CN108474037A - 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途 - Google Patents

普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108474037A
CN108474037A CN201680059564.XA CN201680059564A CN108474037A CN 108474037 A CN108474037 A CN 108474037A CN 201680059564 A CN201680059564 A CN 201680059564A CN 108474037 A CN108474037 A CN 108474037A
Authority
CN
China
Prior art keywords
abundance
shi
phgi
phgii
ibd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680059564.XA
Other languages
English (en)
Inventor
米雷娅·洛佩兹·锡莱斯
利夫拉多·耶素斯·加西亚·吉尔
泽维尔·奥尔迪格·曼特
玛格丽特·马第尼斯·梅迪纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dr Gerona Joseph Te Lothar Biomedical Research Foundation
Goodgate Co
Universitat de Girona
Original Assignee
Dr Gerona Joseph Te Lothar Biomedical Research Foundation
Goodgate Co
Universitat de Girona
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dr Gerona Joseph Te Lothar Biomedical Research Foundation, Goodgate Co, Universitat de Girona filed Critical Dr Gerona Joseph Te Lothar Biomedical Research Foundation
Priority to CN202211643379.9A priority Critical patent/CN115976239A/zh
Publication of CN108474037A publication Critical patent/CN108474037A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

本发明涉及一种用于普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的肠道样品的准确定量的新方法。本发明还涉及用于检测人类对象肠道疾病的方法，包括筛查、诊断、鉴别诊断、和/或监测疾病活动和/或进展，包括测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII的丰度。此外，本发明涉及用于预测药物在人类对象肠道疾病治疗性治疗中的功效的方法，该方法包括测定来自所述对象的肠道样品中PHGI和/或PHGII的丰度。

Description

普氏栖粪杆菌亲缘组I和/或亲缘组II成员的定量方法及其作 为生物标志物的用途
技术领域
本发明一般涉及肠道疾病的诊断和分类以及个体化医学领域。本发明还涉及微生物学和分子生物学领域，更特别地，其涉及肠道微生物群组成和肠道疾病(例如炎症性肠病(IBD))之间的关系。具体地，本发明涉及一种用于普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的肠道样品的准确定量的新方法。本发明还涉及用于检测人类对象肠道疾病的方法，包括筛查、诊断、鉴别诊断、测定疾病活动和/或监测疾病活动和/或进展，包括包含测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII成员的丰度。此外，本发明涉及用于预测药物在人类对象肠道疾病治疗性治疗中的功效的方法，该方法包括测定来自所述对象的肠道样品中PHGI和/或PHGII的丰度。
背景技术
炎症性肠病(IBD)代表一组特发性慢性炎症性肠道病症。该术语涵盖的两个主要疾病类别是克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，两者具有重叠和独特的临床和病理学特征(World Gastroenterology OrganisationGlobal Guidelines,Inflammatory bowel disease:a global perspective,June 2009；and Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19 Suppl A:5-36)。
在美国IBD影响多达160万人，在欧洲影响多达220万人。在世界范围内发病率正在上升，尽管IBD治疗取得了进展，但自1990年以来，在美国，IBD住院率和手术率显著增加。IBD是美国最常见的五种胃肠病负担之一，并且每年总体保健费用超过17亿美元。发达国家每1000人中就有一到两人受IBD的影响，并且由于快速现代化和西方世界生活方式的采用，比率在全球中似乎有所增加。这些慢性病导致显著的发病率和死亡率，影响生活质量和预期寿命(M’Koma A.E.,World J Gastrointest Surg 2014；6(11),208-219)。
在世界不同地区持续发现IBD发病率增加和社会经济发展相关的环境因素之间的关联，似乎发达国家的生活方式可能会削弱人类肠道微生物定殖的天然模式。在IBD中，粘膜损伤通常与对肠内共生微生物的免疫反应过度或失调有关，并且使用分子方法进行肠道微生物群分析的研究表明，肠微生物生态系统的微生态失调(即微生物群组成异常)和复杂性降低是CD或UC患者的共同特征(Manichanh et al.,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2012；9,599–608)。
根据基于16S rRNA基因分析的人肠道微生物群的多样性研究(Arumugam etal.Nature.2011；473:174-180；Eckburg et al.Science.2005；308:1635-1638；Hold etal.Appl Environ Microbiol.2003；69:4320-4324；Schwiertz et al.J Pediatr.2010；157:240-244；Suau et al.Systematic and Applied Microbiology.2001；24:139-145；Walker et al.ISME J.2011:220-230)，普氏栖粪杆菌(瘤胃球菌科)是在肠道中发现的三种最丰富的细菌物种之一，占健康个体的粪便微生物群中的2％-20％。另一方面，据报道，其在粘膜相关微生物群落的细菌中占6％(Swidsinski et al.World JGastroenterol.2005；11:1131-1140)，但一些研究已表明，在一些个体中该值可以增加至约20％-50％(Nava GM,Stappenbeck TS.Gut Microbes.2011；2:99-104；Baumgart etal.ISME J.2007；1:403-418)。
近年来，鉴于普氏栖粪杆菌通过形成抗炎化合物(Louis et al.FEMS MicrobiolLett.2009；294:1-8；Sokol et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105:16731-16736；Barcenilla et al.Appl Environ Microbiol.2000；66:1654-1661；Duncan et al.Int JSyst Evol Microbiol 2002；52:2141-2146；Lopez-Siles et al.Appl EnvironMicrobiol.2012；78:420-428)和增强肠道屏障功能(Carlsson et al.Scand JGastroenterol.2013；48:1136-1144；Wrzosek et al.BMC Biol.2013；11:61)在促进肠道健康(Louis et al.FEMS Microbiol Lett.2009；294:1-8；Sokol et al.Proc Natl AcadSci U S A.2008；105:16731-16736)中起到潜在重要作用，人们对普氏栖粪杆菌的兴趣日益增加。
有许多研究已经显示，在不同的肠道疾病中，普氏栖粪杆菌广泛性和丰度降低(Miquel et al.Curr Opin Microbiol.2013；16:255-261)，特别地，对在炎症性肠病(IBD)中普氏栖粪杆菌数量耗减存在最广泛报道。在成人CD患者的粪便和粘膜相关群落中已经观察到该物种数目的减少((Sokol et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105:16731-16736；Lopez-Siles et al.International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475；Sokol et al.Inflamm Bowel Dis.2009；15:1183-1189；Swidsinski etal.Inflamm Bowel Dis.2008；14:147-161；Willing et al.Inflamm Bowel Dis.2009；15:653-660)。
尽管已经在UC中反复观察到厚壁菌门(Firmicutes)的减少，但已有报道UC患者中存在可变种群(Swidsinski et al.World J Gastroenterol.2005；11:1131-1140；Lopez-Siles et al.International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475；Sokol et al.Inflamm Bowel Dis.2009；15:1183-1189；Hansen et al.Am JGastroenterol.2012；107:1913-1922；Jia et al.FEMS Microbiol Lett.2010；310:138-144；Kabeerdoss et al.BMC Gastroenterol.2013；13:20；Machiels et al.Gut.2013；McLaughlin et al.Therap Adv Gastroenterol.2010；3:335-348；Vermeiren et al.FEMSMicrobiol Ecol.2012；79:685-696)。最近对127名UC对象进行的一项研究指出，普氏栖粪杆菌的减少也与UC微生态失调有关(Machiels et al.Gut.2013)。
有趣的是，在功能性肠道疾病中也观察到较低数目的栖粪杆菌(Faecalibacterium)相关细菌，比如与IBD患者具有一些相同特征(Ghoshal et al.Int JInflam.2012；2012:151085；Spiller RC.Best Practice&Research ClinicalGastroenterology.2004；18:641-661)的交替型肠易激综合症(IBS)((Rajilic-Stojanovic et al.Gastroenterology.2011；141:1792-1801)以及更严重的肠道疾病如结肠直肠癌(CRC)(Balamurugan et al.J Gastroenterol Hepatol.2008；23:1298-1303)。总而言之，这些发现表明，普氏栖粪杆菌数量在几种病理学病症下发生变化。
关注栖粪杆菌属内多样性的研究相对较少。最近的系统发育分析显示，在健康对象的粪便样品中发现了主要的两种不同的普氏栖粪杆菌亲缘组(Lopez-Siles et al.ApplEnviron Microbiol.2012；78:420-428)。更具体地说，Lopez-Siles等人(2012)基于16SrRNA基因序列分析了普氏栖粪杆菌分离株与梭菌群IV的其他成员之间的系统发育关系，并首次定义了普氏栖粪杆菌物种内的两个亲缘组(图1)，这些普氏栖粪杆菌亲缘组包括5个先前报道用于培养的分离株M21/2、ATCC 27766和ATCC 27768(属于PHGI)以及A2-165和L2-6(属于PHGII)的序列。
此外，Jia et al.(FEMS Microbiol Lett.2010；310:138-144)描述了一种用于在单端点PCR中扩增属于普氏栖粪杆菌物种的细菌DNA序列的方法。分别针对普氏栖粪杆菌A2-165和M21/2菌株的核苷酸转移酶基因和丁酰基-CoA转移酶基因序列设计用于扩增的引物(Fp.ID.F2和Fp.ID.R2)，并且PCR产物的产出归类为属于两个不同的亚组，即A2-165亚组和M21/2亚组(参见表1)。因此，用于扩增普氏栖粪杆菌成员的引物不靶向普氏栖粪杆菌16SrRNA基因，并且仅基于两种菌株的序列。此外，通过PCR产物的大小来区分属于每个亚组的成员，并且Jia et al.(2010)中没有公开A2-165和M21/2亚组中的每一个亚组的特异性引物或探针。
目前，IBD的诊断要求全面体检和复查患者病史。包括验血、粪便检查、内镜检查、活检和影像学检查在内的各种检测有助于排除其他原因并确诊(World GastroenterologyOrganisation Global Guidelines,Inflammatory bowel disease:a globalperspective,June 2009)。
准确的IBD诊断对于提供基于证据的正确治疗是至关重要的，因为UC和CD患者中的治疗响应和并发症明显不同(Farmer et al.Am J Gastroenterol 2000；95:3184-3188)。从临床医生的角度来看，这些疾病的准确诊断和分类将对患者辅导、评估疾病预后、监测疾病进展和复发，特别是为每种疾病亚型选择最适当的治疗具有潜在益处。此外，在基因型与表型的关联研究中，CD和UC的疾病进展问题是至关重要的，因为疾病表现和严重程度无疑会随着时间而改变(Satsangi et al.,Gut 2006；55,749-753)。
尽管在过去的二十年，在IBD相关分子和血清学标志物的发现方面取得了重大进展，但仍需要改进的方法来进行准确诊断、分类、研究IBD和IBD表型的进展和/或预后。
发明内容
发明人开发了一种用于对肠道样品中的普氏栖粪杆菌物种亲缘组I成员(PHGI)和/或亲缘组II成员(PHGII)准确定量的新方法。特别地，为了同时定量普氏栖粪杆菌物种亲缘组，开发了多重定量聚合酶链反应(qPCR)，其包括使用发明人设计和优化的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因的独特的物种特异性引物对和靶向普氏栖粪杆菌物种亲缘组的每一个成员的两种水解探针，以在保持特异性的同时具有广泛的覆盖范围。患有肠道疾病(例如，患有IBD、克罗恩病或溃疡性结肠炎)的患者的肠道微生物群组成中存在个体间差异，并且一些普氏栖粪杆菌菌株可能不表现在给定个体的肠道细菌种群中。因此，本发明的引物和探针的广泛覆盖范围提供了对普氏栖粪杆菌亲缘组的更准确定量。
为了设计物种特异性引物和亲缘组特异性探针，从GenBank中获得来自普氏栖粪杆菌16S rRNA基因的33个序列，并进行比对(参见表14，其中这些序列(粗体)分别标记为*、1和2)。根据所产生的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因和每个亲缘组的共有序列，通过人工设计和优化引物和水解探针。因此，与Jia et al.(2010)(其中仅基于普氏栖粪杆菌A2-165和M21/2菌株的核苷酸转移酶基因和丁酰基-CoA转移酶基因序列来设计引物)相比，本发明的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因的物种特异性引物设计基于33个已知普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列的比对。
此外，首次描述了普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和亲缘组II成员(PHGII)的特异性探针。对于PHGI探针的设计，使用5个已知的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列作为起始点，并且对于PHGII探针的设计，使用13个已知的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列作为起始点(分别参见下面的表3和5)。根据Lopez-Siles et al.(2012)对已知序列进行亲缘组分类。
对生成的物种特异性引物和亲缘组特异性探针进行计算机模拟和体内测试，从而确保普氏栖粪杆菌16S rRNA基因的广泛覆盖范围和特异性(包含性/排他性测试)。发明人展示出PHGI探针(SEQ ID NO：3)与超过1000个16S rRNA基因序列(即表3和4中列举的1196个序列)特异性杂交。因此，本申请所用的术语普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)包括16SrRNA基因与PHGI探针(SEQ ID NO：3)特异性杂交的那些细菌菌株。类似地，发明人展示出PHGII探针(SEQ ID NO：4)与超过2000个16S rRNA基因序列(即表5和6中列举的2244个序列)特异性杂交。因此，本申请所用的术语普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)成员包括16SrRNA基因与PHGII探针(SEQ ID NO：4)特异性杂交的那些细菌菌株。
使用新开发的PHGI和PHGII成员的定量方法，发明人测定了健康对象与患有几种肠道疾病的患者之间粘膜相关和粪便相关的普氏栖粪杆菌亲缘组的变化，以便测定普氏栖粪杆菌失衡是否包括全部群体或特异影响特定的亲缘组。
此外，测定了普氏栖粪杆菌亲缘组单独、组合或与其他生物标志物(例如普氏栖粪杆菌和大肠杆菌)组合，作为用于检测肠道疾病(包括筛查诊断、鉴别诊断(例如IBD表型的鉴别诊断)、测定疾病活动和监测疾病活动或进展)的生物标志物进行定量的有用性。以及，普氏栖粪杆菌亲缘组作为用于预测肠道疾病，特别是克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗性治疗效果的生物标志物的有用性。
因此，本发明提供了用于定量PHGI和/或PHGII成员的新方法及其作为肠道疾病，特别是克罗恩病和/或溃疡性结肠炎的新生物标志物的用途。
因此，根据本发明的特定发现，提供：
本发明的第一方面涉及一种用于对对象肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度的进行体外测定的方法；其中PHGI丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：3的引物和/或探针或与其具有至少75％一致性的序列；并且其中PHGII丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：4的引物和/或探针或与其具有至少75％一致性的序列。
在第二方面，本发明涉及一种用于获得可用于检测人类对象肠道疾病和/或预测药物在人类对象肠道疾病的治疗性治疗中的功效的信息的方法，包括根据本发明的方法测定PHGI和/或PHGII的丰度。
第三方面，本发明涉及一种用于检测人类对象肠道疾病的方法，其包括以下步骤：
a.根据第一方面所述的方法测定所述对象肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；以及
b.将对象样品中的可选地上述任一项PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合，和/或，可选地，上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合与参考样品的对应值进行比较，
其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。
另一方面，本发明涉及人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合作为用于检测肠道疾病和/或用于预测药物对肠道疾病的治疗的疗效的生物标志物的用途。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括：
a.用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)的丰度的试剂，由具有序列SEQ IDNO：3或与其具有至少75％一致性的序列的引物和/或探针组成；和/或
b.用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度的试剂，由具有序列SEQID NO：4或与与其具有至少75％一致性的序列的引物和/或探针组成；和
c.可选地，使用所述试剂来测定来自人肠道样品的PHGI和/或PHGII丰度的说明书。
本发明的另一方面涉及选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的核酸序列，或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列。
本发明的又一方面涉及一种用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较一种或多种所述目标微生物的对象样品丰度和/或其数学组合与要区分IBD表型的参考样品的对应值，以确定所述对象患有的IBD表型；其中位值具有与所述IBD表型之一明显相似的值的对象样品将指示所述对象患有所述IBD表型；并且
其中所述IBD表型至少由两个，优选三个选自以下的参数的组合来定义：
-疾病部位；
-IBD类型；和
-诊断年龄，
可选地，包括使用另外的生物标志物来定义所述IBD表型。
本发明的另一方面涉及一种用于在患有结肠受累IBD的人类对象中诊断C-CD的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较一种或多种所述目标微生物的对象样品丰度和/或其数学组合与参考样品的对应值；其中所述对象样品值相对于所述参考样本的显著偏差指示C-CD。
此外，本发明的另一方面涉及一种用于在患有I-CD或C-CD的人类对象中诊断IC-CD的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较一种或多种所述目标微生物的对象样品丰度和/或其数学组合与大约诊断为I-CD或C-CD的所述对象的参考样品的对应值；其中所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示IC-CD。
本发明的另一方面涉及一种炎症性肠病(IBD)的预后的方法，其包括根据用于本发明任何上述方面的鉴别诊断的方法确定IBD表型并根据确定的IBD表型建立预后。
本发明的另一个附加的方面涉及人类对象的肠道样品中测定的普氏栖粪杆菌成员(总FP)丰度、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合作为用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的生物标志物的用途。
根据上述任一方面的方法，本发明的又一附加的方面涉及一种用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的试剂盒，其包含：
-用于测定选自普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的目标微生物的丰度的试剂；以及
-使用所述试剂来测定来自人肠道样品的所述目标微生物的丰度水平的说明书。
附图说明
图1.普氏栖粪杆菌(黑色)、普氏栖粪杆菌亲缘组I(灰色)和普氏栖粪杆菌亲缘组II(白色)的感染率的图示。对象按疾病(左)和IBD部位(右)分类。使用以下缩写：H，对照对象；CRC，结直肠癌；IBS，肠易激综合症；UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病；E1，直肠炎；E2，左侧结肠炎；E3，全结肠炎；C-CD，结肠CD；IC-CD，回结肠CD；I-CD，回肠CD；和IBD，炎症性肠病。柱中的数字表示用以计算感染率的所分析的患者(活检)的数量。分别计算每个图的统计数据。每个图中的同类亚组(P>0.05)以柱上方的相同符号表示，而感染率存在统计学差异的患者组(P<0.05)不共享任何上标。
图2.按疾病分类(A)和按IBD亚型分类(B)的各组患者的普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I和普氏栖粪杆菌亲缘组II的感染率的图示。A)和B)中都已经示出了沿着肠道的感染率数值(从内环向外环-回肠、结肠和直肠)以及所有样品合并的相应感染率(外环)。使用以下缩写：H，对照对象；CRC，结直肠癌；IBS，肠易激综合症；UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病；E1，溃疡性直肠炎；E2，左侧溃疡性结肠炎；E3，溃疡性全结肠炎；C-CD，结肠CD；IC-CD，回结肠CD；和I-CD，回肠CD。扇区中的数字表示所分析的活检数量。*在IBS患者的平均分析中包括了部位不确定的样品。
图3.通过接受者操作特征分析(ROC曲线)获得的曲线下面积(AUC)测定的粘膜相关的普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I和普氏栖粪杆菌亲缘组II丰度，用作生物标志物以区分不同的肠道病症并(通过部位)确定IBD亚型的适合性的热图图示。如果AUC为0.6至0.75(浅灰色)，则认为测试是合适的辨别器，如果AUC为0.75至0.9(深灰色)时，则认为测试具有高辨别性，并且如果AUC为0.9至1(黑色)，则认为测试是优异的辨别器。使用以下缩写：H，对照；IBD，炎症性肠病；IBS，肠易激综合症；UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病；CRC，结直肠癌；I-CD，回肠CD；IC-CD，回结肠CD；C-CD，结肠CD；E1，溃疡性直肠炎；E2，远端UC；和E3，广泛性UC或溃疡性全结肠炎。
图4.用于比较粘膜相关的普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)丰度的群组比较的接受者操作特征(ROC)曲线，其中PHGI显示为存在和不存在肠道疾病或疾病亚型的最佳辨别器。A)H vs IBS+IBD+CRC；B)H vs IBD；C)H vsCD和D)H vs I-CD。Y轴表示灵敏度，X轴表示特异性。使用以下缩写：H，对照；IBD，炎症性肠病；IBS，肠易激综合症；CD，克罗恩病；CRC，结直肠癌；和I-CD，回肠CD。
图5.用于比较所选择的组以进行感兴趣的临床鉴别诊断的粘膜相关普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)丰度的接受者操作特征(ROC)曲线。A)UC-E3 vs C-CD；B)I-CD vs IC-CD；和C)IC-CD vs C-CD。Y轴代表灵敏度，X轴代表特异性。使用以下缩写：I-CD，回肠CD；IC-CD，回结肠CD；C-CD，结肠CD；和E3，广泛性UC或溃疡性全结肠炎。
图6.粪便中的普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I和普氏栖粪杆菌亲缘组II丰度用作生物标志物以通过接受者操作特征分析(ROC曲线)获得的曲线下面积(AUC)来区分不同的IBD诊断并(通过部位)确定IBD亚型的适合性的热图图示。如果AUC为0.6至0.75(浅灰色)，则认为测试是合适的辨别器，如果AUC为0.75至0.9(深灰色)时，则认为测试具有高辨别性，并且如果AUC为0.9至1(黑色)，则认为测试是优异的辨别器。使用以下缩写：H，对照；IBD，炎症性肠病；IBS，肠易激综合症；UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病；CRC，结直肠癌；I-CD，回肠CD；IC-CD，回结肠CD；C-CD，结肠CD；E1，溃疡性直肠炎；E2，远端UC；和E3，广泛性UC或溃疡性全结肠炎。
图7.用于比较所选择的组的IBD疾病和疾病亚型的粪便普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)丰度的接受者操作特征(ROC)曲线。A)H vs IBD；C)H vs CD和D)H vs I-CD。Y轴表示灵敏度，X轴表示特异性。使用以下缩写：H，对照；IBD，炎症性肠病；IBS，肠易激综合症；CD，克罗恩病；CRC，结直肠癌；和I-CD，回肠CD。
图8.用于比较所选择的组以进行感兴趣的临床鉴别诊断的普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)丰度的接受者操作特征(ROC)曲线。A)IC-CD vs I-CD；B)IC-CD vs C-CD；和C)UC-E3vs C-CD。Y轴代表灵敏度，X轴代表特异性。使用以下缩写：I-CD，回肠CD；IC-CD，回结肠CD；C-CD，结肠CD；和E3，广泛性UC或溃疡性全结肠炎。
图9.表示健康(H)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者的粪便总普氏栖粪杆菌、亲缘组I(PHGI和PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度(以Ct表示)的图。
图10.通过生物标志物比率表示细菌丰度的图表。
图11.表示健康(H)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者粪便中总普氏栖粪杆菌、亲缘组(PHGI和PHGII)和大肠杆菌(EC)的ROC曲线分析的图。
图12.CD患者的结肠、回结肠和回肠部位样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)和亲缘组II(PHGII)丰度。
图13.CD患者的结肠、回结肠和回肠部位样品中FT/PHGI和FT/PHGII丰度的比率。
图14.表示克罗恩病(CD)患者回肠部位中的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)和亲缘组(PHGI和PHGII)以及大肠杆菌(EC)的ROC曲线分析的图。
图15.表示克罗恩病(CD)患者的回结肠部位中的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)和亲缘组I(PHGI)的ROC曲线分析的图。
图16.表示克罗恩病(CD)患者结肠部位粪便总普氏栖粪杆菌(FT)和亲缘组(PHGI和PHGII)的ROC曲线分析的图。
图17.表示用以辨别UC患者的细菌标记和比率的ROC曲线分析的图。
图18.表示克罗恩病(CD)患者中结肠部位的细菌标志物和比率的ROC曲线分析的图。
图19.在不同范围的钙卫蛋白之间的CD和UC患者的总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHI)和亲缘组II(PHII)。
图20.在钙卫蛋白为250μg/g以上和以下的CD和UC患者的FT/PHI,PHI/PHII,PHI/EC和PHII/EC比值的图。
图21.钙卫蛋白值为250μg/g以上的CD患者的ROC曲线分析图。
图22.钙卫蛋白值为250μg/g以上的UC患者的ROC曲线分析图。
图23.响应者和无响应者CD和UC患者中总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHI)、亲缘组II(PHII)和大肠杆菌的丰度。
图24.再分类为响应者和无响应者的CD和UC患者的FT/EC、FT/PHI、FT/PHII、PHI/PHII、PHI/EC和PHII/EC比率。
具体实施方式
定义
本申请所用的术语“感染率”是指在所研究的种群内发生疾病的病例数量的度量，即所分析的总生物样品或个体中的目标微生物为阳性的生物样品或个体的百分比。因此，由所研究的每个样品或个体内所述目标微生物的定性测定(存在/不存在)来计算感染率。
