WO2014079350A1

WO2014079350A1 - 检测cho细胞dna的方法

Info

Publication number: WO2014079350A1
Application number: PCT/CN2013/087448
Authority: WO
Inventors: 王滔; 孙玮洁; 杨志行; 吴婉欣; 文明; 朱冰美; 俞燕
Original assignee: 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2014-05-30
Also published as: CN103074334A; CN103074334B

Abstract

本发明提供了检测CHO细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测CHO细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示区段。利用所述引物对的PCR检测可用于区分大肠杆菌或人类，甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性DNA。

Description

检测 CHO细胞 DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及 CHO细胞 DNA的检测方法。背景技术

在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。

重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质 DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。

在重组生物蛋白制品中，残余 DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量 DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留 DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的 DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的 DNA, 则这种 DNA 通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。

从 1984年开始，国际官方机构陆续推出了针对生物制品残余 DNA检测的各种限度标准，并且根据研究及应用的不断变化而逐步修改完善。 1997年， WHO 第 46届生物制品标准化专家委员会（ECBS)会议上，与会专家通过对传代细胞系残余 DNA风险的再评估，认为残余 DNA虽然不是主要危险因素，但应视为细胞污染物，要求清除至最低水平。根据这一再评估，建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的 DNA含量为 10 ng。任何生物制品的纯化工艺应经验证，证明其去除细胞 DNA的能力，包括参入示踪剂研究。另外，产品批次间的均一性应通过临床效果观察，以及三批以上的检测结果予以证实。目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系，如 CHO、 BHK、 SP2/0、 C127等，均有逆转录病毒颗粒阳性的报道。因此，对其残余 DNA含量就需要严格控制。

目前，针对不同的生物制品，其相对应的检测限也略有不同。一般而言， FDA 规定医药生物制品中 DNA污染的检测限为 lOO pg/剂， WHO和 EU略为宽松，检测限可达 10 ng/剂。低浓度的检测限对检测的手段及技术提出了更高的要求。

关于生物制品中宿主细胞残余 DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在 10 pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。

Taqman探针检测属于实时定量 PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在 PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于 taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。

在目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系中， CHO细胞， SP , 中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary)因具有无限增殖性，可以传代百代以上，而成为目前生物工程上广泛使用的细胞。当今批准正式应用于人类疾病治疗或预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种（乙肝疫苗)是由酵母菌生产，其余所有产品均是由 CHO细胞和大肠杆菌生产。与原核的大肠杆菌相比， CHO属于真核哺乳细胞，能形成有活性的二聚体和糖基化的功能，因此， CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主，其已广泛用于重组蛋白药物的制取，是一种重要的工程表达细胞株。

综上所述，本领域急需检测生物制品中残余 CHO细胞 DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于生物制品质量控制。发明内容

本发明的目的是提供检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测 CHO细胞基因组 DNA的方法在第一方面，本发明提供一种检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 64-92位；其中的反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 125-147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 78-84 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 67-92位，所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 125-144位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 78 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为 29-20 bp; 优选 26和 20 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的 Tm温度为 58-60°C，并且正向引物的 Tm与反向引物的 Tm的差值的绝对值 2°C。

在另一优选的实施方式中，所述正向引物如 SEQ ID NO: 3所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 4所示。在第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包含本发明第一方面所述的引物对。

在优选的实施方式中，所述检测体系还包含第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-19位，所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 110 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为 16-24 bp。

在优选的实施方式中，所述第二引物对中所述正向引物如 SEQ ID NO: 5所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 6所示。

在另一优选的实施方式中，所述检测体系还包含探针。

在优选的实施方式中，所述探针是 5-FAM-TTTCATCAGGCCAAAGGCACC TCTGT-TRAMA-3禾口 /或 5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC -TAMRA-3。

在优选的实施方式中，所述检测体系的检测灵敏度为 10⁶-l fg/^，优选地，所述检测体系的检测灵敏度为 0.1 fg/^。在第三方面，本发明提供一种 CHO细胞基因组 DNA的检测方法，所述方法包括：利用本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测体系，对待测样品进行 PCR, 并检测 PCR扩增产物。

