组质粒标准品的鉴定结果
以提取的炭疽杆菌基因组DNA为模板，以BA5345-F/BA5345-R为引物进行PCR扩增。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测显示，目的片段约为510bp，与预期大小一致，并经测序验证，结果表明重组质粒标准品pUC57-BA5345构建正确，测定重组质粒浓度为45ng/μL，换算成拷贝数为8.0×1010拷贝/μL。
2.2 RPA方法的优化结果
为确定RPA最佳引物浓度，反应温度和反应时间，以105拷贝/μL pUC57-BA5345的质粒标准品作为模板进行扩增，并对产物进行分析，结果表明，50.0μL反应体系中加入10mmol/L BA5345-F1/BA5345-R1各2.0μL，250bp的电泳条带已非常清晰，加入3.0μL、4.0μL和5.0μL上、下游引物时，条带亮度没有明显差异(图1)。36℃～40℃反应时，39℃的电泳条带亮度最强(图2)。39℃反应10min时，即可获得一条大小为250bp的特异性条带，20min时条带更加清晰。使用Bio 1D软件对RPA扩增产物进行半定量分析，结果表明，反应30min后RPA扩增产物量为20min的2倍，而40min后产物量没有明显差异(图3)。经反应体系和反应条件优化，最终确定了炭疽杆菌BA5345基因RPA反应体系为10mmol/L BA5345-F1/BA5345-R1各2.0μL、Rehydration Buffer 29.5μL，MgAc(280mmol/L)2.5μL，模板1.0μL，加灭菌去离子水补至50.0μL。最佳反应温度为39℃，最佳反应时间为30min。
2.3特异性试验
以炭疽杆菌疫苗株、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、魏氏芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、变形杆菌(Bacillusproteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的DNA作为模板进行RPA反应，结果发现，只有炭疽杆菌疫苗株扩增出目的条带，其余均未出现特异性扩增(图4)，表明该方法具有较强的特异性。
2.4敏感性试验
将浓度为8.0×106拷贝/μL的pUC57-BA5345质粒标准品10倍倍比稀释，按照所建立的条件，进行RPA敏感性试验，并与常规PCR、实时荧光定量PCR试剂盒的检测结果进行比较。结果显示，RPA对其的检测限为102拷贝/μL(图5)，同实时荧光定量PCR试剂盒检测限一致(图6)，而常规PCR检测限为104拷贝/μL(图7)。表明本发明建立的方法敏感性较高。
将浓度为3×106CFU/mL炭疽杆菌疫苗株芽孢悬液进行10倍倍比稀释为7个浓度梯度后各取200μL提取基因组DNA，按照所建立RPA方法、常规PCR方法和实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增。结果表明，RPA的检测限为3×102CFU/mL，同实时荧光PCR方法检测限一致，而常规PCR检测限为3×104CFU/mL。
2.5临床样品的检测
在35份由炭疽杆菌疫苗株芽孢悬液污染的生皮毛样品中，RPA方法的阳性检出率为65.71％(23/35)，略低于炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的阳性检出率71.43％(25/35)，明显高于常规PCR的阳性检出率42.86％(15/35)；在5份常规PCR和炭疽杆菌实时荧光定量PCR试剂盒均未检出炭疽杆菌的的阴性样品中，RPA方法也未检出炭疽杆菌。
表2临床样品检测结果
Figure BDA0002333483030000111
3讨论
炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病，其病原体为炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢杆菌在我国公布的《人间传染的病原微生物名录》中被列为第二类病原微生物(高致病性病原微生物)，其芽孢可作为生物战剂和生物恐怖的原材料，因此，发展灵敏、高效的炭疽杆菌检测方法十分重要和紧迫。
快速、精准的诊断是有效防控疫病的基础和必要条件。目前已经建立了多种用于炭疽杆菌芽孢检测的分子生物学方法。例如TaqMan-LNA探针多重荧光实时定量PCR检测方法，炭疽杆菌TaqMan-MGB探针检测方法，双重实时荧光定量PCR方法。
这些检测方法的特异性强、敏感性高，但是也存在不足之处，如实时荧光定量PCR方法需要经验丰富的技术人员和昂贵的PCR仪，反应过程中需要复杂的温度变化，反应时间相对较长，或者需要复杂的引物和探针设计，反应试剂需要冷链运输和保存等。与PCR方法相比，RPA具有以下优势：①试剂使用方便，易于保存，RPA核心试剂以冻干颗粒形式保存，从而避免了冷藏保存和冷链运输的必要；②RPA反应时间短，30～40min内RPA即可完成对炭疽杆菌靶基因的扩增，而PCR一般需要60min以上；③等温扩增，RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，一台水浴锅即可完成反应。
