CN108384782A - 检测引发血流感染病原体的成套试剂和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测引发血流感染病原体的成套试剂和试剂盒。本发明公开的成套试剂，由序列表中序列1‑38的38条单链DNA组成，该成套试剂的可以用于检测引发血流感染病原体、制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒、检测待测样本是否含有引发血流感染病原体和制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。实验证明，本发明的成套试剂可同时检测金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、单核细胞增生李斯特菌4种常见血流感染病原体，并且检测结果快速准确，具有很高的灵敏度和特异性，最低检测限可达到101数量级CFU/ml。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测引发血流感染病原体的成套试剂和试剂盒。
背景技术
血流感染(bloodstream infection，BSI)，是临床上重症感染性疾病之一，根据症状不同可分为败血症、脓毒症和脓毒性休克，具有较高的发病率和致死率，其常见感染源包括细菌、真菌。现阶段，血流感染诊断的金标准是血培养，通过生化方法或显微镜观察确定病原体。但该方法耗时长，通常需要数天时间才能确定结果，且对于难培养或无法培养的病原体，则难以准确检测。在缺乏准确诊断结果的情况下，临床医师为了缓解病症，可能盲目使用抗生素，导致患者的生存率降低、细菌耐药性的出现以及治疗费用的增加等。
下一代测序(next-generation sequencing)的面世使得测序通量增加、成本降低，更适于临床检测。国内外已经有报道利用全基因组方法或16S rRNA测序方法直接对患者的全血样本进行病原检测。但血流感染患者中病原体含量较低，全血基因组测定时的随机扩增将产生较多宿主基因数据，造成测序数据的浪费。而16S rRNA的测序方法只能将病原体鉴定到属层级，对于一些亲缘关系较近的病原体很难鉴定到种，无法为临床治疗提供有效的依据。Ampliseq技术是在测序的文库制备过程中选择特定的引物扩增富集特定的片段，扩增的片段长度与下游的测序仪的读长相符可以直接用于测序分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测引发血流感染病原体，尤其是金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂由序列表中序列1-38的38条单链DNA组成。
上述成套试剂中的各单链DNA均可独立包装，各单链DNA的摩尔数可相等。
所述成套试剂的用途可为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
本发明还提供了所述成套试剂的下述任一应用：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述成套试剂。
所述试剂盒的功能可为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
所述试剂盒还可包括构建文库所需的试剂、进行PCR扩增所需的试剂、制备测序模板所需试剂和/或进行测序所需试剂。
所述构建文库所需的试剂可为Ion Ampliseq Library Kit 2.0(Thermo Fisher公司，编号No.4480441)中试剂。所述制备测序模板所需试剂可为Ion PGM OT2 200Template Kit(Thermo Fisher公司，编号No.448094)中试剂。所述进行测序所需试剂可为Ion PITM Hi-QTM Sequencing 200Kit(Thermo Fisher公司，编号No.26433)中试剂。
本发明还提供了所述试剂盒的下述任一应用：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
本发明中，检测引发血流感染病原体，可包括：提取待测样本的DNA，得到基因组DNA，利用所述成套试剂对所述基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；利用所述扩增产物构建测序文库，而后对得到的测序文库进行测序，得到测序结果；将所述测序结果与数据库中序列进行比对，确定待测样本是否为引发血流感染病原体或是否含有引发血流感染病原体。所述方法还可包括在提取待测样本的DNA前去除宿主DNA的步骤。
本发明中，所述引发血流感染病原体可为金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)和/或肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。
本发明的成套试剂可同时检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)4种常见血流感染病原体，并且检测结果快速准确，可在15h内在同一反应体系内快速检测4种常见血流感染病原体，具有很高的灵敏度和特异性，灵敏度为95.38％，特异性为95.45％，Kappa值为0.839～1.000，最低检测限可达到101数量级CFU/ml。本发明可有效减少了宿主的基因的干扰，并且在一次反应、一个反应管中可加入19对病原体特异性引物，检测4种常见血流感染病原体，与单重PCR相比，通量提高。与传统单重PCR方法相比，该法无需预先知道病原特征即可检测，此外减少了对样本核酸需求量，扩大了检测范围。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
