CN107164526A - 一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法,包括以下步骤：S1基于临床的肺部感染病原菌谱确定；S2根据细菌的特定基因做检测靶点；S3设计通用引物和探针；S4芯片制备；S5靶基因扩增；S6芯片杂交、洗涤；S7基因芯片可视化检测；S8优化条件，建立方法；S9临床验证；S10与细菌培养进行比对；S11建立肺部感染病原菌可视化基因芯片检测。本发明有益效果：实现对临床常见呼吸道感染菌群的重要病原微生物快速、灵敏、高通量检测，为呼吸道急性、重症感染性疾病的临床疾病诊断、抗感染治疗提供依据；为应急、防控提供有效提供高效的甄检手段方法。

Description

一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法。
背景技术
长期以来，呼吸道病原体引起的急性重症肺部感染一直是威胁人类健康的重要疾病，如不能得到及时有效救治，不仅可引起呼吸衰竭，还可导致多器官功能障碍，严重威胁患者生命，近20年来，肺部感染的细菌谱发生了变化，是当前医务工作者面临的严峻挑战。对病原菌进行快速、准确的检测，是临床诊治肺部感染的前提与关键，对于降低患者死亡率，减少住院时间、降低住院费用及避免医疗资源的浪费具有重要意义。
目前我国对于感染性疾病的病原菌检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化检测水平。病原菌检测的经典方法是细菌培养，其作为病原菌检测的“金标准”，至少需要3-5天时间，对于一些非典型菌株培养则需时间更长，不能在第一时间给临床医生提供详尽的病原菌信息，导致临床治疗多仅凭经验用药，严重影响治疗准确性及效果。近年来，分子生物学技术在病原学检测方面得到了迅猛发展，PCR等虽然有较好的特异性及灵敏性，但每次只能检测一种或几种致病菌，存在通量低的缺陷，只能作为常规检测方法的补充和辅助。因此，临床迫切需要对肺部感染的病原体进行快速、准确的检测，以指导抗感染药物选择，提高临床治疗效果。利用高新分子生物学技术，建立多种感染性致病菌的快速、准确、高通量的检测方法，使之操作简便、适合临床应用，确保临床医生在较短的时间内准确获得病原菌结果，对于提高肺部感染的诊治和防控能力，防止疾病的传播，都具有重要的价值。
基因芯片技术为病原微生物的诊断提供了一种强有力的手段。基因芯片(Genechip)又称为DNA微阵列(DNA microarray)，该技术采用原位合成或微量点样方法，将大量DNA探针如基因片段、人工合成的寡核苷酸等有序固定在载体(玻璃、硅片、尼龙膜等表面)与标记的核酸样品杂交后通过计算机等信号处理系统获取样品核酸序列信息。与传统的检测技术相比较，具有准确、快速、高通量、平行化等无可比拟的优点，可以在短时间内对多个基因进行准确检测，应用该技术进行细菌检测鉴定已显示出良好的应用前景。
基因芯片技术主要包括四个技术环节：芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应、信号的检测与分析。基因芯片上的探针设计是决定芯片检测效能的关键因素之一，16SrRNA基因在细菌的分类鉴定学上具有重要的生物学意义，其在生物进化过程中比其他基因演变得慢，被称为“细菌进化的活化石。迄今为止，几乎所有已知细菌16S rRNA基因的碱基序列已被测定并存入基因库。一般认为，对于同一种细菌其基因组的同源性应大于70％，对16SrRNA而言，如果出现3个以上碱基差异就可断定细菌不属于同一种属，因此，可设计出针对所有细菌共同的PCR反应引物。基因芯片用于细菌分类鉴定，常用的检测区域和目的基因有：16S rRNA、23S rRNA、16S～23S rRNA ISR(基因间隔区)等。但现有的序列特异性探针设计算法缺乏足够的覆盖度、灵活性以及效率，不能满足大规模细菌检测基因芯片的设计要求，而采用计算机设计的基于相对熵和遗传算法的组合探针设计，使得基于组合探针识别的大规模细菌分类16S rRNA基因芯片设计成为可能。
