CN1617936A - 在单一样本中检测和定量多种靶核酸 - Google Patents

Abstract

用特殊的杂交与滚动循环扩增结合的方法能以灵敏度达到每一样本中10个拷贝靶物的水平在单一反应中对成千上万个核酸序列进行检测和定量。由于在扩增结束时反应产物的数量严格与靶核酸量成比例并依赖于靶核酸量，并且通过使用通用模板和引物排除了不同样本之间的差异性，该方法大大提高了精确性。该方法能够分别适用于为研究和诊断目的的点突变的检测和基因突变的鉴别。

Description

在单一样本中检测和定量多种靶核酸

                        发明领域

本发明涉及遗传分析的领域，特别涉及使用杂交和滚动-循环扩增技术，在单一样本中对包括突变核酸的核酸进行精确的检测和敏感的定量。本发明的组合物和方法学对于研究领域、个体鉴定和临床诊断及其它目的在检测单一样本中多种核酸的存在和拷贝数量时特别有用。

                        发明背景

对样本中核酸的精确检测和定量是多种应用中非常有价值的手段之一，包括实验研究、医学诊断、新药发明和生命科学及生物医学的其它方面。同时，核酸检测技术也存在于许多其它的实践中，这些包括以证明个体身份为目的的亲子鉴定，司法鉴定，器官移植时供体和配体的匹配及产前咨询服务等。

基因突变引起大量疾病的发生，其中包括各种形式的癌症，血管性疾病，神经和内分泌系统疾病。已经鉴定了许多这样的基因突变，包括核酸序列变化，引起的囊状纤维化疾病，肌肉萎缩症，Tay-Sachs疾病，血友病，苯丙酮酸尿症和镰刀状细胞贫血症等。由于遗传变异关系到疾病的状态，因此在症状出现前后准确检测标本中核酸序列对于正确的临床诊断、预防和治疗就至关重要。

遗传变异既可以是小到基因中单个碱基对的改变，也可以是若干碱基对的改变、插入、缺失和易位。在已知的500多种遗传疾病中，有很多由单个碱基对突变引起。单个碱基对突变导致异常细胞活动和疾病的突出例子是镰刀状细胞贫血症。由于从样本的大量靶核苷酸酸序列中识别一个碱基对的差别具有科学上的挑战意义，所以检测单碱基对变异最为困难。因此，一种能够从众多核酸序列中检测出单个碱基对差异的方法，对于研究和改善遗传疾病的影响就显得至关重要了。

遗传密码中的其它变化也可以改变生命中某些方面的功能，并引起疾病。由遗传密码的改变而引起基因产物的改变或基因自身在表达水平上的变化可能是功能改变和疾病发生的决定因素。基因表达的改变可以通过遗传物质DNA拷贝数量的改变而引起(例如：通过始发阶段的控制，RNA前体的改变，异常RNA的剪接等等)。所以，核酸表达水平或拷贝数量的定量应该是临床诊断的基础。

在大量基因中识别单个碱基对改变的能力是遗传物质分析和定量的基础，而定量识别的能力具有更广泛地应用前景。

美国专利(专利号：6,268,147)已经广泛和清晰的描述了各种用于在含有大量核酸序列的单一标本中同时分析多种核酸序列的技术方法和策略。其中，最常用的分析方法是依赖于核酸捕获和标记的杂交技术。

这样的杂交技术之一利用与靶核酸互补的核酸探针定位和杂交样本中的靶核酸。探针或靶核酸用可检测的报告分子，如荧光物质或放射性同位素预先标记。杂交和冲洗步骤后，标记物的存留表明样本中存在靶DNA。点印迹和狭逢印迹方法就是利用这种简单的杂交检测技术。此类膜杂交形式的技术及其派生技术，利用凝胶电泳将混合的DNA片段分开，然后再将凝胶中的DNA片段转移并固定于膜上。通过固定于膜上的DNA片段与一个或多个标记探针在特定杂交条件下的反应而识别相关核酸的存在与否。这样的膜技术包括了单核苷酸酸多态性检测(SNP)、RNA印迹和DNA印迹杂交技术。

上述技术的局限性之一是需要额外的步骤将标记物整合入靶探针或检测探针。虽然直接和广泛使用标记，但毕竟需要额外的步骤。并且，当检测大量标本时，这些额外步骤将消耗大量的时间和费用。更重要的是，如要用标记的核酸探针检测阳性信号，样本中必须至少包含有10万至100万个拷贝的靶核酸，才能达到有效的、用标准技术能检测到的浓度。因此，这些方法对低拷贝数的核酸是不敏感的，并且不能用于靶物数量少于10万至100万个的样本检测。但是，存在于细胞基因组中的大部分基因拷贝数介于1至数个之间，因此，单独使用这一方法，不足以确定大多数核酸的存在或缺失。

杂交技术的另一个局限性是不能用于监测或确定基因的表达水平和拷贝数量。杂交方法仅仅能够用于确定相关基因序列的存在与否而不能对其进行定量分析。此外，核酸序列中单个碱基对的差异不是任何情况下都可以被识别的，这是因为只有一个不同碱基对时，只有靠很小的结合能量差别来区分靶和非靶探针。为了使灵敏度能达到足以鉴别匹配的探针和单个核苷酸酸不匹配的探针，就必须非常仔细的控制杂交、孵化和冲洗步骤的严紧度。最佳的反应条件很大程度上取决于所检测的对象。由于每一个反应必须是特异于靶和探针之间的作用，以至使自动化和/或高通量的同时进行一个以上的核酸筛选变得十分困难。