在优选的实施方式中，在对待测样品进行 PCR之前，利用磁珠对待测样品进行纯化预处理。在第四方面，本发明提供一种 PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。

在进一步的优选实施方式中，所述标准品对照包含 SEQ ID NO: 1所示片段；优选地，所述标准品对照是 SEQ ID NO: 1所示片段。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括用于对待测样品进行纯化预处理的磁珠。在第五方面，本发明提供一种 PCR方法，包括步骤：

在一 PCR检测体系中，利用本发明第一方面所述的引物对扩增目标产物。在优选的实施方式中，所述方法同时利用第二引物对实施多重 PCR, 所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA 上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA 上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID

NO: 2所示区段的第 1-19位，所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 110 bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为 16-24 bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的 Tm温度为 58-60°C，并且正向引物的 Tm与反向引物的 Tm的差值的绝对值 2°C。

在优选的实施方式中，在扩增目标产物之前，利用磁珠对待测样品进行纯化预处理。在第六方面，本发明提供一种检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA 上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

在另一优选的实施方式中，所述正向引物如 SEQ ID NO: 5所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 6所示。在第七方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含 SEQ ID NO: 1所示序列。

在优选的实施方式中，所述多核苷酸如 SEQ ID NO: 1所示。在第八方面，本发明提供本发明第七方面所述的多核苷酸在制备检测 CHO细胞基因组 DNA的试剂中的应用。在第九方面，本发明提供一种检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对，所述引物对特异性结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2所示区段。

在优选的实施方式中，所述正向引物的序列如 SEQ ID NO: 3或 5所示，反向引物的序列如 SEQ ID NO: 4或 6所示。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

图 1显示了参考品的扩增曲线。从图 1可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 3和 4所示。

图 2显示了参考品的标准曲线。由图 2可知，当参考品浓度为 1000 ρ_§/μ1、 100 pg/μΚ 10 pg/μΚ 1 pg/μΚ 100 fg/μΚ 10 fg/μΚ 1 fg/μΐ及 0.1 fg/μΐ时，绘制得到的标准曲线斜率为 -3.39，相关系数 (R2) = 0.999，扩增效率为 97.2%。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到 0.1 fg/μΐ, 其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 3 和 4所示。

图 3显示了利用人类污染 DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，紫色和绿色线为 CHO; 粉色和蓝色线为人类 DNA, 其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 3 和 4所示。

图 4显示了利用大肠杆菌污染 DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，蓝色和红色线为 CHO，紫色和粉色线为大肠杆菌 DNA,其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 3和 4所示。

图 5显示了大鼠干扰实验的结果。图中：粉色为 CHO标准曲线；蓝色为加入大鼠基因的干扰曲线，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 3和 4所示。

图 6显示了小鼠干扰实验的结果。图中：粉色为 CHO标准曲线，绿色为小鼠基因干扰曲线，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 3和 4所示。

图 7显示了参考品的扩增曲线。从图 7可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 5和 6所示。

图 8显示了参考品的标准曲线。由图 8可知，当参考品浓度为 1000 ρ_§/μ1、

100 pg/μΚ lO pg/μΚ 1 pg/μΚ 0.1 pg/μΐ和 0.01 pg/μΐ时，绘制得到的标准曲线斜率为 -3.33，相关系数 (R2) = 0.997，扩增效率为 99.66%。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到 10 fg/μΐ, 其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 5和 6所示。

图 9显示了利用人类污染 DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，黄色和绿色线为 CHO; 红色和紫色线人类，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 5和 6所示。

图 10显示了利用大肠杆菌污染 DNA进行的体系干扰实验的结果。图中，紫色线为 CHO , 蓝色和粉红色线为大肠杆菌，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 5 和 6所示。

图 1 1显示了大鼠干扰实验的结果。图中：粉色为 CHO标准曲线；紫色为加入大鼠基因的干扰曲线，其中，利用的引物对如 SEQ ID NO: 5和 6所示。图 12显示了小鼠干扰实验的结果。图中：紫色为 CHO标准曲线，蓝色为小鼠基因干扰曲线，其中利用的引物对如 SEQ ID NO: 5和 6所示。

