CN1908191A - 应用于猪链球菌2型致病性检测的多重荧光pcr检测试剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多重荧光PCR检测猪链球菌2型致病性的试剂及方法。更具体地说，本发明提供了同时应用针对猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)两种毒力因子编码基因设计的荧光PCR引物和探针序列进行猪链球菌2型致病性检测的试剂和方法。本发明采用针对MRP和EF两个基因设计的引物和探针，通过对目的基因序列和标记荧光基团的选择和反应体系、反应条件的优化，组装了检测猪链球菌2型致病性的试剂，建立了对猪链球菌2型菌株致病性进行检测的多重荧光PCR方法，根据扩增曲线即可判定待检菌的致病性。

Description

应用于猪链球菌2型致病性检测的多重荧光PCR检测试剂及方法

技术领域：

本发明涉及采用多重荧光PCR检测猪链球菌2型致病性的试剂及检测方法。更具体地说，本发明涉及同时应用针对猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(Muramidase-Released Protein，MRP)和胞外因子(extracellular factor，EF)两种毒力因子编码基因设计的荧光PCR引物对和探针进行猪链球菌2型致病性检测的试剂及检测方法。

背景技术

猪链球菌病(Swine Streptococcosis)是由猪链球菌(Streptococcus suis)侵害猪的上呼吸道、生殖道、消化道等组织而引起的一种疾病。病原包括猪链球菌(Streptococcus suis)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus suis equi subsp.zooepidemicus)、马链球菌马亚种(Streptococcussuis equi subsp equi)等。

猪链球菌2型感染广泛发生于各养猪发达国家。英国的Field(1954)从暴发败血症、脑膜炎和多发性关节炎的乳猪中分离出一株α溶血猪链球菌，可是却不能归属于当时所认识的19个兰氏(Lance field)血清群。1956-1963年间，de Moor首次通过生化和血清学方法，对引起猪败血性感染的新的a溶血性链球菌进行了鉴定，认为属于革兰氏R、S和T群。Elliot(1968年)按荚膜分类法把此菌命名为荚膜2型猪链球菌。之后，英国(Lamont，1980)、澳大利亚(Buddle，1981)、美国(Kochae，1982)、丹麦(Beate-Perch，1983)、日本(Azuma，1983)、加拿大(Toutt，1988)和欧洲和北美(Clifton-Hadley，1988)的许多国家均有猪链球菌2型感染猪只发病的报道。1968年丹麦首次报道了人体感染猪链球菌导致脑膜炎的病例。目前全球已有200余例猪链球菌感染病例报告。

引起猪链球菌病的病原一般为猪链球菌2型。猪链球菌2型可以引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突发性死亡，也可引起相关从业人员脑膜炎并致死，是重要的人兽共患病病原，对养猪业造成巨大的经济损失，对公共卫生尤其是相关从业人员的生命构成威胁，所以引起世界范围内的高度重视。1990年我国广东省首次分离到猪链球菌2型(黄毓茂等，1991)。据报道，猪链球菌2型在健康猪扁桃体中的带菌率高达76％(143/188)(Davies，1991)。因此，该病给养猪业所带来的危害越来越严重。

根据荚膜多糖的不同，可将猪链球菌分为35个血清型，其中以2型流行最广、致病性最强，可引起严重的人—猪链球菌感染。但猪链球菌2型不一定都具有致病性，据我国江苏兽医研究所调查表明，正常猪群中猪链球菌2型的带菌率很高，平均为42.6％^[4]。而澳大利亚和新西兰的研究表明75％的健康猪携带有猪链球菌2型菌，3％的健康猪血液培养阳性，但不发病。Davies(1991)报道健康猪的扁桃体带菌率可高达76％(143/188))。故在疫情发生时，只确定病原是猪链球菌2型还远不够，还必须弄清其致病力，以利于有针对性地采取应对措施，防止疫情的蔓延。