一般而言，这种技术达不到检测低数目核酸序列的灵敏度，如仅有几个细胞可供样本分析的临床样本检测。并且，这种方法也不适合单独用于确定大量核酸序列中仅有很少部分序列改变(突变)的存在，而这些很少部分改变直接导致疾病的发生。

另一种检测和定量核酸的方法是利用聚合酶链式反应(PCR)检测样本中的靶核酸。在PCR方法中，通过热循环反应，利用相关靶序列5’和3’端互补引物而扩增相关的靶序列。扩增后的核酸序列就能够用各种技术如凝胶电泳来进行检测，进而确定样本中特定序列的存在或缺失。这个方法尤其适用于从含有多种核酸序列的样本中检测散在分布的低拷贝靶核酸序列。这种情况下，更多的标记物通过指数级的PCR酶反应过程而整合进去，以至能检测到低拷贝数量序列的阳性信号。然而，这种技术在检测单个样本中多种目标靶序列的拷贝数和检测单一碱基对突变时存在缺陷。

PCR方法的检测过程是一个高灵敏度的酶反应过程。在反应的过程中，由于盐浓度和退火温度的影响导致引物退火速率的不同和聚合酶对每一种核酸序列的增扩速度的差异，直接影响到生成物的产生数量。由于存在这种样本与样本之间的差异性，因此，这种方法不适合用于通过单一反应检测单个样本中的多种靶序列拷贝数量的变化。

用PCR方法检测多种核酸的另一个局限是每一种靶序列所需的PCR引物各不相同。反应中每加入一套新的引物，潜在复制物和引物二聚体的数量可以呈指数级增长。在一个PCR反应中，多对引物将造成高比率的非特异性扩增和假阳性结果(参见Sambrook et al，.MolecularCloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)，pages 14 and 15(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)。另外，当野生型和突变型同时存在时，PCR能使两者同时扩增而迫使用更多的步骤将突变型从野生型中分离和鉴别出来。

如美国专利(No.6,312,892，)讨论的，核酸的检测也可运用探针连接方法确定已知核酸序列。探针连接方法涉及到跨越目标靶区域的两个探针。两个探针与靶序列互补并与之杂交，使上游3’端的探针与下游5’端的探针直接相邻。只有当结合点精确互补，在邻接探针的交叉点不存在任何错配时，探针的邻接末端就可以通过连接反应结合在一起。连接反应将两条核酸探针链共价连接为一条核酸链时，对于结合位点上的单一碱基对的错配非常敏感，如有一个碱基对的错配，探针就不能连接。通过检测连接的探针可以确定特定靶核酸序列的存在或缺失。(参见：美国专利No.4,833,750.)

这一技术特异性很强，甚至在靶序列和探针之间存在一个碱基对的不同，连接酶就不能连接DNA链。但是单独使用探针连接方法，不能产生足够的产物用以检测和定量小量的靶序列。

因为连接反应自身不能提供足够的产物以供检测，探针连接技术需要一个附加的扩增步骤用以检测连接反应阳性结果的存在。这一领域的文章描述了大量检测方法。目前使用的许多方法主要依赖于用荧光物质或放射物质对DNA探针的标记(参见：美国专利No.4,833,750)。其它的方法运用了PCR扩增的靶物质和/或多循环杂交和连接反应。(例如，参见：美国专利No.6,312,892)。然而，现有的技术仍不能对小量目标序列检测和定量。

与上述标准杂交技术一样，利用标记探针的探针连接方法的检测体系同样受到标记密度的限制，且不能检测出样本中低拷贝数的靶序列。因而，单独使用这些技术不能为低拷贝数的核酸提供可以检测到的信号。

利用PCR和其它扩增反应的检测技术，如多重杂交和连接反应，由于其核酸扩增产物的数量随靶核酸的变化而不同，因此受到限制。受此影响，每种不同靶序列的检测都有特定的反应动力学且其扩增产物的数量也随之不同。靶序列的不同及其导致信号的不一致使这一方法不适合用于在单一样本中精确定量多种核酸序列。

另外，PCR扩增的方法也不太适用于芯片的微矩阵形式。核酸微矩阵的优势在于可同时分析成千上万种核酸序列。所测试的序列以微米尺度印制在固体表面的特定区域内。核酸不被物理空间分隔。但在PCR扩增的方法中，PCR反应扩增的产物游离于溶液中。因此，在放置待测核酸的同一区域中不能定位发现任何PCR扩增法扩增的产物。所以，每一PCR扩增反应必须有分隔的物理空间，以使每一个PCR扩增产生的阳性信号能与要求的阳性核酸相关联。因为，微矩阵形式在核酸序列之间不存在物理的分隔而PCR反应必须有物理分隔，所以，PCR扩增的方法在单一的样本中就不能有效的检测识别成千上万的核酸序列。

鉴于现有分析核酸技术的明显缺陷，需要建立一种快速单一的分析形式以从含有多种非靶序列的核酸样本中，甚至在低丰度的样本中同时检测出多种特定的核酸序列的存在与否，并可以进行精确定量。

                        发明简述

本发明满足了在单一样本中以单一反应灵敏地检测和定量成千上万种不同的核酸序列的需要。通过结合探针连接技术和滚动循环扩增技术，本发明比杂交方法灵敏，能够在单一样本中检测出少至10个拷贝的靶物质。