图 13显示了 CHO细胞 DNA经过不同时间超声后的凝胶电泳结果。图中泳道 1为 DNA分子量标准，由上至下依次为 15 kb、 1 kb, 7.5 kb, 5 kb, 2.5 kb, 1 kb和 0.25 kb。泳道 2为 0 min超声样本，泳道 3为 1 min超声样本；泳道 4为 5 min 超声样本；泳道 5为 10 min超声样本；泳道 6为 30 min超声样本。

图 14显示了不同大小片段 DNA的检测结果。图中三组曲线由左至右分别为 lOO fg/μΙ, lO fg/μΙ, 1 fg/μΐ浓度下不同大小片段 DNA的检测结果。

图 15显示了比较 SEQ ID NO: 7和 8所示引物对与 SEQ ID NO: 5和 6所示引物对的标准曲线的实验结果。具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用针对 CHO细胞基因组 DNA的 SEQ ID NO: 1 (AGCTGATAAAATAGTAACTATCTACTGTTCAGG

CTGATG)所示区段设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测 CHO细胞基因组 DNA, 还能区分大肠杆菌或人类等干扰性 DNA,甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性 DNA。因此，本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。

此外，发明人还发现利用上述引物构成的多重 PCR荧光检测体系能够进一步提高实验结果的精密度和检测灵敏度，降低样本处理损害 DNA完整性所带来的漏检率。在此基础上完成了本发明。本发明的引物

本文所用的术语"弓 I物 "具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的 CHO 细胞基因组 DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1 (CHO细胞基因组中 LTR元件的部分区段)或 SEQ ID NO: 2(CHO细胞基因组中另一个 LTR元件的部分区段)所示区段设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2所示区段。在具体的实施方式中，特异性结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1 所示区段的所述引物构成第一引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 64-92位，优选第 67-92位；其中的反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 125-147位，优选第 125-144位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 78〜84 bp，优选 78 bp。

在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为 26-20 bp; 优选 26和 20 bp。

在另一优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的 Tm温度为 58-60 °C，并且正向引物的 Tm与反向引物的 Tm的差值的绝对值 2°C。

在优选的实施方式中，所述正向引物如 SEQ ID NO: 3

(5-GTCATCTAAGTACAAACTTAAAGGGC-3)所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 4 (5-GTCCAGAGTGCCAGGTATGG-3)所示。在具体的实施方式中，特异性结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2 所示区段的所述引物构成第二引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位，优选第 1-19 位；反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110 位，优选第 89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp, 优选 110 bp。

在另一优选实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的长度为 16-24 bp, 优选 19和 21 bp。

在另一优选实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的 Tm温度为 58-60°C，并且正向引物的 Tm与反向引物的 Tm的差值的绝对值 2°C。

在具体的实施方式中，第二引物对的所述正向引物如 SEQ ID NO: 5

(5-ACAGGTTTCTGCTTCTGGC-3)所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 6

(5-CATCAGCTGGACTGGTTCACA-3)所示。在优选的实施方式中， SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4是本发明的最佳弓 I物对。多重 PCR

普通 PCR仅应用一对引物，通过 PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一因子的鉴定。多重 PCR (multiplex PCR), 又称多重引物 PCR或复合 PCR, 它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的 PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般 PCR相同。但是相比于一般 PCR, 多重 PCR具有以下优点： 1. 高效性，在同一 PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型； 2. 系统性，多重 PCR很适宜于成组对象的检测； 3. 经济简便性，多种对象在同一反应管内同时检出，大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，从而提供更多更准确的诊断信息。类似地，本领域普通技术人员明白， "多重荧光 PCR" 是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针进行的多重 PCR。

在本发明中，由于检测对象， δΡ，残余 CHO细胞 DNA不一定是完整的基因组 DNA, 为进一步提高检测精密度和灵敏度，降低漏检率，本发明可以利用第一对引物 (SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4)与第二对引物 (SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6)构成多重荧光 PCR体系，针对 CHO细胞基因组 DNA的两处不同区域进行检测，从而极大提高了检测的精密度和灵敏度。本发明的检测体系

本发明还提供一种检测 CHO细胞基因组 DNA的检测体系，所述体系包含上述的本发明引物对以及探针等实施 PCR所需的其它成分，例如 Taq酶、 dNTP、 Mg²⁺等等。