鉴定猪链球菌2型毒力因子的经典方法需通过蛋白电泳及免疫转印等手段，方法较为繁琐，而且要求提供的参考血清难以获得。因此建立敏感度高、特异性强、重复性好、简易、经济的检测方法是发展的方向。分析蛋白图谱时发现，从病猪体内分离的菌株有MRP(溶菌酶释放蛋白)、EF(细胞外因子)等毒力因子，可以作为致病力的重要检测指标。

在分子生物学研究方面，Vecht(1991)研究认为，根据菌株MRP和EF基因的有无，可将猪链球菌2型分为高毒力株(MRP⁺EF⁺)、低毒力株(MRP⁺EF^-)和无毒株(MRP^-EF^-)，引起严重人-猪感染的链球菌2型均为高致病性的MRP⁺EF⁺基因型。Vecht(1992)又用试验探讨了猪链球菌2型与表型间的关系。MRP⁺EF⁺菌株引起无菌猪发热，血液中多形核白细胞增高，特异临床症状为神经紊乱和跛行，组织学病变表现为脑膜炎、多发性浆膜炎及关节炎，MRP+EF-表型只引起非典型临床症状，食欲缺乏和发热。MRP^-EF^-则无症状出现。

在国内，欧瑜、陆承平通过免疫印迹试验证实猪链球菌2型江苏分离株HA9801存在MRP和EF因子，并检测出猪链球菌2型有4种表型，其中表型MRP⁺EF⁺为强致病株，MRP⁺EF^-为弱致病株，MRP^-EF^-为非致病株，未发现MRP^-EF⁺表型。

在猪链球菌2型毒力因子的PCR检测方面，国内外组装了多套PCR体系。何孔旺等(2002)根据猪链球菌2型毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)与细胞外蛋白因子(EF)基因(mrp与epf)序列，分别设计、合成一对引物，建立聚合酶链反应(PCR)方法。该方法扩增出2型菌株的mrp大小为885bp，epf为626bp，PCR检测的敏感度可达100个细菌。用建立的PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测，检测的15株2型分离株中有13株mrp与epf均为阳性，为典型的高毒力表现型菌株(mrp+epf+)，1株为mrp+epf-，1株为mrp-epf-。刘军等(2005)以猪链球菌2型和9型的荚膜多糖抗原编码基因簇中的cps 2J和cps 9H基因、猪链球菌2型的主要毒力因子编码基因epf和mrp为靶基因设计了四对引物，建立了检测猪链球菌的多重PCR反应体系。用该多重PCR反应体系对10株猪链球菌分离株进行了鉴定。结果发现10株猪链球菌分离株中有5株是9型菌株，另有5株是2型菌株，2型菌株有2种基因型：3株cps2+mrp+epf+型，2株cps2+mrp-epf-型。

荧光PCR(FQ-PCR)技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，只需加样时打开一次PCR反应管，具有特异性好、假阳性低、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、操作简单、交叉污染和污染环境的机会少(不需要EB染色)等优点，而且整个反应可在0.5-1小时内完成。多重荧光PCR是在同一个反应体系中加入多个引物对和探针，同时检测多个目的基因的方法，该方法可以方便的进行一管多检，从而达到省时省力的目的。在同时检测多个因子(如猪链球菌2型的毒力因子)时，前景广阔。

本研究同时选取猪链球菌2型的两种毒力因子MRP和EF的编码基因设计引物及探针，通过对反应的退火温度和镁离子浓度进行优化，建立了用于检测猪链球菌2型致病性的多重荧光PCR检测试剂及方法，

发明内容：

本发明目的在于提供用于猪链球菌2型致病性检测的多重实时荧光PCR检测试剂及方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：在分析已报道猪链球菌2型两种毒力因子MRP和EF序列的基础上，分别设计PCR引物和荧光探针。在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时，报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，在荧光PCR反应的退火过程中，探针优先结合到DNA模板上，当引物延伸到探针结合位置时，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对猪链球菌2型两种毒力因子基因的检测，并根据“MRP⁺EF⁺为强致病株、MRP⁺EF^-为弱致病株、MRP^-EF^-为非致病株”的标准判定其致病性。