本发明还满足了用单一反应精确检测和定量成千上万种不同核酸序列的需要。用此滚动循环技术，单个阳性连接反应的结果被扩增一万倍，该扩增过程严格依赖于靶核酸的拷贝数并与靶核酸的拷贝数呈严格成比例。并且，通过使用通用模板和引物，排除了样本与样本之间的变异性。因此，该方法能精密准确地定量样本中的靶物质，甚至低拷贝数量的靶物质。

另外，本发明可望对样本中的点突变进行检测。检测点突变可识别遗传变异，用于人类疾病诊断或研究领域。这种方法既灵敏又精确，能够检测出靶物和非靶物之间一个碱基对的不同，精确度达到99.99％以上。

归结起来，本发明的一方面提供核酸分析的方法，这种方法通过将捕获探针与靶核酸的杂交，将计数探针与靶核酸的杂交，连接捕获探针和计数探针，并将单链环状DNA杂交到计数探针上，然后扩增环状DNA，其中扩增条件足以能够检测靶核酸的存在。

在本发明另一实施方案中，所述的靶核酸是DNA、RNA或cDNA。

本发明的另一个实施方案中，所述靶核酸来自于细菌、病毒、寄生虫或真菌。

依照本发明的另一个方面，靶核酸的样本取自身体的体液、组织或排泄物。

依照本发明的另一个方面，靶核酸的样本取自血液、唾液、尿液或痰液。

在本发明另一个方面中，捕获探针互补于来自于细菌、病毒、寄生虫或真菌的核酸序列。

在本发明另一个方面中，能够通过将扩增产物的数量与至少一个已知量的核酸标准品相比较而确定靶核酸存在的数量。

在本发明的一个优选实施方案中提供了分析靶核酸的方法，这个方法是将靶核酸杂交到捕获探针上，并将靶核酸又与计数探针杂交，由此形成一个包含由捕获探针、计数探针和靶核酸构成的杂交复合体；并将杂交复合体暴露于连接酶并将未共价连接捕获探针的计数探针和核酸洗去；然后将单链环状DNA加到捕获探针中，并加入能扩增单链环状DNA的核酸聚合酶，以此确定扩增的环状DNA的存在与否。

本发明的另一个优选实施方案包括捕获探针、计数探针和单链环状DNA片段的分子装配体(assemblage)，其中环状DNA片段与计数探针相邻接。

本发明的另一个实施方案中所述分子装配体中的靶核酸是DNA、RNA或cDNA。

依照本发明的另一实施方案，所述分子装配体中的靶核酸来自于细菌、病毒、寄生虫或真菌。

本发明的另一实施方案中分子装配体的捕获探针与来自于细菌、病毒、寄生虫或真菌的特定核酸序列互补。

另外一个实施方案中，分子装配体的靶核酸来自体液、组织或排泄物。

                       附图描述

图1是在DNA芯片或96孔板上固定捕获探针的示意图。

图2是在混合靶物质中用核酸杂交方法捕获特定靶物质的示意图。靶物质B和D特定地分别与捕获探针B和D杂交。计数探针B和D分别与靶物质B和D退火。结果，形成一个由捕获探针、计数探针和靶分子三种核酸分子组成的分子复合物。计数探针的5’端有一个连接反应需要的磷酸基团。非特异性的靶物质和指示探针仍然是游离的。

图3显示了计数探针B和D在连接反应后共价地连接到捕获探针上，连接反应是在ATP存在下由DNA连接酶催化的。多余的计数探针和非特异性靶物质仍然保持游离状态。

图4描述了非相关靶物质分子和游离的计数探针被清洗掉。清洗前与靶物质退火的计数探针因与捕获探针共价相连，仍然保留在固体的表面。

图5表现了单链环状DNA分子，例如M13单链DNA，与计数探针3’端退火。计数探针的3’端包含了与单链环状DNA分子互补的核酸序列。

图6是一个示意图，描述了一个线性滚动循环扩增反应和在滚动循环扩增反应结束时产生大量标记的DNA产物。

图7描述了依照本发明，在扩增反应结束时产生的DNA产物的定量。

                        发明详述

发明人发明能够灵敏和准确地在单一反应中检测和定量成千上万种不同核酸序列的方法。本发明比杂交方法更灵敏，结合各种探针连接和滚动循环扩增的方法，能够在单一的样本中检测少至10个拷贝的靶序列。

本发明提供的方法比现有方法具有更高的准确性，因为该方法的定量严格依赖于靶核酸的拷贝数并与靶核酸的拷贝数呈严格比例，并且，通过使用通用模板和引物，排除了样本与样本之间的变异性。加之，采用核酸微矩阵，如DNA芯片，不仅具有能高通量并行分析大量核酸的优势，并且还可高精确度的定量检测核酸。

简言之，本发明的探针-连接涉及使用两种探针以通过杂交反应捕获靶核酸。这两种探针在相应的互补的靶核酸上相互邻接时可连接。在此称作“捕获探针”和“计数探针”的这两种探针在存在互补的靶核酸时连接成单一的探针，这代表存在一个靶核酸序列。

根据本发明，计数探针的3’端是独特的，因为它包括一个与单链环状DNA(如M13)的一段序列互补的序列，由此计数探针能够与单链环状DNA杂交，从而充当滚动循环扩增反应中单链环状DNA的引物。本发明应用了线性的滚动循环扩增，因而与常用的连接技术不同，如：常用的探针和靶物质的扩增反应，对每一种靶DNA而言各不相同，有的更需进行多重探针-靶物质的杂交和连接。