本申请所用的术语“丰度”是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。一般通过分子方法，典型地通过例如荧光原位杂交(FISH)、定量聚合酶链反应(qPCR)或PCR/焦磷酸测序测定所述目标微生物的16S rRNA基因拷贝数，进行细菌定量。生物样品内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对定量”通常是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16S rRNA基因，比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16S rRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16S rRNA基因拷贝归一化而测定的总细菌。“绝对定量”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子的确切数目。
术语“定量水平”可以是浓度(每单位体积的DNA量)、每细胞数量的DNA量或基因拷贝数、循环阈值(Ct值)或其任何数学变换，如基因拷贝数的log10。
本申请所用的表述“作为生物标志物的有用性”是指分子标志物识别感兴趣的目标条件的有效程度，换句话说，所述参数允许辨别属于不同种群组的对象的有效程度，例如疾病与非疾病组或不同疾病表型。这被称为测试的“有效性”或“性能”。
有效性研究解决的是关于识别目标病症的能力的建议(指数)测试和参考标准之间的一致性(参见Florkowski M.C.,Clin Biochem Rev.2008,29(Suppl 1):S83–S87)。灵敏度、特异性、准确度、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值和阴性预测值是可以定义来评估测试性能的统计值。下面的表1中提供了首字母缩略词的定义和更多细节。
表1.用于定义测试的有效性的参数的公式和首字母缩略词定义，FlorkowskiM.C.,Clin Biochem Rev.2008,29(Suppl 1):S83–S87。
本申请所用的术语“灵敏度”是指有目标病症(参考标准阳性)并给出阳性测试结果的对象的比例(TP/(TP+FN))。“灵敏度”显示了该测试在检测疾病上的有效程度。灵敏度(“sens”)的范围可以为0(0％)<sens<1(100％)，理想地，假阴性的数目等于零或接近等于零，灵敏度等于1(100％)或接近等于1(100％)。
本申请所用的术语“特异性”是指在没有目标病症(参考标准阴性)并给出阴性测试结果的对象的比例(TN/(TN+FP))。“特异性”显示了测试在识别正常(阴性)病症上的有效程度。特异性(“spec”)的范围可以为0(0％)<spec<1(100％)，理想地，假阴性的数目等于零或接近等于零，特异性等于1(100％)或接近等于1100％)。
本申请所用的术语“准确度”是指群体中结果为真，无论是真阳性还是真阴性的比例。“准确度”测量病症筛查测试的准确性程度，即测定和排除给定病症的准确程度(TN+TP)/(TN+TP+FN+FP)。准确度(“acc”)的范围可以为0(0％)<acc<1(100％)，理想地，假阳性的数目等于零或接近等于零，准确度等于1(100％)或接近等于1(100％)。
本申请所用的术语“接受者操作特性曲线(ROC)曲线”是指展示二元分类器系统的性能随着其辨别阈值的变化的图形曲线。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率对假阳性率的曲线来创建该曲线。真阳性率也被称为灵敏度。假阳性率计算为1-特异性。因此，ROC曲线是一系列截断值范围内的真阳性率对假阳性率(灵敏度vs(1-特异性))的图形显示以及选择最佳截断值进行临床使用的方式。将准确度表示为ROC曲线下面积(AUC)，为比较测试性能提供了有用的参数。接近1的AUC表示该测试高度灵敏并且具有高度特异性，而AUC接近0.5则表明该测试既不灵敏也不具有特异性。一般地，如果AUC为0.6至0.75，则认为测试是合适的辨别器，如果AUC为0.75至0.9，则认为测试具有高辨别能力，并且如果AUC为0.9至1，则测试是优异的辨别器。更多的细节参见例如Zweig MH and Campbell G,ClinicalChemistry 1993；39:561-577或Greiner et al.Preventive Veterinary Medicine 2000；45:23-41。
当涉及测试样品与对照样品或参考样品之间的差异时，术语“显著的”或“统计学显著的”涉及在使用适当的统计分析时，各组相同的概率小于5％(例如p<0.05)的情况。。换句话说，在完全随机基础上获得相同结果的概率在100次尝试中少于5次。本领域技术人员知道如何选择适当的统计分析。典型地，基于所研究的变量是否具有正态分布(例如通过用Kolmogorov-Smirnov检验)和是否存在同方差性(例如用Levene检验)来确定适当的统计分析。优选地，在存在正态分布和同方差性的情况下，使用参数模型比如t检验或ANOVA检验；并且在这两个要求中的至少一个要求未达到的情况下，通常使用非参数模型，比如Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验。
本申请所用的术语“炎症性肠病(IBD)”是指一组慢性特发性炎症性肠道病症。这个术语涵盖的两个主要病种为克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，两者既有重叠的也有不同的临床和病理学特征。IBD的诊断要求全面体检和回顾患者病史。包括验血、粪便检查、内镜检查、活检和影像学检查在内的各种检测有助于排除其他原因并确诊(WorldGastroenterology Organisation Global Guidelines,Inflammatory bowel disease:aglobal perspective,June 2009；和Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19Suppl A:5-36)。随着对IBD流行病学和遗传学认识的深入，临床医生已经明白UC和CD可能实际上表示若干IBD形式。因此，本申请所用的术语“IBD”包括其表型。
本申请所用的术语“IBD表型”包括如CD、UC、未确定型结肠炎、炎症性肠病类型待定(IBDU)、结肠袋炎、显微镜下结肠炎、憩室炎等疾病或病症(Mowat et al.,Gut 2011,1-37；Geboes et al.,J Clin Pathol 2005；58:1133–1134；Cheifetz A,and Itzkowitz S.,J Clin Gastroenterol.2004May-Jun；38(5 Suppl 1):S44-50)。“IBD表型”还包括IBD疾病或病症中的亚型。例如，CD亚型为由蒙特利尔分类(Montreal classification)定义的那些亚型，其中根据诊断年龄、部位和/或表现来对CD进行分类。UC亚型也可以为蒙特利尔分类所定义的那些亚型，其中根据疾病范围和/或疾病严重程度对UC进行分类(WorldGastroenterology Organisation Global Guidelines,Inflammatory bowel disease:aglobal perspective,June 2009；和Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19Suppl A:5-36)。
本申请所用的术语“未确定型结肠炎(IC)”是指在结肠切除术试样中没有UC或CD特征的慢性IBD病例(Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19Suppl A:5-36；Satsangi et al.,Gut 2006；55,749-753)。
本申请所用的术语“炎症性肠病类型待定(IBDU)”是指那些存在影响结肠而无小肠受累的慢性炎症性肠病的临床和内镜基础证据，并且没有组织学或其他证据来证实CD或UC的病例，其中已排除感染(Satsangi et al.,Gut 2006；55,749-753)。
本申请所用的术语“诊断测试”是指当对象显示疾病的体征或症状时确定疾病存在或不存在的测试。该测试可用于表明或排除疾病或表型。该术语“诊断”可以包括鉴别诊断。
本申请所用的术语“筛查测试”是指鉴定可能患有该疾病的无症状个体并用于疾病的早期检测的测试。该测试可用于怀疑疾病或表型的存在。
本申请所用的用于IBD的术语“用于监测进展的测试”是指确定疾病是否已经扩展至肠道的其他区域的测试，例如监测患者的该疾病是否已经从I-CD(患有回肠部位的CD)进展至IC-CD，其中还怀疑该疾病已经进展至结肠。
本申请所用的术语“治疗的疗效”是指治疗达到期望的或预期的结果的程度，例如药物实现期望效果的能力。
术语“治疗”涵括预防性或治疗性治疗。本申请所用的术语“治疗性治疗”或“治疗”是指使身体从病理状态或疾病恢复至其正常健康状态。本申请所用的术语“预防性治疗”是指预防病理状态。
本申请所用的术语“探针”是指长度为10至285个碱基对的合成的或生物学上产生的核酸，其含有允许在预定条件下与目标核酸序列特异性优先杂交的特异性核苷酸序列，并且可选地含有用于检测或提高试验性能的部分。，通常需要最少10个核苷酸以在统计学上获得特异性并形成稳定的杂交产物，并且最多285个核苷酸通常代表可以容易调节反应参数以测定错配序列和优先杂交的长度上限。探针可以可选地含有某些成分，这些成分在某些试验条件下有助于该探针适当起作用或起到最佳作用。例如，可以修饰探针以提高其对核酸酶降解的抗性(例如，通过封端)，携带检测配体(例如荧光素)或便于该探针在固体支持物上进行捕获(例如聚脱氧腺苷“尾巴”)。
本申请所用的术语“引物”是指可用于扩增方法(例如聚合酶链反应(“PCR”))以扩增核苷酸序列的寡核苷酸。引物基于特定目标序列的多核苷酸序列(例如一个特异性16SrDNA序列)来设计。引物和探针的设计和验证是本领域公知。实时定量PCR方法参见例如Rodriguez A et al.(Methods Mol Biol.,2015,1275:31-56)。
本申请所用的术语“特异性”意指核苷酸序列将与预定的目标序列杂交/扩增预定的目标序列杂交，并且在试验条件(通常使用严格条件)下不会实质性地与非目标序列杂交/扩增非目标序列杂交。
本申请所用的术语“杂交”是指这样的方法：通过该方法，在预定的反应条件下，使两条部分或完全互补的核酸链以反向平行方式聚合而形成具有特异性和稳定性的双链核酸，其遵循与核酸碱基可以彼此配对的明确规则。
术语“实质性杂交”意指观察到的杂交量将使得观察该结果的人认为，所述结果相对于阳性和阴性对照中的杂交数据结果是阳性的。被认为是“背景噪音”的数据不是实质性的杂交。
术语“严格的杂交条件”意指约35℃至65℃且约0.9摩尔的NaCl盐溶液。严格性还可以由如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型、存在的变性剂的类型和浓度、以及杂交温度这些反应参数来控制。一般地，随着杂交条件变得更加严格，如果要形成稳定的杂交物，则优选较长的探针。一般说来，杂交发生的条件的严格性将决定要使用的优选探针的某些特征。
本申请所用的术语“一致性”分别指两条多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应关系。两条或多条序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定其“百分比一致性”来进行比较。两条序列(无论是核酸或氨基酸序列)的“百分比一致性”为两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度并乘以100。用于计算序列之间的百分比一致性或相似性的合适程序(比如NCBI BLAST程序)在本领域中是众所周知的，其与例如默认参数一起使用(http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)。
术语“试剂盒”或“测试试剂盒”是指分析所需的试剂和佐剂的组合。虽然测试试剂盒在大多数情况下由若干单元组成，但也可以使用一体式分析元件，该一体式分析元件也必须视为测试试剂盒。
用于测定普氏栖粪杆菌PHGI和/或PHGII成员丰度的方法
在第一方面，本发明涉及用于来自对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度的体外测定的方法；其中PHGI丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列的引物和/或探针；并且其中PHGII丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列的引物和/或探针。
栖粪杆菌是Duncan等人(Duncan et al.,Int J Syst Evol Microbiol.2002；52,2141-2146)建立的新属，Duncan等人描述了：栖粪杆菌(Fae.ca.li.bac.te《ri.um.L.adj.faecalis pertaining to feces；Gr.dim.n.bakterion a small rod；N.L.neut.n.Faecalibacterium rod from feces,因为这种细菌大量存在于其推定栖息地结肠内的粪便中)。革兰氏阴性，不形成芽孢且严格厌氧。非该运动型生物体产生丁酸盐、d-乳酸和甲酸盐，并利用醋酸盐。基因组DNA GC含量为47±57mol％(热变性测定)。该模式菌株为普氏栖粪杆菌ATCC 27768T(NCIMB 13872T)，其特征被Cato(1974)等人所报道。然而，最近十年来，在该物种上进行的大多数研究基于同样由Duncan等人描述的菌株A2-165(DSM17677)。(Duncan et al.,Int J Syst Evol Microbiol.2002；52,2141-2146)。
以前已经描述了普氏栖粪杆菌的两个亲缘组(Lopez-Siles et al.(ApplEnviron Microbiol.2012；78:420-428)。该研究分析了基于16S rRNA基因序列的普氏栖粪杆菌分离株与梭菌类群IV的其他成员系统发育关系，并首次定义了普氏栖粪杆菌种内的两个亲缘组(图1)，特别地该研究定义了瘤胃球菌科家族内具有大于97％序列一致性的两个分支。这包括先前报道的分离株M21/2、ATCC 27766和ATCC 27768(属于PHGI)以及A2-165和L2-6(属于PHGII)的五条序列。
为了同时定量普氏栖粪杆菌亲缘组，开发了qPCR试验，该qPCR试验包括使用发明人设计并优化的独特的用于普氏栖粪杆菌的16S rRNA基因的物种特异性引物对和靶向每个普氏栖粪杆菌亲缘组的两种水解探针。该研究中使用的寡核苷酸显示在表15中，参见实施例。用于定量普氏栖粪杆菌亲缘组的引物和探针是最新设计的，而用总普氏栖粪杆菌的那些引物和探针先前已在Lopez-Siles等人的International Journal of MedicalMicrobiology 2014,304:464-475中公开。
表15中列举的寡核苷酸在整个说明书中称为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16，如下面的表2所示：
表2.普氏栖粪杆菌及其亲缘组、总细菌、大肠杆菌和内部扩增对照(IAC)的寡核苷酸。
SEQ ID NO:1(Fpra 136F) CTCAAAGAGGGGGACAACAGTT
SEQ ID NO:2(Fpra 232R) GCCATCTCAAAGCGGATTG
SEQ ID NO:3(PHG1 180PR oligont) TAAGCCCACGACCCGGCATCG
SEQ ID NO:4(PHG2 180PR oligont) TAAGCCCACRGCTCGGCATC
SEQ ID NO:5(Fpra 428 F) TGTAAACTCCTGTTGTTGAGGAAGATAA
SEQ ID NO:6(Fpra 583 R) GCGCTCCCTTTACACCCA
SEQ ID NO:7(Fpra 493 PR oligont) CAAGGAAGTGACGGCTAACTACGTGCCAG
SEQ ID NO:8(F_Bact 1369) CGGTGAATACGTTCCCGG
SEQ ID NO:9(R_Prok_1492) TACGGCTACCTTGTTACGACTT
SEQ ID NO:10(P_TM_1389F oligont) CTTGTACACACCGCCCGTC
SEQ ID NO:11(IAC F) TACGGATGAGGAGGACAAAGGA
SEQ ID NO:12(IAC R) CACTTCGCTCTGATCCATTGG
SEQ ID NO:13(IAC PR OLIGONT) CGCCGCTATGGGCATCGCA
SEQ ID NO:14(E.coli 395 F) CATGCCGCGTGTATGAAGAA
SEQ ID NO:15(E.coli 490 R) CGGGTAACGTCAATGAGCAAA
SEQ ID NO:16(E.coli 437 PR) TATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAA
设计
从GenBank中获得来自普氏栖粪杆菌和密切相关的瘤胃球菌科的16S rRNA基因的序列(表14，参见实施例)并使用Clustal W软件进行比对以得到普氏栖粪杆菌16S rRNA基因、PHGI 16S rRNA基因和PHGII 16S rRNA基因，各自的共有序列。根据这些共有序列手动设计引物和水解探针并进行优化。计算机模拟验证
使用TestPrimeTM通过计算机模拟，相对于SILVA数据库中的序列(the SILVAProbe Match and Evaluation Tool-TestProbe 3.0,http://www.arb-silva.de/search/testprobe/)测定覆盖范围。TestPrimeTM允许通过在SILVA数据库上运行计算机模拟PCR(insilico PCR)来评估引物对的性能。根据PCR的结果，TestPrime计算SILVA提供的所有分类法中的每个分类群的覆盖范围。
SILVA是包含通过不同的研究以分子方法获得的所有栖粪杆菌16S rRNA基因序列的数据库。测试了所设计的引物并且该引物靶向数据集中74.85％的普氏栖粪杆菌序列的16S rRNA基因。
因此，在本发明的用于普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度的体外测定的方法的具体实施例中，所述引物能够扩增至少60％、至少65％、至少70％，优选约75％的普氏栖粪杆菌的已知的16S rRNA基因。在具体的实施例中，普氏栖粪杆菌的已知的16S rRNA基因是在提交本申请时包含在SILVA数据库中的那些基因。
由于SILVA数据库仅包含来自16S rRNA基因的序列，但可能存在可与引物匹配并导致假阳性结果的细菌物种基因组的其他部分，所述引物特异性通过使用核苷酸BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome,NCBI BLAST：更好的网页界面Johnson M etal.Nucleic Acids Res.2008,1；36(Web Server issue):W5-9.)，将搜索限制为“bacteriaNOT uncultured”。获得的结果确认了对栖粪杆菌的特异性。
体外验证
此外，进行了体外包容性/排他性测试。引物显示能够特异性扩增可用于普氏栖粪杆菌的9个分离株的16S rRNA基因，并且探针对每个亲缘组都是特异性的。此外，在没有目标物种DNA(排他性测试)和特异性确认的情况下进行相同的测试(表16，参见实施例)。
普氏栖粪杆菌亲缘组I成员是16S rRNA基因与亲缘组I探针(SEQ ID NO：3)匹配的那些细菌序列，这包括表3所示的用于探针设计的5条序列，和在SILVA数据库中匹配的1191条序列，该1191条序列的登录号提供于表4中(应理解，表3中列出的序列也在SILVA数据库中进行了匹配，但在此未重复)。因此，所示的亲缘组I探针(SEQ ID NO：3)与总共1196个16SrRNA基因序列特异性杂交。
表3.用作PHGI特异性探针设计基础的16S rRNA基因细菌序列的登录号、系统发育学、生物名称和长度(bp)。
表4.默认条件下SILVA数据库中与PHGI特异性探针特异性杂交的1191条序列的登录号。
普氏栖粪杆菌亲缘组II成员是具有与亲缘组II探针(SEQ ID NO：4)匹配的16SrRNA基因的细菌序列，这包括表5所示的用于探针设计的13条序列和在SILVA数据库中匹配的2231条序列，该2231条序列的登录号提供于表6中(应理解，表5中列出的序列也在SILVA数据库中进行Lee匹配，但在此未重复)。因此，所示的亲缘组II探针(SEQ ID NO：4)与总共2244个16S rRNA基因序列特异性杂交。
表5.用作PHGII特异性探针设计基础的16S rRNA基因细菌序列的登录号、系统发育学、生物名称和长度(bp)。
表6.默认条件下SILVA数据库中与PHGII特异性探针特异性杂交的2231条序列的登录号。
用于获得有用信息的方法
在第二方面，本发明涉及一种用于获得有用信息的方法，所述信息用于检测人类对象中的肠道疾病和/或预测药物在人类对象肠道疾病的治疗性治疗中的功效，该方法包括根据第一方面的方法测定PHGI和/或PHGII的丰度；其中优选所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)。
在具体的实施例中，本发明涉及一种用于从人类对象肠道样品获得有用信息的方法，该方法包括以下步骤：
a.测定来自所述对象的肠道样品中普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)的丰度；和
b.可选地，测定来自所述对象的肠道样品中普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度。
另外的实施例涉及用于从人类对象的肠道样品获得有用信息的方法，该方法包括测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)的丰度。进一步实施例涉及用于从人类对象的肠道样品获得有用信息的方法，该方法包括测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和PHGII的丰度。
所述信息可用于，通过将对象样品中的PHGI丰度和/或PHGII丰度和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，与参考样品中的具有相应值进行比较，从而可能用于检测所述人类对象肠道疾病，其中所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。定量PHGI和/或PHGII丰度的这种和其他用途如本申请所述。
用于检测肠道疾病的方法
在第三方面，本发明涉及一种用于检测人类对象肠道疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a.根据第一方面所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；以及
b.将对象样品中的、、、PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合，和/或，可选地，上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，与参考样品的对应值进行比较，
其中所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。；
其中优选地，所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)；并且其中所述参考样品优选健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。
优选地，本发明涉及一种用于检测人类对象肠道疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a.测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)的丰度；
b.可选地，测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
c.将对象样品的PHGI丰度、可选地PHGII丰度、和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，与参考样品的对应值进行比较；
其中，所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。
在特定实施例中，其涉及一种用于检测人类对象肠道疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a.测定来自所述对象的肠道样品中普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)的丰度；和
b.比较对象样品丰度水平与参考样品的丰度水平，
其中所述对象样品的丰度水平相对于所述参考样品的丰度水平显著降低指示肠道疾病。
在另一特定实施例中，其涉及一种用于检测人类对象肠道疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a.测定来自所述对象肠道样品的PHGI的丰度；
b.测定来自所述对象肠道样品的PHGII的丰度；
c.比较所述对象样品的所述PHGI丰度、PHGII丰度和/或其数学组合与参考样品的对应值，
其中所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。
在本发明的一个特定实施例中，测定PHGI丰度和PHGII丰度。在另外的特定实施例中，测定PHGI丰度和PHGII丰度，以及所述序列之间的数学组合或关系(例如，比率、多元分析等)。在进一步的实施例中，测定所述PHGI丰度和/或PHGII丰度，以及上述(例如，比率、多元分析等)任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度之间的数学组合或关系
可以通过将第一序列的定量水平除以第二序列的定量水平来获得PHGI、PHGII、FT和/或EC丰度之间的比率。例如，通过将PHGII 16S rRNA基因序列定量水平除以PHGI 16SrRNA基因序列定量水平来获得PHGII丰度/PHGI丰度的比率。
也可以通过从第一序列的定量水平减去第二序列的定量水平来获得PHGI、PHGII、FT和/或EC丰度之间的比率。例如，通过从PHGII 16S rRNA基因序列定量水平中减去PHGI16S rRNA基因序列定量水平来获得PHGII丰度/PHGI丰度的比率。
本发明的优选比率为PHGI丰度/PHGII丰度(PHGI/PHGII)、PHGI丰度/EC丰度(PHGI/EC)、PHGII丰度/EC丰度(PHGII/EC)、FT丰度/PHGI丰度(FT/PHGI)、和FT丰度/PHGII丰度(FT/PHGII)，反之亦然。特别优选的比率为PHGI/EC和PHGII/EC。
优选地，通过qPCR进行定量(后述)，将定量化水平表示为循环阈值(Ct值)。更优选地，通过相减来计算比率。
在一个特定实施例中，测定所述对象样品中PHGII丰度与PHGI丰度(PHGII/PHGI比率)之间的比率，并比较所述对象样品的PHGII/PHGI比率与参考样品中的PHGII/PHGI比率，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。
本领域的普通技术人员知道用于测定普氏栖粪杆菌PHGI和/或PHGII丰度的几种方法和设备。这通常通过细菌基因定量进行。术语“定量”是指测定样品中特定核酸序列的量的能力。
本领域公知用于测量目标核酸序列的量的分子生物学方法。这些方法包括但不限于端点PCR、竞争性PCR、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、定量PCR(qPCR)、逆转录酶qPCR(RT-qPCR)、PCR-焦磷酸测序、PCR-ELISA、DNA微阵列、原位杂交试验如斑点印迹或荧光原位杂交试验(FISH)、分支DNA(Nolte,Adv.Clin.Chem.1998,33:201-235)以及所述方法的多重版本(参见例如，Andoh et al.,Current Pharmaceutical Design,2009；15,2066-2073)。关于研究肠道微生物群的分子方法的综述同样参见Manichanh等的(Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2012；9,599–608)和Weinstock B.M的(Nature 2012,489,250–256)。多重试验是一种在单次运行/循环试验中同时测量多个分析物的试验，通常为数十个或更多。
优选的引物和/或探针以可预测的方式来进行反应，典型地通过对细菌核酸序列的增量提供直接线性响应。通过制备适当标准并与其比较，可以容易地量化样品中给定核酸序列的量。优选地，所述用于基因定量的所述分子方法选自定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列和PCR-ELISA。
一种特别优选的定量方法为FISH，其将探针杂交与荧光显微镜、共焦激光显微镜或流式细胞术结合以直接定量单个细菌序列。关于FISH方法的综述，参见例如，Harmsen etal.,Appl Environ Microbiol,2002；68 2982-2990,Kalliomaki et al.,JAllergClinImmunol,2001；107 129-134；Tkachuk et al.,Genet.Anal.Tech.Appl.,1991；8:67-74；Trask et al.,Trends Genet.,1991；7(5):149-154；和Weier et al.,ExpertRev.Mol.Diagn.,2002,2(2):109-119；以及专利号为6,174,681的美国专利。
另一种特别优选的定量方法是定量PCR(qPCR)，也称为实时PCR。可以使用不同的仪器，例如Applied Biosystems的ABI Prism 7700 SDS、GeneAmp 5700 SDS、ABI Prism7900 HT SDS；Bio-Rad的iCycler iQ；Cepheid的Smart Cycler；Corbett Research的Rotor-Gene；Roche Molecular Light Biochemicals的LightCycler和Stratagene的Mx4000Multiplex。qPCR过程通过在反应的指数阶段的非常早期测量PCR产物积累，实时准确定量PCR产物，从而减少端点PCR中发生的PCR扩增效率相关定量偏差。本领域公知实时PCR，因此在此不再详细描述。qPCR的技术概述和协议例如可以从上述供应商获得，例如http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html或http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html。关于qPCR方法的综述参见Smith CJ andOsborn AM.,FEMS Microbiol Ecol.,2009；67(1):6-20和Giulietti et al.,Methods2001；25,386–401。在优选实施例中，定量方法为多重qPCR。
若干基因可以用于细菌定量目的。通常，通过PCR扩增16S rRNA基因来定量特定的明显细菌。每种细菌种类的16S rRNA不同。细菌种类很难定义，但通常认为是具有至少97％一致性的16S rRNA基因序列的生物，定义为操作分类单元(OTU)。约1.5千碱基的16S rRNA基因序列具有九个区分细菌分类的短高变区域；群落调查以一个或多个所述区域中的序列为目标(Weinstock B.M,Nature 2012,489,250–256)。
也可以使用蛋白质编码基因，例如看家基因。Roux等人(FEMS Microbiol Ecol 78(2011)617–628)描述了使用具有可用引物组的五种蛋白质标记基因((rplB、pyrG、fusA、leuS和rpoB)作为生态学研究的分类标记。也已经描述了用于特定的目标细菌定量目的的核苷酸转移酶基因和丁酰基-CoA转移酶基因。
qPCR可使用不同的检测用化学方法。，其均可用于上述qPCR仪器。术语“检测用化学方法”是指报道实时PCR中特定PCR产物的扩增的方法，并且可以包括水解或探针、分子信标、蝎子(scorpions)、杂交探针和DNA结合染料如 Green I。例如Giulietti et al.,Methods 2001；25,386–401中详细描述了这些检测用化学方法。
在一个优选的实施例中，所述探针为双重标记的寡核苷酸，比如水解探针或分子信标。所述寡核苷酸的5'端通常用荧光报告分子标记，而3'端用猝灭剂分子标记。探针的序列对扩增的目标分子中感兴趣的区域有特异性。在更优选的实施例中，所述探针为水解探针，其被设计成序列的长度使5'荧光团和3'猝灭剂足够接近以抑制荧光。
本领域公知用于qPCR探针的若干报告分子和猝灭剂。这些报告分子和猝灭剂可从例如
https://www.eurofinsgenomics.