金黄色葡萄球菌记载在“li et al.,Phenol-soluble modulin α4 mediatesStaphylococcus aureusassociated vascular leakage by stimulating heparin-binding protein release from neutrophils，Scientific RepoRts|6:29373|DOI:10.1038/srep29373”一文中，表皮葡萄球菌记载在“杨祖钦等，脑脊液细菌16SrRNA荧光定量PCR快速诊断儿童化脓性脑膜炎，中国实用儿科杂志2007年3月第22卷第3期”一文中，单核细胞增多性李斯特氏菌记载在“赵成娜等，检测6种常见儿童化脓性脑膜炎病原菌的PCR阵列方法的建立与评价，军事医学2017年11月第41卷第11期”一文中，肺炎克雷伯菌记载在“Jiang et al.,Sequencing of blaIMP-Carrying IncN2Plasmids,and ComparativeGenomics of IncN2Plasmids Harboring Class 1Integrons,Frontiers in Cellularand Infection Microbiology,March 2017|Volume 7|Article 102”一文中，公众可从申请人处获得这些生物材料，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、检测引发血流感染病原体的成套试剂的制备
本实施例提供的检测引发血流感染病原体的成套试剂由名称分别为引物对1-19的19个引物对组成，其序列分别为序列表中序列1-38的38条单链DNA，具体如表1所示。该成套试剂能检测3种革兰阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)以及以及1种革兰阴性菌肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，其中引物对1-3能检测金黄色葡萄球菌，引物对4-9能检测表皮葡萄球菌，引物对10-18能检测肺炎克雷伯菌，引物对19能检测单核细胞增多性李斯特氏菌。该成套试剂中，各单链DNA间的摩尔数均相等，各单链DNA均独立包装。
表1、各引物对的序列及相关信息
表1中F表示上游引物；R表示下游引物。
实施例2、实施例1的成套试剂对病原体的检测
1.1材料
待测细菌：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，单核细胞增多性李斯特氏菌，肺炎克雷伯菌。
1.2测序仪
测序过程中模板的乳化与富集在Ion One Touch System(Thermo Fisher公司)上操作完成，上机测序使用Ion P1芯片在Ion Proton测序仪(Thermo Fisher公司)上操作完成。
1.3方法
1.3.1模拟样本的建立：
每种细菌均按照如下步骤制备模拟阳性样本：将细菌进行过夜培养，第2天进行二代培养，取3.5h的二代培养结果进行OD600的测定，记录OD600值并对菌液进行10倍比梯度稀释，取稀释了106、107、108倍的菌液100μl涂布于平板上，每个浓度梯度涂3个平板，在37℃静置24h后计算3个平板菌落数的平均值，作为参考菌落数。在每个浓度梯度中取75μl菌液掺入到750μl健康人血样本中制备模拟血液样本，获得菌浓度均为103CFU/ml的模拟血液样本。共得到65份模拟阳性样本，其中，金黄色葡萄球菌模拟阳性样本14份，表皮葡萄球菌模拟阳性样本17份，肺炎克雷伯菌模拟阳性样本18份，单核细胞增多性李斯特氏菌模拟阳性样本16份。
按照如下步骤制备模拟阴性样本：取75μl PBS掺入到750μl健康人血样本中制备模拟阴性样本，共得到44份模拟阴性样本，其中，金黄色葡萄球菌模拟阴性样本12份，表皮葡萄球菌模拟阴性样本9份，肺炎克雷伯菌模拟阴性样本12份，单核细胞增多性李斯特氏菌模拟阴性样本11份。
1.3.2样本病原体核酸提取：
针对上述的模拟样本，先进行人基因组的移除，再采用HMW DNA Kit试剂盒(Qiagen公司，编号No.67563)提取病原体的核酸。人基因组移除的具体步骤为：向步骤1.3.1得到的模拟血液样本中加入750μl裂解液(该裂解液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为2％(v/v)Tween20和1.3％(v/v)Triton-100)，室温条件下反应5min，，反应后向反应产物中加入15μl硅基磁珠进行人基因组吸附。恒温振荡2min后，将置于磁力架上静止一分钟，然后吸取清液(病原体核酸位于清液中)至新的EP管，然后利用HMW DNA Kit试剂盒(Qiagen公司，编号No.67563)提取病原体的核酸，得到100μl病原体DNA模板。经验证，发现得到的病原体DNA模板均含有相应病原体的DNA，且浓度也均达到了构建文库的要求。
1.3.3文库构建：
利用Ion Ampliseq Library Kit 2.0(Thermo Fisher公司，编号No.4480441)进行文库构建。步骤如下：
1)目标DNA的扩增
将实施例1成套试剂中的19对引物分为两个引物池，引物对2、4-7、10-12归为引物池1，引物对1、3、8、9、13-19归为引物池2，利用引物池1和2分别对步骤1.3.2得到的病原体DNA模板进行PCR扩增。所用2×Ion Ampliseq HiFi Mix为Thermo Fisher公司产品。
引物池1的反应体系如下：
2×Ion Ampliseq Primer Pool 1：5μL
2×Ion Ampliseq HiFi Mix：2μL
病原体DNA模板：2.5μL
H2O：0.5μL
其中，2×Ion Ampliseq Primer Pool 1为引物池1的溶液，该溶液中8对引物的16条单链的浓度均相等，均为400nM。
引物池1的扩增条件如下：
引物池2的反应体系如下：
2×Ion Ampliseq Primer Pool 2：5μL
2×Ion Ampliseq HiFi Mix：2μL
病原体DNA模板：2.5μL
H2O：0.5μL