芯片的信号采集和分析方法是获得病原菌感染结果的关键步骤。目前，荧光检测法是基因芯片常规检测方法，方法成熟、简便，能够达到一般的检测要求，但有机荧光染料有自身难以克服的缺点：易淬灭、信号强度低等，在各种环境中稳定性差，影响检测信号的均一性和实验重现性，其最大的缺点是检测仪器的昂贵、体积笨重，检测成本较高，限制了基因芯片的临床及现场检测中的应用与推广，也是生物芯片技术发展面临的瓶颈问题。为解决这个问题，国内外学者探索研究基因芯片的可视化技术。可视化芯片即可用肉眼直接观察到生物大分子的反应信号，其原理是在酶的催化作用下产生的沉淀，沉积在芯片表面，使芯片的厚度发生变化，致使反射在芯片上的光的波长发生改变，由此可以通过芯片上颜色的变化来观察实验结果。
近年已有研究者将免疫组化的金银染色的技术应用于基因芯片的检测，实现了可视化检测，大大降低了检测成本，但缺点是检测灵敏度低，不能达到分子检测的要求。在传统金标银染(gold label silver stain，GLSS)技术基础上，应用酪胺信号放大金标银染(TSA-GLSS)的方法，将TSA信号放大与量子点银染信号放大相结合，通过两步放大，实现了基因芯片高灵敏度的检测。该方法的原理是：将待检测物标记生物素分子，使其与亲和素特异性结合，亲和素分子上连有的辣根过氧化物酶(HRP)可以催化酪胺分子大量地沉积在HRP分子表面，起到级联放大的作用，将酪胺分子标记生物素分子，进而可以对结果进行分析，与常规的方法相比，检测的灵敏度可提高10-100倍，对细菌的检测灵敏度达103CFU/ml，且结果肉眼可见，实现了基因芯片的可视化(原理见图1)，检测过程在5小时内完成。
可视化基因芯片以其高通量、特异、快速，又可以摆脱昂贵的基因芯片实验设备的限制等优势，在病原体检测中的应用逐渐得到重视。但迄今为止，基于临床致病菌谱的肺部感染病原体筛查的可视化基因芯片研究，国内尚未见报道。
近年来，课题组对老年肺部感染及导致多器官功能障碍综合征早期预警和预后预测指标进行了研究，观察老年肺部感染致病菌谱变化，在以往研究的基础上，本课题紧密结合临床实际，针对肺部感染病原菌检测结果滞后的矛盾，选取近年医院常见的10种肺部感染致病菌，应用基因芯片结合高灵敏的可视化技术，研究、建立一种新的适用于临床、现场应用的肺部感染病原菌筛选、检测方法，实现对病原菌快速、灵敏、高通量、低成本的现场检测，以期为肺部感染的诊断、抗感染治疗提供依据。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种可可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法，包括以下步骤：
S1基于临床的肺部感染病原菌谱确定，在若干例肺部感染患者致病菌中，通过统计、分析选取10种常见致病菌作为检测的靶细菌；
S2根据细菌的特定基因做检测靶点；
S3设计通用引物和探针；
S4芯片制备；
S5靶基因扩增；
S6芯片杂交、洗涤；
S7基因芯片可视化检测；
S8优化条件，建立方法；
S9临床验证；
S10与细菌培养进行比对；
S11建立肺部感染病原菌可视化基因芯片检测。
进一步的，步骤S2和S3中，以取筛查的10种细菌为检测靶点，采用计算机Clustal×1.8msw Alignment软件对多种细菌的靶基因进行序列比对，采用Primer 5.0软件设计特异性引物与探针，并进行Blast分析筛选，筛选通用性引物和多种呼吸道致病菌特异性检测探针，所有下游引物在5′端进行生物素标记，全部寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰。
进一步的，步骤S4中，成引物、探针，将探针用点样液稀释至终浓度后，各取20ul置于384孔板，用点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，于室温放置至少18h，每张芯片10个区，每个区为7×7探针矩阵。
进一步的，步骤S7中，依次点加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、生物素-标记的酪胺和链霉亲和素-纳米金孵育，最后加入银增强试剂显色，观测结果。