一个方面，本发明提供了一种用于猪链球菌2型致病性检测的多重实时荧光PCR检测试剂，该试剂包括分别特异性地针对毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)编码基因的引物对及探针，因而可同时针对猪链球菌2型的两种毒力因子MRP和EF进行检测，其中所述的特异性地针对MRP编码基因的引物对和探针的核苷酸序列为：

MRP引物(正向)：5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC

MRP引物(反向)：5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG

MRP探针：5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC

该探针的5’端标记有报告荧光染料JOE，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；其中所述的特异性地针对EF编码基因的引物对和探针的核苷酸序列为：

EF引物(正向)：5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC

EF引物(反向)：5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC

EP探针：5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC该探针的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料TAMRA。

其中所述的MRP引物对及探针与EF引物对及探针可以预先混合在一起，也可以独立存在于所述检测试剂中，使用时现用现配。

本发明所述的检测试剂进一步还可以含有其他PCR扩增用成分，例如，包括但不限于PCR缓冲液、MgCl₂和dNTP。

在本发明的一个优选实施方案中，该试剂为表1所列成分的混合液：

                    表1.猪链球菌2型致病性检测试剂

成分	浓度	加入量	说明
				PCR缓冲液	10倍浓缩	2.5μl	Mg2+Free，100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mM KCl
MRP(正向)	20mM	0.5μl	序列为：5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC
				MRP(反向)	20mM	0.5μl	序列为：5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG
MRP探针	10mM	0.5μl	序列为：5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC，5’标记JOE，3’标记Eclipse
				EF(正向)	20mM	0.5μl	序列为：5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC
EF(反向)	20mM	0.5μl	序列为：5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC
				EF探针	10mM	0.5μl	序列为：5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC，5’标记FAM，3’标记TAMRA
MgCl2	25mM	3.0μl
				dNTP	2.5mM	2.0μl

另一个方面，本发明提供了一种用于检测猪链球菌2型致病性的多重实时荧光PCR检测方法，该方法同时选取猪链球菌2型两种毒力因子MRP和EF基因为目的基因，使用本发明所述的特异性地针对MRP和EF基因的引物对和探针实施检测。

本发明人首先设计分别针对毒力因子MRP和EF基因的引物对和探针，采用软件分析所设计引物对和探针的特异性，引物对和探针合成后分别进行稀释并确定反应需要量，通过调整反应体系中的镁离子浓度和对退火温度进行优化，以培养菌液或者带菌组织DNA为检测样本，确定荧光PCR检测培养菌液或者带菌组织中每个毒力因子最佳反应体系和反应条件，采用倍比稀释的猪链球菌2型培养菌液及带菌组织DNA作为模板进行敏感性试验，采用其它的猪体致病菌为对照进行特异性试验，以确保本方法的实际应用效果。在此基础上，将MRP和EF的检测试剂组装在一起，建立了猪链球菌致病性的多重实时荧光PCR检测方法，并确定其敏感性和特异性。具体试验过程参见实施例1-5。

本发明所述方法可以直接对培养菌液进行检测，也可以对组织中携带的猪链球菌2型实施检测。在采用培养菌液作为检测材料时，菌体分离及培养须在P3实验室、按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。即采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，实验室内，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养后，灭活备用。在对带菌的组织，如猪扁桃体、肌肉等进行检测时，须首先采用商品化的基因组提取试剂盒提取其基因组DNA作为荧光PCR检测用模板。

在利用本发明所述方法对待检样本实施检测时，可直接取一定量的本发明所述检测试剂，按照确立的反应体系和条件进行检测并判定结果。简而言之，本发明所述的用于检测猪链球菌2型致病性的多重实时荧光PCR检测方法包括下述步骤：

1)使用本发明所述的特异性地针对MRP和EF的引物对及荧光素标记探针，与PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

2)向上述检测预混液中加入待检菌液或以待检组织提取的基因组DNA作为模板；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，按照本发明确立的反应条件进行荧光PCR扩增，反应结束后读取并记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；