本发明基于炭疽杆菌BA5345基因建立了有效检测炭疽杆菌的RPA方法，在39℃水浴锅中反应30min即可实现对目的基因片段的有效扩增，对重组质粒pUC57-BA5345的最低检测限为102拷贝/μL。在对RPA反应时间进行摸索时发现，在反应10min后可得到少量的扩增产物，在反应30min后，即可得到大量的扩增产物，条带清晰。利用本发明建立的RPA方法对35份污染样品进行检测，检测的阳性率(65.71％)较常规PCR检测的阳性率(42.86％)更高，表明本发明建立的炭疽杆菌RPA检测方法比目前常用的PCR方法更加准确。
由于炭疽杆菌致病性强，快速、准确的诊断该病，尽早发现并处理传染源，是防控炭疽杆菌病的重要和有效手段。本发明首次建立了一种检测炭疽杆菌的RPA等温扩增检测方法，对设备的要求低，结果准确可靠。该方法特异性强、敏感度高、操作简单、反应速度快，适用于兽医诊断实验室和养殖场现场的炭疽杆菌检测，尤其是在资源匮乏的边缘地区养殖场的现场检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 王素华
<120> 一种用于检测炭疽杆菌的RPA引物及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctggcaca tggtactact caaacaagat 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aataatactt gtaattcacc attgaagcaa 30
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggattgcgt atgcagttct ac 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgtaattca ccattgaagc aa 22

Claims (10)

1.一种用于检测炭疽杆菌的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-GTCTGGCACATGGTACTACTCAAACAAGAT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-AATAATACTTGTAATTCACCATTGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.2)。
2.一种检测炭疽杆菌的RPA试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物。
3.含有权利要求1所述RPA引物或权利要求2所述RPA试剂的试剂盒。
4.权利要求1所述RPA引物、或权利要求2所述RPA试剂、或权利要求3所述的试剂盒在检测炭疽杆菌中的应用，所述应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。
5.一种用于检测炭疽杆菌的RPA方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DNA模板提取：提取待测样品中的DNA；
(2)RPA扩增反应：以步骤(1)提取的DNA为模板，并采用权利要求1所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物；
所述的RPA方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。
6.根据权利要求5所述的RPA方法，其特征在于，RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
模板DNA 1.0μL
上游引物1.0～5.0μL
下游引物1.0～5.0μL
再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL
醋酸镁2.5μL
灭菌去离子水补至50μL；
其中，上游引物和下游引物的初始浓度均为10mmol/L，所述醋酸镁的初始浓度为280mmol/L。
7.根据权利要求5或6所述的RPA方法，其特征在于，RPA扩增反应的反应体系中，上游引物和下游引物的终浓度均为0.4mmol/L。
8.根据权利要求7所述的RPA方法，其特征在于，RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
模板DNA 1.0μL
上游引物2.0μL
下游引物2.0μL
再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL
醋酸镁2.5μL
灭菌去离子水补至50μL；
其中，上游引物和下游引物的初始浓度均为10mmol/L，所述醋酸镁的初始浓度为280mmol/L。
9.根据权利要求7或8所述的RPA方法，其特征在于，所述RPA扩增反应的温度为36℃～40℃，扩增时间为20～30min，优选39℃扩增30min。
10.根据权利要求6所述的RPA方法，其特征在于，所述步骤(3)使用DNA纯化试剂盒对RPA扩增产物进行纯化，取RPA扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像系统中观察分析电泳结果。
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