在环状DNA、核酸聚合酶和核苷酸存在时，扩增过程将产生一个包含有千千万万个环状DNA序列拷贝的长链核酸分子，其中依据本发明，这个长链核酸分子仍然连在被固定的DNA探针上。依靠一个单一的引物，滚动循环扩增几分钟内产生数百个衔接相连的环状模板的拷贝。本扩增反应在单个连接事件的位点，即检测到单个靶分子的这个点上能产生单链环状DNA的多至104个拷贝，这些拷贝共价地连接在被固定的探针DNA上。参见：Zhong等人，Proc，Nat’l Acad.Sci.USA 98：3940-945(2001)。

更具体的是：计数探针有一个5’端和3’端，5’端包含了与靶DNA的3’端互补的区域；3’端包含与单链环状DNA序列互补的区域。环状DNA可以是任何不同源于捕获探针序列的核酸序列，例如M13，并且可由任何已知几种方法来产生环状DNA。计数探针的3’端一旦与单链环状DNA杂交就可充当扩增反应的引物。在这种情况下，加入聚合酶和核苷酸就能生成一个延长的核酸分子，该分子起始于计数探针3’端，并因此共价连接在计数探针3’端上。合成的扩增产物通过共价连接到探针而共价地连接到固体载体上。

滚动循环扩增的产物可以通过多种途径来检测和定量，例如：放射性核苷酸、荧光标记核苷酸或其它标记方法。无论如何，本发明开拓了以“信号-检测”策略的滚动-循环扩增技术，在恒温下，以线性级数或指数级数复制了环状核酸。参见Lizardi等人，Nature Genet。

与基于PCR的技术和运用多重杂交及连接的方法不同，本发明的优势在于：在此滚动循环反应中，信号的扩增不因各种样本的不同而改变。在一个反应中，对各种靶物而言，引物是同样的，被扩增的单链环状DNA也是同样的。因此，每一个探针复性到单链环状DNA上并启动滚动循环检测反应的机会和反应动力学相同。结果，在检测的步骤中的变异性非常小；每一个探针被同等地扩增，确保了准确的定量和一致的结果，而与靶序列的不同无关。

此外，依照本发明，成千上万个反应能够在同一多孔板或一个DNA芯片或其它微矩阵中进行，这是因为扩增的产物通过探针共价地连接在固体载体上。这也能够将信号扩增产物定位于载体上最初含有捕获探针的同一区域。(与此不同的是，在PCR技术中，扩增的产物游离于液相中。)由于能精确定位来自一个连接反应的单一信号，本发明的方法很适于微矩阵的形式。另外，DNA快速和稳定的产生能简单、准确地检测信号扩增，能够从每个样本中识别出少至10个拷贝的核酸。

这一检测方法与已被广为应用为改良版本的探针连接方法以检测靶核酸的存在的技术方法。参见：美国专利6,312,892和4,883,750；Wu等人，Genomics 4：560(1989)；Landegren等人，Science 241：1077(1988)；和Winn-Deen等人，Clin.Chem.37：1522(1991)。通常，利用样本中精确配对核酸的存在，探针连接方法产生了一个可检测的固定探针。本发明的方法相对于其它探针连接检测方法的改进在于：计数探针的3’端包含了与单链环状DNA分子中的序列互补的序列。只有当样本中存在靶DNA时，同时含有固定的5’端和3’单链环状DNA互补端的共价连接的探针才产生。另外，当探针与样本中其它非靶核酸(包括只有一个碱基对不同的核酸)杂交时，由于连接酶的特异性，在交叉点上出现的错配将阻止连接发生。

具体来说，在这种方法中，第一个核酸探针——捕获探针固定于固体载体上。捕获探针的序列被设计成互补于靶序列的一个保守区。捕获探针的5’端构建有一个活性化学基团，如：生物素或带连接臂的氨基基团，便于捕获探针能固定在载体的表面。从而通过捕获探针的5’端，将捕获探针固定在玻璃、塑料载体上或任何其它固体的表面。

第二个核酸探针——计数探针设计成：探针的5’端互补于靶序列紧位于与捕获探针退火的上游的一个区域。计数探针的3’端是独特的，被设计成包含与单链环状DNA序列(如：M13)互补的序列，以至计数探针能够充当杂交到计数探针上的单链DNA滚动循环扩增反应的引物。计数探针还含有一个5’端的磷酸基团。

靶核酸是指来自于生物样本中的任何脱氧核糖核酸或核糖核酸。靶核酸可以由熟悉该专业的人员按照许多已知方法从样本中分离出来。核酸的范围包括但不局限于DNA，mRNA，cDNA和cRNA。一个靶核酸可以是自然的染色体物质或RNA反转录产物，或是第二链的cDNA，或是由双链中间体转录的RNA，或是由专业的人员所熟知的方法产生的核酸。

当含有精确靶序列的核酸序列存在时，即：当该核酸与捕获探针和计数探针都互补时，固定的捕获探针将与靶核酸杂交，而计数探针也紧邻捕获探针与上游靶核酸杂交。只有当精确的核酸配对时，捕获探针和计数探针之间才发生连接。再依照本发明，单链环状DNA杂交到计数探针3’端的序列上，然后在滚动循环扩增中产生很多的DNA拷贝。通过与一套参考靶物质及其产生的参照数学公式和曲线相比较，就能够检测和定量最终的扩增产物了。