本发明的有益效果：建立基于临床致病菌谱的肺部感染病原体筛查的可视化基因芯片检测技术；实现对临床常见呼吸道感染菌群的重要病原微生物快速、灵敏、高通量检测，为呼吸道急性、重症感染性疾病的临床疾病诊断、抗感染治疗提供依据；为应急、防控提供有效提供高效的甄检手段方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明TSA-GLSS生物芯片检测原理图；和
图2为本发明实施例所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法的流程框图；
图3-4为本发明实施例所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法的实验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图2所示，本发明实施例所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法包括以下步骤：
S1在近年300例肺部感染患者致病菌中，通过统计、分析选取10种常见致病菌作为检测的靶细菌；
S2设计通用引物及特异性探针：以取筛查的10种细菌为检测靶点，采用计算机Clustal×1.8msw Alignment软件对多种细菌的靶基因进行序列比对，采用Primer Primer5.0软件设计特异性引物与探针，并进行Blast分析筛选。筛选通用性引物和多种呼吸道致病菌特异性检测探针，所有下游引物在5′端进行生物素标记，全部寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰。
S3芯片制备：合成引物、探针，将探针用点样液稀释至终浓度后，各取20ul置于384孔板，用点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，于室温放置至少18h，每张芯片10个区，每个区为7×7探针矩阵。
S4核酸提取：按照实验室建立的一步法，提取细菌DNA。
S5、靶基因扩增：取5ul上清作为模板，按试剂盒方法进行PCR反应。
S6、进行生物素、酪胺的制备：按照实验室建立方法进行。
S7、进行芯片杂交、洗涤：按照实验室建立方法进行。
S8、可视化检测：依次点加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)、生物素-标记的酪胺(biotin-tyramine)和链霉亲和素-纳米金(streptavidn-Nanogld)孵育，最后加入银增强试剂显色，观测结果。
S9、最后用可视化生物芯片扫描仪扫描并记录结果，进行分析。
S10、优化上述各项反应条件：包括：引物比例、镁离子浓度、退火温度、退火时间、杂交温度、杂交液成分等因素。
S11、进行特异性、灵敏度、重复性评价，进一步完善基因芯片检测方法：
①、特异性评价：由我院微生物实验室及军事医学科学院提供致病菌阳性及阴性参考品进行。
②、灵敏度评价：各种致病菌灵敏度标准品由军事医学科学院提供，使灵敏度在101-103CFU/ml之间。
③、重复性测定：同一芯片不同点及不同批次芯片变异系数＜15％。
三、临床验证研究：
(一)、病例选择及标本留取
1、入选标准：患者年龄大于16岁，根据临床症状、查体、检验及影像学结果符合中华医学会呼吸病学分会制定的社区获得性肺炎(HAP)、呼吸机相关肺炎(VAP)、医院获得性肺炎(HAP)诊断标准。
2、排除标准：①活动性肺结核；②肺部肿瘤；③咯血的肺部疾病；④单纯病毒性肺炎、真菌性肺炎。
3、自愿签署知情同意书。
4、标本留取：患者入院时及治疗过程中均可收集，严格按照实验室规范留取、存放各种标本。
(二)、研究设计与方案
1、研究设计：随机、开放的临床研究。选取150例在我院门诊就诊及住院治疗的肺部感染患者为研究对象，留取临床标本(包括咽鼻试子、含漱液、痰、气管分泌物及支气管肺泡灌洗液致病菌)标本进行可视化基因芯片检测，同时进行细菌培养和鉴定，用于芯片检测结果的复核，进行临床验证。
2、研究方案与流程：
①、确定最常见的10种致病菌。
②、制备基因芯片。
③、选取150例在我院门诊就诊及住院治疗的肺部感染患者，进行临床标本(包括咽试子、含漱液、痰、气管分泌物及支气管肺泡灌洗液致病菌)可视化基因芯片检测，同时进行细菌培养和鉴定，进行临床验证。前期研究检测50-120例患者标本进行试验，后期根据结果调整研究进度。