5)根据各样本的反应Ct值，按照猪链球菌2型致病性判定标准判定待检样本中猪链球菌2型的致病性。

在本发明中，所述的猪链球菌2型致病性判定标准为：(1)反应曲线呈对数增长时，Ct＜30，判定为阳性；30＜Ct＜40，判定为可疑，加大模板量重复扩增，如果得到相同的试验结果，则判为阳性，否则为阴性；(2)反应曲线为一条直线，则为阴性。对于阳性菌株，以有无MRP和EF基因作为标准来判定其致病性。MRP+EF+为强致病株，MRP+EF-为弱致病株，MRP-EF-为非致病株。

在本发明的一个优选实施方案中，取由表1所列成分组成的试剂10.5μl，加入0.5μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)，加灭菌双蒸水13.0μl，制备得到预混液，然后加入1μl灭活菌液或者待检组织基因组DNA作为模板，即检测体系体积为25μl。将各检测体系放入实时(Real-time)PCR仪后，选择FAM和JOE两个荧光通道，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；55℃，10s，45个循环。每个循环结束后采集荧光信号。反应结束后读取各样本扩增曲线的Ct值并根据“MRP⁺EF⁺为强致病株、MRP⁺EF^-为弱致病株、MRP^-EF^-为非致病株”的标准判定待检样本的致病性。

附图说明

图1图示的是多重荧光PCR技术检测培养菌液中猪链球菌2型毒力因子MRP基因的敏感性试验结果。其中：曲线1-8代表PCR扩增时加入反应体系中的菌落数(CFU，菌落形成单位)分别为5000、1000、500、100、50、20、10、5。

图2图示的是多重荧光PCR技术检测培养菌液中猪链球菌2型毒力因子EF基因的敏感性试验结果。其中：曲线1-8代表PCR扩增时加入反应体系中的菌落数(CFU，菌落形成单位)分别为5000、1000、500、100、50、20、10、5。

图3图示的是多重荧光PCR检测组织中猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验结果。其中：曲线1为阳性对照，曲线8为阴性对照，曲线2-7代表PCR扩增时掺入组织中的菌落数(CFU，菌落形成单位)分别为1×10⁴、5×10³、1×10³、500、100、50。

图4图示的是多重荧光PCR检测组织中链球菌2型毒力因子EF的敏感性试验结果。其中，曲线-----为阳性对照；-●-●-●-代表PCR扩增时掺入组织中的菌落数(CFU)为1×10⁴、-◆-◆-◆-代表菌落数为5×10³、-▲-▲-▲-代表菌落数为1×10³、-●-●-●-代表菌落数为5×10²、----代表菌落数为100、-■-■-■-代表菌落数为50、-◆-◆-◆-为阴性对照。

图5图示的是多重荧光PCR检测培养菌液中猪链球菌2型毒力因子MRP的特异性试验结果。

图6图示的是多重荧光PCR技术检测培养菌液中链球菌2型毒力因子EF的特异性试验结果。

图7图示的是多重荧光PCR检测组织中猪链球菌2型毒力因子MRP的特异性试验结果。

图8图示的是多重荧光PCR检测组织中链球菌2型毒力因子EF的特异性试验结果。

图9图示的是用本发明所述多重荧光PCR检测方法对所采集扁桃体样本进行猪链球菌2型致病性检测的结果，其中图9A为MRP扩增结果，图9B为EF扩增结果。

本发明的优点：

1.本发明的试剂及检测方法充分利用了PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否含有MRP和EF两个基因，并根据“MRP⁺EF⁺为强致病株、MRP⁺EF^-为弱致病株、MRP^-EF^-为非致病株”的标准判定其致病性。

2.将针对猪链球菌2型毒力因子两种毒力因子MRP和EF设计的引物对和探针组装到一个荧光PCR体系中进行多重荧光PCR检测，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例