在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。在具体的实施方式中，所述探针如

5-FAM-TTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA-3 (SEQ ID NO: 9)或 5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC-TAMRA-3 (SEQ ID NO:

10)所示。

在具体的实施方式中，本发明检测体系的检测灵敏度达到 10⁶-l fg/^。在优选的实施方式中，本发明检测体系的检测灵敏度达到 0.1 fg/^。在其它实施方式中，本发明还提供利用上述的本发明引物对或本发明检测体系检测 CHO细胞基因组 DNA的方法。在其它实施方式中，本发明还提供 PCR试剂盒，所述 PCR试剂盒装有本发明引物对和用于实施 PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作 PCR检测的使用说明书。

在优选的实施方式中，为排除假阴性结果，本发明的 PCR试剂盒还装有标准品对照。

在进一步的优选实施方式中，所述标准品对照包含 SEQ ID NO: 1所示片段，优选地，所述标准品对照是 SEQ ID NO: 1所示片段。在其它实施方式中，本发明还提供利用本发明引物对实施的 PCR方法。本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含 SEQ ID NO: 1所示片段。

在优选的实施方式中，所述多核苷酸如 SEQ ID NO: 1所示。

本领域技术人员知道，所述多核苷酸是一种特异性的 CHO细胞基因组 DNA检测标志物， δΡ, 可通过扩增该标志物特异性地检测体系中 CHO细胞基因组 DNA是否存在。

因此，本领域技术人员不难理解，上述多核苷酸可用于 CHO细胞基因组 DNA 的检测。例如，如果具体的检测环境存在可能影响 PCR扩增的因素，就有可能产生假阴性结果，因此，本发明的多核苷酸可在检测中用作标准品对照，以排除特定体系下产生的假阴性结果。本领域普通技术人员鉴于本文内容可以理解，如果检测体系中只含有一对引物，进行的 PCR方法是普通 PCR, 如果检测体系中含有两对以上的引物，那进行的是多重 PCR。本发明的引物和方法的优点包括：

1. 本发明的引物灵敏度高，能够检测出 l fg/μΐ, 甚至 O. l fg/μΐ的 DNA浓度；

2. 本发明的引物特异性好，能够区分 CHO细胞基因组 DNA与其它干扰性 D A;

3. 本发明的方法操作简便快捷。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明所用的材料与方法

1. 样本处理试剂：（柱纯化回收）包括蛋白酶 K 20 mg/ml，预处理缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，结合柱，收集管， 1.5 ml离心管。

2. DNA检测体系：

2 Taqman mix: 含有 Taq酶、 dNTP、 Mg²⁺、本发明引物及探针等成分。

正向引物 GTCATCTAAGTACAAACTTAAAGGGC (SEQ ID NO: 3)

反向引物 GTCCAGAGTGCCAGGTATGG (SEQ ID NO: 4)

探针 FAM-TTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA (SEQ ID NO:

A 9)

组扩增片段 AGCTGATAAAATAGTAACTATCTACTGTTCAGGCACGAGTTCAAG

GTTTTTAAGTTTATTTTGGTTGTCATCTAAGTACAAACTTAAAGGG CTTTTCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGTCCAATCCATACCTGGCA CTCTGGACAGAAGCTATACATGCTTATAGCCCAAATCTGCAGTTT

掺加标准品，阴性质控（NTC)， DNA稀释液

3. 检测仪器： ABI 7500ο

4. 实验操作及过程

4.1 样本处理

4.1.1 准备工作：

在洗涤缓冲液中加入 80 ml无水乙醇

4.1.2 样本处理：

1) 取 lOO ul检测样品，加入 1.5 ml离心管中，加入 5 ul蛋白酶 K， 55 °C 1 小时；

2) 将结合柱内放入收集管，加入 200 预处理缓冲液，室温放置 5 min; 12000 g离心 2 min，弃废液；

3) 在检测样品中加入 600 ul的结合缓冲液，震荡混匀；

4) 将溶液加入结合柱中， 8000 g离心 l min, 弃废液；

5) 结合柱中加入 700 洗涤缓冲液（已加乙醇）， 10000 g离心 1 min，弃废液；

6) 重复第五步；

7) 将空的结合柱与收集管， 13000 g离心 2 min，丢弃收集管；

8) 将柱子放入干净的 1.5 ml离心管中，开盖，晾干 10 min，除去乙醇； 9) 柱子中加入 50 洗脱缓冲液（预先 55°C水浴），放置 2 min;