对于非特异性的核酸，固定的捕获探针和计数探针是不与非特异性的核酸杂交的。因此，捕获探针的3’端与计数探针磷酸化的5’端不相邻，然而连接反应发生必需捕获探针和计数探针之间相邻定位。对非特异性的核酸，由于捕获探针和计数探针之间的不适当排列，计数探针未被连接到捕获探针上。没有发生连接，计数探针将在后续的清洗步骤中被清除，这样既不会发生单链环状DNA的杂交，也不会发生单链环状DNA的扩增。

当核酸中含有靶核酸序列，但靶序列中的一个或几个核苷酸存在改变时，虽然固定的捕获探针与靶核酸杂交，计数探针也紧邻捕获探针与上游靶核酸杂交。然而，在这种情况下，在核苷酸酸发生变异的点位上出现错配。(“错配”当靶核酸的核苷酸不能与一个或多个捕获探针或计数探针中的核苷酸形成非共价相互作用时发生。)如上所述，只有当在捕获探针和计数探针的邻接部位有精确的核酸配对时，捕获探针和计数探针的连接才能发生。因此，在捕获探针5’端或捕获探针3’端的错配将干扰连接反应。没有连接反应，计数探针就将在后续的清洗步骤中被清洗掉，从而既不会发生单链环状DNA的杂交，也不会发生单链环状DNA的扩增。所以，通过设计捕获探针和计数探针使感兴趣的单个核苷酸或多个核苷酸定位在计数探针与捕获探针的邻接部位，人们就可以运用本发明检测出小到一个单核苷酸酸的改变。

用本发明对不同来源的样本中目的核酸进行检测、分析和/或定量。靶核酸可来源于任何的生物资源，包括：产前的和死后的样本。生物资源包括但不局限于病毒、细菌、寄生虫、真菌、单个细胞、体液、排泄物、组织。靶核酸可以按照现有的方法从生物资源中提取。由于本发明适用于各种样本来源，因此，对于医学诊断、遗传背景确定、耐药菌株识别、环境检测、司法鉴定、以及基础和工业研究等都具有广泛的应用前景。

因此，本发明能够通过识别相关的病原体而用于检测感染性疾病。所鉴别的病原体包括：细菌、病毒、寄生虫和真菌及其它各种各样的病原体，通过提取样本中的核酸和鉴别样本中的特定病原体核酸的存在与否，诊断与其相关的感染性疾病。用该方法能够检测到的病原体例证是：大肠埃希菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、细胞内鸟分枝杆菌、耶尔森氏菌属、弗朗西丝氏菌属、巴斯德氏菌属、布鲁氏菌属、梭菌属、百日咳鲍特氏菌、拟杆菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、B-溶血链球菌、棒状杆菌属、军团菌属、枝原体、脲枝原体、衣原体、淋病奈瑟氏菌属、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌、粪肠球菌、普通变形菌、奇异变形菌、幽门螺旋杆菌、梅毒密螺旋体、布氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体、立克次氏病原体、诺卡氏菌属、放线菌、新隐球酵母菌(Cryptococcus neoformans)、皮炎芽生菌、荚膜组织浆菌属、粗球孢子菌属、巴西类球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、白色念珠菌属、烟曲霉、藻菌(酒曲菌属)、Sporothrix schenckii、着色真菌、足分枝菌、人类免疫缺陷病毒、人类T细胞亲淋巴细胞性病毒、肝炎病毒(如：乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒、人类乳头状瘤病毒、正粘病毒、副粘病毒、腺病毒、冠状病毒、rhabdo病毒、脊髓灰质炎病毒、披膜病毒、布尼病毒、沙粒病毒、风疹病毒、呼肠孤病毒、Plasmodium falciparum、Plasmodiummalaria、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Onchovervavolvulus、利什曼原虫、锥虫属、裂体吸虫属、溶组织性肠阿米巴、隐孢菌、梨形鞭毛虫属、毛滴虫属、Balatidium coll、班氏吴策线虫、弓浆虫属、蠕形住肠线虫、似引蛔虫、人鞭虫、麦地那龙线属、吸虫、latum裂头绦虫、绦虫属、Pneumocystis carinii、和美洲板口线虫。.

另外，本发明还能用于鉴别特定病原体的特殊菌株。对特殊菌株或某一菌株的变种的鉴别广泛应用于包括耐药菌株的确定，以便合理有效的制定抗菌素疗程。例如：可用以确定万古霉素抗性的结核杆菌、新青霉素抗性的金葡菌、青霉素抗性的肺炎链球菌、和AZT抗性的人类免疫缺陷病毒。

本发明也可满足确定遗传性易患病体质和/或确认临床诊断遗传疾病的需要。通过设计与相关靶核酸杂交的捕获探针和计数探针，在一个含有病人的整个基因组的核酸池中，可以检测到小至一个单核苷酸突变的存在与否。突变包括：插入、删除、单碱基对的改变、和异位。这样的遗传性疾病实例是：21羟化酶缺失、囊性纤维化症、易脆性X染色体综合症、Turner综合症、杜兴肌肉萎缩营养不良症、Down综合症或其它的三性体、心脏的疾病、单基因疾病、人体白细胞抗原分型、苯丙酮尿酸症、镰状细胞贫血症、Tay-Sachs疾病、地中海贫血、克兰费尔德(Klinefelter)综合症、Huntington疾病、自体免疫性疾病、脂沉积症、肥胖缺陷、血友病、先天性代谢紊乱和糖尿病。