实施例1引物及探针的设计和合成

根据猪链球菌2型两种毒力因子MRP(GenBank No.X64450)和EF(GenBankNo.A24023)编码基因的公开序列、采用探针设计软件Beacon Designer 2.1设计引物对及探针，引物序列为：

MRP(正向)：5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC

MRP(反向)：5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG，扩增产物长度为80bp；

所述探针的序列为：5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC

该探针的5’端用报告荧光染料JOE标记，3’端用淬灭荧光染料Eclipse标记。

EF(正向)：5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC

EF(反向)：5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC，扩增产物长度为139bp；

所述探针的序列为：5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC

该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

上述两种探针均针对待扩增序列间的高GC含量区。

实施例2DNA的提取

2.1菌体分离及培养

在中国人民解放军军事医学科学院P3实验室，按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，带回实验室后，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养后，革兰氏染色、显微镜检查后，灭活备用。

2.2组织基因组DNA的提取

无菌采取待检猪及健康猪的扁桃体、肌肉等组织，实验室内，采用QIAGEN基因组提取试剂盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改进后分别提取其基因组DNA，具体步骤如下：

A.在无菌环境下(最好是在实验室生物安全柜中或超净工作台上进行操作)，将采集的组织样本(如淋巴结、扁桃体、肌肉等)除去包膜和其它结缔组织，选取内部实质部分，置玻璃匀浆器内充分磨成糊状后备用。

B.将研成糊状的20mg的动物组织放入离心管中，加180μl的buffer ATL。

C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋涡混合器混匀，55℃孵育直至组织完全消化(为保证试验结果，消化时间应保持在1小时以上，如时间允许，过夜消化)，在消化的过程中需每隔一段时间振荡混合一次。

D.旋涡15s，在样品中加入200μl的buffer AL，旋涡混匀，70℃孵育30min。

E.在样品中加入200μl的无水乙醇，旋涡混匀。

F.将试剂盒中的DNeasy Mini Spin Column安置于2ml的收集管上，将上述操作E中的溶液转移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)离心1min，弃去滤液和收集管。

G将DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)离心1min，弃去滤液和收集管。

H.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)离心3min使DNeasy膜完全干燥，弃去滤液和收集管。

I.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的1.5ml的收集管上，将100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室温孵育1min，≥6000g(8000rpm)离心1min洗脱DNA。

实施例3实时(Real-time)PCR扩增方法的建立

3.1PCR反应体系

将引物对和探针采用灭菌双蒸水进行溶解，MRP/EF上、下游引物浓度为20mM，不同标记的MRP/EF探针浓度为10mM。然后按照如下比例配制反应预混液：

20mM MRP/EF上、下游引物各0.5μl，探针各0.5μl，10×PCR缓冲液(Mg²⁺Free)2.5μl，25mM MgCl₂ 3.0μl，2.5mM dNTP 2μl，4℃保存备用。

使用前，取上述预混液10.5μl，加入5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，然后加入1μl待检组织基因组DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μl。

3.2PCR反应条件

将样品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；55℃，10s，45个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4猪链球菌2型感染的多重荧光PCR方法的敏感性确定

4.1多重荧光PCR检测培养菌液的敏感性试验

以猪链球菌2型四川株(由中国人民解放军军事医学科学院提供)培养菌液作为待检菌液，计数后，采用血清肉汤培养液按照如下梯度稀释后，直接进行菌液PCR，荧光PCR扩增后，分析Ct值，以Ct＝40作为检测低限，确定本方法可以检测的最少菌数。

表2.用于猪链球菌2型检测的荧光PCR方法的敏感性实验的培养菌液浓度(CFU/μl)

管号	1	2	3	4	5	6	7	8
									菌数(CFU/μl)	5000	1000	500	100	50	20	10	5

4.2多重荧光PCR检测组织中猪链球菌2型感染的敏感性试验

按照试剂盒组织用量说明，分别称取10mg扁桃体组织，在其中分别加入如下表所述的计数后的猪链球菌2型培养菌液，按照DNA提取试剂盒操作提取其中的基因组DNA，并取1μl作为模板进行多重荧光PCR，PCR同时设置阳性和阴性对照。扩增后，分析Ct值，以Ct＝40作为检测低限，确定本方法可以检测的组织中最低猪链球菌2型的数量。

