CN109402276A - 一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌lamp检测的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌lamp检测的引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒及应用，属于细菌的分子生物学检测技术领域，所述引物组包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。本发明可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检出携带blaOXA‑23基因的多重耐药鲍曼不动杆菌，该技术方案为多重耐药鲍曼不动杆菌的检测提供了新的技术平台。

Description

一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒 及应用
技术领域
本发明涉及细菌的分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒及应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)属于不动杆菌属，广泛分布于自然环境及医院环境中。由于其具有强大的获得耐药性和克隆传播的能力，多重耐药、广泛耐药甚至全耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行。因其特别容易在住院患者的多部位定植且在体外长期存活，已成为中国院内感染的主要致病菌之一，是医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎的重要致病菌，特别是重症监护病房的患者，感染鲍曼不动杆菌的机率更高。
鲍曼不动杆菌给临床治疗带来的困境不仅在于它容易感染患有严重基础性疾病的患者，使其发生院内感染的几率大大增加，从而延长住院时间，有加重病死率的风险。另一方面，面对其造成的复杂感染，临床医生面临无高效抗生素可用的难题。目前，鲍曼不动杆菌耐药形势非常严重。
鲍曼不动杆菌耐药机制十分复杂，且多重耐药甚至泛耐药鲍曼不动杆菌的检出率日益增高，临床的治疗也变得愈加棘手。因此开展对药物的敏感性监测具有重要意义。现有技术中检测鲍曼不动杆菌的耐药性的方法有体外药敏实验、KB纸片法和分子生物学检测等，但是药敏实验和KB纸片法对操作要求比较高，对实验场地和实验人员的专业技能有较高要求；而从分子生物学检测来看，由于多重耐药鲍曼不动杆菌相关的耐药基因较多，检测时需同时对多种基因进行引物设计和扩增，检测繁琐，且成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒及应用，以实现多重耐药鲍曼不动杆菌的快速检测，与常规体外药敏试验比较，可显著缩短检测时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组，所述引物组包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。
优选的，所述试剂盒还包括Tris·HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱、MgSO4、dNTP和Bst DNA聚合酶。
优选的，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。
优选的，所述阳性对照品为包括blaOXA-23序列的质粒；所述阴性对照品为双蒸水。
本发明提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA；
2)以待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组中的外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF，进行LAMP扩增反应，获得LAMP扩增产物；
3)利用浊度仪分析LAMP扩增产物，浊度上升的数值＞0.1表示待测样品中存在多重耐药鲍曼不动杆菌，浊度无变化或者上升的数值≤0.1表示待测样品中不存在由于携带blaOXA-23基因而导致的多重耐药鲍曼不动杆菌
优选的，步骤2)中所述LAMP扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA 2μL，反应液12.5μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，引物组2.6μL和去离子水6.9μL；
所述反应液包括以下终浓度的成分：20mM Tris·HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.8M甜菜碱、8mM MgSO4、1.4mM dNTP；以12.5μL计，所述反应液还包括0.0125μL的Tween20；
所述引物组由以下终浓度的成分组成：外引物F3和B3的浓度独立为5pmol，内引物FIP和BIP浓度独立为40pmol，环引物LF浓度为20pmol；
所述Tris·HCl的pH值为8.8；
所述LAMP扩增反应的程序为：60～68℃恒温58～80min。
优选的，所述LAMP扩增反应的程序为：65℃恒温60min。
优选的，步骤3)中所述浊度仪的检测波长为390～410nm。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒及应用，该试剂盒操作简单，对设备要求低，在检测时，只需将检测样品和检测反应液放入65℃恒温水浴锅中孵育60min后即可完成扩增。并且，本发明的试剂盒具有灵敏度高和特异性强的优点。此外，本发明的检测结果可通过浊度仪判断，无需复杂仪器，为多重耐药鲍曼不动杆菌的检测提供了新的技术平台。本发明的技术方案可用于基层医疗卫生单位、各级医院床旁快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