eu/en/dna-rna-oligonucleotides/optimised-application-oligos/qpcr-probes.aspx:获得。为了说明的目的，下面的表7提供了用于qPCR分析的双重标记探针的非详尽列表。
表7.用于以不同报告子荧光基团-猝灭剂组合进行qPCR分析的双标记探针以及相应的吸收和发射波长。
优选地，通过16S rRNA基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定。
在一个特定实施例中，通过对与SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列特异性杂交的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量，来实施PHGI丰度测定。在可选实施例中，通过对这样的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定：包含SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列或由SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成。
在另一个实施例中，通过对与SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列特异性杂交的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。在可选实施例中，通过对如下普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来测定PHGII丰度：包含SEQ IDNO：4或与其具有至少75％一致性的序列或由SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成。在优选的实施例中，通过对如下普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定：包含SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列，或由SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成；并且通过对如下普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定：包含SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列，或由SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成。
在优选的实施例中，用序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列的至少一种寡核苷酸分子；和/或序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列的寡核苷酸分子进行PHGI 16S rRNA基因定量。优选地，使用序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的寡核苷酸分子。
在进一步优选的实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
优选用序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列和/或序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸分子或与其具有至少75％一致性的序列中的至少一种寡核苷酸分子进行PHGII16S rRNA基因定量。优选地，使用序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的寡核苷酸分子。
在另一个优选的实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
优选地，本申请所述的具有至少75％一致性的所述寡核苷酸序列与相应序列(例如分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、更优选96％、97％、98％、99％或100％的一致性；特别优选具有100％序列一致性的核苷酸分子。此外，具有至少75％一致性的这些寡核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4具有相同的核苷酸数目，可以比其、、更长或更短。
在特别优选的实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量，优选通过qPCR。在进一步优选的实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量，优选通过qPCR。
可以对所述寡核苷酸序列进行修饰。例如，可以修饰探针以改善该探针对核酸酶降解的抗性(例如通过封端)、携带检测配体(例如荧光素)或促进该探针在固体支持物上进行捕获(例如聚脱氧腺苷“尾部”)。
在一个优选的实施例中，所述PHGI特异性探针由SEQ ID NO：3或经修饰的与其具有至少75％一致性的序列组成。优选地，该PHGI特异性探针是如上所述的双重标记探针，更优选为水解探针。在更优选的实施例中，SEQ ID NO：3的5'端用6FAM(6-羧基荧光素)修饰且其3'端用BHQ1(Black Hole Quencher1)修饰，并且经修饰的序列表示为6FAM-TAAGCCCACGACCCGGCATCG-BHQ1。
在另一个优选的实施例中，所述PHGII特异性探针由SEQ ID NO：4或经修饰的与其具有至少75％一致性的序列组成。优选地，该PHGII特异性探针为双重标记探针，更优选为水解探针。在更优选的实施例中，SEQ ID NO：4的5'端用JOE(4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-5(6)-羧基荧光素)并且其3'端用BHQ1(Black Hole Quencher1)修饰，并且经修饰的序列表示为JOE-TAAGCCCACRGCTCGGCATC-BHQ1。
通过本发明的方法进行肠道样品中的PGHI和/或PGHII丰度的体外测定。所述肠道样品可以为肠道活检样品。本领域公知若干种用于获得肠道活检样品的方法，例如，通过内镜检查。在优选的实施例中，所述肠道样品为非侵入性肠道样品。非侵入性肠道样品可以是例如通过非侵入性方法(比如直肠乙状结肠镜检查)获得的活检样品，以及粪便样品。在更优选的实施例中，所述肠道样品为粪便样品。
在本发明的方法中，从肠道样品中提取DNA，优选在基因定量之前。收集样本后，可以立即加工新鲜样品并提取DNA。可选地，为了在提取之前保持DNA的质量，公知有若干种处理，比如冷冻，或与缓冲液或DNA稳定化溶液混合。在DNA提取之前，所述样品也可以进行额外的加工，比如进行一个或多个洗涤循环。
在特定的实施例中，所述肠道样品为活检样品，并且在定量所述细菌序列之前从所述样品中提取DNA。在优选实施例中，所述肠道样品为粪便样品，并且在定量所述细菌序列之前从所述粪便样品中提取DNA。
本领域公知若干种从生物样品提取DNA的方法，所有这些方法依赖于细胞的化学或机械破碎、使用洗涤剂进行裂解、或这些方法的组合(Kennedy A.et al.,PLoS One,2014；9(2):e88982)。例如，可以使用组织试剂盒( Tissue Kit)提取活检样品中的DNA。
例如，从M Corist et al.,Journal of Microbiological Methods,2002；50(2):131-139，Whitney D et al.,Journal of Molecular Diagnostics,American Societyfor Investigative Pathology,2004；6(4):386-395和WO2003/068788知晓用于从粪便样品中提取细菌DNA的方法。优选的方法使用机械破碎(比如高速珠磨抽提)、化学裂解和最终纯化步骤的组合，优选使用硅胶膜柱，比如市售DNA提取试剂盒“ DNAextraction procedure”(Mo-Bio Laboratories Inc.)，用于土壤程序的 SPIN试剂盒(MP biomedicals)和 Soil试剂盒(Macherey-Nagel Gmbh&Co.KG)中所含。来自粪便样品的DNA提取物中的PCR抑制剂如胆红素、胆汁盐和复合碳水化合物的存在，是测定来自粪便的DNA提取物中的DNA生物标志物所面临的困难之一(Fleckna et al.,MolCell Probes,2007；21(4):282-7)。优选的DNA提取方法是使粪便提取物具有少量PCR抑制剂的方法，例如少于5％，优选少于2％，更优选少于1％，甚至更优选少于0.5％，比如少于0.25％、0.1％、0.05％或0.01％。
定量水平可以是绝对的或相对的。通常优选使丰度水平归一化。可以针对样品中的不同测量结果进行归一化，比如通过样品重量、人类细胞定量、总DNA定量、总细菌定量、总普氏栖粪杆菌定量或其他普氏栖粪杆菌亲缘组定量。本领域技术人员公知这些方法。
在特定的实施例中，通过qPCR进行PHGI和/或PHGII丰度水平的定量，并且将定量水平归一化。在优选实施例中，相对于总细菌16S rRNA基因定量进行归一化，例如归一化为中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万个细菌rRNA基因拷贝。已经描述了若干种用于定量总细菌的引物和探针，例如参考Furet J-P,et al.FEMS Microbiology Ecology 2009,68:351-362，Corless et al.,J Clin Microbiol.2000,38(5):1747-52，Suzuki et al.,ApplEnviron Microbiol.2000,66(11):4605-14，Bach et al.,J Microbiol Methods.2002,49(3):235-45，Nadkarni et al.,Microbiology.2002,148(Pt 1):257-66中描述的那些引物和探针。用于总细菌定量的优选引物和探针为Furet J-P,et al.FEMS MicrobiologyEcology.2009；68:351-362并在表15中指定的那些引物和探针，参见实施例。
本发明的方法还可以包括检测和/或定量肠道疾病的一种或多种生物标志物，优选地这些标志物是IBD特异性或特定IBD表型特异性的，更优选地这些标志物是UC或CD特异性的，甚至更优选地这些标志物是CD特异性的。例如Silverberg et al.,Can JGastroenterol.2005,19 Suppl A:5-36和Satsangi et al.,Gut 2006；55,749-753描述了IBD生物标志物及其对分类和诊断的影响。
本申请所用的术语“生物标志物”是指疾病标志物，该疾病标志物典型地为可以容易测量的、存在于身体样品中的物质。所述身体样品可以是例如血液、血浆或粪便样本。典型地，测定的量与潜在的疾病病理生理学(比如存在或不存在特定的IBD疾病或表型)相关，使其对诊断和测量疾病的进展或治疗效果有用。术语“生物标志物”涵盖生物物理学和生物化学测定，包括遗传标志物和血清标志物。
可以使用血清生物标志物，比如抗酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗体(ASCA)、抗中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)、抗OMPC和抗-I2以及抗CBir1鞭毛蛋白抗体。其他作者报道了ASCA、ANCA、抗OmpC和抗-I2的组合可能有助于CD的细分，特别是这些血清标志物与包括需要手术在内的特别复杂和严重的疾病表现相关。也可以使用遗传标志物，比如NOD2/CARD15、HLA、MDR1、DLG5或TLR4基因。
也可以使用微生物群生物标志物。在特定的实施例中，PHGI和/或PHGII丰度与白细胞计数组合使用。先前已经报道，通过监测普氏栖粪杆菌丰度与粪便白细胞计数结合可以区分CD和UC(Swidsinski et al.,Inflamm Bowel Dis.2008；14:147-161)。在特别优选的实施例中，PHGI和/或PHGII丰度与大肠杆菌丰度结合使用。Lopez-Siles等人(International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475)描述了将普氏栖粪杆菌丰度与大肠杆菌丰度组合用作互补性对比指示器。
在一个特定的实施例中，本发明的方法还包括总普氏栖粪杆菌(FT)和/或大肠杆菌(EC)的定量。FT丰度测定可以用具有序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或与其具有至少75％一致性的序列的引物；和具有序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的序列的探针进行。类似地，EC丰度测定可以用具有序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15或与其具有至少75％一致性的序列的引物；和具有序列SEQ ID NO：16或与其具有至少75％一致性的序列的探针进行。
优选地，本申请所述的具有至少75％一致性的所述寡核苷酸序列与相应序列(例如分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和/或SEQID NO：16)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，更优选96％、97％、98％、99％或100％一致性；具有100％序列一致性的核苷酸分子是特别优选的。
在本发明的方法中，所述参考样品可以为个体样品或参考群体的样品集合。通常根据用途选择参考群体提供给本发明的方法，例如为了诊断，所述参考群体通常是健康对象或缓解期患者，而为了测定疾病的活性或进展，参考群体通常是此前时间点(例如，诊断或缓解时)的相同患者。
术语肠道疾病是指影响小肠、结肠和/或直肠的疾病。优选地，所述肠道疾病选自CRC、IBS和IBD。在一个特定的实施例中，所述肠道疾病为CRC。在另一个特定的实施例中，所述肠道疾病为IBS。在一个优选的实施例中，所述肠道疾病为IBD。
本发明的方法可用于肠道疾病的筛查或早期检测、用于肠道疾病的诊断、用于疾病活动的测定、用于监测肠道疾病的进展和/或活动、用于监测肠道疾病的复发、和/或用于监测肠道疾病的手术后复发、和/或用于确对肠道疾病的治疗的疗效。
在优选的实施例中，本发明的方法用于IBD的筛选或早期检测、用于IBD的诊断、用于监测IBD的进展、用于监测IBD的复发、和/或用于监测IBD的术后复发、和/或用于确定对IBD的治疗的疗效。
IBD交替时期是指，患者有出现疾病症状(急性发作)的时期且有无症状且其处于缓解期的其他时期。当患者处于缓解期，然后转变成出现症状时，即为复发。用于检测疾病存在的测试也可能能够检测复发。
可应用于IBD患者的可用治疗之一是肠道受影响区域的手术切除。术语手“术后复发”是指治疗不成功且在一段时间后患者再次患有IBD的那些情况。用于检测疾病存在的测试也可能能够检测术后复发。
在更优选的实施例中，本发明的方法用于筛查和/或诊断肠道疾病，优选IBD。优选地，所述参考样品为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期对象样品。健康对象定义为未患有肠道疾病的对象，优选未患有IBD，更优选未患有CD或UC。所述来自健康患者的样品可以例如从出于不同原因(比如，直肠出血、CRC家族史或腹痛)而进行结肠镜检查的患者获得。在一个优选的实施例中，所述参考样品为处于缓解期的同一对象的样品。
实施例14和15显示了根据本发明所述的用于测定健康消化状态的生物标志物。用于确定健康消化状态的特别优选的生物标志物为PHGI/EC、PHGII/EC、FT/PHGI和FT/PHGII。实施例14显示在来自健康患者的样品中PHGI/EC，PHGII/EC比率降低，而实施例15的ROC曲线分析显示FT/PHGI和FT/PHGII为良好的辨别器。
本领域技术人员知晓，建立正确的诊断能够提供更准确的预后，能够为每种疾病或疾病亚型选择最合适的预防性或治疗性治疗，并且甚至能够预测特定治疗的功效。在特定的实施例中，本发明的方法用于预后目的。在另一个实施例中，本发明的方法用于选择最合适的预防性或治疗性治疗。在另外的实施例中，本发明的方法用于预测给定的预防性或治疗性治疗的功效或有用性。优选地，所述治疗为治疗性治疗。
实施例14和15显示了根据本发明的用于筛查和/或诊断IBD、CD和/或UC的生物标志物。用于筛查和/或诊断IBD的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC。IBD中PHGI和PHGII丰度降低，而IBD中PHGI/EC和PHGII/EC比率提高。IBD可能为UC或CD。在特定的实施例中，所述IBD为UC。用于筛查和/或诊断UC的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC。中PHGI、PHGII丰度在UC中降低，PHGI/EC和PHGII/EC比率在UC中提高，优选PHGI/EC和PHGII/EC。在一个优选的实施例中，所述IBD为CD。用于筛查和/或诊断CD的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC。PHGI、PHGII的丰度在CD中降低，PHGI/EC和PHGII/EC在CD中提高，优选PHGI/EC和PHGII/EC。
通常，通过结肠近端疾病、会阴部疾病、瘘管、组织学肉芽肿以及与粘膜限制性疾病相对的全层厚度区别CD和UC。通常，在CD中，多达50％的患者明显有肉芽肿且25％明显有瘘管。下面来自世界胃肠病组织全球指南(World Gastroenterology OrganisationGlobal Guidelines)(Inflammatory bowel disease:a global perspective,June 2009)的表7提供了关于UC和CD的当前诊断标准的概述：
表8.溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的诊断。
此外，世界胃肠组织全球指南(Inflammatory bowel disease:a globalperspective,June 2009)中的如下表9中提供了区分UC和CD的特征：
表9.溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的主要鉴别诊断。
在另一个实施例中，本发明的用于检测肠道疾病的方法为用于CD和UC之间的鉴别诊断的方法。在实施例14和15中显示了根据本发明的用于CD和UC之间的鉴别诊断的生物标志物。用于CD和UC之间的鉴别诊断的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII，其通过ROC曲线分析和在CD中提高的PHGI/EC和PHGII/EC比率来鉴定。
典型地，使用国际分类法(比如国际工作组在其1991年罗马报告、1998年维也纳报告或2005年蒙特利尔报告中颁布的国际分类法)进行亚型分类。优选地，根据蒙特利尔分类法确定IBD亚型(下面提供了更多关于蒙特利尔分类法的细节)。
在一个优选的实施例中，UC患者根据以下亚型中的结肠直肠炎症程度进行分类：
E1：溃疡性直肠炎：限于直肠受累，
E2：远端结肠炎：限于脾曲以远的结肠直肠部分受累，以及
E3：广泛性UC或全结肠炎：延及脾曲以近受累。
在另一个优选的实施例中，在以下亚型中，根据疾病部位对CD患者进行分类：回肠CD(I-CD)、回结肠CD(IC-CD)和结肠CD(C-CD)。
实施例16中显示了根据本发明的用于检测I-CD、IC-CD和C-CD的生物标志物。用于检测I-CD的特别优选的生物标志物为PHGI/PHGII和FT/PHGII，ROC曲线分析显示PHGI/PHGII和FT/PHGII为良好的辨别器。用于检测IC-CD的优选生物标志物为FT/PHGI，ROC曲线分析显示FT/PHGI为良好的辨别器。优选地，如上文和实施例中所述通过相减计算所述比率。在一个特定的实施例中，测定PHGI丰度，并且对象样品的PHGI丰度水平相对于所述参考样品的PHGI丰度水平的显著降低指示CD，优选回肠受累的CD(CD-CD或I-CD)。
用于检测C-CD的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC，优选PHGI和PHGI/EC，ROC曲线分析显示PHGI和PHGI/EC为良好的辨别器。优选地，如上文所述和实施例中所述通过相减计算所述比率。
在另一个特定的实施例中，测定PHGII/PHGI比率，并且所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示CD，优选结肠受累的CD(C-CD或IC-CD)。
在另外的特定的实施例中，测定PHGI丰度和PHGII丰度，并且PHGII显著降低而PHGI不显著降低指示I-CD。
本发明的方法还可以包括将如本申请所述的PHGI丰度、PHGII丰度和/或另外的生物标志物检测和/或定量结果与肠道疾病(优选IBD)的其它指标结合。
IBD的诊断通常通过临床评估和实验室、内镜、组织学或基于成像的研究的组合来确认。这些临床、实验室、内镜、组织学和基于成像的研究的单独或组合结果可以作为IBD的指标。临床研究通常是内镜、组织病理学和影像学检查，包括超声、磁共振成像、计算机断层扫描、钡餐透视检查和/或同位素标记扫描(Mowat et al.,Gut 2011,1-37)。
实验室研究可以包括全血细胞计数、尿素和电解质、肝功能测试、红细胞沉降率、C反应蛋白、铁蛋白、转铁蛋白饱和度、维生素B12和叶酸。
优选地，所述实验室测试包括粪便测试。常用于IBD诊断的粪便测试是常规粪便检查和培养以除去细菌、病毒或寄生虫病因的腹泻，特别是排除艰难梭菌或巨细胞病毒感染，检验潜血或粪便白细胞、钙卫蛋白、乳铁蛋白和α1-抗胰蛋白酶。
在一个特定的实施例中，本发明的方法与粪便钙卫蛋白测试组合使用。钙卫蛋白是在血浆和粪便中发现的丰富的中性粒细胞蛋白，其在传染性和炎症症状(包括IBD)中明显升高。先前已描述了在IBD中，粪便钙卫蛋白作为肠道炎症的生物标志物的作用，参见例如Konikoff and Denson,Inflamm Bowel Dis.2006；12(6):524-34，或Van Rheenen etal.BMJ 2010；341:c3369。
用于评估疾病活动的指数有若干种，这些指数可以为例如经验证的临床指数：克罗恩病活动指数(CDAI)(Best,W.R.,et al.Gastroenterology,1976.70(3):p.439-44.)、Harvey-Bradshaw(Lancet.1980；315(8167):514)、Mayo(Pineton de Chambrun,G.,L.etal.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010.7(1):p.15-29)、肛周疾病活动指数(PDAI)、瘘管引流评估；生活质量评分：炎症性肠病问卷(IBDQ)；和内镜指数：克罗恩病内镜下严重指数(CDEIS)/克罗恩病内镜下简单评分(SES-CD)、针对手术后复发的Rutgeeerts评分)，参见Sostegni et al.,Aliment Pharmacol Ther.2003；17 Suppl 2:11-7。特别地，对于UC，例如参见True Love and Witts(Journal of Crohn’s and colitis 2008；2:1-23)或Sutherland疾病活动指数(Sutherland et al.Gastroenterology 1987；92:1894–8)；对于CD，参见例如Harvey-Bradshaw简化的克罗恩病活动指数(Harvey-Bradshaw simplifiedCrohn’s disease activity index，Lancet.1980；315(8167):514)。
在另外的方面，本发明涉及一种用于测定疾病活动(即钙卫蛋白水平超过250μg/g)的方法，其中所述方法包括如以上方面所定义的步骤a)和b)，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示活跃的肠道疾病。
实施例18中显示了根据本发明的用于检测IBD、UC或CD的疾病活动的生物标志物。在CD中，用于检测疾病活动的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII和PHGII/EC，ROC曲线显示PHGI为良好的辨别器，在活跃的CD中，PHGII丰度降低而PHGII/EC比率提高。另一方面，在UC中，用于检测疾病活动的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、FT/PHGI和PHGI/PHGII。在活跃的UC中，PHGI丰度降低，ROC曲线显示PHGII为良好的辨别器，FT/PHGI比率降低，PHGI/PHGII比率降低，并且PHGI/EC比率提高。用于CD的PHII和用于UC的PHI似乎是疾病活动(即钙卫蛋白水平超过250μg/g)的理想辨别器。
在相关方面，本发明涉及一种用于监测人类对象中肠道疾病活动的方法，其包括如上述方面所定义的步骤a)和b)，其中所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示活跃的肠道疾病，并且其中所述参考样品优选为(例如，处于诊断或缓解期中)同一对象的先前样品。
对于任何这些方面，所述肠道疾病优选选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)，更优选IBD。在一个特定的实施例中，与FT丰度和/或EC丰度的所述数学组合为选自如下的比率：PHGI丰度/EC丰度、PHGII丰度/EC丰度、FT丰度/PHGI丰度、和FT丰度/PHGII丰度。优选地，通过qPCR进行丰度测定并表示为阈值循环(Ct)值，且通过从第一Ct值减去第二Ct值来获得所述比率。
实施例19中显示了根据本发明的用于监测疾病活动的生物标志物。在UC中，用于监测疾病活动(即测定两个时间点之间炎症活动增加)的特别优选的生物标志物为PHGI，并且FT/PHGI比率降低。
目前可用于IBD管理的治疗有若干种。通常根据疾病的部位、严重程度和活动选择最合适的治疗。目前使用的常见药物是由唾液酸(即美沙拉嗪和柳氮磺胺吡啶)、皮质类固醇(即强的松、甲基强的松龙和布地奈德)、抗生素(即甲硝唑和环丙沙星)、免疫抑制剂(即硫唑嘌呤和巯嘌呤)、抗代谢药和叶酸拮抗剂甲氨蝶呤衍生的抗炎化学物质，以及由抗肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体组成的所谓的“生物类”药物，如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(cetolizumab pegol)、依那西普(etanercept)和戈利木单抗(golimumab)。患有暴发型或瘘管型CD的那些患者以及对前述任何药物无反应的患者(难治病例)也指示肠切除。最近，患有难治性疾病的CD患者的治疗需求的持续未满足，引起了对创新的细胞免疫调节和再生药物(包括自体造血干细胞移植)的兴趣。越来越多的文献支持的新兴概念表明，益生菌或益生素可以通过平衡微生态失调而对IBD产生治疗效果。例如，对动物模型的研究指出，一些肠道微生物群如脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)和普氏栖粪杆菌能够分别产生预防结肠炎或具有抗炎效果的分子，这为未来将肠道微生物群用作这种肠道疾病的治疗剂带来了新曙光。优选的治疗为美沙拉嗪，适中的免疫抑制剂如硫唑嘌呤或甲氨蝶呤，和抗-TNFα试剂，如英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、依那西普和戈利木单抗。
本发明还提供一种用于预测治疗的疗效的方法。一个特定的实施例涉及一种用于预测对患有IBD的人类对象的治疗的疗效的方法，其中所述方法包括：
a.根据第一方面的方法测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
b.比较对象样品的所述PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度与参考样本的对应值，
其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示对处理的响应可能性增加。
在一个相关方面，本发明涉及一种用于将患有IBD的对象分类为对治疗的响应者的体外方法，所述方法包括本发明上述方面的步骤a)和b)，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差，指示对治疗的响应可能性增加，并且其中响应可能性增加的对象分类为响应者。在另外的相关方面，本发明涉及一种选择用于患有IBD的对象的治疗的方法，所述方法包括如上述方面所述的将对象分类为治疗的响应者或无响应者，并且所选择的治疗用于响应者。
所述治疗可以为上述治疗中的任何一种。在一个特定的实施例中，所述治疗使用抗TNFα试剂。优选地，所述参考样品为健康对象样品或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。其他优选的特征和实施例如上面对本发明的其他方面所定义。
实施例20中显示了根据本发明所述的用于测定对TNF-α治疗的响应的生物标志物。用于将对象分类为TNF-α治疗的响应者或无响应者的特别优选的生物标志物为PHGI和PHGII。在实施例20中，观察到PHGI Ct在UC和CD的无响应者中增加(分别为26.80％和53.94％)并且PHGII Ct在UC的无响应者中增加66.82％。
本申请所用的术语“响应者”是指患有IBD的那些对象(例如CD或UC)，该对象表现出炎症减轻，即生物治疗诱导后钙卫蛋白水平下降低于250μg/g。本申请所用的术语“诱导”是指给予不同治疗用量以实现治疗量的时期。
另一方面，该治疗可以基于手术。优选地，该治疗是药物治疗和手术的组合。UC通常是可手术治愈的。然而，手术切除常常不能治愈CD，复发是正常的。IBD的外科干预特别包括以下内容：
·UC：直肠结肠切除术以及回肠造口术，全直肠结肠切除术以及回肠肛管吻合术；
·暴发性结肠炎：选择的外科手术是次全结肠切除术与末端回肠造口术以及创建哈特曼囊袋；
·CD：在疾病的疾病并发症病例中最常进行的手术，一般由保守性切除(例如，潜在的狭窄整形术vs切除手术)组成，以保留肠道长度，以防万一未来需要额外手术；
·选定的远端回肠或近端结肠疾病的患者：选择回肠直肠或回结肠吻合术；
·严重的肛周瘘：可选择转移回肠造口术，一般地，切除症状性肠道瘘管。
本发明还提供一种用于治疗患有肠道疾病的对象的方法，其中所述方法包括如本申请所述的用于检测肠疾病的本发明方法的步骤，并且进一步包括c)向该对象施用治疗。优选地，其中所述治疗为抗TNFα试剂。
本发明还提供一种用于治疗患有肠道疾病的对象的方法，其中所述方法包括本发明的用于将对象分类为响应者或无响应者的方法的步骤，并且还包括c)对作为响应者的对象施用治疗。优选地，其中所述治疗为抗TNFα试剂。
优选地，本发明的方法还包括将所述方法的结果存储在数据载体中。在一个实施例中，所述数据载体为纸张。在优选实施例中，所述数据载体为计算机可读介质。本申请所用的“计算机可读介质”可以为可包括、存储、传送、传播或传输本发明的方法的测定结果的任何仪器。所述介质可以为电子、磁性、光学、电磁、红外或半导体系统(或仪器或设备)或传播介质。
灵敏度、特异性和准确度或其组合是常用于描述测试的有效性和性能的参数。特别地，该参数用于定量该方法的有效程度和多可靠。
优选地，本发明的方法具有70％至90％、75％至95％、80％至95％、85％至100％、或90％至100％的灵敏度。更优选地，本发明的方法具有至少85％的灵敏度值，比如约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％或100％。