本发明的另一个应用领域涉及检测疾病相关的靶核酸中是否存在增长量的序列，例如：与囊肿性纤维化症相关的突变序列。在检测遗传性易患病体质和/或确认这种疾病的诊断中，最理想检测是通过单个测定对个体基因组中所有可能的突变进行分析。本发明具备这样的能力，例如：在单一的样本中，通过单个反应对每种已知的囊状纤维症的基因突变进行分析。

另外，本发明提供了在单一反应中同步监测众多基因的多样性表达水平的方法。同步监测可准确比较基因表达水平和识别改变基因表达的生物条件。在表达监测中特别重要的基因包括：在乳腺癌病例中的HER2(c-erbB-2/neu)原癌基因；关系大量肿瘤(包括乳腺、肝脏、膀胱和胰腺的恶瘤及神经胶质瘤、肉瘤和鳞装恶瘤)发病的受体酪氨酸激酶(RTK)；肿瘤抑制基因如：P53基因和其它的“标志”基因如：RAS，MSH2，MLH1，和BRCA1。另外在表达监测中特别重要的基因涉及免疫反应如：白介素基因和涉及到细胞粘附的基因(包括：整合素和选择素)，凋亡和信号传递基因(包括：酪氨酸激酶)。

而且，本发明适用于检测引起肿瘤形成的突变基因。特定将捕获探针和计数探针设计成能与已知的引起异常细胞增长的核酸序列杂交。典型涉及肿瘤形成的可检测基因如：BRCA1基因、p53基因、APC基因、Her2/Neu扩增，Bcr/Ab1，K-ras基因，和16和18型人类乳头状瘤病毒。

本发明也可以用于个体遗传鉴定。用单一的样本，在单一的反应中检测不同个体所特有的核酸序列多样性的存在与否。结果可应用于司法鉴定、亲子鉴定和其它与个体鉴定有关的应用。

另外，本发明也可用于确定特定基因的变异以在器官移植前确定免疫相容的供体器官、组织和体液。

本发明在食品、饲料和农业方面有广泛地应用前景，包括：检测和识别植物特有的病原体和牲畜的传染病，识别植物或动物繁殖的遗传背景，识别影响植物或动物生长、健康和/或品质的生物体或基因。因此，一般而言，本发明可用于临床、工业和研究领域。

下面用举例的形式对于本发明的进一步描述：

                       实施例1

A.材料

1.用于本发明方法中的固体表面可以是玻璃、塑料或其它任何能将捕获探针固定于上面的材料。

2.捕获探针是人工合成的DNA寡核苷酸，它被设计成能捕获特定的靶物质。捕获探针的5’端修饰有活性化学基团，如生物素或带连接臂的伯氨基基团。捕获寡核苷酸的大小范围约20至100个核苷酸。捕获探针优选大小约60至75个核苷酸。选择捕获探针的序列使其能与靶序列的一个保守区互补。探针的熔点温度(Tm)在50至80摄氏度左右。

3.计数探针也是合成的DNA寡核苷酸，它被设计成能计数靶分子。该寡核苷酸5’端被磷酸化，以至捕获探针和计数探针之间能够发生连接。计数探针包含了两个主要的部分：5’端和3’端，其5’端与靶序列上的一个区域互补，该区域在上游紧邻靶序列与捕获探针退火区域。5’端的大小范围在50至70个核苷酸之间。退火的Tm值在50℃至80℃之间。探针的3’端互补于单链环状DNA的一段序列，该序列的大小范围在18至30个核苷酸之间，熔点温度在50℃至70℃之间。该序列在单链环状DNA的序列中是唯一的。

4.扩增子为单链环状DNA分子，该分子是信号扩增反应中的关键成分。环状DNA可以是合成的或从自然中提取的DNA，如M13单链DNA或其衍生物。扩增子不应该有很强的二级结构，很强的二级机构可能干扰DNA扩增反应时的效率和精确性；且不应该有重复的序列，重复的序列能引起模板的折叠而使扩增反应降低。扩增反应需要环状DNA含有与计数探针3’端互补的序列。

5.聚合酶是扩增反应体系作用中的另一个关键成分。酶的高进行性和链置换活性对于扩增反应是很重要的。大肠杆菌DNA聚合酶I，phi29 DNA聚合酶，和其它具有上述的特性的DNA聚合酶，在扩增反应中都优选使用。

6.DNA连接酶靶物质准确计数的一个关键因素。连接酶催化的反应使计数探针共价连接于捕获探针。与捕获探针退火的计数探针的数量与样本中靶物质的数量相等。因此，连接效率直接影响到本方法的灵敏度和定量的精确性。DNA连接酶对缺口位点或临近缺口位点的错配应该是敏感的。此特点提高本方法的特异性。T4 DNA连接酶和其它具备了上述特性的DNA连接酶，在该方法中优选使用。

7.单链核酸结合蛋白和其它核酸伴侣蛋白(nucleicacid-chaperone proteins)促进了扩增反应，因而提高了本方法的灵敏度。这些蛋白还增加了退火反应的速度和帮助形成最稳定的核酸杂交体，进一步提高了特异性。

8.任何常规的核苷酸标记物、核苷酸类似物及其配体或检测试剂。这些试剂用作检测和定量扩增反应结束时合成的DNA量。标记的数量与连接后的捕获探针和计数探针的数量成比例，它们共同反映了样本中靶物质的数量。检测系统的灵敏度是关键因素。但是任何检测系统都可用于检测和定量标记物。