10) 13000 g离心 1 min，所得滤液即为纯化产物。

4.2 检测体系

4.2.1 准备工作：

参考品：参考品为 CHO-K1细胞基因组 DNA (仓鼠卵巢细胞亚株 CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，具体提取 DNA方法参考中国药典附录 IX B中提供的阳性对照 DNA制备方法)，标准参考品经校正后使用，其浓度为 50 ng/ul，冰冻保存。使用时用 DNA稀释液稀释成 7个浓度梯度，分别为 100 pg/μΚ 10 pg/μΚ 1 pg/μΚ 100 fg/μΐ, 10 fg/μΐ, 1 fg/μΐ及 0.1 fg/μΐο NTC 为无样本阴性质控。

检测体系： 30 ul 15 μΐ 2X Taqman mix + 10 μΐ样品 + 5 μΐ 7j

实时荧光定量 PCR反应程序优选为：95 °C预变性 2 min; 95°C 15 s, 60°C 1 min, 40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中 CHO细胞 DNA的量。 4.3 本发明还可采用以下样本处理试剂和样本处理方法：

4.3.1. 样本处理试剂：（磁珠纯化回收）包括蛋白酶 K，结合液，磁珠，异丙醇，洗涤液、 70%乙醇，乙醇，洗脱液， 1.5 ml离心管。

4.3.2 样本处理

4.3.2.1 准备工作：

在洗涤液中加入 20 ml无水乙醇；

4.3.2.2 样本处理：

1) 取 100 μΐ待检测样本到 1.5 ml干净的离心管中，加入 3 μ1蛋白酶 K，振荡混匀后， 55°C水浴 1小时。

2) 将磁珠振荡混匀， 37°C水浴孵育 10 min。

3) 从水浴中取出样本，快速离心，加入 200 μΐ结合液，振荡混匀。

4) 在样本混合物中分别加入 200 μΐ异丙醇， 5 μ1磁珠，加入时需分别振荡混匀。

5) 将全部混合物快速振荡 5 min, 快速离心后静置于磁性分离架上。

6) 待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。

7) 将含有磁珠的离心管从磁性分离架上取下，加入 700 μΐ洗涤液，振荡混匀；快速离心 10 s后，将离心管重新静置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 1次磁珠洗涤。

8) 从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，用 700 μ170%乙醇，振荡混匀；快速离心 10 s后，将离心管重新静置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 2次磁珠洗涤。

9) 从磁性分离架上取下离心管，打开管盖将离心管和磁珠在室温下干燥 10 min, 除去乙醇残留。

10) 沿离心管壁加入 50 μΐ预热的洗脱液，轻微振荡混匀磁珠后 70°C水浴 7 min, 水浴过程中可适当振荡磁珠。

11) 孵育完成后，将离心管快速离心 15 s，然后静置于磁性分离架上后，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。

12) 再次往磁珠中加入 50 μΐ预热的洗脱液， 70°C水浴 7 min，磁珠分离后收集上清和第 11步上清混合，即为样本纯化液。实施例

实施例 1.评价 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4所示引物对的性能

根据上文 "本发明所用的材料与方法" ，利用 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4 所示的引物对进行 PCR检测。实验结果如图 1和图 2所示。其中图 1是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图 2是参考品标准曲线。由图 2可知，当参考品浓度为 1000 pg/μΚ 100 pg/μΚ lO pg/μΚ 1 pg/μΚ 100 fg/μΚ 10 fg/μΚ l fg/μΐ及 O. l fg/μΐ时，绘制得到的标准曲线斜率为 -3.39，相关系数 (R2) = 0.999，扩增效率为 97.23 %。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到 0.1 实施例 2. 评价 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4所示引物对的特异性为评价 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4所示引物对的特异性，选取生产中常见的人类及大肠杆菌污染 DNA以及与仓鼠细胞同源性高的小鼠、大鼠基因作体系干扰实验。具体为：