优选地，本发明的方法具有70％至90％、75％至95％、80％至95％、85％至100％、或90％至100％的特异性。更优选地，本发明的方法具有至少85％的特异性值，例如约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％或100％。
在一个优选的实施例中，本发明的用于检测炎症性肠病(IBD)的方法以统计学显著的方式诊断、进行早期检测、测定疾病进展、测定复发、测定重现和/或测定治疗的疗效，并且灵敏度和/特异性为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％，或优选100％。
优选地，本发明方法的准确度为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％，或优选100％。在优选的实施例中，本发明的方法具有70％至90％、75％至95％、80％至95％、85％至100％、或90％至100％的准确度。优选地，本发明的方法具有至少85％，比如约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％或100％的准确度值。
灵敏度、特异性和准确度参数为比例，因此可以使用本领域公知的标准比例方法来计算相应的置信区间。围绕比例通常定义有两种类型的95％置信区间。精确的置信区间使用二项分布来定义，以达到精确估计。通过假设样品近似正态分布来计算渐近置信区间。本领域技术人员知晓如何定义适当的置信区间。选择一种或另一种置信区间通常取决于样品比例是否较好地近似正态分布。
优选由ROC曲线下面积测定准确度。“ROC曲线”是呈现灵敏度和特异性之间关系的图形显示，并且其有助于通过测定筛选测试的最佳阈值(最佳截断点)来确定最佳模型。ROC曲线下面积(AUC)提供了一种测量测试准确度的方法。优选地，本发明方法的AUC范围值为0.6至1，更优选0.7至1，更优选的值为0.75至1，更优选0.8至1，或0.9至1。在优选的实施例中，AUC为0.7至0.9、0.7至0.95、0.75至0.9、0.75至0.95、0.8至0.9、0.8至0.95、0.85至0.9、或0.85至0.95。
在一个优选的实施例中，本发明的用于检测炎症性肠病(IBD)的方法以统计学显著的方式诊断、进行早期检测、测定进展、测定复发、测定重现和/或测定治疗的疗效，并且AUC值为至少0.6、至少0.65,at 0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.95或更高。
PHGI和/或PHGII作为用于检测肠道疾病的生物标志物的用途
在一个另外的方面中，本发明涉及人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，作为用于检测肠道疾病的生物标志物和/或用于在肠道疾病的治疗中预测药物功效的用途。
在一个特定的实施例中，本发明涉及人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度，可选地与普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度一起(包括其任何数学组合)，作为用于检测肠道疾病的生物标志物的用途。根据本发明的方法进行肠道样品的PGHI和/或PGHII丰度的体外测定。
在优选的实施例中，所述人类对象的肠道样品中的PHGI丰度与PHGII丰度(包括其任何数学组合)组合使用，优选地，其中测定PHGII丰度与PHGI丰度之间的比率(PHGII/PHGI比率)。
如上所述，本领域的普通技术人员知晓若干种用于测定普氏栖粪杆菌PHGI和/或PHGII丰度的方法和设备。上文提供了更多的细节。
在优选的实施例中，通过基于如下分子方法的基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
而且，如上所述，用于细菌定量目的的基因可以有若干种。优选地，通过16S rRNA基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定。在一个特定的实施例中，通过对包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定。在另一个实施例中，通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成的普氏栖粪杆菌16SrRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。在一个优选的实施例中，通过对包含SEQ IDNO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定并且通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。上文提供了用于PHGI和/或PHGII丰度测定、检测用化学方法、和定量方法的优选实施例的优选寡核苷酸。
所述肠道样品可以是肠道活检样品。在一个优选的实施例中，所述肠道样品为通过非侵入性方法(比如直肠乙状结肠镜检查)获得的肠道活检样品。在另一个优选的实施例中，所述肠道样品为粪便样品。上文提供了样品处理的优选实施例。
优选地，所述肠道疾病选自CRC、IBS和IBD。在优选的实施例中，所述肠道疾病为IBD，优选地，所述IBD为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选地，所述IBD为CD。上文提供了更多关于所述肠道疾病的诊断、分类和治疗的细节。
在优选的实施例中，将肠道样品中的PHGI和/或PHGII丰度用作如下用途的生物标志物：肠道疾病的筛查、诊断、监测进展、监测复发、和/或监测手术后复发、和/或用于测定对肠道疾病的治疗的疗效，优选用于肠道疾病的筛查或诊断。
本发明的上述方面提供了人类对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII丰度作为用于检测肠道疾病的生物标志物的用途的附加细节和其他优选实施例。
用于检测肠道疾病的试剂盒
本发明的另外的方面涉及一种用于根据本发明第三方面所述方法检测肠道疾病的试剂盒，所述试剂盒包含：
-用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度的试剂；
-可选地，用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度的试剂；和
-使用所述试剂来测定来自人肠道样品中的PHGI和/或PHGII丰度的说明书。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括：
-用于测定由具有序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％的一致性的引物和/或探针的序列组成的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度的试剂；和/或
-用于测定由具有序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％的一致性的序列的引物和/或探针组成的普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度的试剂；和
-可选地，使用所述试剂来测定来自人肠道样品中的PHGI和/或PHGII丰度的说明书。
优选地，所述肠道样品为粪便样品。
所述试剂盒可用于肠道疾病的筛查、诊断、测定疾病活动、监测活动和/或进展、监测复发、和/或监测手术后复发、和/或测定对肠道疾病的治疗的疗效；优选用于肠道疾病的筛查和/或诊断。因此，本发明还涉及如本申请所述的试剂盒在检测肠道疾病、预测药物在肠道疾病治疗中的功效和/或IBD表型鉴别诊断中的用途。
用于测定PHGI和/或PHGII丰度的试剂如以上文针对本发明的前述方面所述。
在一个特定的实施例中，用于测定PHGI丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对，和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
在另一个特定的实施例中，用于测定PHGII丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对或；和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
在一个优选的实施例中，用于测定PHGI丰度的所述试剂和用于测定PHGII丰度的所述试剂为以上针对本发明的前述方面在特定的实施例中定义的那些试剂。
在优选的实施例中，所述试剂盒还可包含DNA提取装置、用于进行杂交和/或扩增的装置、检测装置和/或用于收集和/或保持生物样品的一个或多个容器。
本发明的试剂盒还可包含用于使数据归一化的参考试剂，优选其中所述试剂为用于定量总细菌的引物和/或探针。上文提供了更多关于定量数据归一化的细节。
优选地，所述肠道疾病选自CRC、IBS和IBD。在优选的实施例中，所述肠道疾病为IBD，优选地，所述IBD为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选地，所述IBD为CD。上文提供了更多关于所述肠道疾病的诊断、分类和治疗的细节。
本发明的前述方面提供了本发明的用于检测肠道疾病的试剂盒的附加细节和其他优选实施例。
本发明的核酸序列
本发明的另一方面涉及具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的序列或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列的核酸分子。优选地，所述具有至少75％一致性的寡核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ IDNO：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，更优选96％、97％、98％、99％或100％一致性。此外，所述具有至少75％一致性的寡核苷酸序列可以相对于SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4具有相同、更长或更短的核苷酸数目。
在一个特定的实施例中，所述核酸分子具有选自如下的序列：SEQ ID NO：1或与其具有至少80％一致性的序列；SEQ ID NO：2或与其具有至少90％一致性的序列；SEQ ID NO：3或与其具有至少80％一致性的序列；和SEQ ID NO：4或与其具有至少85％一致性的序列。
修饰。本发明的前述方面所提供了附加细节和其他优选实施例。
用于测定肠道样品中PHGI和/或PHGII丰度的方法
基于本发明的第一方面，该部分提供了另外的实施例。在一个特定的实施例中，本发明涉及用于测定来自对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)成员的丰度和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)成员的丰度的方法，其中通过对包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因进行定量来实施PHGI丰度测定，并通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因进行定量来实施PHGII丰度测定。
如上所述，本领域的普通技术人员知晓若干种用于测定普氏栖粪杆菌PHGI和/或PHGII丰度的方法和设备。上文提供了更多的细节。
在优选的实施例中，用选自定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列、和PCR-ELISA的分子方法进行16S rRNA基因定量，优选通过qPCR进行定量。
在优选的实施例中，用至少一个如下寡核苷酸分子进行PHGI 16S rRNA基因定量：序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列中的至少一个寡核苷酸分子，和/或序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列的寡核苷酸分子。优选使用序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的寡核苷酸分子。
在进一步优选的实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
优选地，用至少一个如下寡核苷酸分子进行PHGII 16S rRNA基因定量：序列SEQID NO：1或SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列中的至少一个寡核苷酸分子，和/或序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列的寡核苷酸分子。优选使用序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的寡核苷酸分子。
在另一个优选的实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
优选地，具有至少75％一致性的所述寡核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，更优选96％、97％、98％、99％或100％一致性。此外，具有至少75％一致性的这些寡核苷酸序列可以具有相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4相同、更长或更短的核苷酸数目。
更具体地，优选通过qPCR用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。而且，优选通过qPCR用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物和由寡核苷酸序列SEQID NO：4组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
可以对所述寡核苷酸序列进行修饰。在一个优选的实施例中，所述PHGI特异性探针由SEQ ID NO：3或由经修饰的与其具有至少75％一致性的序列组成。优选地，所述PHGI特异性探针为双重标记探针，更优选水解探针。在一个更优选的实施例中，SEQ ID NO：3的5'端用6FAM(6-羧基荧光素)修饰，并且其3'端用BHQ1(Black Hole Quencher1)修饰，并且经修饰的序列表示为6FAM-TAAGCCCACGACCCGGCATCG-BHQ1。
在另一个优选的实施例中，所述PHGII特异性探针由SEQ ID NO：4或经修饰的与其具有至少75％一致性的序列组成。优选地，该PHGII特异性探针为双重标记探针，更优选水解探针。在更优选的实施例中，SEQ ID NO：4的5'端用JOE(4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-5(6)-羧基荧光素)并且其3'端用BHQ1(Black Hole Quencher1)修饰，并且经修饰的序列表示为JOE-TAAGCCCACRGCTCGGCATC-BHQ1。
在优选的实施例中，如上文所述对PHGI和/或PHGII丰度水平进行归一化。优选地，相对于总细菌定量进行归一化。
上文提供了更多关于PHGI和/或PHGII丰度定量方法、检测化学方法和其他特性的细节。
通过本发明的方法体外测定肠道样品中PGHI和/或PGHII丰度。所述肠道样品可以为肠道活检样品。本领域公知若干种用于获得肠道活检样品的方法，例如，通过内镜检查。在优选的实施例中，所述肠道样品为非侵入性肠道样品。非侵入性肠道样品可以为通过非侵入性方法(比如直肠乙状结肠镜检查)获得的活检样品，以及粪便样品。上文提供了样品处理的优选实施例。在更优选的实施例中，在PHGI和PHGII基因定量之前从肠道样品中提取DNA。
本发明的前述方面提供了用于测定肠道样品中PHGI和/或PHGII丰度的方法的附加细节和其他优选实施例。
用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法
本发明的另一方面涉及一种用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.对一种或多种所述目标微生物的对象样品丰度、和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)分度的数学组合，与要区分的IBD表型的参考样品的对应值进行比较以确定所述对象患有的IBD表型；其中位值呈现出与所述IBD表型之一明显相似的对象样品将指示所述对象患有所述IBD表型；并且
其中所述IBD表型由至少两个、优选三个以下参数的组合来定义：
-疾病部位；
-IBD类型；和
-诊断年龄，
可选地，包括使用另外的生物标志物来定义所述IBD表型。
本申请所用的术语“IBD类型”指代如上所述的IBD疾病或病症。优选地，所述IBD类型选自溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、未确定型结肠炎和炎症性肠病类型待定(IBDU)。
可以在IBD疾病或病症中定义亚型。典型地，使用国际分类法(比如国际工作组在其1991年罗马报告、1998年维也纳报告或2005年蒙特利尔报告中颁布的国际分类法)进行亚型分类。优选地，根据蒙特利尔分类法确定IBD亚型。
在一个优选的实施例中，所述IBD表型选自：
i.由一个或多个，优选全部以下参数定义的CD表型：
-疾病部位；
-诊断年龄；和
-表现；
ii.由一个或多个，优选全部以下参数定义的UC表型：
-疾病部位或范围；和
-严重性。
优选地，CD亚型为由蒙特利尔分类定义的那些亚型，其中根据诊断年龄、部位和/或表现来对CD进行分类。类似地，优选的UC亚型为蒙特利尔分类所定义的那些亚型，其中根据疾病范围和/或疾病严重程度对UC进行分类(World Gastroenterology OrganisationGlobal Guidelines,Inflammatory bowel disease:a global perspective,June 2009；Satsangi et al.,Gut 2006；55,749-753 and Silverberg et al.,Can JGastroenterol.2005,19 Suppl A:5-36)。下面Satsangi等人的表提供了根据这些参数定义的特定亚型(Satsangi et al.,Gut 2006；55,749-753)。
表10.CD的维也纳分类和蒙特利尔分类。
表11.UC范围的蒙特利尔分类。
表12.UC严重性的蒙特利尔分类。
在另外优选的实施例中，所述IBD表型由疾病部位定义，更优选地，这些IBD表型选自：
-由回肠CD(I-CD)、回结肠CD(IC-CD)和结肠CD(C-CD)组成的CD表型；和
-由溃疡性直肠炎(UC-E1)、远端结肠炎(UC-E2)和广泛性UC或全结肠炎(UC-E3)组成的UC表型。
本发明的方法可用于一种或多种以下IBD亚型之间的鉴别诊断：UC vs C-CD、UC-E2 vs UC-E3、UC-E2 vs C-CD、UC-E2 vs IC-CD、UC-E2 vs I-CD、UC-E3 vs C-CD、UC-E3 vsIC-CD、UC-E3 vs I-CD、C-CD vs IC-CD、C-CD vs I-CD或I-CD vs IC-CD；优选地选自UC vsC-CD、UC-E3 vs C-CD、I-CD vs IC-CD和C-CD vs IC-CD。
所述肠道样品可以为肠道活检样品。在一个优选的实施例中，所述肠道样品为通过非侵入性方法(比如直肠乙状结肠镜检查)获得的肠道活检样品。在另一个优选的实施例中，所述肠道样品为粪便样品。上文提供了样品处理的优选实施例。
在一个优选的实施例中，所述IBD表型为UC-E3和C-CD，并且比较对象样品值与UC-E3阳性参考样品和/或C-CD阳性参考样品，其对象样品的中位值呈现出与UC-E3或C-CD明显相似，则指示所述对象患有所述IBD表型。优选地，所述人类对象先前已被诊断为结肠受累的IBD。在另外的优选实施例中，可选地与上述任何数据组合，所述目标微生物为PHGII。
在再一个优选的实施例中，可选地与上述任何数据组合，所述与FT丰度和/或EC丰度的数学组合的是选自以下的比率：PHGI丰度/EC丰度、PHGII丰度/EC丰度、FT丰度/PHGI丰度、FT丰度/PHGII丰度。优选地，通过qPCR进行丰度测定并且表示为阈值循环(Ct)值，并且通过从第一Ct值减去第二Ct值来获得所述比率。
实施例17中显示了根据本发明所述的用于UC与C-CD的鉴别诊断的生物标志物。用于UC与C-CD的鉴别诊断的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC比率。在UC中，PHGI和PHGII丰度增加，并且在UC中PHGI/EC和PHGII/EC比率降低。用于UC与C-CD的鉴别诊断的其他特别优选的生物标志物为FT/PHGI和FT/PHGII比率，ROC曲线分析显示FT/PHGI和FT/PHGII比率为良好的辨别器。另一方面，用于C-CD与UC的鉴别诊断的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC，优选地ROC曲线分析显示PHGI和PHGI/EC为良好的辨别器。
用于诊断患有结肠受累的IBD的人类对象C-CD的方法
本发明的另一方面涉及一种用于在患有结肠受累的IBD的人类对象中诊断C-CD的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较一个或多个所述目标微生物的对象样品丰度、和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合与参考样本的对应值，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示C-CD。
在一个特定的实施例中，所述目标微生物为PHGI和PHGII。在另一个特定的实施例中，所述目标微生物为PHGI。在另一个特定的实施例中，所述目标微生物为PHGII。
如上所述，用于检测C-CD的特别优选的生物标志物为PHGI、PHGII、PHGI/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC，优选PHGI和PHGI/EC。优选地，如上所述和实施例中所述通过相减计算所述比率。
在一个优选的实施例中，本发明涉及一种用于诊断患有结肠受累的IBD的人类对象C-CD的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
ii.比较对象样品丰度水平与参考样品的丰度水平，其中对象样品丰度水平相对于所述参考样品丰度水平的显著降低指示C-CD。
优选地，所述参考样品为健康对象的样品和/或IBD缓解期患者的样品，更优选缓解期同一对象的样品。
在优选的实施例中，所述IBD表型选自I-CD、C-CD和IC-CD，并比较对象样品值与I-CD阳性参考样品、C-CD阳性参考样品和/或IC-CD阳性参考样品，其中位值与I-CD、C-CD或IC-CD明显相似的对象样品，指示对象患有所述IBD表型。
在一个优选的实施例中，本发明的方法用于测定先前已被诊断患有I-CD的人类对象疾病向结肠区域(IC-CD)的扩展。优选地，所述目标微生物为PHGII。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法用于测定先前已被诊断患有C-CD的人类对象疾病向回肠区域(IC-CD)的扩展。优选地，所述目标微生物为PHGII。
用于在患有I-CD或C-CD的人类对象中诊断IC-CD的方法
本发明的另外的方面涉及一种用于在患有I-CD或C-CD的人类对象中诊断IC-CD的方法，其包括如下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.将一种或多种所述目标微生物的对象样品丰度、和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，与来自大约诊断为I-CD或C-CD的所述对象的参考样品的对应值比较，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示IC-CD。
在一个特定的实施例中，所述目标微生物为PHGI和PHGII。在另一个特定的实施例中，所述目标微生物为PHGI。在另一个特定的实施例中，所述目标微生物为PHGII。在另外的实施例中，所述目标微生物为FT和PHGI。如上所述用于检测IC-CD的优选生物标志物为FT/PHGI。
在一个优选的实施例中，本发明涉及一种用于在患有I-CD或C-CD的人类对象中诊断IC-CD的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
ii.比较对象样品PHGII丰度水平与来自大约诊断为I-CD或CD-CD的所述对象的参考样品的水平，其中对象样品的丰度水平相对于所述参考样品的丰度水平的显著降低指示IC-CD。
如上所述，本领域普通技术人员知晓若干种用于测定目标微生物丰度的方法和设备。上面提供了更多的细节。
在优选的实施例中，通过基于如下分子方法的基因定量进行目标微生物丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
而且，如上所述，可以用于细菌定量目的基因有若干种。优选地，通过16S rRNA基因定量进行所述目标微生物丰度测定。
所述目标微生物优选选自PHGI和PHGII。在一个优选的实施例中，所述人类对象的肠道样品的PHGI丰度与PHGII丰度(包括其任何数学组合)组合使用，优选地其中测定PHGII丰度与PHGI丰度(PHGII/PHGI比率)之间的比率。
在一个优选的实施例中，通过对包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定。在另一个实施例中，通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来测定PHGII丰度。在一个优选的实施例中，通过对包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定，并且通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。本发明的上述方面提供了用于PHGI和/或PHGII丰度测定、检测用化学方法、和定量方法的优选实施例的优选寡核苷酸。
相对于总FP，通过对包含SEQ ID NO：7或由SEQ ID NO：7组成的普氏栖粪杆菌16SrRNA基因序列进行定量来进行FP 16S rRNA基因定量。
在优选的实施方案中，用序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或与其具有至少75％一致性的序列中的至少一种寡核苷酸分子，和/或序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的序列的寡核苷酸分子，进行总FP 16S rRNA基因定量。优选使用序列SEQ ID NO：5和SEQID NO：6的寡核苷酸分子。
在另外的优选实施例中，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针，进行PHGI 16S rRNA基因定量。在一个优选的实施例中，优选通过qPCR，用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6组成的引物和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：7组成的探针进行总FP 16S rRNA基因定量。
优选地，具有至少75％一致性的所述寡核苷酸序列与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，更优选96％、97％、98％、99％或100％一致性。此外，具有至少75％一致性的这些寡核苷酸序列可以具有相同的核苷酸数目，可以比SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7更长或更短。
在一个优选的实施例中，所述总FP探针由SEQ ID NO：7或由经修饰的与其具有至少75％一致性的序列组成。优选地，所述总FP探针为双重标记探针，更优选水解探针。在一个更优选的实施例中，SEQ ID NO：7的5'端用6FAM(6-羧基荧光素)修饰，并且其3'端用TAMRA(四甲基罗达明)修饰，并且经修饰的序列表示为6FAM-CAAGGAAGTGACGGCTAACTACGTGCCAG-TAMRA。
本发明的上述方面提供了定量方法的更多细节和优选实施例。
在优选的实施例中，所述方法还包括检测和/或定量肠道疾病(优选IBD)的一种或多种生物标志物。
在另外优选的实施例中，所述方法还包括将目标微生物定量和/或所述另外的生物标志物检测和/或定量的结果与作为IBD的独立预报器的临床体征和/或症状组合。
在另一个实施例中，所述方法还包括将方法结果存储于数据载体中，优选地其中所述数据载体为计算机可读介质。
本发明的前述方面提供了关于根据本发明的第六至第八方面中的任一方面的用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法的附加细节和其他优选实施方式。
用于预防炎症性肠病(IBD)的方法
另一方面，本发明涉及一种用于炎症性肠病(IBD)的预后的方法，其包括根据本申请所述的本发明的用于鉴别诊断的方法来确定IBD表型，并根据确定的IBD表型建立预后。
总FP、PHGI和/或PHGII作为用于IBD表型的鉴别诊断的生物标志物的用途。
在进一步的方面，本发明涉及人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度、和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合、和/或上述任一种与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，作为用于IBD表型的鉴别诊断的生物标志物的用途。根据本发明的方法测定肠道样品中的PGHI和/或PGHII丰度。
在特定的实施例中，本发明涉及：在人类对象的肠道样品中测定的普氏栖粪杆菌成员(总FP)丰度、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度、和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合作为用于炎症性肠病(IBD)表型的生物标志物的用途。总FP、PGHI和/或PGHII丰度的测定是体外测定。
上文提供了关于IBD表型的更多细节和优选实施例。在一个优选的实施例中，所述IBD表型选自：
-由溃疡性直肠炎(UC-E1)、远端结肠炎(UC-E2)和广泛性UC或全结肠炎(UC-E3)组成的溃疡性结肠炎(UC)表型；和
-由回肠CD(I-CD)，回结肠CD(IC-CD)和结肠CD(C-CD)组成的克罗恩病(CD)表型。
在一个优选的实施例中，将PHGI的丰度、PHGII的丰度和/或其数学组合用作生物标志物。在另外的优选实施例中，将PHGI和PHGII丰度的数学组合用作生物标志物，优选地其中将PHGII和PHGI丰度之间的比率(PHGII/PHGI比率)用作生物标志物。
在另一个优选的实施例中，通过基于如下分子方法的基因定量进行所述目标微生物丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
在另外的优选实施例中，其中通过16S rRNA基因定量进行所述目标微生物丰度测定。
在又一个优选的实施例中，所述肠道样品为粪便样品。
本发明的前述方面提供了关于人类对象的肠道样品中的总FP、PHGI和/或PHGII丰度作为用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的生物标志物的用途的附加细节和其他优选实施方式。
用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的试剂盒
本发明的又一方面涉及一种用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的试剂盒，其包含：