图1为实施例1中LAMP检测方法的建立
图2为实施例2中LAMP检测方法的特异性检测结果；
图3为实施例3中LAMP检测方法的灵敏度检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组，所述引物组包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明中，所述LAMP检测的引物组的引物是根据鲍曼不动杆菌苯挫西林水解酶OXA-23基因(blaOXA-23)的特异性保守序列设计；所述鲍曼不动杆菌苯挫西林水解酶OXA-23基因特异性保守靶序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述引物组设计的软件为Primerdesign V5。本发明中，所述引物组用以定性检测纯菌、患者痰液、血液及其它分泌物等样品中的由于携带blaOXA-23而引起对临床常用抗生素耐药的鲍曼不动杆菌；所述临床常用抗生素包括头孢三代及四代、β内酰胺酶抑制剂、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青霉烯类；所述头孢三代及四代优选为头孢哌酮、头孢他啶或头孢毗肟；所述β内酰胺酶抑制剂优选为舒巴坦；所述四环素类优选为米诺环素；所述氨基糖苷类优选为阿米卡星；所述喹诺酮类优选为环丙沙星、左氧氟沙星或莫西沙星；所述碳青霉烯类优选为亚胺培南或美罗培南。
本发明中，所述多重耐药鲍曼不动杆菌是指潜在对该菌有抗菌活性的三类及以上抗药物耐药。临床常用的针对鲍曼不动杆菌的抗生素包括头孢三代及四代四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类和碳青霉烯类。
本发明采用LAMP技术检测多重耐药鲍曼不动杆菌的原理是极低拷贝数量的质粒携带的blaOXA-23基因足以使对碳青霉烯类敏感的鲍曼不动杆菌变成耐药菌。因此，鲍曼不动杆菌菌株一旦获得了blaOXA-23基因，就会对碳青霉烯类抗生素产生耐药性，而一旦对碳青霉烯类耐药，鲍曼不动杆菌菌株对上述临床常用的抗生素基本都耐药，成为多重耐药的鲍曼不动杆菌(Evans BA，Amyes SG.OXA-Lactamases.Clin Microbiol Rev.2014 Apr；27(2)：241-63.doi：10.1128/CMR.00117-13.Review)。并且，现有研究表明，多重耐药鲍曼不动杆菌中blaOXA-23的携带率在90％以上(Schultz MB，Pham Thanh D，Tran Do Hoan N，Wick RR，Ingle DJ，Hawkey J，Edwards DJ，Kenyon JJ，Phu Huong Lan N，Campbell JI，Thwaites G，Thi Khanh Nhu N，Hall RM，Fournier-Level A，Baker S，Holt KE.Repeatedlocal emergence of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in a singlehospital ward.Microb Genom.2016 Mar 2；2(3)：e000050.doi：10.1099/mgen.0.000050.eCollection 2016 Mar.)(Li P，Niu W，Li H，Lei H，Liu W，Zhao X，GuoL，Zou D，Yuan X，Liu H，Yuan J，Bai C.Rapid detection of Acinetobacter baumanniiand molecular epidemiology of carbapenem-resistant A.baumannii in twocomprehensive hospitals of Beijing，China.Front Microbiol.2015 Sep 23；6：997.doi：10.3389/fmicb.2015.00997.eCollection 2015.)。因此，本申请通过LAMP技术检测blaOXA-23，来筛查多重耐药的鲍曼不动杆菌。
本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组，优选的还包括Tris·HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱、MgSO4、dNTP和Bst DNA聚合酶。
本发明中，所述引物组中外引物F3和B3的使用浓度优选的独立为5pmol；所述引物组中内引物FIP和BIP的使用浓度优选的独立为20pmol；所述引物组中的环引物LF的浓度优选为40pmol。在本发明的具体实施过程中，所述引物组中的引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成。
在本发明中，所述Tris·HCl的使用浓度优选为19～21mmol/L，更优选为20mmol/L；所述Tris·HCl的pH值优选为8.8；所述KCl的使用浓度优选为9～11mmol/L，更优选为10mmol/L；所述(NH4)2SO4的使用浓度优选为9～11mmol/L，更优选为10mmol/L；所述甜菜碱的使用浓度优选为0.7～0.9mol/L，更优选为0.8mol/L；所述MgSO4的使用浓度优选为7～9mmol/L，更优选为8mmol/L；所述dNTP each的使用浓度优选为1.3～1.5mmol/L，更优选为1.4mmol/L；所述Bst DNA聚合酶的使用浓度优选为5～8U/μL，更优选为8U/μL；所述Tween20购自于美国Amresco公司。本发明中所述试剂盒优选的还包括10×SAP Buffer。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为根据GenBank公布的blaOXA-23序列合成的质粒；所述阴性对照品为双蒸水。
