CN103122383A - 猪链球菌种水平荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪链球菌种水平的荧光定量PCR检测方法，其是针对askA基因序列设计出特异性引物和TaqMan-MGB探针，建立了快速检测猪链球菌的Real-time PCR方法。该方法具有较高的灵敏性和良好的特异性，所检测的血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌以及120株分离株均显示阳性结果，所检测的27种常见致病菌和条件致病菌都为阴性。本方法可以检测到100拷贝/反应体系的目的基因。同时进行了血液模拟标本的检测，血液模拟标本中3.5×10²CFU/ml的细菌含量可被检出。

Description

猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及猪链球菌的分子生物学检测，具体地说，涉及一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法。

背景技术

猪链球菌是革兰氏阳性兼性厌氧球菌，作为一种人畜共患病原菌,越来越受到人们的关注。按荚膜抗原分为35型，分别是1型～34型和1/2型。其中2型、1型、9型、7型、14型等是导致人类感染的常见血清型。之前已建立了针对血清2型的荧光定量PCR检测方法，进一步工作中发现需要建立一种针对猪链球菌种水平的荧光定量PCR检测方法，不仅血清2型检测阳性，其它常见血清型也检测阳性。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供猪链球菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针，所述引物对包括：

正向引物128-F：5’-AATGCAGGTAGTTCAAGTCTAAAATGG-3’

反向引物128-R：5’-AACCGCAACCGTATGATTAGGA-3’，

所述探针为128-P：5’-FAM-ATCAAATGCCAGAAGAA-MGB-3’。

本发明还提供含有上述引物对和探针的用于种水平检测猪链球菌的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：1）提取样品中的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用所述引物128-F和128-R及探针128-P进行荧光定量PCR扩增反应；3）分析PCR产物。

所述PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃10秒；95℃5秒，60℃45秒，共40个循环。

依据已发表的14株猪链（A7、SS12、JS14、GZ1、P1/7、SC84、98HAH33、05ZYH33、S735、BM407、D12、D9、ST3、ST1）全基因组序列比对，发现作为核心基因组(core genome)的ackA基因是这些已测序猪链球菌菌株所特有的，在其他菌株中同源性很低，而且ackA基因在猪链球菌株个体间变异度小。本发明针对该基因设计了荧光定量PCR检测引物对和探针，并基于Taqman-MGB探针Real-timePCR技术，建立针对猪链球菌种水平的快速检测方法。具体地，针对猪链球菌种特异基因ackA序列，应用Beacon Designer7.0软件，设计出引物和Taqman-MGB探针，建立Real-timePCR检测方法；把目的片段克隆到pMD18-T载体上，绘制标准曲线；以血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌以及120株分离株检测引物探针的灵敏性，以常见致病菌及条件致病菌验证引物探针的特异性；制备血液模拟标本评价本方法在临床标本中的应用。结果表明，从标准曲线可以看出，该方法可以检测到100个拷贝/反应体系的目的基因,灵敏性检测显示血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌以及120株分离株均有荧光信号,其他常见致病菌及条件致病菌均无荧光信号，血液模拟标本中3.5×10²CFU/ml的细菌含量可被检出。因此，本发明以ackA为目的基因建立的Real-timePCR检测方法针对猪链球菌种水平，涵盖常见致病血清型，特异性好，灵敏度高，可快速、准确地用于疑似标本的初步筛查。

附图说明

图1为本发明实施例2中质粒标准品的Real-timePCR检测荧光信号图。

图2为本发明实施例2中根据质粒标准品绘制的Real-time PCR标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1用于猪链球菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针的

合成

针对猪链球菌种特异基因ackA序列，应用Beacon Designer7.0软件，设计出如表1所示的引物对和Taqman-MGB探针，由上海基康生物公司合成。

表1Real-time PCR引物和探针

实施例2猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法

1材料与方法

1.1菌株来源

以测序菌株SC84为阳性对照，实验菌株包括血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型，分离自健康猪的100株猪链球菌及分离自病人的20株猪链球菌由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存，均经api-20Strep生化系统及16S特异PCR检测。用于特异性检测的细菌由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所各科室提供，包括EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EaggEC、UPEC、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、摩根氏摩根菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌。

1.2试剂与仪器设备

Premix(Takara)Ex Taq^TM、EasyDilution、pMD18-T载体、JM109感受态细胞、小量质粒提取试剂盒、核酸纯化试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。血标本提取试剂盒使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)。荧光定量PCR仪使用7900HT Fast Real-Time PCR System(AB)。

1.3反应体系与条件

20μl反应体系:Premix(Takara)Ex Taq^TM(2х)10μl；引物128-F(10μmol/L)0.4μl；引物128-R(10μmol/L)0.4μl；探针128-P(10μmol/L)0.2μl；DNA模板1.0μl;去离子水8.0μl。反应条件采用两步法PCR扩增标准程序：第一步，预变性95℃10s，1个循环；第二步，95℃5s，60℃45s，共40个循环。

1.4灵敏性检测

以血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型的猪链球菌，以及分离自健康猪的100株猪链球菌和分离自病人的20株猪链球菌为模板进行Real-time PCR,检测引物及探针的灵敏性。