-用于测定选自普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的目标微生物的丰度的试剂；以及
-使用所述试剂来测定来自人肠道样品的所述目标微生物的丰度水平的说明书。
在一个优选的实施例中，所述肠道样品为粪便样品。
在另一个优选的实施例中，用于测定PHGI丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对，和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
在另外的优选实施例中，用于测定PHGII丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对或；和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
在又一优选实施例中，用于测定总FP丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对或；和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
在另外的优选实施例中，所述试剂盒还包含用于使数据归一化的参考试剂，优选地其中所述试剂为用于定量总细菌的引物和/或探针。
本发明的前述方面提供了关于用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的试剂盒的附加细节和其他优选实施方案。
与用于检测人类对象肠道疾病的方法相关的项目
1.一种用于检测人类对象肠道疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a.测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)的丰度；
b.可选地，测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
c.将对象样品的PHGI、可选地PHGII丰度、和/或其数学组合与参考样品的对应值比较，其中所述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病。
2.根据项目1的方法，包括以下步骤：
a.测定来自所述对象的肠道样品中PHGI的丰度；和
b.比较对象样品丰度水平与参考样品中的水平，其中对象样品的丰度水平相对于所述参考样品的丰度水平的显著降低指示肠道疾病。
3.根据项目1的方法，包括以下步骤：
a.测定来自所述对象的肠道样品的PHGI丰度；
b.测定来自所述对象的肠道样品的PHGII丰度；和
c.比较对象样品的PHGI丰度、PHGII丰度和/或其数学组合与参考样品的相应值，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病，
其中优选地测定PHGII丰度与PHGI丰度(PHGII/PHGI比率)之间的比率；并比较所述对象样品的PHGII/PHGI比率与参考样品的PHGII/PHGI比率。
4.根据项目1至3中任一项目的方法，其中所述方法用于肠道疾病的筛查、诊断、监测进展、监测复发、和/或监测手术后复发、和/或用于测定对肠道疾病的治疗的疗效；优选用于肠道疾病的筛查和/或诊断。
5.根据项目1至4中任一项目的方法，其中通过基于如下分子方法的基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
6.根据项目1至5中任一项目的方法，其中通过16S rRNA基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定。
7.根据项目1至46任一项目的方法，其中通过对包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定。
8.根据项目1至7中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针，进行PHGI 16S rRNA基因定量。
9.根据项目1至8中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2组成的引物，和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
10.根据项目1至9中任一项目的方法，其中通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ IDNO：4组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。
11.根据项目3至10中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
12.根据项目3至11中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2组成的引物，和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
13.根据项目5至12中任一项目的方法，其中在PHGI和/或PHGII基因定量之前从肠道样品中提取DNA。
14.根据项目1至13中任一项目的方法，其中将PHGI和/或PHGII丰度水平归一化，优选地其中归一化相对于总细菌定量进行。
15.根据项目1至14中任一项目的方法，其中所述肠道样品为粪便样品。
16.根据项目1至15中任一项目的方法，其中所述参考样品为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品，优选缓解期同一对象的样品。
17.根据项目1至16中任一项目的方法，其中所述肠道疾病为IBD，优选地其中所述IBD为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选地其中所述IBD为CD。
18.根据项目1至17中任一项目的方法，其中测定PHGI丰度，并且对象样品的PHGI丰度水平相对于所述参考样品的PHGI丰度水平的显著降低指示CD，优选回肠受累的CD(IC-CD或I-CD)。
19.根据项目1至18中任一项目的方法，其中测定PHGII/PHGI比率并且对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示CD，优选结肠受累的CD(C-CD或IC-CD)。
20.根据项目1至19中任一项目的方法，其中所述方法还包括检测和/或定量肠道疾病(优选IBD)的一种或多种生物标志物。
21.根据项目1至20中任一项目的方法，其中所述方法还包括将PHGI丰度、PHGII丰度和/或所述另外的生物标志物检测和/或定量的结果与肠道疾病(优选IBD)的其他指标结合。
22.根据项目1至21中任一项目的方法，其中所述方法还包括将所述方法结果存储于数据载体中，优选地其中所述数据载体为计算机可读介质。
23.人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度作为用于检测肠道疾病的生物标志物的用途。
24.根据项目23的用途，用于肠道疾病的筛查、诊断、监测进展、监测复发、和/或监测手术后复发、和/或用于测定对肠道疾病的治疗的疗效；优选用于肠道疾病的筛查和/或诊断。
25.根据项目23或24中任一项目的用途，其中所述人类对象的肠道样品中的PHGI丰度与普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度组合使用，优选地，其中测定所述PHGII丰度和PHGI丰度(PHGII/PHGI比率)之间的比率。
26.根据项目23至25中任一项目的用途，其中通过基于如下分子方法的基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
27.根据项目23至26中任一项目的用途，其中通过16S rRNA基因定量进行PHGI和/或PHGII丰度测定。
28.根据项目23至27中任一项目的用途，其中所述肠道样品为粪便样品。
29.根据项目23至28中任一项目的用途，其中所述肠道疾病为IBD，优选地，其中所述IBD为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选地，其中所述IBD为CD。
30.一种用于根据项目1至22中任一种的方法检测肠道疾病的试剂盒，其包含：
用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度的试剂；
可选地，用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度的试剂；和
使用所述试剂来测定来自人肠道样品中的PHGI丰度水平和可选地的PHGII丰度水平的说明书，
其中优选地，所述肠道样品为粪便样品。
31.根据项目30的试剂盒，所述试剂盒用于肠道疾病的筛查、诊断、监测进展、监测复发、和/或监测手术后复发、和/或测定对肠道疾病的治疗的疗效；优选用于肠道疾病的筛查和/或诊断。
32.根据项目30或31中任一项目的试剂盒，其中用于测定PHGI丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对，和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
33.根据项目30至32中任一项目的试剂盒，其中用于测定PHGII丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对或；和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
34.根据项目30至33中任一项目的试剂盒，还包含用于使数据归一化的参考试剂，优选其中所述试剂为用于定量总细菌的引物和/或探针。
35.根据项目30至34中任一项目的试剂盒，其中所述肠道疾病为IBD，优选地，其中所述IBD为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选地，其中所述IBD为CD。
36.选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列的核酸序列。
37.一种用于测定来自对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度的方法；其中通过对包括SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定，并且通过对包括SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。
38.根据项目37的方法，其中用选自以下的分子方法进行16S rRNA基因定量：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
39.根据项目37或38的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
40.根据项目37至39中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物，和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
41.根据项目37至40中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ IDNO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
42.根据项目37至41中任一项目的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物，和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
43.根据项目37至42中任一项目的方法，其中在PHGI和/或PHGII基因定量之前从所述肠道样品中提取DNA。
44.根据项目37至43中任一项目的方法，其中将PHGI和/或PHGII丰度水平归一化，优选地其中归一化相对于总细菌定量进行。
45.根据项目37至44中任一项目的方法，其中所述肠道样品为粪便样品。
与用于炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法相关的项目
1.一种用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较一种或多种所述目标微生物的对象样品丰度和/或其数学组合与要区分的IBD表型的参考样品的对应值，以测定所述对象患有的IBD表型；其中位值呈现出与所述IBD表型之一显著相似的对象样品，将指示所述对象患有所述IBD表型；并且
其中所述IBD表型由至少两个、优选三个以下参数的组合来定义：
-疾病部位；
-IBD类型；和
-诊断年龄，
可选地，包括使用另外的生物标志物来定义所述IBD表型。
2.根据项目1的方法，其中所述IBD表型选自：
-由一个或多个，优选全部以下参数定义的CD表型：
疾病部位；
诊断年龄；和
表现；
-由一个或多个、优选全部以下参数定义的UC表型：
疾病部位或范围；和
严重性。
3.根据项目1或2中任一项的方法，其中所述IBD表型选自：
-由回肠CD(I-CD)、回结肠CD(IC-CD)和结肠CD(C-CD)组成的CD表型；和
-由溃疡性直肠炎(UC-E1)、远端结肠炎(UC-E2)和广泛性UC或全结肠炎(UC-E3)组成的UC表型。
4.根据项目1至3中任一项的方法，其中实施目标微生物选自PHGI和PHGII。
5.根据项目1至4中任一项的方法，其中测定PHGII丰度与PHGI丰度之间的比率(PHGII/PHGI比率)；并比较所述对象样品的PHGII/PHGI比率与参考样品的PHGII/PHGI比率。
6.根据项目1至5中任一项的方法，其中所述IBD表型为UC-E3和C-CD，并且比较对象样品值与UC-E3阳性参考样品和/或C-CD阳性参考样品，其中位值呈现出与UC-E3或C-CD显著相似的对象样品将指示所述对象患有所述IBD表型。
7.根据项目6的方法，其中所述人类对象先前已被诊断为结肠受累的IBD。
8.根据项目6或7中任一项的方法，其中所述目标微生物为PHGII。
9.一种用于在患有结肠受累的IBD的人类对象中诊断C-CD的方法，其包括以下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较对象样品丰度水平与参考样品的水平，其中对象样品的丰度水平相对于所述参考样品的丰度水平的显著偏差指示C-CD，
其中优选地所述目标微生物为PHGII。
10.根据项目9的方法，其中所述参考样品为健康对象的样品和/或IBD缓解期患者的样品，更优选缓解期同一对象的样品。
11.根据项目1至5中任一项的方法，其中所述IBD表型选自I-CD、C-CD和IC-CD，并比较对象样品值与I-CD阳性参考样品、C-CD阳性参考样品和/或IC-CD阳性参考样品，其中位值呈现出与I-CD、C-CD或IC-CD明显相似的对象样品将指示对象患有所述IBD表型。
12.根据项目11的方法，用于测定先前已被诊断患有I-CD的人类对象疾病向结肠区域(IC-CD)扩展。
13.根据项目12的方法，其中所述目标微生物为PHGII。
14.根据项目13的方法，用于测定先前已被诊断患有C-CD的人类对象疾病向回肠区域(IC-CD)的扩展。
15.根据项目14的方法，其中所述目标微生物为PHGII。
16.一种用于诊断患有I-CD或C-CD的人类对象IC-CD的方法，其包括如下步骤：
i.测定来自所述对象的肠道样品中的目标微生物的丰度，其中所述目标微生物选自：普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)；和
ii.比较对象样品PHGII丰度水平与来自大约诊断为I-CD或CD-CD的所述对象的参考样品的水平，其中对象样品的丰度水平相对于所述参考样品的丰度水平的显著降低指示IC-CD；
其中，优选地，所述目标微生物为PHGII。
17.根据项目1至16中任一项的方法，其中通过基于如下分子方法的基因定量进行目标微生物丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
18.根据项目1至17中任一项的方法，其中通过16S rRNA基因定量进行所述目标微生物丰度测定。
19.根据项目1至18中任一项的方法，其中通过对包含SEQ ID NO：3或由SEQ IDNO：3组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGI丰度测定。
20.根据项目1至19中任一项的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
21.根据项目1至20中任一项的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2组成的引物，和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3组成的探针进行PHGI 16S rRNA基因定量。
22.根据项目1至21中任一项的方法，其中通过对包含SEQ ID NO：4或由SEQ IDNO：4组成的普氏栖粪杆菌16S rRNA基因序列进行定量来实施PHGII丰度测定。
23.根据项目1至22中任一项的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
24.根据项目1至23中任一项的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2组成的引物，和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4组成的探针进行PHGII 16S rRNA基因定量。
25.根据项目1至24中任一项的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQID NO：6或与其具有至少75％一致性的序列组成的引物，和/或由寡核苷酸序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的序列组成的探针进行总FP 16S rRNA基因定量。
26.根据项目1至25中任一项的方法，其中用由寡核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQID NO：6组成的引物和由寡核苷酸序列SEQ ID NO：7组成的探针进行总FP 16S rRNA基因定量。
27.根据项目1至26中任一项的方法，其中在目标微生物基因定量之前从肠道样品中提取DNA。
28.根据项目1至27中任一项的方法，其中所述肠道样品为粪便样品。
29.根据项目1至28中任一项的方法，其中将目标丰度水平归一化，优选地其中归一化相对于总细菌定量进行。
30.根据项目1至29中任一项的方法，其中其中所述方法还包括检测和/或定量肠道疾病(优选IBD)的一种或多种生物标志物。
31.根据项目1至30中任一项的方法，其中其中所述方法还包括将目标微生物定量和/或所述另外的生物标志物检测和/或定量的结果与作为IBD的独立预报器的临床体征和/或症状组合。
32.根据项目1至31中任一项的方法，其中所述方法还包括将方法结果存储于数据载体中，优选地其中所述数据载体为计算机可读介质。
33.用于炎症性肠病(IBD)的预后的方法，其包括根据项目1至31中任一项目的用于鉴别诊断的方法来确定IBD表型，并根据确定的IBD表型建立预后。
34.测定的人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌成员(总FP)丰度、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度、和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合，作为用于如项目1至3中任一项目所定义的炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的生物标志物的用途。
35.根据项目34的用途，其中所述IBD表型选自：
-由溃疡性直肠炎(UC-E1)、远端结肠炎(UC-E2)和广泛性UC或全结肠炎(UC-E3)组成的溃疡性结肠炎(UC)表型；和
-由回肠CD(I-CD)，回结肠CD(IC-CD)和结肠CD(C-CD)组成的克罗恩病(CD)表型。
36.根据项目34或35中任一项的用途，其中将PHGI的丰度、PHGII的丰度和/或其数学组合用作生物标志物。
37.根据项目34或35中任一项的用途，其中将PHGI和PHGII丰度的数学组合用作生物标志物，优选地其中将PHGII和PHGI丰度之间的比率(PHGII/PHGI比率)用作生物标志物。
38.根据项目34至37中任一项的用途，其中通过基于如下分子方法的基因定量进行所述目标微生物丰度测定：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
39.根据项目34至39中任一项的用途，其中通过16S rRNA基因定量进行所述目标微生物丰度测定。
40.根据项目34至38中任一项的用途，其中所述肠道样品为粪便样品。
41.用于根据项目1至33中任一项目的方法进行炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的试剂盒，其包含：
-用于测定选自普氏栖粪杆菌成员(总FP)、普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的目标微生物的丰度的试剂；以及
-使用所述试剂来测定来自人肠道样品的所述目标微生物的丰度水平的说明书。
42.根据项目41的试剂盒，其中所述肠道样品为粪便样品。
43.根据项目41或42中任一项的试剂盒，其中用于测定PHGI丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对，和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
44.根据项目41至43中任一项的试剂盒，其中用于测定PHGII丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对或；和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
45.根据项目41至44中任一项的试剂盒，其中用于测定总FP丰度的所述试剂选自：
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的核酸引物对或；和/或
-由寡核苷酸序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的寡核苷酸序列组成的探针。
46.根据项目41至45中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于使数据归一化的参考试剂，优选地其中所述试剂为用于定量总细菌的引物和/或探针。
根据本发明的构思，本说明书中所讨论的任何实施例均可以应用于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或用途，反之亦然。应该理解的是，本申请描述的特定实施例是作为说明而非限制本发明。本发明的原理特征可以应用于各种实施方式中，而不脱离本发明的范围。本领域技术人员知晓或仅仅使用常规实验就能够确定本申请所述的特定方法的许多等同形式。这些等同形式应认为是在本发明的范围内，并且被权利要求所涵盖。
说明书中提到的所有出版物和专利申请均属于本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本申请，其程度如同具体且单独地指示通过引用并入每个单独的出版物或专利申请。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”一起使用时，使用词语“一种”或“一个”可以表示“一个”，但是其也相当于“一个或多个”、“至少一个”、“一个或一个以上”。尽管本发明支持仅是指替代方案以及“和/或”的定义，在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出其仅指代替代方案或替代方案是相互排斥的。在整个申请中，术语“约”用于指示值包括用于确定该值的设备和方法的固有变差，或者所研究的对象间差异。
本说明书和权利要求书中所用的词语“包含”(以及包含的任何形式，比如“含”和“含有”)、“具有”(以及具有的任何形式，比如“设有”和“有”)、“包括”(以及包括的任何形式，比如“涵括”和“涵盖”)、或“含有”(以及含有的任何形式，比如“包括”和“包含”)都是具包容性的或开放式的，并且不排除其他未列出的元素或方法步骤。本申请所用的短语“基本上由...组成”，将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及实质上不影响要求保护的发明的基本特征和新颖特征的那些。本申请所用的短语“由......组成”则排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分，除了例如通常与该元素或限制相关的杂质之外。
本申请所用的术语“或其组合”是指术语前的所列项目的所有排列和组合，例如，“A、B、C或其组合旨在包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及如果在特定情况下顺序很重要，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续以此为例，明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复组合，比如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解，通常不对任何组合中的项目或术语的数量进行限制，除非从上下文中显现。
本申请所用的近似词语，例如但不限于“约”、“大约”、“近似”是指如下条件：当用其修饰时，应当理解为不一定是绝对的或完美的，而是对于本领域的普通技术人员而言足够接近，从而可以保证指定条件存在。此描述可能变化的程度将取决于，可以进行多大的改变而仍然使本领域的普通技术人员将以此修饰改变后的特征认定为仍具有未修饰特征的所需特征和能力。一般地，通过近似词(比如“约”)修饰的本申请的数值可以与所称的值相差至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％，但亦受制于前面的讨论。
实施例
实施例1.用于活检样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组定量的材料和方法
1.患者、临床数据和采样。
登记由70名IBD(45名CD和25名UC)患者、10名IBS患者、20名CRC患者和31名H组成的西班牙人群组(表13)。
对象由Universitari Dr.Josep Trueta医院(西班牙赫罗纳)和Santa Caterina医院(西班牙Salt)的肠胃科服务部招募。对所有组进行对象性别匹配。关于年龄，CD患者比H组年轻(P<0.001)，而CRC患者年龄明显大于其他所有组(P≤0.019)。根据标准临床、病理和内镜检查标准对IBD患者进行诊断并根据蒙特利尔分类法(Silverberg et al.,Can JGastroenterol.2005,19Suppl A:5-36)进行分类。根据罗马III标准(可在<http://www.romecriteria.org/criteria/>获得)对IBS患者进行诊断。通过结肠镜检查和活检确定CRC诊断，记录与发展该疾病的高风险相关的数据。对照组由因不同的原因(包括直肠出血(N＝9)、结肠直肠癌家族史(N＝11)和腹痛(N＝11))经受结肠镜检查的对象组成。收集所有患者的临床相关数据。对象在结肠镜检查前至少两个月内都没有接受抗菌治疗。
在结肠镜检查之前，按照制造商的指导，使用对患者进行胃肠道清洁。在常规内镜检查中，按照标准程序，沿着肠道(回肠末端、结肠和直肠)的不同部位从每个患者取出最多3个活检样品。立即将所有活检样品置于无任何缓冲液的无菌管中，并且在完成整个内镜检查程序并分析后，储存于-80℃。
这项工作分别于2009年2月24日和2009年4月21日由Universitari Dr.JosepTrueta医院临床研究伦理委员会(西班牙赫罗纳)和赫罗纳d’Assistència Sanitària研究所(西班牙Salt)批准。登记前获得对象的知情同意。
表13.对象的样品尺寸和临床特征
IBD,炎症性肠病；IBS,肠易激综合症；CRC,结直肠癌；TNF,肿瘤坏死因子；nd,不确定；na,不适用
*对照组由因不同原因进行结肠镜检查的对象组成：9/31直肠出血，11/31结直肠癌家族史，以及11/31腹痛。
**可获得采样时41/45的CD患者和23/25的UC患者的医疗处理；可获得43/45的CD患者和22/25的UC患者的发病年龄；可获得39/45的CD患者采样之前最后随访的疾病表现，且没有一例出现穿透CD(B3)；可获得采样时23/25的UC患者的最大疾病程度；可获得4/10的肠易激综合症患者的疾病亚型，并且没有一例出现交替主导型；只有17/20的CRC患者能清楚追踪到有或者没有患CRC疾病的亲属。
***如果患者的一级亲属也患有CRC，则患者包括在这一类中.
§表示通过非参数统计检验来对组进行比较，p值≤0.05被认为是显著的；为χ2检验；为曼-惠特尼U检验
2.样品处理和DNA提取。
提取DNA之前，如之前所报道，对活检样品进行两次温和的超声波清洗循环以去除暂时松散附着的细菌(34)。使用 Tissue Kit(Macherey-Nagel GmbH&Co.，Duren，德国)提取DNA。实施对革兰氏阳性细菌的支持实验方案和RNAse处理步骤。用10mMTris-HCl(pH7.4)洗脱基因组DNA并储存于-80℃直至使用。用NanoDrop ND-100分光光度计(NanoDrop Technologies，USA)测定提取物的DNA浓度和纯度。
3.引物和水解探针设计，以及普氏栖粪杆菌亲缘组的qPCR分析设定。
为了同时对两个普氏栖粪杆菌亲缘组进行定量，设计了qPCR试验，其由用于普氏栖粪杆菌的独特的物种特异性引物对和靶向各个普氏栖粪杆菌亲缘组的两种水解探针组成。
从GenBank中获得普氏栖粪杆菌和亲缘相近的瘤胃球菌科的16S rRNA基因序列(表14)，并使用Clustal W软件进行比对(Thompson JD et al.Nucleic Acids Res.1994；22:4673-4680)。根据Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)设定的说明，依据专门为每个目而构建的共有序列(表14)手动设计引物和水解探针，从而设计用于辨别等位基因的引物和探针，并且使用软件3.0版Primer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行进一步检验。还使用NetPrimer软件(PREMIER Biosoft International，美国加利福尼亚)评估寡核苷酸以检验引物二聚体结构、发夹和可能的二聚体相互交叉作用。表15列出了所得引物和探针。
表14.用于进行寡核苷酸设计的16S rRNA基因序列。已指出GenBank登录号。来自普氏栖粪杆菌分离株的序列，通过分子方法获得的相关序列以及来自普氏栖粪杆菌近亲的相同基因的序列已经包括在内。
*用于获得普氏栖粪杆菌16S rRNA基因的共有序列以进行寡核苷酸设计的序列
1用于获得普氏栖粪杆菌亲缘组I 16S rRNA基因的共有序列以进行特异性水解探针设计的序列
2用于获得普氏栖粪杆菌亲缘组II 16S rRNA基因的共用序列以进行特异性水解探针设计的序列
表15.本研究中使用的16S rRNA靶向引物和探针
a探针序列为粗体。FAMTM(6-羧基荧光素)，(6-羧基罗丹明)，JOE(4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-5(6)-羧基荧光素)，TAMRATM(四甲基罗丹明)BHQ1(Black HoleQuencher1).
bIAC,内部扩增对照；DNA IAC序列:5’-TACggATgAggAggACAAAggACgCCgCTATgggCATCgCACCAATggATCAgAgCgAAgTg-3’(根据参考文献18).