9.四种脱氧核糖核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP以及DTT、盐和反应缓冲液。

10.定量参照品。定量参照品包括捕获探针、计数探针、参考靶物和上述的其它材料。捕获探针和计数探针的特性与上面描述的相同。参考靶物是一组化学和/或酶合成DNA和/或RNA寡核苷酸酸。寡核苷酸的长度范围在40至100个核苷酸之间或更长。典型的寡核苷酸的长度是在60至80个核苷酸。寡核苷酸的Tm值应该在上述样本测试探针的同一范围内。

B.程序

1.在固体表面固定捕获探针

a.将捕获探针印制在玻片或其它固体表面。用带有7碳连接臂的伯氨基基团修饰捕获探针的5’端。用DNA芯片制作仪将修饰后的捕获探针印制到玻片上。印制误差应小于5％。

b.捕获探针固定在96或384孔板的孔中。在板孔中覆盖有抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白，或其它的配体。用生物素或其它的配体修饰捕获探针的5’端。点样误差最好小于2-5％。每一样本孔中点有一种捕获探针或多种捕获探针。

2.从样本中分离靶物质

从血液、组织液、培养上清液、组织、细胞群和任何其它样本中分离靶DNA或RNA。

3.捕获探针和计数探针与分离的靶物质杂交

将分离出的靶物质在混合液中与捕获探针和计数探针孵育，温度约37℃至80℃，混合液的组成是：盐、酸碱缓冲液和可选的退火促进剂如精胺、核酸伴侣蛋白。下例是一个典型的退火过程：混合液在65至70℃孵育5至10分钟，然后，在15到30分钟内梯度冷却混合液至25℃。此过程中捕获探针捕捉到特异的靶物质，并且使计数探针发现和杂交到靶物质上。计数探针与靶物质的退火比例为一比一。一个靶物质只能与一个计数探针退火。从而保证了定量测定的精确性。

4.连接

在反应中加入一个连接酶和ATP。然后在约25至37℃之间孵育5至30分钟。

5.漂洗

连接反应之后，进行漂洗。充分漂洗以确保多余的计数探针、非特异的靶物质以及靶物质本身被漂洗掉。漂洗末，只有与捕获探针共价结合的计数探针被保存下来。

6.DNA聚合反应的组装

漂洗后，在反应混合物中加入单链环状DNA，在约65至70℃孵育5至10分钟，然后，在15至30分钟内梯度冷却至25℃。此过程使在计数探针3’端的引物与单链环状DNA退火。此退火反应组装了DNA扩增机器。

7.DNA扩增

在反应中加入DNA聚合酶和含dNTPs的反应缓冲液，组成DNA扩增反应混合液。在混合液中包括可检测的dNTP或连接可检测分子的dNTP，这样在扩增反应结束时生成的DNA产物能够被检测和定量。反应混合物在37℃孵育约2至6小时。

8.检测

基于扩增反应中使用的标记类型，进行DNA产物检测和定量步骤。

C.结果的定量和解释

1.建立参照性数学公式和曲线。十种不同的靶物质，如“材料”部分中描述的，也是合成的DNA或RNA探针，被加入到在程序A3的退火混合液中。由于十种探针的每一种都已预定量，因此，每种靶物质的拷贝数量已知。所以，可以产生检测读数与拷贝数量的参考曲线和数学公式。由此可以从每一个样本的读数得出靶物质的拷贝数。

2.由于在DNA模板和RNA模板上连接的效率是不同的，如果靶物质对应的参考曲线是DNA，而样本中靶物质是RNA或靶物质是RNA和DNA的混合物，这里就会产生测量上的误差。然而，因为可以通过用已知拷贝数量的RNA或DNA模板预先测量连接效率，所以可以校准这种误差。

                          实施例2

微矩阵制备

1.寡核苷酸探针的合成

寡核苷酸探针由MWG Biotechnologies Inc.合成，将氨基连接基团共价连接到捕获寡核苷酸5’端，将计数寡核苷酸5’端磷酸化[insert*：What is“MWG”]。

2.微矩阵制作

a)将氨基修饰的寡核苷酸以200pmol/μl重悬于蒸馏水中。

b)(可选择的)用6×SSC或DMSO点样液1∶1稀释各探针。

c)取稀释液每份10μl加入384孔板中；

d)在25℃室温，70％相对湿度下，以微矩阵点样针，用Cartesian PS5500点样仪将样本印制到玻片上(CSS-100硅化玻片，来自于TeleChemInternational Inc.公司，通过席夫碱醛基-氨基化学，硅化玻片共价结合单链DNA或双链DNA在高质量的显微镜载玻片的表面)，然后在上述相同条件下孵育1小时。点的直径为200μm，点中心到点中心的距离为500μm。

e)将玻片放在室温(25℃)，相对湿度＜30％，约12小时晾干。

3.将氨基修饰的寡核苷酸固定到载体上的后处理过程

a)用0.1％SDS溶液在室温下振摇清洗载玻片一次，2分钟，以除去未结合的DNA。

b)在室温下用蒸馏水振摇清洗载玻片2次，每次2分钟。

c)在室温下用硼氢化钠溶液处理载玻片5分钟，以减少游离的醛基。(硼氢化钠液：溶解0.5g NaBH₄于150ml PBS中，然后，加50ml100％乙醇以减少泡沫。使用前配置。)