1. 人类和大肠杆菌污染 DNA体系干扰实验

在检测体系中加入同样浓度的 10 pg/μΐ CHO基因和人类基因 (人肝癌细胞 SK-HEP-1来源中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；用 takara基因提取试剂盒提取)、以及同样浓度的 lO pg/^ CHO基因和大肠杆菌基因（E.coil DH5a菌株来源于中国科学院微生物研究所，编号 1.1595，用 takara 基因提取试剂提取)作为样本进行检测。

2. 大鼠干扰实验

用参考品稀释 1000 pg/ 、 100 pg/μΚ 10 pg/μΚ 1 pg/μΚ 0.1 pg/μΐ做标准曲线，等量分成两份，一份不加大鼠基因 (大鼠来源于浙江医学科学院实验动物中心， SD Wistar; 取大鼠肝脏用 MP DNA提取试剂盒提取)，一份加入大鼠基因并使加入后的终浓度为 100 pg^L。

3. 小鼠干扰实验

用参考品稀释 1000 pg/ 、 100 pg/μΚ 10 pg/μΚ 1 pg/μΚ 0.1 pg/μΐ做标准曲线，等量分成两份，一份不加小鼠基因 (小鼠来源于浙江医学科学院实验动物中心，昆明种，小鼠肝脏用 MP DNA提取试剂盒提取)，一份加入小鼠基因并使加入后的终浓度为 100 pg^L。

实验结果如图 3-6所示。从产生的曲线可以看出，人类和大肠杆菌 DNA污染对 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4所示引物对的检测结果明显没有造成影响；即便是与仓鼠同源性很高的大鼠和小鼠 DNA污染，对 SEQ ID NO : 3和 SEQ ID NO : 4所示引物对的检测结果也未造成实质性影响。实施例 3. 评价 SEQ ID NO : 5和 SEQ ID NO : 6所示引物对的性能

按照实施例 1所述的方法，评价 SEQ ID NO : 5和 SEQ ID NO : 6所示引物对的性能。

实验结果如图 7和图 8所示。其中图 7是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图 8是参考品标准曲线。由图 8可知，当参考品浓度为 1000 pg/μΚ 100 pg/μΚ lO pg/μΚ 1 pg/μΚ 0.1 pg/μΐ及 0.01 pg/μΐ时，绘制得到的标准曲线斜率为 -3.33，相关系数 (R2) = 0.997，扩增效率为 99.66%。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到 10 fg^l。

实施例 4. 评价 SEQ ID NO : 5和 SEQ ID NO : 6所示引物对的特异性按照实施例 2所述的方法，评价 SEQ ID NO : 5和 SEQ ID NO : 6所示引物对的特异性。

实验结果如图 9-12所示。从产生的曲线可以看出，人类和大肠杆菌 DNA污染对本发明检测体系的检测结果明显没有造成影响；即便是与仓鼠同源性很高的大鼠和小鼠 DNA污染对 SEQ ID NO : 5和 SEQ ID NO : 6所示引物对的检测结果也未造成实质性影响。实施例 5. 替代样本实际定量检测实验

用 10 mg/ml BSA水溶液作为检测基质，在 100 μΐ样本基质中分别加入 100 pg、 10 pg的 CHO参考品 DNA, 按实验操作（如上所述)步骤，对替代样本进行处理并定量检测，所得数值计算实际检测回收率，其中该实施例使用 SEQ ID NO : 3 禾口 4以及 5禾 Π 6所示两组引物对。

从以上结果可以看出：为了排除样本中高浓度蛋白对检测结果的影响，样本必须经过预处理。从实验结果看，试剂盒预处理过程可以从粗制样本中回收并浓缩微量存在的 DNA目的片段，回收率在 70%〜130%保证后期检测结果的可靠性。实施例 6. 替代样本实际定量检测实验