其中，2×Ion Ampliseq Primer Pool 2为引物池2的溶液，该溶液中11对引物的22条单链的浓度均相等，均为400nM。
引物池2的扩增条件如下：
2)步骤1)反应结束后，将引物池1和2得到的反应产物混合，得到混和PCR产物；按照试剂盒说明书向反应产物中添加FuPa试剂进行反应，之后连接接头(barcode)并纯化，即得到相应病原体文库，并对文库的DNA浓度进行检测，对于未达到要求浓度的文库，使用上述方法对文库进行扩增，得到DNA浓度满足测序要求的文库。
1.3.4模板准备与测序：
将步骤1.3.3得到的文库使用Ion PGM OT2200Template Kit(Thermo Fisher公司，编号No.448094)试剂盒制备测序模板，将得到的测序模板使用试剂盒Ion PITM Hi-QTMSequencing 200Kit(ThermoFishe公司，编号No.26433)进行测序，均按照试剂盒指导书明使用。
1.3.5生物信息学分析：
测序所得数据在Torrent Suite软件上与参考序列进行比对。由Torrent Suite产生的bam格式数据经过Samtools(版本1.6)软件转化为sam文件，之后提取出有效的fasta格式测序结果,使用bowtie(版本1.2.0)软件将测序结果与NCBI上各菌株的序列分别进行比对，提取结果，从而确定该样本的病原体种类。
1.4特异性与灵敏度分析：
利用上述方法进行检测的结果(表2)中，14份金黄色葡萄球菌模拟阳性样本中检测出有13份为金黄色葡萄球菌感染阳性样本，1份为金黄色葡萄球菌感染阴性样本；12份金黄色葡萄球菌模拟阴性样本中检测出有1份为金黄色葡萄球菌感染阳性样本，11份为金黄色葡萄球菌感染阴性样本。17份表皮葡萄球菌模拟阳性样本中检测出有15份为表皮葡萄球菌感染阳性样本，2份为表皮葡萄球菌感染阴性样本；9份表皮葡萄球菌模拟阴性样本中检测出有0份为表皮葡萄球菌感染阳性样本，9份为表皮葡萄球菌感染阴性样本。18份肺炎克雷伯菌模拟阳性样本中检测出有18份为肺炎克雷伯菌感染阳性样本，0份为肺炎克雷伯菌感染阴性样本；12份肺炎克雷伯菌模拟阴性样本中检测出有1份为肺炎克雷伯菌感染阳性样本，11份为肺炎克雷伯菌感染阴性样本。16份单核细胞增多性李斯特氏菌模拟阳性样本中检测出有16份为单核细胞增多性李斯特氏菌感染阳性样本，0份为单核细胞增多性李斯特氏菌感染阴性样本；11份单核细胞增多性李斯特氏菌模拟阴性样本中检测出有0份为单核细胞增多性李斯特氏菌感染阳性样本，11份为单核细胞增多性李斯特氏菌感染阴性样本。
表2、灵敏度和特异度评价
计算特异性与灵敏度，灵敏度＝(阳性样本中检出阳性样本数/总阳性样本数)×100％；特异性＝(阴性样本中检出阴性样本数/阴性样本总数)×100％。上述方法总的灵敏度＝95.38％，总的特异性＝95.45％；检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的灵敏度＝92.85％，特异性＝91.67％；检测表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的灵敏度＝88.24％，特异性＝100％；检测肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的灵敏度＝100％，特异性＝91.67％；检测单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)的灵敏度＝100％，特异性＝100％，表2。表明，实施例1的成套试剂检测不同菌感染的样本具有高特异性和灵敏度。检测结果与实际掺入菌量相比Kappa值为0.839～1.000，P<0.05，表3，一致性极好。
表3、一致性系数
| 病原体 | Kappa值 | P值 |
| S.aureus | 0.845 | <0.05 |
| S.epidermidis | 0.839 | <0.05 |
| K.pneumoniae | 0.930 | <0.05 |
| L.monocytogenes | 1.000 | <0.05 |
1.5检出限评价：
在步骤1.3.1中的方法制备四种菌株的模拟阳性样本，然后将得到的样本进行稀释至临床常见浓度(1-100CFU/ml)得到金黄色葡萄球菌(S.aureus)的浓度分别为37、42、16、59、79、54、30、52、77、79、80、38、48、51CFU/ml的样本，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的浓度分别为69、81、89、80、90、101、93、77、74、73、70、78、84、82、80、87、96CFU/ml的样本，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的浓度分别为23、45、50、82、17、102、132、98、91、45、41、85、94、52、75、98、24、109CFU/ml的样本，单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)的浓度分别为75、79、90、84、82、73、69、98、150、142、97、109、69、93、63、78、54CFU/ml的样本。
利用步骤1.3.2-1.3.5的方法检测上述各样本，结果显示，这4种菌的最低检出限均可达101数量级CFU/ml(表4)。
表4、最低检出限(LOD)评价
| 病原体 | LOD(CFU/ml) |
| 金黄色葡萄球菌(S.aureus) | 16 |
| 表皮葡萄球菌(S.epidermidis) | 69 |
| 肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae) | 17 |
| 单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes) | 54 |