本发明提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA；
2)以待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组中的外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF，进行LAMP扩增反应，获得LAMP扩增产物；
3)利用浊度仪分析LAMP扩增产物，浊度上升的数值＞0.1表示待测样品中存在多重耐药鲍曼不动杆菌，浊度无变化或者上升的数值≤0.1表示待测样品中不存在由于携带blaOXA-23基因而导致的多重耐药鲍曼不动杆菌
在本发明中，首先提取待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA。本发明对所述待测鲍曼不动杆菌的菌株类型没有特殊要求，任何菌株类型的鲍曼不动杆菌均可；本发明对所述待测鲍曼不动杆菌的基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的细菌基因组DNA提取方法即可。在本申请的具体实施过程中，采用PromegaGenomic DNA PurificationKit A1125试剂盒提取待测鲍曼不动杆菌的基因组。
本发明在提取待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA后，以待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组中的外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF，进行LAMP扩增反应，获得LAMP扩增产物；所述LAMP扩增反应在LAMP实时浊度仪LA-320CE(EikenChemical Co.，Ltd.，Tochigi，Japan)中进行；所述LAMP扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA 2μL，反应液12.5μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，引物组2.6μL和去离子水6.9μL；所述反应液包括以下终浓度的成分：20mM Tris·HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.8M甜菜碱、8mM MgSO4、1.4mM dNTP；以12.5μL计，所述反应液还包括0.0125μL的Tween20；所述引物组由以下终浓度的成分组成：外引物F3和B3的浓度独立为5pmol，内引物FIP和BIP浓度独立为40pmol，环引物LF浓度为20pmol；所述Tris·HCl的pH值为8.8；所述LAMP扩增反应的程序为：60～68℃恒温58～80min，优选为65℃恒温60min。
本发明在获得LAMP扩增产物后，利用浊度仪分析LAMP扩增产物，浊度上升的数值＞0.1表示待测样品中存在多重耐药鲍曼不动杆菌，浊度无变化或者上升的数值≤0.1表示待测样品中不存在由于携带blaOXA-23基因而导致的多重耐药鲍曼不动杆菌。在本发明的具体实施过程中，所述浊度仪的检测波长优选为390～410nm，更优选为400nm；所述浊度仪优选为Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tochigi，Japan。本发明利用浊度仪检测LAMP扩增结果的原理是LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 一种利用LAMP技术检测多重耐药鲍曼不动杆菌的方法
1、实验材料
多重耐药鲍曼不动杆菌，由中国人民解放军第三○七医院呼吸与危重症医学科保存
2、试剂及仪器
试剂：PromegaGenomic DNA Purification Kit A1125
基因扩增：水浴锅
结果分析：浊度仪
3、基因组DNA提取
PromegaGenomic DNA Purification Kit A1125提取待测样品中的核酸
4、LAMP扩增引物组
用于对blaOXA-23进行LAMP检测的引物序列如下：
外引物F3：5’-3’CAGAATATGTGCCAGCCTCT，如SEQ ID NO：1所示；
外引物B3：5’-3’CGATACGTCGCGCAAGTT，如SEQ ID NO：2所示；
内引物FIP：5’-3’
TGACCTTTTCTCGCCCTTCCATGTTGAATGCCctGATCGGA，如SEQ ID NO：3所示；
内引物：BIP5’-3’
CCGCTTGGGAAAAAGACATGACACCCTGATAGACTGGGACTGC，如SEQ ID NO：4所示；
环引物LF：AGGAGAAGCCATGAAGCTTTC，如SEQ ID NO：5所示。
上述引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。
5、LAMP扩增
LAMP扩增体系：以25μL计包括：待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA 2μL，反应液12.5μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，引物组2.6μL和去离子水6.9μL；所述反应液包括以下终浓度的成分：20mM Tris·HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.8M甜菜碱、8mM MgSO4、1.4mM dNTP；所述反应液还包括0.0125μL的Tween20；所述引物组由以下终浓度的成分组成：外引物F3和B3的浓度独立为5pmol，内引物FIP和BIP浓度独立为40pmol，环引物LF浓度为20pmol；所述Tris·HCl的pH值为8.8；
LAMP扩增条件为：置于恒温水浴锅中65℃恒温反应60min；
6、结果判定