c对于所有定量PCR，在50℃进行初始步骤2分钟用于amperase处理。且最初的变性步骤设定为95℃10分钟。在定量PCR中，退火和延伸步骤同时进行。
18.Lopez-Siles M,Martinez-Medina M,Busquets D,et al.Mucosa-associatedFaecalibacterium prausnitzii and Escherichia coli co-abundance candistinguish Irritable Bowel Syndrome and Inflammatory Bowel Diseasephenotypes.International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475
43.Huijsdens XW,Linskens RK,Mak M,et al.Quantification of BacteriaAdherent to Gastrointestinal
Mucosa by Real-Time PCR.J Clin Microbiol.2002；40:4423-4427
44.Furet J-P,Firmesse O,Gourmelon M,et al.Comparative assessment ofhuman and farm animal faeca microbiota using real-time quantitative PCR.FEMSMicrobiology Ecology.2009；68:351-362
为了测定qPCR试验的最佳试剂浓度，使用浓度范围为50至900nM的不同引物和探针进行实验。将对106个拷贝/反应的目标DNA产生最大荧光信号及最低定量循环(Cq)值的试剂浓度循环选定为最佳浓度，并将其用于样品的进一步定量(如下文中qPCR试验部分中所述)。
通过Seqmatch和BLAST分别在核糖体数据库项目II(RDP)(Maidak BL,et al.,Nucleic Acids Research.2001；29:173-174)和GenBank数据库中检验寡核苷酸的特异性(Altschul SF,et al.Nucleic Acids Research.1997；25:3389-3402)。使用SILVA探针匹配和评估工具-TestProbe 3.0(可从http://www.arb-silva.de/search/testprobe/获得)评估覆盖率。最后，进行体外包含性/排他性测试，其中包括89个细菌菌株，其中9个为普氏栖粪杆菌(表16)。
测定所述试验的线性、效率和检测限。为了确定所述试验的置信定量范围，使用包含普氏栖粪杆菌S3L/3(亲缘组I)或普氏栖粪杆菌DSM 17677(亲缘组II)的单拷贝16S rRNA基因的线性化质粒的10倍稀释液(每个反应2×108至2个目标基因拷贝)，一式十份。将重复试样之间SD值小于0.34的那些浓度看作是定量的线性范围。还进行回归分析，将所得的Cq对反应中的目标基因数量的对数作图。使用下式计算qPCR试验的效率：效率＝[10(-1/斜率)]-1。对于所述试验的检测限，对1至100个普氏栖粪杆菌16S rRNA基因目标拷贝的两倍连续稀释液制校准曲线。对每个稀释液的八个重复试样进行试验。通过Probit测试(14Statistical Software，美国宾夕法尼亚州)分析数据，其中针对每个反应中存在的目标基因的量绘制正/负扩增事件的比率。
4.qPCR定量标准。
根据之前所报道，在PCR扩增之后，由普氏栖粪杆菌菌株S3L/3(亲缘组I)和普氏栖粪杆菌DSM 17677(亲缘组II)制备标准DNA模板作为遗传构建体(Lane DJ.et al.,E.Stackebrandt and M.Goodfellow(ed.).,John Willy and Sons；1991；Weisburg WG,Barns SM,Pelletier DA,et al.J Bacteriol.1991；173:697-703)，随后按照制造商的说明将整个16S rRNA基因插入克隆质粒中(Invitrogen，CA，USA)。用Plasmid(Macherey-Nagel GmbH&Co.，Duren，德国)纯化后，用SpeI(普氏栖粪杆菌)使质粒线性化并使用QubitTM定量平台(QubitTMQuantitation Platform，Invitrogen，Carlsbad，USA)进行定量。根据之前所报道，推断初始目标浓度(Lopez-Siles M,etal.International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475)。由线性化质粒滴定悬浮液的10倍系列稀释液获得标准曲线，范围为20至2×108个拷贝/反应，这与所有反应的线性动态范围跨度对应。将用普氏栖粪杆菌DSM 17677 16S rRNA基因构建的标准曲线用于总细菌和总粪便菌16S rRNA基因定量，并且使用总普氏栖粪杆菌引物和探针组对由任一亲缘组获得的标准曲线进行相互校准。
5.qPCR分析
将之前报道的16S rDNA靶向引物和探针用于总普氏栖粪杆菌定量(Lopez-SilesM,et al.International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475)和总细菌定量(Furet J-P,et al.FEMS Microbiology Ecology.2009；68:351-362)，并且根据之前的描述进行扩增反应(Lopez-Siles M,et al.International Journal of MedicalMicrobiology.2014；304:464-475)。用于对总普氏栖粪杆菌进行定量的新试验以20μl总反应体积进行，其中包含如下物质： Universal PCR Master Mix 2×(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)，每种引物各900nm、每种探针各300nM和至多50ng的基因组DNA模板。表15中详述了本研究中使用的所有引物和探针以及PCR条件。总普氏栖粪杆菌和总细菌引物和水解探针购自Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)，而普氏栖粪杆菌亲缘组的引物和水解探针从Biomers(乌尔姆，德国)获得。内部扩增对照(IAC)的DNA由Bonsai technologies group(阿尔科文达斯，西班牙)合成。
样品在同一平板中以一式两份运行。对于数据分析，使用重复定量的平均值。如果定量循环之间的标准偏差(Cq)小于0.34(即容许数量差异小于10％)，则认为重复有效。进行定量对照以评估批次间重复性，该定量对照由以已知数目的目标基因进行的至少5次反应组成。通过在每个反应中加入103个IAC模板拷贝来控制对总普氏栖粪杆菌的抑制。如果所获得的Cq与对任何重复试样单独定量IAC时所获得Cq的差异小于0.34，则认为无抑制。在每次试验中还包括由不含普氏栖粪杆菌DNA的反应组成的无模板对照以及不含任何DNA模板(细菌或IAC)的非扩增对照。在所有情况下，阴性对照均导致检测不到Cq值。
所有定量PCR都使用7500实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行。使用1.4版7500SDS系统软件(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)收集和分析数据。所有定量均在平均PCR效率为89.51±7.06％下完成。
6.数据归一化和统计分析。
关于定性分析，如果在qPCR分析过程中未检测到任何结果，则认为不存在普氏栖粪杆菌或其亲缘组，这对应于所携带的普氏栖粪杆菌或亲缘组低于检测限的样品(即，对于每个反应中总普氏栖粪杆菌、亲缘组I和亲缘组II的16S rRNA基因分别为106.6、1.10和2.39)。使用皮尔逊χ2检验来比较患者组之间和IBD疾病部位之间的普氏栖粪杆菌及其亲缘组的流行率。
参考定量分析，将总普氏栖粪杆菌和亲缘组拷贝数按照总细菌16S rRNA基因拷贝进行归一化。数据表示为：在相同样品中检测到的目标微生物16S rRNA基因拷贝与百万个总细菌16S rRNA基因之间的比率的log10。
将非参数Kruskal-Wallis检验用于测试具有两类别以上的变量(比如诊断、CD和UC疾病部位以及目前的药物治疗)之间的差异。使用Mann-Whitney U检验分析这些子类变量的两两比较。该检验还用于在患者亚组内比较具有两种类别的变量，比如活动(分别在CDAI>150时(Best,W.R.,et al.Gastroenterology,1976.70(3):p.439-44.)和Mayo评分>3(Pineton de Chambrun,G.,L.et al.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010.7(1):p.15-29.)时活跃的CD和UC患者)和肠切除术。
此外，接受者操作特征(ROC)曲线分析，应用真阳性率(灵敏度)与假阳性率(1-特异性)的关系图确定普氏栖粪杆菌的有用性，并且应用每个亲缘组来区分不同的肠道疾病。通过ROC曲线下面积(AUC)来测量辨别的准确性。接近1的AUC表示该测试高度灵敏并且具有高度特异性，而AUC接近0.5表示该测试既不灵敏也不具有特异性。
所有统计分析均使用SPSS 15.0统计软件包(LEAD Technologies，Inc.)进行。P值≤0.05时认为是显著水平。
实施例2.普氏栖粪杆菌亲缘组I和II的新型多重qPCR试验的特征。
设计新寡核苷酸组来定量最近描述的两种普氏栖粪杆菌亲缘组(表15)。选定的寡核苷酸组的计算机模拟分析显示，引物Fpra 136F-Fpra 232R对普氏栖粪杆菌具有特异性并靶向所有迄今为止可用的分离株，而探针PHG1 180PR和PHG2 180PR分别与亲缘组I和II特异性匹配。这些结果通过包容性-排他性测试进行体外证实(表16)。Fpra 136F-Fpra232R引物组对SILVA数据集中的序列的覆盖率为74.85％。PHG1 180PR探针靶向20.50％的普氏栖粪杆菌物种序列，而PHG2 180PR探针对该数据库中的普氏栖粪杆菌物种序列的覆盖率为38.80％。SILVA数据集所有可用普氏栖粪杆菌序列中大约25％的序列无法被这些计算机模拟试验中的任何一个靶向。这种差异可能是由于其他亲缘组的存在和/或因为不同亲缘组探针不包括每个亲缘组内的所有成员。在我们的研究中，我们的结果对如何进行疾病之间的比较仍然有效，因为对亲缘组成员的定义使用了相同的标准，即通过与SEQ ID NO：3特异性杂交来定义PHGI和通过与SEQ ID NO：4特异性杂交来定义PHGII。
这两个反应在以20个目标基因/每次反应开始的7个对数的线性范围量程上进行可靠定量是可能的(R2＝0.998)，对于亲缘组I平均效率为85.68±3.23％，对于亲缘组II，平均效率为90.31±3.40％。对于亲缘组I和亲缘组II，检测限分别为1.10和2.39个目标基因。
表16.本研究中使用的细菌菌株的生长条件和来源。还包括了由特异性测试获得的结果。
*还使用人Xsomal DNA(Eurogentec,Belgium)执行特异性测试
(1)ATCC:美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas,VA,USA)；CECT:西班牙典型菌种保藏中心(Colección de CultivosTipo；西班牙巴伦西亚)；DSMZ：德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutche Sammlung vonMikroorganismen and Zellkulturren；德国布伦瑞克)，NCTC:英国典型菌种保藏中心(National Collection of Type Cultures；英国伦敦)，nd：未保藏(发明人英国阿伯丁的Rowett营养与健康研究所留有存货)。(2)nc：未培养。BHI(脑心浸液肉汤)，AN(营养琼脂)，BA(血琼脂)，MRS(Man,Rogosa和Sharp培养基)，LiB(肝肉汤，CECT培养基#15)，CZ(Colby和Zathman培养基，DSMZ培养基#606)，PDA(马铃薯葡萄糖琼脂),M2GSC(改良Hobson Med2,(1))。(3)用于包容性/排他性测试的基因组DNA(ng)。可能的话，使用10ng。由1ml生长停滞期的细菌培养物获得DNA，或对于nc菌株，直接由典型保藏中心获得的干培养物用合适的缓冲液补充水分以进行DNA提取，并用于DNA纯化。
实施例3.健康肠道和患病肠道中的粘膜相关普氏栖粪杆菌及亲缘组I和II的感染率。
考虑所有位点的所有数据，通过疾病状态，分析由总样品中的阳性测定结果计算出的普氏栖粪杆菌和两种亲缘组的流行率(图1)。CD患者的普氏栖粪杆菌的流行率低于H患者的普氏栖粪杆菌的流行率(图1)。具有I-CD特征的CD患者的普氏栖粪杆菌的流行率低于患有E1、E2、E3和C-CD的患者的普氏栖粪杆菌的流行率。除了I-CD的流行率值明显较低(降低至68％，P≤0.046)之外，流行率值的范围在81％-100％。
就亲缘组而言，已发现CD患者(尤其是回肠受累的患者)中两个亲缘组的流行率均低于H组和CRC组(P<0.001；图1)。CRC和UC患者中的流行率与H流行率保持相似。尽管如此，在溃疡性全结肠炎中，亲缘组I表现出低值的趋势，但可能是因处理的样品数量低而没有达到统计学显著性(P＝0.053)。类似地，IBS患者的亲缘组I的流行率仅低于H对象。
来自H和CRC患者的含有普氏栖粪杆菌的样品中，两个亲缘组分别在85.4％和85.0％的样品中共同出现。在10％的H和CRC对象中仅存在亲缘组I，而在4.2％的H对象中发现仅存在亲缘组II(图2A)。相反，具有普氏栖粪杆菌的16％的IBS、6％的UC和22％的CD患者既不携带亲缘组I也不携带亲缘组II，这暗示存在其他亲缘组。在IBD疾病部位之间观察到流行率差异。UC较不严重的所有患者(即E1和E2)具有所述两个普氏栖粪杆菌亲缘组或其中之一，类似H对象，而在23.1％的溃疡性全结肠炎患者中没有检测到任何亲缘组，尽管这些患者携有普氏栖粪杆菌(图2B)。类似地，所有CD患者中有22.2％没有显示任何一个亲缘组。在CD患者中，47.1％的C-CD患者具有两个普氏栖粪杆菌亲缘组，在回肠受累的患者中，更普遍的是存在唯一的亲缘组(44.4％的IC-CD和28.0％的I-CD患者)。值得注意的是，只要在I-CD中发现单个亲缘组，则其总是亲缘组II。
大部分H和CRC对象含有的两个亲缘组远远高于可检测水平，而IBS和IBD患者，特别是CD患者，其特征在于其中一个亲缘组的流行率降低。此外，在16％的携有普氏栖粪杆菌的IBS和22％的携有普氏栖粪杆菌的CD患者中，未检测到亲缘组I和亲缘组II。这些发现暗示着，在这些疾病中，普氏栖粪杆菌群体内部不平衡并且存在至少一个以上的亲缘组。
实施例4.健康和疾病时的粘膜相关普氏栖粪杆菌和亲缘组的丰度。
在患有不同肠道疾病的患者和H对象中，将所有活检样品合并后的普氏栖粪杆菌及其亲缘组的丰度比较(表17)。与健康对象相比，IBD和CRC患者中的普氏栖粪杆菌丰度较低(P<0.001)，而IBS患者与H组非常类似。如之前所报道(Lopez-Siles M,etal.International Journal of Medical Microbiology.2014；304:464-475)，在UC患者中，患有E1和E3的患者呈现的普氏栖粪杆菌负载与H对象呈现的普氏栖粪杆菌负载相似，而患有E2的患者的丰度在CD患者的丰度和H对象的丰度之间。在CD患者中，回肠受累患者呈现的该细菌水平最低，而C-CD患者与UC患者相似(表17)。
除了IBS患者之外，所分析的所有肠道疾病中的普氏栖粪杆菌亲缘组I负载均低于H对象，可能是由于纳入的患者数量少和数据的高度分散性所致。这种降低在CD患者中特别明显，CD患者的值比H对象的值低1000倍(P<0.001)。在根据疾病部位分析数据时，所有CD患者显示出亲缘组I丰度明显降低，并且患有E3的UC患者更类似于CD患者而非类似于具有其它UC疾病部位的患者。相反，在CD患者特别是回肠受累的患者(I-CD或IC-CD)中，普氏栖粪杆菌亲缘组II的丰度仅显著低于H的普氏栖粪杆菌亲缘组II的丰度(P<0.001)(表17)，这表明普氏栖粪杆菌的耗减影响整个栖粪细菌群落。
表17.对照(H)、肠易激综合症(IBS)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者的粘膜相关普氏栖粪杆菌及其亲缘组的丰度。对UC和CD患者的疾病部位作为独立组进行了分析。
*分别针对每个变量(列)计算统计数据。用相同的上标(a、b或c)表示普氏栖粪杆菌丰度或其亲缘组丰度相似的患者组，而不共享上标的组是平均丰度值在统计学上有差异的组(P<0.05)
§中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
我们的数据显示CRC和CD患者(特别是回肠受累的患者)中的粘膜相关普氏栖粪杆菌负载明显降低。在5％的CRC和20％的CD患者中，普氏栖粪杆菌低于该方法的检测限(每个反应中普氏栖粪杆菌的16S rRNA基因为106.6个)。UC患者的特征还有普氏栖粪杆菌丰度低于H对象的普氏栖粪杆菌丰度，但是相比CD和CRC患者中观察到的耗减，该耗减不那么普遍，减少了4倍。最后，IBS患者的丰度与H对象的丰度相似。我们的研究与之前在成人CD、UC和CRC中发现普氏栖粪杆菌丰度较低和/或流行率较低的报道一致。我们没有观察到IBS患者中普氏栖粪杆菌负载的耗减，但这种观察可能会因尚未按疾病类型分类的小群组规模而偏倚。
一般而言，这种定量分析表明，虽然亲缘组I丰度的耗减是异常肠道症状的一般特征，但普氏栖粪杆菌亲缘组II的耗减似乎是回肠疾病部位的CD患者特有的。
实施例5.粘膜相关普氏栖粪杆菌和亲缘组丰度作为诊断性生物标志物的有用性。
应用ROC曲线分析来测试总普氏栖粪杆菌丰度作为区分两组患者的指标的推定准确度，由此确认了该物种负载降低是区分CRC患者与H和IBS患者的良好辨别器，在设定的阈值下其AUC值大于0.8(图3)并且特异性为80％，灵敏度高于70％。还观察到在CD与H患者之间的良好的辨别性，但是对于相同的特异性值，灵敏度降低至62％。有趣的是，相比总普氏栖粪杆菌丰度，亲缘组I丰度是区分H与IBD对象的更准确的指标(图3)。当比较H对象和UC对象时，在设定的阈值下，对除了溃疡性直肠炎(E1)之外的所有疾病部位实现了超过76.60％的敏感度和超过57.14％的特异性。当仅考虑E3患者时，特异性提高至70％。此外，亲缘组I的丰度是特别准确的区分H和CD患者的生物标志物(灵敏度91.48％，特异性73.02％)，特别是对于I-CD患者，灵敏度可达91.48％，特异性可高达88.00％。虽然亲缘组II丰度可以准确地辨别H和CD对象，但AUC值略低于亲缘组I所获得的值，因此表明对于H状态，亲缘组I是更合适的生物标志物。相反，亲缘组II是辨别IBD亚型的有用的生物标志物，其获得了用于区分溃疡性全结肠炎患者和结肠受累的CD患者的最佳AUC值(亲缘组II AUC E3vsC-CD＝0.817)。
图3提供了粘膜相关普氏栖粪杆菌、亲缘组I和亲缘组II丰度用作生物标志物以通过接受者操作特征分析(ROC曲线)获得的曲线下面积(AUC)来区分不同的肠道病症并(通过部位)确定IBD亚型的适合性的热图。图4和5显示了用于比较选定组的ROC曲线、计算的AUC值以及最佳截断点的特异性和灵敏度值。此外，实例部分的末尾的表29-35提供了用于比较这些选定组的ROC曲线坐标。
总之，已发现粘膜相关普氏栖粪杆菌I(PHGI)丰度是肠道疾病(特别是IBD、CD和I-CD)的良好的生物标志物，因为PHGI丰度可以准确辨别H对象和肠道疾病患者，其H vs IBS+IBD+CRC的AUC为0.804，。相比总普氏栖粪杆菌丰度(AUC:0.724)或PHGII(AUC：0.693)，PHGI也是更好的辨别器。PHGI丰度的H+IBS vs IBD+CRC AUC为0.753。
此外，PHGI丰度显示出以高准确度(AUC：0.816)辨别H对象和IBD(UC+CD)患者，并且相比总普氏栖粪杆菌丰度(AUC：0.720)或PHGII(AUC：0.699)是更好的辨别器。
此外，相比总普氏栖粪杆菌负载，PHGI丰度是区分H对象与CD患者(AUC：0.858)的更准确的指标，并且特异性为80％，灵敏度为78％。此外，灵敏度值可高达91.48％，并保持73.02％的良好的特异性。更具体地，PHGI丰度显示为特别良好的回肠部位(I-CD)指标，灵敏度可达91.48％，特异性可高达88.00％。准确度值也优于总普氏栖粪杆菌丰度和PHGII所获得的准确度值(PHGI AUC：0.948对比总FP AUC：0.875和PHGII AUC：0.772)。
另一方面，PHGII丰度对IBD亚型显示出良好的辨别能力。特别是，PHGII丰度显示出以高准确度区分溃疡性全结肠炎患者(UC-E3)和结肠受累的CD(C-CD)患者(E3 vs C-CD，AUC为0.691)，这两种疾病可能呈现出相似的临床表现并且两者都位于结肠区域。鉴于UC和CD治疗和管理之间的区别，UC-E3和C-CD之间的准确辨别是有必要的。此外，已发现PHGII是C-CD和IC-CD之间的适当辨别器(AUC：0.611)，因此可以用作疾病从结肠进展至回肠区域的指标。
实施例6.粘膜中的普氏栖粪杆菌和亲缘组丰度与患者临床和治疗数据的相关性。
1.疾病活动状况
活跃和不活跃的UC患者之间的普氏栖粪杆菌和亲缘组丰度无差别(表18)。虽然没有达到统计学显著性，但相对于CD缓解期患者，活跃的CD患者显示出亲缘组I丰度显著降低(P＝0.106)。
表18.基于疾病活动状态的IBD患者中普氏栖粪杆菌及其亲缘组丰度。分别通过CDAI>150(Best,W.R.,et al.Gastroenterology,1976.70(3):p.439-44.)和Mayo评分>3(Pineton de Chambrun,G.,L.et al.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010.7(1):p.15-29.)来定义活跃的CD和UC。
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
在缓解期期间，普氏栖粪杆菌丰度(包括两个亲缘组)似乎仍然较低，此事实暗示这种耗减可能发生在疾病早期阶段或甚至在疾病发作之前，并且随时间而保持该改变后的状态，即使存在内镜检查和临床缓解。尽管没有观察到统计学显著性差异，但与不活跃的患者相比，活跃的CD患者呈现出亲缘组I水平降低。
2.肠切除
在经受肠切除的CD患者中，普氏栖粪杆菌丰度降低(表19)。有趣的是，这可能归因于较低的亲缘组II丰度，在接受切除的CD患者中亲缘组II丰度比未进行肠道手术的患者的亲缘组II丰度低10倍(P＝0.001)，而在接受切除的患者和未接受切除的患者之间，亲缘组I负载仅稍微降低。
表19.在疾病过程中接受或未接受过肠切除的炎症性肠病患者的普氏栖粪杆菌及其亲缘组丰度。
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
在接受切除的CD患者中检测到较低数量的普氏栖粪杆菌。这种降低也重现于亲缘组计数中。然而，在这种情况下，只有亲缘组II实现统计学显著性差异，可能是因为耗减更加明显。
3.药物治疗
最后，就治疗而言，在考虑采样时对患者的药物治疗的前提下分析数据(表20)。在任何IBD中没有观察到药物治疗对普氏栖粪杆菌或亲缘组丰度的差异。然而，没有接受治疗或接受美沙拉嗪的CD患者比接受中度免疫抑制剂或抗肿瘤坏死因子的患者具有更高的普氏栖粪杆菌负载。药物治疗并未与这些细菌指标恢复正常水平相关。
一般而言，我们观察到所用的药物治疗没有恢复粘膜相关普氏栖粪杆菌或其亲缘组的水平，这与之前的报道(Lopez-Siles M,et al.International Journal of MedicalMicrobiology.2014；304:464-475)一致。
表20.抽样时对炎症性肠病进行药物治疗的普氏栖粪杆菌及其亲缘组的丰度(中位数log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准差)。
*中位数log10 16S rRNA基因拷贝数/百万细菌16S rRNA基因拷贝数±标准差
§UC,溃疡性结肠炎；CD,克罗恩病
4.疾病持续时间
关于疾病的持续时间，在从发病起的时间与普氏栖粪杆菌和亲缘组丰度之间没有发现统计学显著相关性(表21)。
表21.在溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者中，发病后年数与粪便样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度之间的Spearman相关性系数和显著性。
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
实施例7.对粪便样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组进行定量的材料和方法
1.患者、临床数据和采样。
登记由20名IBD(12名CD和8名UC)以及12名H组成的西班牙群组(表22)。对象由Universitari Dr.Josep Trueta医院肠胃科服务部(西班牙赫罗纳)招募。对所有组匹配对象年龄和性别。根据临床标准、病理和内镜检查标准诊断IBD患者并根据蒙特利尔分类法(Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19Suppl A:5-36)进行分类。收集所有患者的临床相关数据。在收集样品前至少一个月内对象都没有接受抗菌治疗。
每个对象提供一个粪便样品，该粪便样品在排出后24小时内收集于UniversitariDr.Josep Trueta医院肠胃科服务部。将所有样品均质化，分装到2ml试管中并储存于-80℃直至使用。
这项工作于2015年1月由Universitari Dr.Josep Trueta医院临床研究伦理委员会(西班牙赫罗纳)和赫罗纳d’Assistència Sanitària研究所(西班牙Salt)批准。登记前获得对象的知情同意。
表22.对象的样品尺寸和临床特征
IBD,炎症性肠病；TNF,肿瘤坏死因子；nd,不确定；na,不适用
**采样时，可获知5/8的UC患者的医疗处理；可获知5/8的UC患者的发病年龄；无一例患者可以确定采样之前最后随访的疾病表现；可获知采样时4/8的UC患者的最大疾病程度；
§表示通过非参数统计检验来对组进行比较，且p值≤0.05被认为是显著的
χ2检验
曼-惠特尼U检验
2.样品处理和DNA提取。
使用 Soil Kit(Macherey-Nagel GmbH&Co。，Duren，德国)从200mg-500mg粪便样品中提取DNA。为了提高DNA回收率，将SL1(700μl)和Enhancer SX(150μl)加入每个样品中。此后，按照制造商的说明书提取和纯化DNA。用10mM Tris-HCl(pH7.4)洗脱基因组DNA并储存于-80℃直至使用。用NanoDrop ND-100分光光度计(NanoDropTechnologies，USA)测定提取物的DNA浓度和纯度。
3.qPCR分析。
根据实施例1中的详细描述进行qPCR测定。
4.数据归一化和统计分析。
根据实施例1中的详细描述进行数据归一化和统计分析。
实施例8.健康和疾病时的粪便中的普氏栖粪杆菌亲缘组I和II的流行率。
按照疾病状态和疾病部位分析由总样品中的阳性测定计算出的普氏栖粪杆菌亲缘组的流行率(表23)。发现这两个亲缘组在CD患者，特别是患有I-CD的患者中的流行率低于H对象。有趣的是，虽然C-CD患者的亲缘组I流行率较低，但IC-CD患者的特征是亲缘组II的流行率较低。相反，UC患者的亲缘组II流行率仅低于H对象，并且这仅在患有E2的患者中观察到。为了确认所观察到的趋势，优选地，应该用更大的患者群组进行附加分析。
表23.各诊断及IBD亚型中的普氏栖粪杆菌亲缘组的流行率。
与活检样品的结果相反，所有IBD患者至少携带一个普氏栖粪杆菌亲缘组。两个亲缘组共同出现在来自H的所有样品和来自IBD患者(75％的UC和66.7％的CD)的大多数样品中。在25％的CD(两名I-CD和一名IC-CD)和25％的UC(一名E2患者，另一名患者的疾病部位不能确定)中仅存在亲缘组I，而在CD患者(8.3％的CD对象)中发现仅存在亲缘组II。
实施例9.健康和疾病的粪便中普氏栖粪杆菌亲缘组的丰度。
比较患有不同肠道疾病的患者和H对象的粪便样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组的丰度(表24)。与H对象相比，在所分析的所有IBD患者中普氏栖粪杆菌亲缘组I负载降低。这种降低在CD患者中特别明显，CD患者的值比H对象的值低186倍。然而，观察到的差异没有得到统计学上的支持，可能是由于纳入的患者数量少以及数据的高度分散性。当根据疾病部位分析数据时，所有CD患者均显示出该亲缘组I丰度显著降低。UC患者的特征在于，其中间值在H和CD患者之间，并且不能如在活检中观察到的那样确定患有E3的患者是否相比于其他UC疾病部位的患者更类似于CD患者，因为该研究中仅纳入了一个该疾病部位的对象。与H相比，IBD患者，特别是结肠受累的患者(C-CD或IC-CD)的普氏栖粪杆菌亲缘组II丰度也有所降低(表24)，表明在这些患者的粪便中普氏栖粪杆菌的耗减影响整个粪便细菌群落。这些结果与在活检样品中观察到的结果相反，其中仅在回肠受累的患者中观察到亲缘组II的减少。应纳入更大数量的每个疾病部位的对象进行进一步分析，以验证这些观察结果。这可以由该亲缘组在粪便/粘膜之间的不同分布或因为疾病部位对炎症过程的影响不同来进行解释
表24.对照(H)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者的粪便中的普氏栖粪杆菌亲缘组的丰度。对UC和CD患者的疾病部位作为独立组进行分析。
中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
有趣的是，我们观察到对于H和UC患者，两个亲缘组丰度存在不平衡，其中亲缘组II数量超过10倍亲缘组I数量。相反，CD患者的特征是两个亲缘组丰度类似。这与活检样品中观察到的结果不一致，其中我们发现在H、CRC和IBS对象中两个亲缘组丰度相似，而在IBD患者中，亲缘组II数量超过亲缘组I.