重复实施例 5，但区别在于采用 "4.3 其它样本处理试剂和样本处理方法" 中所述的样本处理试剂和方法，结果如下表所示。

从以上结果可以看出：检测的回收率和稳定性均得到进一步的提高。实施例 1. 片段化 DNA检测实验

取 300 ng/ulCHO参考品 DNA分装入 1.5 ml离心管中，每管 30ul，分装 5 管。分别将每管 DNA在水浴中以不同时间超声（0min、 1 min, 5 min, 15 min, 30 min), 超声所得不同大小的 DNA分别稀释梯至为 100 fg/μΚ 10 fg/μΐ及 1 fg/μΐ 后，以稀释 DNA作为模板，用包含 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示引物对和 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6所示引物对的多重检测体系检测。

由图 13和图 14的结果可知，不同片段大小的 DNA作为模版后，对检测结果影响不大。这就表明联用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4所示引物对和 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6所示引物对的检测体系可以很好的避免由于样本中残余 DNA收到损伤而造成基因不同程度的片段化所引入的漏检现象，使检测结果更为可靠全面。实施例 8. 包含本发明其它引物的检测体系

本发明人还获得了特异性结合于 CHO细胞基因组 DNA(SEQ ID NO: 2)的第

1〜18以及 89〜110位的其它弓 I物对：正向引物： ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT (SEQ ID NO: 7)；反向引物： CATCAGCTGACTGGTTCACA(SEQ IDNO: 8)。并且在其他条件不变的情况下，以 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6为对照，对 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8进行了评估。

结果如图 15所示。由图 15可知，当参考品浓度为 1000pg/^、 100 pg/μΚ 10 pg/μΐ和 1 pg/μΐ时， SEQIDNO: 7和 SEQ ID NO: 8所示引物可以检测出 DNA, 但它们的检测限不如 SEQIDNO: 5和 SEQIDNO: 6所示引物那般优秀，不能检测出 0.1 pg^L的 DNA浓度，高浓度下的 CT出现值比 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6所示引物少 1个循环， SP, 检测浓度差一个数量级。但 SEQIDNO: 7和 SEQ ID NO: 8所示引物对依然是可以实现本发明目的的引物对。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1. 一种检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 64-92位；其中的反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1所示区段的第 125-147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 78-84 bp。

2. 如权利要求 1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如 SEQ ID NO: 3 所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 4所示。

3. 一种检测体系，其特征在于，所述检测体系包含权利要求 1或 2所述的引物对。

4. 如权利要求 3所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO 细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

5. 如权利要求 3或 4所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含探针。

6. 如权利要求 3-5中任一项所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系的检测灵敏度为 106-1 fg/ u 1，优选地，所述检测体系的检测灵敏度为 0.1 fg/ u lo

7. 一种 CHO细胞基因组 DNA的检测方法，所述方法包括：利用权利要求 1 或 2所述的引物对或权利要求 3-5中任一项所述的检测体系，对待测样品进行 PCR, 并检测 PCR扩增产物。

8. 如权利要求 7所述的检测方法，其特征在于，在对待测样品进行 PCR之前，利用磁珠对待测样品进行纯化预处理。

9. 一种 PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求 1或 2所述的引物对。

10. 如权利要求 9所述的 PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

11. 如权利要求 9或 10所述的 PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于对待测样品进行纯化预处理的磁珠。

12. 一种 PCR方法，包括步骤：

在一 PCR检测体系中，利用权利要求 1或 2所述的引物对扩增目标产物。

13. 如权利要求 12所述的 PCR方法，其特征在于，所述方法同时利用第二引物对实施多重 PCR, 所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

14. 如权利要求 12或 13所述的 PCR方法，其特征在于，在扩增目标产物之前，利用磁珠对待测样品进行纯化预处理。

15. 一种检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 1-22位；所述反向引物结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 2所示区段的第 86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 80-110 bp。

16. 如权利要求 3所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如 SEQ ID NO: 5所示，所述反向引物如 SEQ ID NO: 6所示。

17. 一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含 SEQ ID NO: 1所示序列。

18. 如权利要求 17所述的多核苷酸在制备检测 CHO细胞基因组 DNA的试剂中的应用。

19. 一种检测 CHO细胞基因组 DNA的引物对，其特征在于，所述引物对特异性结合于 CHO细胞基因组 DNA上 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2所示区段。

20. 如权利要求 19所述的引物对，其特征在于，所述正向引物的序列如 SEQ

ID NO: 3或 5所示，反向引物的序列如 SEQ ID NO: 4或 6所示。