1.5特异性检测

以常见致病菌及条件致病菌DNA（EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EaggEC、UPEC、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、摩根氏摩根菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌）为模板进行Real-time PCR,检测引物及探针的特异性。

1.6标准曲线检测

1.6.1质粒标准品

①以128-F和128-R为引物，扩增目的基因171bp；②切胶回收，纯化PCR产物；③连接到pMD18-T载体；④导入JM109感受态细胞；⑤筛选阳性克隆子，通过PCR进行验证，最终测序进一步确认；⑥提取质粒。

1.6.2质粒拷贝数换算

测定质粒DNA的浓度为102.6ng/μl，根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度:每μl样品中检测基因的拷贝数＝浓度（ng/μl）×阿佛加德罗常数×10^-9/（660×重组质粒碱基数）。

1.6.3标准曲线

用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×10⁹拷贝/μl～1.0×10⁰拷贝/μl，共10个浓度梯度，每个浓度梯度作三个平行样本进行Real-timePCR反应。

1.7血液模拟标本检测

①猪链球菌SC84摇菌至OD值为0.62，平板计数为3.5×10⁸CFU/ml；②加磷酸盐缓冲液稀释为3.5×10⁸CFU/ml～3.5×10⁰CFU/ml；③取健康人新鲜血液200μl/管，其中一管加100μl磷酸盐缓冲液作为空白对照，其余各管加各个稀释度的菌液100μl；④按照QIAamp DNABlood Mini Kit操作说明提取染色体，三个平行样品进行Real-timePCR反应。

2结果

2.1灵敏性检测结果

用针对ackA基因的Real-timePCR方法检测血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌，结果均为阳性。分离自健康猪的100株猪链球菌和分离自病人的20株猪链球菌均为阳性。

2.2特异性检测结果

用针对ackA基因的Real-timePCR方法检测EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EaggEC、UPEC、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、摩根氏摩根菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌。结果除阳性对照外，其他菌株均呈阴性。

2.3标准曲线检测结果

当质粒浓度为1.0×10⁹拷贝/μl～1.0×10²拷贝/μl时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，而质粒浓度为1.0×10¹拷贝/μl和1.0×10⁰拷贝/μl时，每个浓度梯度的3个平行样分别有2个和3个样本未出现扩增。为了进一步确认检测下限，把1.0×10²拷贝/μl～1.0×10⁰拷贝/μl三个稀释度分别进行了8次平行反应，结果1.0×10²拷贝/μl的8次反应均有检测信号，1.0×10¹拷贝/μl的8次反应有6次未出现扩增，1.0×10⁰拷贝/μl的8次反应均无扩增。依据每反应体系加1μl模板计算可知，本Real-time PCR体系的检测下限为100拷贝/反应体系（图1）。

以质粒浓度的lg值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线y＝-3.234x＋41.385（图2）。二者的相关系数R²＝0.998。可见，当质粒的浓度在1.0×10⁹拷贝/μl～1.0×10²拷贝/μl范围内时，质粒浓度的对数值与Ct值具有非常好的相关性。

2.4血液模拟标本检测结果

当200μl血液中加入的菌量为3.5×10⁸CFU/ml～3.5×10²CFU/ml时,每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，加入菌量为3.5×10¹CFU/ml时，3个平行样中有一个样本未出现扩增，加入的菌量为3.5×10⁰CFU/ml时3个平行样均未出现扩增。菌量为3.5×10²CFU/ml时重复进行了8次平行反应均扩增阳性，由此可见，本Real-time PCR体系用于血液模拟标本时3.5×10²CFU/ml菌量可被检出。

本发明针对askA基因序列设计合成了引物和TaqMan-MGB探针，建立了检测猪链球菌的Real-time PCR方法。TaqMan-MGB探针是近来开发的新型探针，与一般TaqMan探针相比，具备荧光本底更低,分辨率更高，杂交稳定性及特异性更强等特点。实验结果表明，该方法具有较高的灵敏性和良好的特异性，所检测的血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌以及120株分离株均显示阳性结果，所检测的27种常见致病菌和条件致病菌都未阴性。在确定检测下限时，以能够产生稳定扩增为依据，即8个平行样中都出现扩增判为阳性，8个平行样不全扩增时即判为阴性。在检测中，当模板的浓度低于1.0×10²拷贝/μl时，8个平行样即出现不完全扩增。因此判定检测下限的模板浓度为1.0×10²拷贝/μl,因为每反应体系加1μl模板，所以本方法可以检测到100拷贝/反应体系的目的基因。同时进行了血液模拟标本的检测，血液模拟标本中3.5×10²CFU/ml的细菌含量可被检出。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.猪链球菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针，其特征在于，所述引物对包括：

正向引物128-F：5’-AATGCAGGTAGTTCAAGTCTAAAATGG-3’

反向引物128-R：5’-AACCGCAACCGTATGATTAGGA-3’，

所述探针为128-P：5’-FAM-ATCAAATGCCAGAAGAA-MGB-3’。

2.含有权利要求1所述引物对和探针的用于种水平检测猪链球菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物对和探针进行荧光定量PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃10秒；95℃5秒，60℃45秒，共40个循环。

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