表3.荧光PCR检测猪链球菌2型感染的敏感性实验的组织中对应菌数(CFU/μl)

管号	1	2	3	4	5	6
							加入菌数CFU/μl	1×1061×104	5×1055×103	1×1051×103	5×1045×102	1×1041×102	5×1035×101

试验结果：

多重荧光PCR技术检测培养菌液中猪链球菌2型毒力因子MRP基因的敏感性试验的结果如图1所示。自图1中可以看出，第6管的Ct值为37.2，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的实时PCR方法单独检测MRP基因的敏感性为20CFU。

多重荧光PCR技术检测培养菌液中猪链球菌2型毒力因子EF的敏感性试验的结果如图2所示。自图2中可以看出，第7管的Ct值为36.2，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的多重荧光PCR方法检测培养液中猪链球菌2型EF基因的敏感性为10CFU。

多重荧光PCR技术检测组织中猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验的结果如图3所示。自图3中可以看出，第6管的Ct值为34.3，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的多重荧光PCR方法检测MRP基因的敏感性为100CFU。

多重荧光PCR技术检测组织中猪链球菌2型毒力因子EF的敏感性试验的结果如图4所示。自图4中可以看出，第7管的Ct值为34.0，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的多重荧光PCR方法检测组织中猪链球菌2型EF基因的敏感性为50CFU。

实施例5猪链球菌2型感染的多重荧光PCR检测方法特异性确定

5.1多重荧光PCR检测培养菌液的特异性试验

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌(这三种菌株购自中国兽药监察所)和猪霍乱沙门氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行荧光PCR扩增，根据扩增产物的有无判定本方法是否是检测猪链球菌2型感染的特异性方法。

5.2多重荧光PCR检测组织中猪链球菌2型感染的特异性试验

采用正常组织基因组DNA作为空白对照，以在扁桃体组织中定量加入马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株后提取的DNA作为阴性对照，以加入猪链球菌2型四川株的扁桃体组织作为阳性样品，进行多重荧光PCR，以检验本研究所建立方法的特异性。

试验结果

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR扩增。对培养菌液中MRP基因的扩增曲线分析表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株均没有扩增(见图5)，说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于培养菌液中猪链球菌2型毒力因子MRP的检测。

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR扩增。对EF基因的扩增曲线分析表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株均没有扩增(见图6)，说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于培养菌液中猪链球菌2型毒力因子EF的联合检测。

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR扩增。对组织中MRP基因的扩增曲线分析表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株均没有扩增(见图7)，说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于组织中猪链球菌2型毒力因子MRP的检测。

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR扩增。对EF基因的扩增曲线分析表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株均没有扩增(见图8)，说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于组织中猪链球菌2型毒力因子EF的联合检测。

结果判定方法

反应结束后，仪器自动给出每个样品的Ct值。记录Ct值，分析检测结果。如果反应曲线呈对数增长，而且Ct＜30，则表明为阳性；如果30＜Ct＜40，判为可疑，可以加大模板量再重复扩增，根据结果得到重复，则判为阳性，否则为阴性；如果反应曲线为一条直线，则为阴性。对于阳性菌株，以有无MRP和EF基因作为标准来判定其致病性。MRP+EF+为强致病株，MRP+EF-为弱致病株，MRP-EF-为非致病株。

实施例6

北京市某屠宰场扁桃体样品85份，按照实施例2.2中所述方法提取组织基因组DNA后用ddH₂O溶解。在各检测管内加入10.5μl表1所示的致病性检测试剂、0.5μl聚合酶、13μlddH₂O，加入1μl上述提取的待检DNA，反应同时设置掺入猪链球菌2型(四川株)菌液的扁桃体提取的DNA 1μl作为模板进行的阳性对照和以ddH₂O作为阴性对照。