④、可对同一患者的咽拭子、含漱液、痰液及支气管肺泡灌洗液同时检测，但用于基因芯片与细菌培养及鉴定的标本须为同一类型标本。
⑤、临床首诊及住院治疗过程中的患者标本均可应用于研究。
⑥、急危重症及住院治疗过程中感染加重患者可根据病情再次留取标本检测，患者临床治愈停止可标本检测。
⑦、患者常规化验血常规、生化及各项炎症等相关指标，进行血气分析、影像学等相关检查。
⑧、不能同时进行基因芯片、细菌培养检测的病例退出实验研究。
3、主要评价指标：可视化基因芯片阳性与细胞培养结果符合比例。
4、样本量的估算：
由于国内尚无相关研究，但本实验室及课题组应用该技术筛查呼吸道病毒技术已建立，方法较成熟，且肺部感染病例来源丰富，易于收集，预计可在3个月内收集150例病例，去除可能不符合实验要求的病例，按照20％退出率，考虑实验条件及成本预算，可先选择研究病例对象120例。
5、统计学方法：
两种检测方法的比较采用：①、符合率的比较，应用卡方检验；②、采用一致性检验，KaPPa系数＞0.7为具有统计学意义，图3-4和表1是本发明实施例所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法实验结果。
标1 标2 标3 标4 标5 标6 标7 标8 标9
标2 ACT g1tA2 SP6 1ytA3 HI6 P6-12 PA-12 toxA3
标3 ACT g1tA2 SP6 1ytA3 HI6 P6-12 PA-12 toxA3
标4 MP48 P1-2 SIA nuc BC12 recA3 SM11 chitA14
标5 MP48 P1-2 STA nuc BC12 recA3 SM11 chitA14
标6 FE31 FP CP13 CPP KP32 mdh12 dnaJ3 phoA3
标7 FE31 FP CP13 CPP KP32 mdh12 dnaJ3 phoA3
标8 ES11 SP LEG2 mig1 阴性3 阴性4 阴性5 阳性
标9 ES11 SP LEG2 mig1 阴性3 阴性4 阴性5 阳性
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1基于临床的肺部感染病原菌谱确定；
S2根据细菌的特定基因做检测靶点；
S3设计通用引物和探针；
S4芯片制备；
S5靶基因扩增；
S6芯片杂交、洗涤；
S7基因芯片可视化检测；
S8优化条件，建立方法；
S9临床验证；
S10与细菌培养进行比对；和
S11建立肺部感染病原菌可视化基因芯片检测。
2.根据权利要求1所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法，其特征在于，步骤S2和S3中，以取筛查的10种细菌为检测靶点，采用计算机Clustal×1.8 msw Alignment软件对多种细菌的靶基因进行序列比对，采用Primer 5.0软件设计特异性引物与探针，并进行Blast分析筛选，筛选通用性引物和多种呼吸道致病菌特异性检测探针，所有下游引物在5′端进行生物素标记，全部寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰。
3.根据权利要求1所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法，其特征在于，步骤S4中，成引物、探针，将探针用点样液稀释至终浓度后，各取20ul置于384孔板，用点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，于室温放置至少18h，每张芯片10个区，每个区为7×7 探针矩阵。
4.根据权利要求1所述的可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法，其特征在于，步骤S7中，依次点加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、生物素－标记的酪胺和链霉亲和素－纳米金孵育，最后加入银增强试剂显色，观测结果。
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