在此，我们已经证实，粪便样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组负载在IBD部位之间存在差异。例如，与患有溃疡性全结肠炎的患者相比，远端UC患者的亲缘组II丰度特别受损。此外，该亲缘组也允许将I-CD患者与结肠受累的患者区别开来。
实施例10.粪便普氏栖粪杆菌亲缘组丰度作为诊断性生物标志物的有用性。
应用ROC曲线分析来测试粪便中的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度作为区分两组患者的指标的推定准确度，证实亲缘组I负载降低是CD患者(特别是回肠受累的患者)与H的良好辨别器，其AUC值大于0.75(图6)且在设定的阈值下特异性为80％，灵敏度高于58％，。为区分CD和UC实体所获得的值类似，并且对于IC-CD和E3之间，AUC值大于0.9，辨别性是优异的。相反，与活检中观察到的结果相比，该指标在H和UC患者之间的辨别能力较低。
亲缘组II丰度也可以辨别H与IBD对象，但不适合辨别UC与CD患者。然而在活检中，我们观察到亲缘组II的AUC值略低于由亲缘组I获得的AUC值，粪便中该指标的丰度是区分E3患者和结肠受累的CD患者(C-CD或IC-CD)的优异的生物标志物(AUC＝1.000)。
图6提供了粪便中的普氏栖粪杆菌、亲缘组I和亲缘组II丰度用作生物标志物以通过接受者操作特征分析(ROC曲线)获得的曲线下面积(AUC)来区分不同的IBD诊断并(通过部位)确定IBD亚型的适合性的热图。图7和8显示了用于比较选定组的ROC曲线、计算出的AUC值、以及最佳截止点的特异性和灵敏度值。此外，实施例部分的末尾的表35-41提供了用于比较这些选定组的ROC曲线坐标。
总之，已证实PHGI丰度的AUC为0.720，特别对于CD诊断的AUC为0.785，是粪便中用于诊断IBD的良好的生物标志物，在H对象与IBD患者之间显示出良好的辨别能力。PHGII丰度也显示出与CD有良好的相关性，但准确度值(AUC：0.715)略低于用PHGI丰度所获得的准确度值。因此，已证实PHGI丰度是粪便样品中用于检测IBD(并且特别是检测CD)的良好的生物标志物。
此外，已证实PHGII是C-CD和IC-CD之间的良好的辨别器(AUC：0.889)，这表明PHGII在确定先前已被诊断为患有C-CD的人类对象的疾病扩展至回肠区(IC-CD)上的潜在价值。此外，尽管ROC AUC值稍低，但PHGII也被指定为I-CD和IC-CD之间的合适的辨别器(AUC：0.667)，并且可能是用于确定先前已被诊断为患有I-CD的人类对象的疾病扩展至回肠区(IC-CD)的有用的生物标志物。
实施例11.粪便中的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度与患者临床和治疗数据的相关性。
1.疾病活动状况
在活跃的和不活跃的IBD患者之间，普氏栖粪杆菌亲缘组丰度无差异(表25)。与活检中观察到的结果相反，活跃的IBD患者的丰度高于不活跃的IBD患者的丰度。尽管没有达到统计学意义，但相对于缓解期的UC患者，不活跃的UC患者显示出亲缘组I丰度明显降低(P＝0.068)。
表25.各疾病活动状态的炎症性肠病患者中的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度。通过CDAI>150(Best,W.R.,et al.Gastroenterology,1976.70(3):p.439-44.)和Mayo评分>3(Pineton de Chambrun,G.,L.et al.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010.7(1):p.15-29.)来定义活跃的CD和UC。
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
2.肠切除
在经受肠切除的CD患者中，普氏栖粪杆菌丰度降低(表26)，这与活检中观察到的结果相符。有趣的是，这可能归因于两个亲缘组数量较少。然而，这些结果得不到统计学支持，可能是由于患者数量较少和数据的高度分散性。
表26.在疾病过程中接受过或未接受过肠切除的炎症性肠病患者的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度。
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
3.疾病持续时间
关于疾病的持续时间，在自发病起的时间与普氏栖粪杆菌亲缘组丰度之间没有发现统计学显著相关性(表27)，这与活检样品中获得的结果相符。
表27.在溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者中，发病后年数与粪便样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度之间的Spearman相关性系数和显著性。
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
4.采样时的药物治疗
最后，就治疗而言，在考虑采样时对患者的药物治疗的前提下分析数据(表28)。在任何疾病中均没有观察到药物治疗之间的普氏栖粪杆菌亲缘组丰度的差异。与活检相反，CD患者中没有观察到药物治疗之间的趋势。有趣的是，带抗肿瘤坏死因子的UC患者的粪便中的两个亲缘组的丰度与在H对象中观察到的类似。
表28.有炎症时的普氏栖粪杆菌丰度(中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差)
*中位值log10 16S rRNA基因拷贝/百万细菌16S rRNA基因拷贝±标准偏差
§UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病
最后，关于患者的临床数据，我们观察到在缓解期，粪便中的两个亲缘组负载保持较低，这与我们在活检中观察到的结果一致。然而，需要对较大的患者群组进行后续研究以证实这些观察结果，并且后续研究也将有助于确定粪便中的该两个亲缘组作为预后生物标志物的潜在用途。。
与之前的研究一致，在接受切除的CD患者中检测到较低数量的普氏栖粪杆菌(okol,H.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,2008.105(43):p.16731-16736；Lopez-Siles,M.,et al.International Journal of Medical Microbiology,2014.304(3–4):p.464-475)。我们关于亲缘组负载的结果与活检中观察到的结果一致。然而，在此情况下，没有达到统计学显著性差异，可能是由于参与的对象队伍较小。
一般而言，我们已观察到所用的药物不能恢复CD患者粪便中的粪便普氏栖粪杆菌亲缘组的水平，这与我们基于活检的观察结果一致。
表29.H vs IBS+IBD+CRC的粘膜相关样品的ROC曲线坐标
表30.H vs IBD的粘膜相关样品的ROC曲线坐标
表31.H vs CD的粘膜相关样品的ROC曲线坐标
表32.H vs I-CD的粘膜相关样品的ROC曲线坐标。
表33.E3 vs C-CD的粘膜相关样品的ROC曲线坐标。
表34.I-CD vs IC-CD的粘膜相关样品的ROC曲线坐标。
表35.C-CD vs IC-CD的粘膜相关样品的ROC曲线坐标。
表36.H vs IBD的粪便样品的ROC曲线坐标。
表37.H vs CD的粪便样品的ROC曲线坐标。
表38.H vs I-CD的粪便样品的ROC曲线坐标。
表39.C-CD vs E3-UC的粪便样品的ROC曲线坐标。
表40.I-CD vs IC-CD的粪便样品的ROC曲线坐标。
表41.C-CD vs IC-CD的粪便样品的ROC曲线坐标。
实施例12.对粪便样品中总普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌亲缘组和大肠杆菌进行定量的材料和方法。
1.患者、临床数据和采样
由Universitari Dr.Josep Trueta(西班牙赫罗纳)医院肠胃科服务部招募十一(11)名健康对象和二十三(23)名诊断为炎症性肠病(IBD)的患者、10名诊断为克罗恩病(CD)的患者和13名诊断为溃疡性结肠炎(UC)的患者。从这些志愿者中，在其不同治疗时间获得六十七(67)份粪便样品(26名CD，30名UC，11名健康对象的样品)(表42)。
根据标准临床、病理学和内镜检查标准诊断招募为IBD患者的对象，并根据蒙特利尔分类法(Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19 Suppl A:5-36)进行分类。招募的对照组由根据临床标准未患任何已知的胃肠疾病的健康对象组成。还收集了所有患者的临床相关数据(例如年龄、性别、钙卫蛋白水平或患病年数)。所有对象都签署了对应的知情同意书。排除标准包括：结肠镜检查前和术前1个月内进行了抗菌治疗。
表42.研究对象的临床和采样数据
这项工作于2016年5月18日由Universitari Dr.Josep Trueta医院临床研究伦理委员会(西班牙赫罗纳)和赫罗纳d’Assistència Sanitària研究所(西班牙Salt)批准。
2.样品收集、保藏和储存
每名对象提供粪便样本，该样品在排出后24h内收集在Universitari Dr.JosepTrueta医院的肠胃科服务部处。
3.样品处理和DNA提取
使用 Soil Kit(Macherey-Nagel GmbH&Co.，Duren，德国)提取DNA。简而言之，将30-70mg的粪便样品置于Nucleospin珠管中。为了提高DNA回收率，将700μl的SL1和150μl的Enhancer(SX)加入每个样品中。此后，按照制造商的说明书提取和纯化DNA。用100μl洗脱缓冲液洗脱基因组DNA并储存于-20℃中直至使用。使用Qubit dsDNA高灵敏度分析试剂盒，用Qubit荧光计(Invitrogen detection Technologies，USA)测定提取物的DNA浓度。在qPCR分析之前，用游离DNA水将DNA浓度调节至8ng/μl。
4.从粪便样品中提取的DNA的实时定量PCR(qPCR)
通过实时定量PCR分析粪便样品中的DNA。更具体地，我们评估了总普氏栖粪杆菌(FT)、普氏栖粪杆菌亲缘组I(PHGI)、普氏栖粪杆菌亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的数量。使用基于Taqman探针的试验，以实时定量PCR对细菌序列进行定量。引物和qPCR条件如实施例1中所述。
样品在同一平板中以一式两份重复试样试验。对于数据分析，使用重复试样定量的平均值。每个样品的细菌丰度表示为Ct，根据总DNA浓度进行归一化，其中Ct(循环阈值)定义为荧光信号越过阈值所需的qPCR循环次数。Ct水平与样品中目标核酸浓度的对数成反比。实时试验经历40个扩增循环。
对于实施例1，引入了方法差异。细菌拷贝数未根据总细菌16S rRNA基因拷贝进行归一化，但Ct根据总DNA浓度进行归一化。FT、PHGI、PHGII和EC的新试验由GoTaq qPCRMaster Mix 2x(Promega，Wisconsin，USA)代替Taqman Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)组成。所有细菌引物均购自Macrogen(韩国汉城)。使用AriaMx PCR系统(Stratagene by Agilent，Santa Clara，CA，USA)进行所有定量PCR，并使用1.2版AriaMx软件(Stratagene by Agilent，Santa Clara，CA，USA)进行分析。
引入的所有差异都经过验证，并且观察到方法之间没有差异。
5.统计分析方法
通过Kolmorov-Smirnov检验分析数据的统计学正态分布。根据数据是否存在统计学正态分布，使用适当的统计检验来比较以下各组。正态t检验用于比较正态分布的组，而Mann-Withney非参数检验用于比较非正态分布的组。所分析的组为：健康的vs CD，健康的vs UC和CD vs UC，以及两种疾病的不同部位：CD与远端(E2)UC和广泛性(E3)UC的回肠(I)、回结肠(IC)和结肠(C)。
-本文所述的与总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌对应的四种细菌序列以Ct表示的定量；和
-这四种细菌序列的定量比率。
通过从第一序列的定量水平减去第二序列的定量水平获得总普氏栖粪杆菌亲缘组、亲缘组I、亲缘组II和大肠杆菌之间的不同比率。
此外，还进行了接受者操作特征(ROC)曲线分析，即真阳性率(灵敏度)vs假阳性率(1-特异性)的绘图，以评估普氏栖粪杆菌和每个亲缘组对区分不同的肠道疾病的有用性。通过ROC曲线下面积(AUC)来测量辨别的准确度。而AUC接近1表示该测试高度灵敏并具有高度特异性，AUC接近0.5表示该测试既不灵敏也不具有特异性。灵敏度和特异性值以百分比(％)表示。
所有统计分析均使用SPSS 15.0统计软件包(LEAD Technologies，Inc.)进行。P值≤0.05时确定显著性水平。使用GraphPad Prism 6进行制图。
实施例13.健康和患病时的粪便中的普氏栖粪杆菌亲缘组I和II的流行率
根据疾病状态(CD和UC)和疾病部位(CD与远端UC(E2)和广泛性UC(E3)的回肠(I)、回结肠(IC)和结肠(C))，分析由总样品中的阳性测定计算出的普氏栖粪杆菌亲缘组的流行率(表43)。CD患者中两个亲缘组的流行率均低于健康个体两个亲缘组的流行率，但亲缘组Ⅰ明显比亲缘组II降低更多。有趣的是，相比I-CD和IC-CD，C-CD样品的亲缘组I具有较低的流行率，而仅在C-CD中中存在亲缘组II的减少。
与实施例8相反，UC患者仅相对于健康个体具有较低的亲缘组I流行率。与远端UC相比，在广泛性UC中，这种较低的流行率是专有的。
表43.各诊断和IBD亚型中的普氏栖粪杆菌亲缘组的流行率。
实施例14.健康和疾病时的粪便总普氏栖粪杆菌、亲缘组和大肠杆菌的丰度
分别比较健康对象(H)和不同IBD患者(H vs CD、H vs UC)的粪便样品的生物标志物的丰度(表44；图9A至9E)。还比较健康对象与IBD(同时考虑CD和UC患者)(图9F至9I)。
与H对象相比，在所分析的IBD患者中总普氏栖粪杆菌负载降低(图9A)。在CD患者中观察到的差异为统计学差异，但在UC患者中该差异没有得到统计学支持。
普氏栖粪杆菌PHGI的Ct和PHGII的Ct增加，与H相比，在IBD患者中其丰度减少(图9B和9C的数字)。然而，仅在CD患者中PHGI丰度显著降低(图9C)，CD和UC患者中PHGII丰度均下降(图9C)。
与H对象相比，在IBD中大肠杆菌丰度显著增加(图9D)。这种增加在CD患者中特别明显。此外，与UC患者相比，CD患者的大肠杆菌丰度显著增加(图9E)。
正如所预期的那样，在比较H与IBD疾病时，IBD患者中的总普氏栖粪杆菌及其亲缘组丰度减少(图9F至9H)，而大肠杆菌负载增加(图9I)。
总之，在CD患者中，微生物谱的特征在于FT、PHGI和PHGII丰度降低而大肠杆菌增加。对于UC患者，该微生物谱种PHGII减少而大肠杆菌增加。
表44.对照(H)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度。CD患者的疾病部位作为独立组进行分析。
*p值<0.05**p值<0.01***p值<0.001
还比较了健康样品与CD和UC样品之间的生物标志物比率(表45)。与健康样品相比，IBD样品中的比率FT/EC，PHGI/EC和PHGII/EC显著增加。此外，还观察到三个比率在CD、UC和健康个体中的显著差异(图10A、图10B和图10C)。与健康样品相比，CD中的FT/PHGI比率也显著提高(图10D)。最后，没有在三个组的PHGI/PHGII和FT/PHGI比率之间观察到统计学差异。
此外，在对比H比率与IBD比率时，在比率FT/EC，PHGI/EC和PHGII/EC中还观察到显著差异(图10E至10G)。
总之，由于在比较CD或UC与H或比较CD与UC观察到的差异，我们可以推断出IBD样品由粪便微生物谱中的FT/EC、PHGI/EC和PHGII/EC计数的变化表示，并且FT/PHGI的变化是UC样品专有的。
表45.由不同细菌标志物的比率表示的细菌丰度(以Ct表示)
*p值<0.05**p值<0.01***p值<0.001
实施例15.粪便普氏栖粪杆菌亲缘组丰度作为诊断性生物标志物的有用性
进行ROC曲线分析以测试粪便总普氏栖粪杆菌、其亲缘组和大肠杆菌丰度作为区分两个患者组的指标的推定准确度。图11中提供了结果。
最能辨别健康消化状态的微生物谱由大肠杆菌(H vs CD-AUC:0.860，灵敏度为81.8，特异性为76.9，图11A；H vs UC-AUC:0.715，灵敏度为72.7，特异性为66.7，图11D)、FT/PHGI(H vs CD-AUC:0.706，灵敏度为63.6，特异性为73.1，图11B；H vs UC-AUC:0.647，灵敏度为63.6，特异性为70，图11E)和FT/PHGII(H vs CD-AUC:0.675，灵敏度为54.5，特异性为65.4，图11C；H vs UC-AUC:0.682，灵敏度为72.7，特异性为63.3，图11F)组成。图11A至11F的数字描述了细菌生物标志物定义健康个体的性能。
若干标志物AUC值大于0.70，已被证实是CD患者的良好辨别器(图11G至11L)。更具体地，总普氏栖粪杆菌(AUC：0.755，灵敏度为80.8，特异性为72.7，图11G)、普氏栖粪杆菌亲缘组I(AUC：0.710，灵敏度为65.4，特异性为81.8，图11H)、普氏栖粪杆菌亲缘组II(AUC：0.797，灵敏度为76.9，特异性为72.7，图11I)、FT/EC(AUC：0.867，灵敏度为80.1，特异性为81.8，图11J)、PHGI/EC(AUC：0.885，灵敏度为88，特异性为72.7，图11K)和PHGII/EC(AUC：0.874，灵敏度为80.1，特异性为81.8，图11L)。
相同的标志物已被证实为UC的良好辨别器，但相反，与CD患者中观察到的结果以及AUC在0.745和0.635之间相比，标志物的辨别能力较低(图11M至11R)：总普氏栖粪杆菌(AUC：0.635，灵敏性为63.3，特异性为72.7，图11M)、普氏栖粪杆亲缘组I(AUC：0.642，灵敏度为60，特异性为63.6，图11N)、普氏栖粪杆亲缘组II(AUC：0.700，灵敏度为63.3，特异性为63.6，图11O)，FT/EC(AUC：0.727，灵敏度为70，特异性为72.7，图11P)，PHGI/EC(AUC：0.745，灵敏度为70，特异性为72.7，图11Q)和PHGII/EC(AUC：0.745，灵敏度为80，特异性为63.6，图11R)。
最后，已发现两种标志物和三个比率的AUC在0.600和0.669之间，是辨别CD和UC疾病的良好的辨别器(图11S至11X)：普氏栖粪杆菌亲缘组I(AUC：0.600，灵敏度为61.5和特异性为60，图11S)、普氏栖粪杆菌亲缘组II(AUC：0.623，灵敏度为65.4，特异性为66.7，图11T)、大肠杆菌(AUC：0.672，灵敏度为60，特异性为57.7，图11U)、FT/EC(AUC:0.642，灵敏度为61.5，特异性为56.7，图11V)，PHGI/EC(AUC:0.669，灵敏度为61.5，特异性为66.7，图11W)和PHGII/EC(AUC:0.662，灵敏度为61.5，特异性为63.3，图11X)。
此外，三种标志物和三个比例的AUC在0.674至0.805之间，已被证明是区分H和IBD(CD和UC两种疾病一起)的良好辨别器(图11Y至11AD)：总普氏栖粪杆菌(AUC：0.691，灵敏度为71.4，特异性为72.7，图11Y)、普氏栖粪杆菌亲缘组I(AUC:0.674，灵敏度为60.7，特异性为72.7，图11Z)、普氏栖粪杆菌亲缘组II(AUC:0.745，灵敏度为69.6，特异性为72.7，图11AA)、FT/EC(AUC:0.789，灵敏度为80.4，特异性为72.7，图11AB)、PHGI/EC(AUC:0.805，灵敏度为76.8，特异性为72.7，图11AC)和PHGII/EC(AUC:0.797，灵敏度为73.2，特异性为72.7，图11AD)。
总之，已发现CD疾病的最佳辨别器为FT/EC、PHGI/EC和PHGII/EC比值，AUC值高于0.850，灵敏度和特异性超过80％。
至于UC，即使标记物的辨别能力较低，但也已证明最佳辨别器为比率PHGI/EC和PHGII/EC，AUC值为0.745，灵敏度超过70％。
下面的图提供了上述所有标志物的ROC曲线、AUC值和最佳截断点的特异性和灵敏度值。
实施例16.不同病变部位的CD中的总普氏栖粪杆菌、亲缘组和大肠杆菌的丰度及其作为根据疾病部位/扩展进行鉴别诊断的生物标志物的有用性。
实施例16.1.丰度
通过疾病部位分析CD样品，研究了回肠(I-CD)、结肠(C-CD)和回结肠(IC-CD)部位。
对于炎症位于结肠的患者，总普氏栖粪杆菌和亲缘组I(PHGI)丰度显著降低，而对于炎症位于回肠的患者，PHGII丰度显著增加(表46，图12)。
表46.在结肠、回结肠和回肠部位的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度。
*p值<0.05**p值<0.01***p值<0.001
还比较了所研究的不同部位的标志物内部的比率。当对结肠和回结肠部位进行比较时，FT/PHGI和PHGI/EC显示出显著差异，而FT/PHGII在结肠和回肠部位之间显示出显著差异(表47，图13)。
表47.由不同细菌标志物的比率表示的细菌丰度(以Ct表示)
*p值<0.05**p值<0.01***p值<0.001
实施例16.2有用性
进行ROC曲线分析以测试粪便普氏栖粪杆菌总数、其亲缘组和大肠杆菌丰度及其比率作为区分不同疾病部位的指标的推定准确度。
CD患者的回肠部位
从图14中我们可以观察到，四种标志物的AUC在0.632和0.789之间，已被证实是CD患者回肠部位的良好辨别器。更具体地，总普氏栖粪杆菌(AUC：0.632，灵敏度为83.3，特异性为47.4，图14A)、大肠杆菌(AUC：0.667，灵敏度为83.3，特异性为57.9，图14B)、PHGI/PHGII(AUC：0.711，灵敏度为83.3，特异性为57.9，图14C)和FT/PHGII(AUC：0.789，灵敏度为83.3，特异性为78.9，图14D)。
CD患者的回结肠部位
关于回结肠部位，只有一种标志物，即FT/PHGI，被证实为良好的辨别器，其AUC为0.779，灵敏度为78.6，特异性为72.7(图15)。
CD患者的结肠部位
最后，对于CD患者的结肠部位，7种标志物已被证实为良好的辨别器(图16)。更具体地，总普氏栖粪杆菌(AUC：0.755，灵敏度为80.0，特异性为75.0，图16A)、PHGI(AUC：0.845，灵敏度为80.0，特异性为80.0，图16B)、PHGII(AUC：0.685，灵敏度为60.0，特异性为85.0，图16C)、FT/EC(AUC：0.770，灵敏度为80.0，特异性为80.0，图16D)，PHGI/PHGII(AUC：0.640，，灵敏度为60.0，特异性为55.0，图16E)、PHGI/EC(AUC：0.770，灵敏度为80.0，特异性为85.0，图16F)和PHGII/EC(AUC：0.670，灵敏度为60.0，特异性为80.0，图16G)。
实施例17.C-CD和UC中的总普氏栖粪杆菌、亲缘组和大肠杆菌的丰度及其作为用于C-CD和UC之间的鉴别诊断的生物标志物的有用性
结肠CD和UC之间的鉴别诊断与临床实践相关。因此我们在这两组的细菌标志物和比率之间进行了比较。与UC患者相比，在结肠病变的CD患者中观察到普氏栖粪杆菌亲缘组I和II以及大肠杆菌的丰度较低(表48)。至于比率，PHGI/EC、PHGII/EC和FT/PHGI在这两组之间显示出显著差异(表49)。
表48.结肠CD部位和UC患者的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度。
表49.由不同细菌标志物的比率表示的细菌丰度(以Ct表示)。
进行ROC曲线分析以测试粪便普氏栖粪杆菌总数，其亲缘组和大肠杆菌丰度及其比率作为区分结肠病变的CD患者和UC患者的指标的推定准确度。从图17中我们可以观察到，三种标志物的AUC在0.637和0.880之间，被证实为UC的良好辨别器。更具体地，大肠杆菌(AUC：0.780，灵敏度为80，特异性为80，图17A)，FT/PHGI(AUC：0.880，灵敏度为73.3，特异性为100，图17B)，FT/PHGII(AUC：0.637，灵敏度为80，特异性为60，图17C)。
7个标志物与区分结肠部位CD患者相关：FT(AUC：0.740，灵敏度为80和特异性为73.3，图18A)、PHGI(AUC：0.83，灵敏度为80和特异性为90，图18B)、PHGII(AUC：0.773，灵敏度为80，特异性为66.7，图18C)、FT/EC(AUC：0.760，灵敏度为80，特异性为90，图18D)，PHGI/PHGII(AUC：0.663，灵敏度为60，特异性为66.7，图18E)、PHGI/EC(AUC：0.860，灵敏度为80，特异性为100，图18F)，PHGII/EC(AUC：0.787，灵敏度为80，特异性为80，图18G)。
综上所述，UC和病变结肠的CD患者的鉴别诊断的最佳标志物为EC、PHGI、FT/PHGI、PHGI/EC和PHGII/EC。
实施例18.细菌生物标志物丰度及其在确定克罗恩病和溃疡性结肠炎疾病活动中的有用性
实施例18.1丰度
根据钙卫蛋白值是否小于或大于250μg/g来比较CD和UC患者粪便样品中生物标志物的丰度。钙卫蛋白浓度作为肠粘膜炎症的非侵入性标志物，其通常用作确定IBD疾病活动的参考标志物，即钙卫蛋白值大于250μg/g被认为是高水平的炎症反应的体征(表50)。在钙卫蛋白水平超过250μg/g的组中，总普氏栖粪杆菌及亲缘组负载显著降低，然而，尽管CD和UC中的FT均降低(图19A和19B)，但CD患者中仅PHGII丰度降低(图19C)，而UC患者中仅PHGI丰度降低(图19D)。此外，大肠杆菌丰度没有显示出显著差异。
总之，已发现总普氏栖粪杆菌为疾病活跃的标志物(即，与钙卫蛋白值超过250μg/g相关联)。此外，有趣的是，PHGI似乎是活跃的UC专有的标志物，同时也发现PHGII为活跃的CD专有的标志物。
表50.不同范围钙卫蛋白之间的的CD和UC患者的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度
还根据钙卫蛋白值比较了CD和UC患者中的FT/EC、FT/PHGI、FT/PHGII、PHGI/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC比率(表51)。对于CD患者，只有PHGII/EC的比例显示出显著增加的趋势(图20D)，而在UC患者中显著表现出三种标志物：FT/PHGI(图20A)、PHGI/PHGII(图20B)和PHGI/EC(图20C)。这些数据与上述结果一致，对该标志物进行了独立研究，其中PHGII代表活跃的CD疾病，PHGI代表活跃的UC。
表51.钙卫蛋白大于或小于250μg/g的CD和UC患者的FT/EC、FT/PHGI、FT/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC比率
此外，通过Spearman相关性来研究CD和UC患者中的钙卫蛋白浓度与不同标志物及其比率之间的相关性。如所预期，在CD和UC中，FT与钙卫蛋白浓度正相关，此外，在UC患者中，PHGI也与粪便钙卫蛋白正相关，而CD中显示出PHGII与CD正相关的趋势(表52)。就比率而言，只观察到趋势(表52)。
表52.CD和UC患者中钙卫蛋白浓度与粪便总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度和比率之间的Spearman相关性。
实施例18.2有用性
此后，进行ROC曲线分析来测试总普氏栖粪杆菌、其亲缘组、大肠杆菌丰度及其比率作为区分钙卫蛋白水平低于250μg/g和钙卫蛋白水平高于250μg/g的指标的推定准确度。
不同的标志物被证实为CD疾病的良好辨别器(图21)，更具体地，该标志物为总普氏栖粪杆菌(AUC：0.940，灵敏度为80，特异性为100，图21A)、普氏栖粪杆菌亲缘组I(AUC：0.820灵敏度为80，特异性为60，图21B)、普氏栖粪杆菌亲缘组II(AUC：1.000，灵敏度为100，特异性为100，图21C)、FT/EC(AUC：0.840，灵敏度为80，特异性为80，图21D)、PHGI/EC(AUC：0.640，灵敏度为60，特异性为80，图21E)和PHGII/EC(AUC：0.880，灵敏度为100，特异性为80，图21F)。
此外，若干标志物被证实为良好的UC辨别器(图22)：总普氏栖粪杆菌(AUC：0.900，灵敏度为100，特异性为75，图22A)、普氏栖粪杆菌亲缘组I(AUC:1.000，灵敏度为100，特异性为100，图22B)、普氏栖粪杆菌亲缘组II(AUC:0.700，灵敏度为60，特异性为87.5，图22C)、FT/EC(AUC:0.725，灵敏度为60，特异性为87.5，图22D)、FT/PHGII(AUC:0.725，灵敏度为80，特异性为62.5，图22E)、PHGI/PHGII(AUC:0.825，灵敏度为80，特异性为87.5，图22F)、PHGI/EC(AUC:0.925，灵敏度为100，特异性为87.5，图22G)和PHGII/EC(AUC:0.700，灵敏度为60，特异性为807.5，图22H)。
重点要强调的是，尽管一些标志物是两种疾病常见的辨别器，但就超过250μg/g的钙卫蛋白水平而言，PHII似乎是CD疾病的优选辨别器，而PHI是UC疾病的优选辨别器，因为AUC为1.000，而灵敏度和特异性都为100％(分别为图21C和22B)。
实施例19.细菌生物标志物丰度及其用于克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的疾病监测的有用性
在两个不同的临床实践检查时间点(T0和T1)收集8名克罗恩病(CD)患者和7名溃疡性结肠炎(UC)患者(诊断超过6个月)的粪便样品。根据炎症反应定义疾病活动并且对两个患者组进行随访，通过测量粪便钙卫蛋白浓度来观察炎症活动。粪便钙卫蛋白水平高于250μg/g认为是高水平的炎症反应，粪便钙卫蛋白水平低于250μg/g认为是非炎症反应。
对于这些患者组中的每一组，仅考虑独立于治疗时的钙卫蛋白测量结果来定义两个亚组：
(+)炎症活动增加：两个时间点的样品中粪便钙卫蛋白水平的增加至超过250μg/g的患者。
(-)炎症活动减少：两个时间点的样品中粪便钙卫蛋白水平的下降至低于250μg/g的患者。
分析两个时间点的样品中的总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度，并比较其炎症活动进展。
在炎症活性进展不同的CD患者中，在细菌标志物丰度(表53)和比率(表54)中观察到非统计学差异。
相反，观察到UC的FT和PHGI呈现出统计学显着性差异(表55)。在监测期间，这两个标志物的丰度在炎症活动呈现出增加的患者中显著降低。类似地，在UC患者中比率FT/PHGI也随炎症活动进展增强而呈现出显著差异(表56)。
为了测试两个时间点的样品之间的相关性(表57)，进行了Pearson和Spearman相关性检验。在UC患者中检测到FT显著相关性，并且观察到PHGII/EC的趋势。
总之，细菌标志物丰度及其比率(尤其是FT、PHGI和FT/PHGI)的测定对于UC患者的随访是有用的。
表53.根据钙卫蛋白测量结果，炎症进展不同(炎症活动增加(+)和炎症活动减少(-))的克罗恩病患者(CD)的两时间点样品(T0和T1)中细菌标志物的丰度：
表54.根据钙卫蛋白测量结果，炎症进展不同(炎症活动增加(+)和炎症活动减少(-))的克罗恩病患者(CD)的两时间点样品(T0和T1)中细菌标志物的比率：
表55.根据钙卫蛋白测量结果，炎症进展不同(炎症活动增加(+)和炎症活动减少(-))的溃疡性结肠炎患者(UC)的两时间点样品(T0和T1)中细菌标志物的丰度：
表56.根据钙卫蛋白测量结果，炎症进展不同(增加的炎症活性(+)和减少的炎症活性(-))的溃疡性结肠炎患者(UC)的两时间点样品(T0和T1)中细菌标记物的比率：
表57根据钙卫蛋白测量结果，炎症进展不同(炎症活动增加(+)和炎症活动减少(-))的克罗恩病患者(CD)的两个不同时间点的样品(T0和T1)的细菌标志物的丰度和比率之间的Pearson和Spearman相关性。
实施例20.细菌生物标志物丰度及其在预测克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗功效中的有用性
收集在炎症反应方面疾病活跃并且未进行生物治疗的4名克罗恩病(CD)和3名溃疡性结肠炎(UC)患者的粪便样品。(通过测量钙卫蛋白浓度)记录其对生物治疗(抗TNF试剂)的炎症反应并且根据其对治疗的响应将患者分组：
-响应者：在生物治疗诱导后，显示钙卫蛋白水平下降至低于250μg/g的对象。*
-无响应者：在生物诱导后，显示钙卫蛋白水平增加的对象。*
*诱导：给予不同治疗用量来实现治疗剂量的时间段。
研究在进行生物治疗前这些患者的粪便总普氏栖粪杆菌、亲缘组I、亲缘组II和大肠杆菌的丰度，以便测定这些细菌标志物对治疗功效的预测潜力(表16)。无论是CD还是UC患者，响应者与无响应者之间的差异均无显著性差异，这可能是由于纳入研究的对象数量较少。
尽管如此，观察到趋势(图23)。与响应者相比，在无响应者中CD和UC的FT Ct增加了28.57％和26.58％。UC和CD的PHGI Ct也增加(分别为26.80％和53.94％)。在UC的无响应者中，PHGII Ct增加66.82％。相反，在UC和CD的无响应者中EC Ct都减少(分别为-20.91％和14.53％)。
已发现CD无响应对象的特征在于微生物谱中FT和PHGI负载低并且EC负载高。UC无响应者的特征在于FT和PHGII负载低并且EC负载高。
表58.在响应者和无响应者CD之间，CD和UC患者的粪便总普氏栖粪杆菌(FT)、亲缘组I(PHGI)、亲缘组II(PHGII)和大肠杆菌(EC)的丰度
还计算了粪便总普氏栖粪杆菌、亲缘组I、亲缘组II和大肠杆菌的丰度之间的比率：FT/EC、FT/PHGI、FT/PHGII,PHGI/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC(表59)。再次由于样本量小，只观察到趋势。在UC中可见更多明显的差异，其中，在无响应的对象中，FT/EC、FT/PHGII和PHGI/PHGII比率趋于增加，而无响应CD患者仅FT/EC比率趋于增加(图24)。
表59.分类为响应者和无响应者的CD和UC患者的FT/EC、FT/PHGI、FT/PHGII、PHGI/PHGII、PHGI/EC和PHGII/EC比率。
尽管所研究的患者数量少，但在钙卫蛋白水平对生物治疗进行响应的患者与不响应的患者之间观察到了有趣的趋势。
在实施例2中，测定了健康和患病时的粪便总普氏栖粪杆菌、亲缘组和大肠杆菌的丰度。这表明，与健康对象相比，CD患者和UC患者的大肠杆菌丰度均增加，而CD患者的PHGII减少并且FT和PHGI降低。
在本实施例中，我们观察到，大肠杆菌丰度增加或FT及其亲缘组负载降低可以预测UC和CD患者在抗-TNF治疗下的炎症反应。
结论是，钙卫蛋白值改善可能与微生物状态改善有关，因为响应患者的标志物值接近健康状况下观察到的标志物值。
序列表
<110> 赫罗纳大学
赫罗纳约瑟夫特鲁塔博士生物医学研究基金会
古德盖特公司
<120> 普氏栖粪杆菌亲缘组I和/或亲缘组II成员的定量方法及其作为生物标志物的用途
<130> 901 588
<150> 15 382 427.1
<151> 2015-08-11
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> Fpra 136F; F. prausnitzii phylogroups forward primer
<400> 1
ctcaaagagg gggacaacag tt 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Fpra 232R; F. prausnitzii phylogroups reverse primer
<400> 2
gccatctcaa agcggattg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> PHG1 180PR oligont; Phylogroup I probe (unmodified oligonucleotide)
<400> 3
taagcccacg acccggcatc g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> PHG2 180PR oligont; Phylogroup II probe (unmodifiedoligonucleotide)