d)用蒸馏水清洗载玻片2次，每次1分钟，温度37℃；

e)在空气中凉干载玻片。

4.质量控制

用荧光核酸染料(二聚氰染料TOTO-3购自分子探针公司)，按说明书染色，检测点样斑的一致性：

a)用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)10,000倍稀释染料原液；

b)用稀释后的染料液覆盖微矩阵并在室温中孵育3分钟。

c)用TE缓冲液清洗微矩阵3次。

d)甩干微矩阵。

e)用ScanArray 4000B型扫描仪扫描微矩阵(Axon Inc.)。

杂交和信号扩增

1.将靶DNA(片段)与计数探针和捕获探针退火

a)将计数探针(以终浓度约1pm/μl)和靶DNA加入退火缓冲液中(50mM Tris.HCl pH7.5，75mM KCl)配制成杂交混合液；

b)用10μl杂交混合液覆盖微矩阵；

c)将载玻片放入杂交仓内(CMT杂交仓来自于Corning Inc.)。在杂交仓内孔中加入50μl退火液以保持仓内湿度。然后关闭杂交仓；

d)在82℃水浴中孵化杂交仓2分钟，然后将杂交仓转移到53℃水浴中孵育30分钟；

e)在30分钟内水浴梯度冷却杂交仓至25℃。

2.连接

a)打开杂交仓盖，吸去退火混合液；

b)加入10μl的连接混合液(2单位/微升Promega T4 DNA连接酶，1×酶缓冲液)到微矩阵中；在25℃室温下孵育15分钟至2小时(按不批次酶的用法而定)以连接捕获探针和计数探针；

c)在室温下用1×退火缓冲液清洗载玻片5次，每次1分钟；

3.将单链环状DNA与计数探针退火

a)用退火缓冲液稀释单链环状DNA(M13mp 19单链DNA来自于Invitrogen)，终浓度为0.025μg/μl；

b)用10μl稀释液覆盖微矩阵，然后将载玻片放入杂交仓；

c)在53℃水浴中孵育杂交30分钟，然后在30分钟内梯度冷却至25℃；

d)用清洗液(50mM Tris.HCl pH7.5，10mM MgCl₂，2mM DTT)清洗载玻片5次，每次1分钟；

4.扩增反应

a)用10μl扩增反应混合液覆盖微矩阵；

b)将载玻片放入杂交仓内，在37℃下孵育～4小时；

c)在25℃室温下，用30mlTE缓冲液清洗载玻片3次，每次5分钟，凉干后扫描。

扩增反应混合液

10x缓冲液(随酶提供)                     1.0μl

DNA聚合酶I(9.2μg/μl，Promega M2051)   1.0μl

100mM dATP                              0.2μl

100mM dGTP                              0.2μl

100mM dTTP                              0.2μl

10mM dCTP                      0.2μl

花菁3-dCTP(25nM/25μl，NEN)    2.0μl

蒸馏水                         5.2μl

图象检测和数据分析

用Axon Inc公司的ScanArray 4000B激光扫描仪以5μm解析度，300v PMT，检测整合的Cy3-dCTP信号密度。用GenePix Pro 3.0Microarray Acquisition & Analysis软件进行数据分析。

Claims (13)

1.核酸分析的方法，包括(a)将靶核酸杂交到捕获探针上，(b)将计数探针杂交到靶核酸上，(c)将捕获探针与计数探针连接，及(d)将单链环状DNA杂交到计数探针上，及然后(e)扩增所述环状DNA，其中该扩增足以检测靶核酸的存在。

2.依照权利要求1的方法，其中该靶核酸是DNA，RNA，或cDNA。

3.依照权利要求1的方法，其中该靶核酸来自细菌、病毒、寄生虫或真菌。

4.依照权利要求1的方法，其中该靶核酸取自体液、组织或粪便。

5.依照权利要求4的方法，其中该靶核酸取自血液、唾液、尿液或痰液。

6.依照权利要求1的方法，其中该捕获探针与来自细菌、病毒、寄生虫或真菌的核酸序列互补。

7.依照权利要求1的方法，还包括将来自于(e)步骤中的扩增产物的量与至少一个已知量的核酸标准品比较而确定靶核酸存在的量。

8.分析靶核酸的方法，该方法包括：(a)将靶核酸杂交到捕获探针上和(b)将计数探针杂交到靶核酸上，形成由捕获探针、计数探针和目标探针组成的杂交体；(c)将所述的杂交体与连接酶作用，且然后(d)清洗掉未共价连接所述捕获探针的计数探针和核酸；然后(e)加入单链环状DNA到所述捕获探针中；(f)向所述捕获探针中加入能够扩增单链环状DNA的核酸聚合酶；及然后(g)确认扩增的环状DNA存在与否。

9.分子装配体，由(i)捕获探针，(ii)计数探针，和(iii)单链环状DNA片段组成，其中所述环状DNA片段邻接所述计数探针。

10.依照权利要求9的分子装配体，其中所述靶核酸是DNA、RNA或cDNA。

11.依照权利要求9的分子装配体，其中所述靶核酸来自细菌、病毒、寄生虫或真菌。

12.依照权利要求9的分子装配体，其中所述捕获探针与来自细菌、病毒、寄生虫或真菌的核酸序列互补。

13.依照权利要求9的分子装配体，其中所述靶核酸取自体液、组织或粪便。

Images