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 检测引发血流感染病原体的成套试剂和试剂盒
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<213> 人工序列
<400> 22
cgagaggtta ttaaccttac gcctt 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tctgtcaagt cggatgtgaa atcc 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cctccaaatc gacatcgttt acg 23
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcgaagaacc ttacctggtc tt 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tcgtaagggc catgatgact tg 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tatgtcgtag tccggattgg agt 23
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tacggttacc ttgttacgac ttcac 25
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acatgcaagt cgagcggt 18
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gcctaggtga gccgttacc 19
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gccttcgggt tgtaaagcac tt 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctgccagttt cgaatgcagt tc 22
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
acgatgtcga tttggaggtt gt 22
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
accaatccat ctctggaaag ttctg 25
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctgccagtga taaactggag gaa 23
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ctacgattac tagcgattcc gacttc 26
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
actgaagcaa aggatgcatc tg 22
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ccaatccttg tatatactta tcgatttcat ccg 33
Claims (10)
1.成套试剂，由序列表中序列1-38的38条单链DNA组成。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的成套试剂，其特征在于：所述引发血流感染病原体为金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)和/或肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。
4.权利要求1或2所述成套试剂的下述任一应用：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述引发血流感染病原体为金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)和/或肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。
6.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述成套试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的功能为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述引发血流感染病原体为金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)和/或肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。
9.权利要求6或7所述试剂盒的下述任一应用：
(b1)检测引发血流感染病原体；
(b2)制备用于检测引发血流感染病原体的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有引发血流感染病原体；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有引发血流感染病原体的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述引发血流感染病原体为金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)和/或肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。
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