将样品管放入荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃ 5s；55℃ 10s，40个循环。每个循环结束后采集荧光信号，反应结束后仪器自动给出Ct值。分析Ct值发现，阳性样本的MRP扩增曲线的Ct值为21.5(图9A)，EF为21.9(图9B)，阴性对照没有扩增曲线，表明试验成立；各样本均没有明显扩增曲线，表明各样本均没有检出猪链球菌2型毒力因子MRP和EF，即所采集的所有扁桃体均不携带有猪链球菌2型。

                            序列表

<110>中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所

<120>应用于猪链球菌2型致病性检测的多重荧光PCR检测试剂及方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>1

agaccgtcca aaagtacctt acc                                              23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>2

catttgttcc tggtgtcgtt gg                                               22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>探针

<222>(1)..(24)

<223>

<400>3

tgacccaaca gagccagacg agcc                                             24

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>4

acagtgcaga agcagtaggc                                                  20

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>5

gaacatcttg ggcgattgaa cc                                               22

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>探针

<222>(1)..(24)

<223>

<400>6

acgcctttgt cctctgccga ttgc                                             24

Claims (8)

1.一种用于猪链球菌2型致病性检测的多重实时荧光PCR检测试剂，该试剂包括分别特异性地针对猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)编码基因的引物对及探针，其中所述的引物对及探针混合或各自独立地存在于该检测试剂中。

2.权利要求1所述的多重实时荧光PCR检测试剂，其中所述的特异性地针对MRP编码基因的引物对及探针的核苷酸序列为：

MRP引物(正向)：5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC

MRP引物(反向)：5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG

MRP探针：5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC

MRP探针的5’端标记有报告荧光染料JOE，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述的特异性地针对EF编码基因的引物对和探针的核苷酸序列为：

EF引物(正向)：5’-ACAGTGCAGAAGCAGTAGGC

EF引物(反向)：5’-GAACATCTTGGGCGATTGAACC

EP探针：5’-ACGCCTTTGTCCTCTGCCGATTGC

EP探针的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料TAMRA。

3.权利要求1或2所述的多重实时荧光PCR检测试剂，该试剂中进一步还包括PCR扩增用的PCR缓冲液、MgCl₂和dNTP。

4.权利要求3所述的多重实时荧光PCR检测试剂，该试剂为由下列成分组成的混合液：

10X PCR缓冲液                 2.5μl

20mM MRP引物(正向)            0.5μl

20mM MRP引物(反向)            0.5μl

10mM MRP探针                  0.5μl

20mM EF引物(正向)             0.5μl

20mM EF引物(反向)             0.5μl

10mM EF探针                   0.5μl

25mM MgCl₂                  3.0μl

2.5mM dNTP                    2.0μl

5.一种用于猪链球菌2型致病性检测的多重实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)使用特异性地针对MRP和EF的引物对及荧光素标记探针，与PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

2)向步骤1)得到的检测预混液中加入待检菌液或从待检组织提取的基因组DNA作为扩增模板；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；

5)根据各样本的反应Ct值，按照猪链球菌2型致病性判定标准判定待检样本中猪链球菌2型的致病性。

6.权利要求5所述的多重实时荧光PCR检测方法，该方法使用权利要求2所述的MRP引物对及探针和EF引物对及探针。

7.权利要求5所述的多重实时荧光PCR检测方法，其中荧光PCR扩增条件为：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；55℃，10s，45个循环。

8.权利要求5所述的多重实时荧光PCR检测方法，其中所述的猪链球菌2型致病性判定标准为：(1)反应曲线呈对数增长时，Ct＜30，判定为阳性；30＜Ct＜40，判定为可疑，加大模板量重复扩增，得到相同的试验结果，则判为阳性，否则为阴性；(2)反应曲线为一条直线，则为阴性；对于阳性菌株，以有无MRP和EF基因作为标准来判定其致病性，MRP⁺EF⁺为强致病株，MRP⁺EF^-为弱致病株，MRP^-EF^-为非致病株。

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