利用浊度仪对扩增产物进行检测。检测结果参见图1(横坐标为反应产物在400nm的浊度值，纵坐标为反应时间)。起峰时间在24分钟左右，且浊度上升的数值可达0.6，表明利用该引物组检测多重耐药鲍曼不动杆菌方法建立成功。
实施例2 多重耐药鲍曼不动杆菌的LAMP检测方法的特异性检测
分别以根据GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得苯挫西林水解酶OXA-24基因(blaOXA-24)、OXA-58基因(blaOXA-58)序列合成的DNA片段、碳青霉烯水解酶KPC基因(blaKPC)序列合成的DNA片段、金属β-内酰胺酶NDM基因(blaNDM)、SIM基因(blaSIM)、VIM基因(blaVIM)以及IMP基因(blaIMP)序列合成的DNA片段为模板，前期申请单位分离测序的含blaOXA-23耐药基因的鲍曼不动杆菌HRAB-85株、以双蒸水为阴性对照(NEG)，以苯挫西林水解酶OXA-23基因(blaOXA-23)序列合成的DNA片段为阳性对照(POS)，进行LAMP检测，检测方法同实施例1。
检测结果如图2所示，可以看出，在60min反应时间内，只有HRAB-85及POS发生了LAMP反应，其余片段均未发生反应，表明针对多种耐药鲍曼不动杆菌的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到携带blaOXA-23的多重耐药鲍曼不动杆菌。
实施例3 多重耐药鲍曼不动杆菌的LAMP检测方法的灵敏度检测
LAMP检测多重耐药鲍曼不动杆菌的灵敏度，方法为：提取含OXA-23基因(blaOXA-23)序列DNA片段，以10倍梯度(原始浓度、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍)进行稀释，再以经梯度稀释的该DNA为模板，使其浓度分别为324ng/μL、32.4ng/μL、3.24ng/μL、324pg/μL、32.4pg/μL、3.24pg/μL、0.324pg/μL、0.032pg/μL，进行LAMP检测多重耐药鲍曼不动杆菌灵敏度检测，检测方法同实施例1。
多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测方法灵明度的浊度仪检测结果如图3(1～8的模板浓度分别为：324ng/μL、32.4ng/μL、3.24ng/μL、324pg/μL、32.4pg/μL、3.24pg/μL、0.324pg/μL、0.032pg/μL)所示。可以看出，用多重耐药鲍曼不动杆菌的LAMP检测方法可检测到32.4pg/μL鲍曼不动杆菌基因组DNA(104倍稀释浓度)。
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组、试剂盒及应用，本发明的技术方案可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检出携带blaOXA-23基因的多重耐药鲍曼不动杆菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的引物组，所述引物组包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Tris·HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、甜菜碱、MgSO4、dNTP和Bst DNA聚合酶。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包括blaOXA-23基因序列的质粒；所述阴性对照品为双蒸水。
6.权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的多重耐药鲍曼不动杆菌LAMP检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA；
2)以待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组中的外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LF，进行LAMP扩增反应，获得LAMP扩增产物；
3)利用浊度仪分析LAMP扩增产物，浊度上升的数值＞0.1表示待测样品中存在多重耐药鲍曼不动杆菌，浊度无变化或者上升的数值≤0.1表示待测样品中不存在由于携带blaOXA-23基因而导致的多重耐药鲍曼不动杆菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述LAMP扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：待测鲍曼不动杆菌的基因组DNA2μL，反应液12.5μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，引物组2.6μL和去离子水6.9μL；
所述反应液包括以下终浓度的成分：20mM Tris·HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.8M甜菜碱、8mM MgSO4、1.4mM dNTP；以12.5μL计，所述反应液还包括0.0125μL的Tween20；
所述引物组由以下终浓度的成分组成：外引物F3和B3的浓度独立为5pmol，内引物FIP和BIP浓度独立为40pmol，环引物LF浓度为20pmol；
所述Tris·HCl的pH值为8.8；
所述LAMP扩增反应的程序为：60～68℃恒温58～80min。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述LAMP扩增反应的程序为：65℃恒温60min。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述浊度仪的检测波长为390～410nm。
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