<400> 4
taagcccacr gctcggcatc 20
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> Fpra 428 F; F. prausnitzii total forward primer
<400> 5
tgtaaactcc tgttgttgag gaagataa 28
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> Fpra 583 R; F. prausnitzii total reverse primer
<400> 6
gcgctccctt tacaccca 18
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Faecalibacterium prausnitzii
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> Fpra 493 PR oligont; F. prausnitzii total probe (unmodifiedoligonucleotide)
<400> 7
caaggaagtg acggctaact acgtgccag 29
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacterial DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> F_Bact 1369; Total bacteria forward primer
<400> 8
cggtgaatac gttcccgg 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacterial DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> R_Prok_1492; Total bacteria reverse primer
<400> 9
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacterial DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> P_TM_1389F oligont; Total bacteria probe (unmodifiedoligonucleotide)
<400> 10
cttgtacaca ccgcccgtc 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal Amplification Control (IAC)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> IAC F; IAC forward primer
<400> 11
tacggatgag gaggacaaag ga 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal Amplification Control (IAC)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> IAC R; IAC reverse primer
<400> 12
cacttcgctc tgatccattg g 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal Amplification Control (IAC)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> IAC PR oligont; IAC probe (unmodified oligonucleotide)
<400> 13
cgccgctatg ggcatcgca 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli 395 F; E.coli forward primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 14
catgccgcgt gtatgaagaa 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli 490 R; E.coli reverse primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 15
cgggtaacgt caatgagcaa a 21
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli 437 PR; E.coli probe (unmodified oligonucleotide)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<400> 16
tattaacttt actcccttcc tccccgctga a 31

Claims (29)

1.用于对对象肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度进行体外测定的方法；
其中PHGI丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：3或具有其至少75％一致性的序列的引物和/或探针；并且
其中PHGII丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：4或具有其至少75％一致性的序列的引物和/或探针。
2.用于获得检测人类对象肠道疾病和/或预测药物在人类对象肠道疾病的治疗性治疗中的功效的有用信息的方法，所述方法包括根据权利要求1所述的方法测定PHGI和/或PHGII的丰度；
其中所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)。
3.用于检测人类对象肠道疾病的方法，其包括以下步骤：
a.根据权利要求1所述的方法测定所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；以及
b.对所述对象样品中的PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合与参考样品的对应值进行比较，
其中上述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病；
其中所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)；并且其中所述参考样品优选为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为用于人类对象肠道疾病的筛查和/或诊断的方法，并且所述参考样品为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为用于监测人类对象肠道疾病的活动和/或进展的方法，并且所述参考样品为同一对象的先前样品。
6.用于预测对患有IBD的人类对象的治疗功效的方法，其中所述方法包括：
a.根据权利要求1所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
b.比较对象样品的所述PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度与参考样本的对应值，
其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示对治疗的响应可能性增加；并且
其中所述参考样品优选为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述肠道疾病为IBD，优选溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选CD。
8.用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法，其包括以下步骤：
a.根据权利要求1所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和
b.对对象样品中的PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，与要区分IBD表型的参考样品的对应值进行比较，以确定对象所患有的IBD表型；
其中呈现出与所述IBD表型之一显著相似的值的对象样品将指示所述对象患有所述IBD表型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述IBD表型选自：
-CD表型，其由一个或更多个以下参数，优选所有以下参数定义：
ο疾病部位；
ο诊断年龄；和
ο表现
-UC表型，其由一个或更多个以下参数，优选所有以下参数定义：
ο疾病部位或扩展；以及
ο严重性。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其特征在于，所述IBD表型选自：
-由回肠CD(I-CD)、回结肠CD(IC-CD)和结肠CD(C-CD)组成的CD表型；和
-由溃疡性直肠炎(UC-E1)、远端结肠炎(UC-E2)和广泛性UC或全结肠炎(UC-E3)组成的UC表型。
11.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其特征在于，要区分的所述IBD表型为C-CD与UC或C-CD与UC-E3。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，通过选自以下的分子方法进行PHGI和/或PHGII丰度测定，以及可选地进行FT和/或EC丰度定量：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR-ELISA，优选通过qPCR进行定量。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，用具有序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列的引物以及具有序列SEQ ID NO：3或与其具有至少75％一致性的序列的探针进行PHGI丰度测定。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，用具有序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列的引物以及具有序列SEQ ID NO：4或与其具有至少75％一致性的序列的探针进行PHGII丰度测定。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的方法，其特征在于，用具有序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或与其具有至少75％一致性的序列的引物以及具有序列SEQ ID NO：7或与其具有至少75％一致性的序列的探针进行FT丰度测定。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法，其特征在于，用具有序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15或与其具有至少75％一致性的序列的引物以及具有序列SEQ ID NO：16或与其具有至少75％一致性的序列的探针进行EC丰度测定。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的方法，其特征在于，与FT丰度和/或EC丰度的所述数学组合为选自以下的比率：PHGI丰度/EC丰度、PHGII丰度/EC丰度、FT丰度/PHGI丰度、和FT丰度/PHGII丰度，所述丰度测定通过qPCR进行并表示为阈值循环(Ct)值，并且所述比率是通过从第一Ct值减去第二Ct值而获得。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其特征在于，在测定PHGI和/或PHGII丰度并且可选地测定FT和/或EC丰度之前，从所述肠道样品总提取DNA。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其特征在于，对所述PHGI和/或PHGII丰度水平，以及可选地上述FT和/或EC丰度水平进行归一化，其中所述归一化相对于总细菌定量或DNA浓度进行。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其特征在于，所述肠道样品选自粘膜活检查样品和粪便样品，优选为粪便样品。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测和/或定量肠道疾病的一种或多种其他生物标志物，所述肠道疾病优选为IBD，并可选地包括结合PHGI丰度、PHGII丰度和/或所述另外的生物标志物检测和/或定量结果与肠道疾病的其他指标。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述方法结果存储在数据载体中，优选地所述数据载体为计算机可读介质。
23.人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合、和/或可选地上述任一种与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，作为用于检测肠道疾病和/或用于预测药物对肠道疾病的治疗功效的生物标志物的用途，
其中，根据权利要求1所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII丰度；并且
其中所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述肠道疾病为炎症性肠病(IBD)，优选为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选为CD。
25.人类对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)丰度、和/或其数学组合、和/或可选地上述任一种与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，作为用于IBD表型的鉴别诊断的生物标志物的用途，
其中，根据权利要求1所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII丰度。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的用途，其特征在于，与FT丰度和/或EC丰度的所述数学组合选自以下的比率：PHGI丰度/EC丰度、PHGII丰度/EC丰度、FT丰度/PHGI丰度、和FT丰度/PHGII丰度，
其中所述丰度表示为阈值循环(Ct)值，并且通过从第一Ct值减去第二Ct值来获得所述比率。
27.一种试剂盒，其包括：
a.由具有序列SEQ ID NO：3或具有其至少75％一致性的序列的引物和/或探针组成的用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)丰度的试剂；和/或
b.由具有序列SEQ ID NO：4或与具有其至少75％一致性的序列的引物和/或探针组成的用于测定普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度的试剂；和
c.可选地，使用所述试剂来测定来自人肠道样品的PHGI和/或PHGII丰度的说明书。
28.根据权利要求27所述的试剂盒用于检测肠道疾病，用于预测药物对肠道疾病的治疗功效、和/或用于IBD表型的鉴别诊断的用途；其中所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)。
29.一种核酸分子，其具有选自如下的序列：SEQ ID NO：1或与其具有至少80％一致性的序列；SEQ ID NO：2或与其具有至少90％一致性的序列；SEQ ID NO：3与其具有至少80％一致性的序列；和SEQ ID NO：4与其具有至少85％一致性的序列。
CN201680059564.XA 2015-08-11 2016-08-11 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途 Pending CN108474037A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211643379.9A CN115976239A (zh) 2015-08-11 2016-08-11 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15382427.1 2015-08-11
EP15382427.1A EP3130680A1 (en) 2015-08-11 2015-08-11 Method for the detection, follow up and/or classification of intestinal diseases
PCT/EP2016/069188 WO2017025617A1 (en) 2015-08-11 2016-08-11 Method for the quantification of faecalibacterium prausnitzii phylogroup i and/or phylogroup ii members and the use thereof as biomarkers

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211643379.9A Division CN115976239A (zh) 2015-08-11 2016-08-11 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108474037A true CN108474037A (zh) 2018-08-31

Family

ID=53938288

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680059564.XA Pending CN108474037A (zh) 2015-08-11 2016-08-11 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途
CN202211643379.9A Pending CN115976239A (zh) 2015-08-11 2016-08-11 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211643379.9A Pending CN115976239A (zh) 2015-08-11 2016-08-11 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11299788B2 (zh)
EP (2) EP3130680A1 (zh)
JP (2) JP7095210B2 (zh)
KR (1) KR20180048696A (zh)
CN (2) CN108474037A (zh)
AU (1) AU2016306627B2 (zh)
CA (1) CA2995308A1 (zh)
DK (1) DK3334838T3 (zh)
ES (1) ES2901465T3 (zh)
HK (1) HK1257108A1 (zh)
HR (1) HRP20211757T1 (zh)
IL (1) IL257461B (zh)
MX (1) MX2018001697A (zh)
PT (1) PT3334838T (zh)
SI (1) SI3334838T1 (zh)
WO (1) WO2017025617A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230149497A1 (en) 2017-06-02 2023-05-18 Goodgut S.L. Grape skin for use in the treatment of dysbiosis
CA3084012A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Mitsubishi Chemical Corporation Intraoral examination method using information on bacterial group related to clinical indexes
US11649508B2 (en) 2017-12-15 2023-05-16 Vib Vzw Inflammation associated, low cell count enterotype
CZ2018456A3 (cs) * 2018-09-08 2020-01-02 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. Způsob detekce Faecalibacterium prausnitzii pomocí metody PCR v reálném čase a sada primerů pro tento způsob detekce F. prausnitzii
CA3118304A1 (en) * 2018-11-02 2020-05-07 The Regents Of The University Of California Methods to diagnose and treat cancer using non-human nucleic acids
JP2022523596A (ja) 2019-03-13 2022-04-25 グッドガット エッセ．エッレ． 結腸直腸進行新生物、進行腺腫、及び／又は結腸直腸癌をスクリーニング、診断、及び／又はモニタリングする改善された方法
WO2023049838A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Diagnosis and treatment of diseases and conditions of the intestinal tract
CN114015761A (zh) * 2021-09-24 2022-02-08 上海交通大学医学院附属瑞金医院 粪便tyrDC基因丰度作为预测左旋多巴疗效生物标志物的应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174681B1 (en) 1999-03-05 2001-01-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method and probe set for detecting cancer
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
AU2003245465A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Medimolecular Pty. Ltd. Method of isolating nucleic acids from stool samples
US7696334B1 (en) * 2002-12-05 2010-04-13 Rosetta Genomics, Ltd. Bioinformatically detectable human herpesvirus 5 regulatory gene
EP1752536A4 (en) 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
US7323308B2 (en) * 2004-09-03 2008-01-29 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis of E. coli
US7901882B2 (en) * 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
WO2008021290A2 (en) * 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
WO2011009099A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Metabolic biomarkers of crohn's disease
CA2776420A1 (en) * 2009-10-05 2011-04-14 Aak Patent B.V. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
US8906610B2 (en) 2010-02-08 2014-12-09 The Regents Of The University Of California Using phylogenetic probes for quantification of stable isotope labeling and microbial community analysis
WO2012170478A2 (en) 2011-06-06 2012-12-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and kits for detecting adenomas, colorectal cancer, and uses thereof
BR112015009138A2 (pt) * 2012-10-23 2020-10-20 Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. métodos para caracterizar um câncer
RU2015137415A (ru) * 2013-03-05 2017-04-10 Рейксуниверситет Гронинген Применение штамма htf-f фекальной бактерии prausnitzii htf-f (dsm 26943) для подавления воспаления
WO2014138999A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 University Of Ottawa Methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease
WO2014197607A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 The Regents Of The University Of California Detection of tick-borne diseases
EP2876167A1 (en) 2013-11-21 2015-05-27 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to chemotherapy, and use of microbial modulators (pre-,pro- or synbiotics) for improving the efficacy of a cancer treatment
ES2661684T3 (es) 2014-03-03 2018-04-03 Fundacio Institut D'investigació Biomèdica De Girona Dr. Josep Trueta Método para diagnosticar cáncer colorrectal a partir de una muestra de heces humanas mediante PCR cuantitativa
CN104745620A (zh) * 2015-03-03 2015-07-01 昆明理工大学 蚕豆vfpp1c基因的植物表达载体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIREIA LOPEZ-SILES 等: "Mucosa-associated Faecalibacterium prausnitzii and Escherichia colico-abundance can distinguish Irritable Bowel Syndrome and Inflammatory Bowel Disease phenotypes", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICIAL MICROBIOLOGY》 *
MIREIA LOPEZ-SILES等: "Cultured Representatives of Two Major Phylogroups of Human Colonic Faecalibacterium prausnitzii Can Utilize Pectin，Uronic Acids，and Host-Derived Substrates for Growth", 《APPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY》 *
WENJING JIA等: "Is the abundance of Faecalibacterium prausnitzii relevant to Crohn"s disease?", 《RANDOMIZED CONTROLLED TRIAL》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017025617A1 (en) 2017-02-16
AU2016306627B2 (en) 2022-01-13
PT3334838T (pt) 2021-11-23
SI3334838T1 (sl) 2022-01-31
HRP20211757T1 (hr) 2022-02-18
DK3334838T3 (da) 2021-11-15
JP7095210B2 (ja) 2022-07-05
CA2995308A1 (en) 2017-02-16
HK1257108A1 (zh) 2019-10-11
JP2018525035A (ja) 2018-09-06
EP3130680A1 (en) 2017-02-15
US20190024146A1 (en) 2019-01-24
AU2016306627A1 (en) 2018-03-15
US11299788B2 (en) 2022-04-12
ES2901465T3 (es) 2022-03-22
WO2017025617A8 (en) 2017-07-27
MX2018001697A (es) 2019-04-29
JP2022031644A (ja) 2022-02-22
EP3334838A1 (en) 2018-06-20
EP3334838B1 (en) 2021-10-06
IL257461A (en) 2018-04-30
CN115976239A (zh) 2023-04-18
IL257461B (en) 2022-05-01
US20220307075A1 (en) 2022-09-29
KR20180048696A (ko) 2018-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lopez-Siles et al. Changes in the abundance of Faecalibacterium prausnitzii phylogroups I and II in the intestinal mucosa of inflammatory bowel disease and patients with colorectal cancer
Papa et al. Non-invasive mapping of the gastrointestinal microbiota identifies children with inflammatory bowel disease
AU2016240362B2 (en) Method for determining gastrointestinal tract dysbiosis
CN108474037A (zh) 普氏栖粪杆菌亲缘组i和/或亲缘组ii成员的定量方法及其作为生物标志物的用途
Willing et al. A pyrosequencing study in twins shows that gastrointestinal microbial profiles vary with inflammatory bowel disease phenotypes
Eggers et al. Urinary lead concentration and composition of the adult gut microbiota in a cross-sectional population-based sample
CN107075446B (zh) 用于肥胖症相关疾病的生物标记物
Yildiz et al. Association of enteric protist Blastocystis spp. and gut microbiota with hepatic encephalopathy
US11243203B2 (en) Companion diagnostic method for use in the treatment of irritable bowel syndrome with dietary interventions or faecal microbiota transplant
Pan et al. Elderly patients with mild cognitive impairment exhibit altered gut microbiota profiles
Kweon et al. Performance evaluation of a DNA chip assay in the identification of major genitourinary pathogens
Lopez-Siles et al. Evaluation of bacterial biomarkers to aid in challenging inflammatory bowel diseases diagnostics and subtype classification
Al-Bayati et al. Quantitative analysis of the three gut microbiota in UC and non-UC patients using real-time PCR
Van Dissel Procalcitonin and other markers of infection. What should be their role in clinical practice?
Yıldız et al. Association of Enteric Protist Blastocystis spp. and gut microbiota with hepatic encephalopathy
You et al. Discovery of fecal microbial signatures in patients with ankylosing spondylitis
Khater et al. Role of Gene-Xpert MTB/RIF assay in detection of Mycobacterium tuberculosis in smear-negative sputum samples
Sabat-Mir et al. Mireia Lopez-Siles1, Margarita Martinez-Medina1, Romà Surís-Valls1, Xavier Aldeguer2, Miriam

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination