I3〇65〇8 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種快速檢測常見院内感染菌株一鮑 氏不動择菌（Acinetobacter baumannii')：^方法以反用於 此方法的專一性引子。 【先前技術】 目前所知的不動桿菌屬（如包括了 33 個基因組種（genomic species)，其中鮑氏不動桿菌 i ( 如⑽仙/?// —基因組種2)為院内感染中 常見的菌種。鮑氏不動桿菌為革蘭氏陰性桿菌，可存在於 大自然環境中，如：水、土壤及食物，或人體的皮膚、口 腔、上呼吸道及下腸胃道之中。其特性喜好潮濕，但也可 以存活在乾燥的環境中。其傳染途徑是經由接觸傳染，常 見經由醫院中治療儀器傳播。研究報告顯示，在許多檢體 都曾分離出鮑氏不動桿菌，舉凡醫院中使用的手套、自來 水、蒸餾水、靜脈輸液、監視器、床墊、工作人員的爭、 .呼吸器等’都曾報導與院内感染有關。其高度感染群包括· 1.入住加護病房的慢性病、白血病、癌症等，真有進行令 吸器、插管或靜脈治療的抵抗力、免疫力較弱的病患’ 2· 重大手術後、燒傷、使用各種侵入性設備者，3.有嚴重的 潛在性疾病’如慢性肺部疾病、長期住院、免疫機能缺陷 者，其感染率與死亡率均增加。鲍氏不動桿菌常造成菌也 症、敗血症、肺炎、腦膜炎等疾病’嚴重時會導致病患死 亡，致死率高達20%-50%。 5 •1306508 近年來抗生素的濫用，造成鮑氏不動桿菌具多重抗藥 . 性，連強力抗生素都難以消滅，幾乎無藥可醫。由於缺乏 有效治療藥物，一旦病房内出現鮑氏不動桿菌傳染，幾乎 很難消滅，只能透過加強環境消毒，宣導醫護人員勤洗手、 穿隔離衣，及徹底隔離受感染病患等方式來預防發生更大 規模的院内感染情形。因此在住入加護病房或普通病房 前’加強檢驗鮑氏不動桿菌為時勢所趨。 在不動桿菌屬中’由於乙酸鈣不動桿菌（i • 基因組種1)、鮑氏不動桿菌加⑽5777?// 基因組種2)、基因組種3及基因組種13的 （13TU)等菌株在基因組與型態上具 有高度的相似性，此四種菌株被歸類為乙酸鈣不動桿菌一 鮑氏不動桿菌複合體（ 办仙财/j/n’/dWcomplex)，在醫院中無法被常規檢驗分 辨，但是這四種菌株的病理特徵與對抗生素的感受性 (susceptibility)皆不相同，其中鲍氏不動桿菌 鲁Ζ?5Μ5/7/7//)最具有傳染性。因此快 速從icZ?複合體dZ? comp 1 ex)中分辨出鮑氏不動桿菌並且 針對感染此菌株之病患採適當的治療及防護措施是避免鮑 氏不動桿菌更進一步散播所造成的院内感染的最佳方法。 目前常用到的檢測方法有： 1.RFLP-PCRC限制片段長度多形體-PCR[restriction fragment length polymorphism-PCR]): 設計一段特殊引子，這些特殊的引子可以放大不動 1306508 桿菌屬的16S rRNA基因、16S-23S rRNA基因的基因間 隔區（intergenic spacer，ITS)、/"ecA 基因或同時放大 acA和16S rRNA基因，將放大的DNA片段純化後利用 限制酶切割，再經DNA電泳，即可以DNA電泳圖來判斷 菌株（表2,第二圖及第三圖）。理論上，利用PCR的方法 來鑑定鮑氏不動桿菌是最有效率的技術。但是，引子的 设計若利用保守區（conserved region)的序列，也會與 其他菌屬的DM互補，放大其他菌屬的DNA，經限制酶 切割後的電泳圖會有一些新的切割圖案產生，因而影響 鑑別能力，因此在利用此法分辨鮑氏不動桿菌前必須先 經過其他識別系統鑑定出含有不動桿菌屬的檢體，這樣 的過程會造成不必要的時間與金錢的花費。 表2、乙酸鈣不動桿菌（基因組種1)、鲍氏不動桿 菌（基因組種2 )、基因組種3及基因組種13 sensu (13TU )四種菌株經位於基因間 隔區（ITS)5’端保守序列引子P-Acb-ITS:5’ GTCAGA CCC ACC ATG ACT3’及位於23S rRNA基因共用區域的 引子 P-23SU:5’ GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC3’ 進行 PCR放大後，4種菌株的PCR放大片段大小，以及此片 段後再經限制酶办/?11或Main切割後所預測的片段大 菌株 放大段 片段長度 圖樣 片段長度 圖樣 (基因組種） 長度 (鹼基對 (驗基對（base (鹼基 (base pair)) 7 1306508 對 (base pair)) pair)) {DpnU) (Nlalll) BCRC11562C1) 723 108，144, 191, 280 D1 15, 16, 50, 65, 138, 213, 226 N1 BCRC19606C2) 693 49, 108, 191, 345 D2 15, 37, 50, 138, 453 N2 BCRC15420C3) 705 108, 597 D3 15, 37, 50, 138, 189, 276 N3 304C13TU) 701 108, 144, 191, 258 D4 15, 16, 37, 50, 138, 189, 256 N4 B C R C:食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 2.自動核糖核酸分類系統（Automated ribotyping system): 將檢驗菌落置於核糖核酸分類系統中，菌株的DNA 經限制酶及7^1的切割，切割後的DNA片段經電泳分 離’然後轉印到尼龍製的轉印膜上，經帶有特殊螢光物 質的DM探針雜合後，轉印膜上會有特殊的ribopattern 產生並且被儲存到電腦中’每一個菌株所檢驗出來的 ribopattern經過電腦中的資料庫（Rib〇printerTM database)比對電泳圖中條紋（band)的多寡、位置及訊 號的強弱即可判斷菌種名稱，當ribopattern比對出來 的相似係數（simi larity coef f icient) g 〇. 93 即被歸類 為相同菌種（第五圖）。 8 1306508 3.序列分析（sequence analysis): 分析菌株的16S-23S rRNA基因間隔區（intergen· spacer，ITS) ’此ITS區域在相同物種間的變異復小， 但在不同物種間變異很大’因此比對這個區域的Dna序 列用來鑑定鮑氏不動桿菌。但是這樣的檢測方法所需的 時間長且花費高。 本案發明人經多年精心研究而提供一種對鮑氏不 動桿菌具有專一性的引子，以及利用此引子鑑定鮑氏不 • 動桿菌之方法’包括將此引子經複式 PCR(multiplex-PCR)放大與DNA電泳後，可以直接鑑定 鮑氏不動桿菌’不需要再經其他步驟或方法。約三個小 時即可判別檢體中是否含有鲍氏不動桿菌，並且不會受 到灰^複合體中其他菌株的干擾，可以節省許多時間與 金錢上的浪費，並且快速的檢驗方法在醫療上可以免去 許多不必要的風險，減少院内感染的發生。 【發明内容】 本發明的一項目標為提供一種對鲍氏不動桿菌具有 專一性的引子 ’ P-Ab-ITSF:5’ CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG3’ 及 P-Ab-ITSB:5’ AGA GCA CTG TGC ACT TM G3，。 本發明的另一項目標為提供一種利用上述引子鑑定 鮑氏不動桿菌之方法，包括將此引子與檢測樣品經複式 PCR(multiplex-PCR)放大與DNA電泳後，可以直接鑑定鲍 氏不動桿菌。 【實施方式】 '1306508 於本發明一方面中，提供一種對鮑氏不動桿菌具有專 - 一性的引子。於此等對鮑氏不動桿菌具有專一性的引子之 尋求中，比對複合體四種菌株的16S-23SrRNA基因間隔 區（intergenic spacer，ITS)序列，分析鲍氏不動桿菌與 複合體其他三種不同菌株（基因組種1，3, 13TU)不一樣 序列且對鮑氏不動桿菌具有專一性之處，並根據此設計一 對引子P-Ab-ITSF:5’ CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG3，及 P-Ab-ITSB:5’ AGA GCA CTG TGC ACT TAA G3’ ，此對引子 • 可以經PCR放大鮑氏不動桿菌16S-23S rRNA基因間隔區中 的一段序列’得到一段208驗基對（base pair)長度的片段。 於本發明一方面中，提供一種利用上述引子鑑定鮑氏 不動桿菌之方法，包括將此引子與檢測樣品經複式 PCR (mu 11 i p 1 ex-PCR)放大與DNA電泳後，根據檢測到的鲍氏 不動桿菌獨具之一段208驗基對（base pair)長度的片段而 可以直接鑑定鮑氏不動桿菌之存在。 於此方法的實施中加入另一對先前學者已設計的引 •子 P-rAl:5， CCT GAA TCT TCT GGT AAA AC3’ 及 P-rA2:5, GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC3,，可以專 一的放大不動桿菌屬中具有高保守性（conserved)的recA 基因，此放大片段約為425驗基對（base pair)，這個放大 的片段為對照組實驗。 複式PCR(multiplex-PCR)進行時反應溶液的體積為2 0 微升（V 1)，其中包括 10mM Tris-HCl(pH 8. 4)、50mM KC 卜1. OmM MgCl?、200mM去氧核糖核苷三磷酸（dNTP)(d 1306508 ATP、dTTP、dCTP、dGTP)、2. 5 微微克（pg)/微升1)引 子（包括 P-Ab-ITSF，P-Ab-ITSB，P-rAl 及 P-rA2)、0.5U7^ 聚合酶，再從檢體中挑取樣本加入反應溶液中，反應溶液 上層覆蓋礦物油（mineral oil)。反應溶液先經94°C、5 分鐘處理，打破菌株細胞並且讓其DNA釋放到反應溶液 中’然後進行30個循環，每一個循環的狀態為：1.反應 溶液中的MA在94 C、30秒的處理下變性（denaturatio η)，打開雙股螺旋並且兩股分開2.反應溶液降溫到55ΐ • 作用30秒，使得引子可以接到與其序列互補的DNA上3. 再將反應溶液溫度升高到72°C作用30秒，讓聚合酶可以 作用延展合成與模板（template)相互補的一股。以上述三 步驟進行30個循環之後，再將溶液在？2t：作用7分鐘， 進行最後的延展。 完成複式PCR後，取其產物於1%洋菜膠（agar〇se)進行 DNA電泳，經溴化乙錠（EtBr)染色後，即可在uv燈下進行觀 察與拍照，判讀鮑氏不動桿菌是否存在與檢體中。 鲁 本發明要參知下面非性實施例予以進一步闡明。 實施例 材料與方法 細菌菌株 複合體的臨床分離物係在1999年一月至2〇〇丨年十 二月採自台北榮民總醫院者。於本研究中所賴11種不相 同的不動桿菌基因組種菌株（表1)係購自食品工業發展研 究所生物η保存中心、（BGRG)。料分離物係經貯存在—70 1306508 °匸有加15%甘油的1^7口1；丨0336 30；7或1^111'丨3461'1^11丨（1^)培 養基之中。鮑氏不動桿菌臨床分離物的初步鑑定係使用API ID32GN(bioMc’ rieux，Marcyl’ Etoile，France)且評定 細菌在44°C腦心注輸培養液中生長的能力而完成的。鮑氏 不動桿菌臨床分離物的基因組種別鑑定係經由將部份 16S-23S rRNA ITS區的序列與得自Genbank的資料庫（參閱 下文）使用BLAST程式比對而完成的。 BCRC No. 不動桿菌屬基因組 種 其他名稱 RiboPrinterTM 鑑定 之菌種名稱 11562 乙酸妈不動桿菌 =ATCC 14987 乙酸鈣不動桿菌 10591 鮑氏不動桿菌 =ATCC 19606 鮑氏不動桿菌 15420 基因組種3 =ATCC 17922 NI 14852 溶血不動桿菌 (儿 haemolyticus) =ATCC 17906 溶血不動桿菌 14854 A. junii =ATCC 17908 NI 15421 基因組種6 =ATCC 17979 NI 14853 A. Johnsonji =ATCC 17909 NI 14855 魯氏不動桿菌 (A. lwoffn') =ATCC 15309 Gluconacetobacter diazotroghicus 表1、本實驗中所提及的11種不動桿菌屬菌種名稱， ’以及利用RiboPrinterTM所鑑定出的菌種名稱。本表中也附 上在美國菌種中心及食品工業發展研究所生物資源保存及 心，這些菌種的所屬代號。 12 ‘1306508 15423 基因組種10 =ATCC 17924 NI 15424 基因組種11 =ATCC 11171 NI 15425 A. radi ores is tens =ATCC 43998 A. radioresistens ATCC，美國菌種中心（American Type Culture Collection)； BCRC:食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 (Bioresources Col lection and Research Center)(新 φ 竹，台灣）； NI，無法鑑定 PCR放大與部份16S-23S rRNA ITS區的定序 將先刖公開的基因組種1、2、3和13TU(Genbank登 錄號碼分別為U60278、U60279、U60280和U60281)經由使 用DNA序列分析軟體.GCG p i 1 e叩予以排比。選出在此四 種別的5’ ITS區内之保守區作為前向引子（p_Acb_ITS): 5 GTCAGACCCACCATGACT3， 。PCR 係在 50 微升1)的總 •體積内實施，其中包括10 mM Tris-HCl(pH8. 4)、50 _ KC1、1. 0 mM MgCh、各200 mM的每一種去氧核糖核苷 三磷酸（dNTP) (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、各 5 微微克 (pg)/U升（/zl)的前向和後向引子（包括p_AbITSF， P-Ab-ITSB，P-rAl 及 P-rA2)，以及 h 25 u 的細聚合酶（pr〇 Tag，Taipei’ Taiwan)且使用礦物油予以覆蓋。直接使用 2微升（// 1)的細g整夜培養液作為模板。使肢有模板的 反應混合物作為陰性對照。放大反應係在Thenno-Hybaid Ι3Θ6508 PCR機（Needham Heights, ΜΑ)内實施：反應溶液先經94。〇、 ' 5分鐘處理’打破菌株細胞並且讓其DNA釋放到反應溶液 中，然後進行30個循環，每一個循環的條件為：丨.反應 溶液中的DNA在94。(：、30秒的處理下變性 (denaturat i on) ’打開雙股螺旋並且兩股分開2.反應溶液 降溫到55°C作用30秒，使得引子可以接到與其序列互補 的MA上3.再將反應溶液溫度升高到72°C作用30秒，讓 聚合酶可以作用延展合成與模板（temp 1 ate )相互補的一 籲股。以上述三步驟進行30個循環之後，再將溶液在72°C 作用7分鐘，進行最後的延展。將放大的產物在商業公司 (Mission Biotech)處定序，於該處使用 PCR-M Clean-up 套組（Viogene，Taipei，Taiwan)予以純化且在 model ABI 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems, CA, USA) 上使用 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle 定序套組 (version V3.1;Applied Biosystems，CA，USA)進行定序。 限制片段長度多形體（RFLP)分析
胃 將從基因組種1、2、3和臨床菌株304(與菌株BCRC 15417[登錄號碼，AY601830]和菌株BCRC 17903[登錄號 碼，U60281 ]有98%的序列相同率，兩菌株都是基因組種 13TU)所得到的放大產物使用PCR Clean-up套組（Bioman, Taipei，Taiwan)予以純化，連接到ΤΑ選殖載體（Yeastern Biotech, Taipei, Taiwan)之内且轉形到大腸桿菌DH5a co// DH5 α )之中。選擇出具有所欲插置物 的殖株且將質體離析並定序（Mission Biotech)。藉助軟 14 1306508 體：Clone manager for Windows 4. 01 製作出此 4 序列的 限制興圖。根據該等限制舆圖，選用办MI和11限制 酵素進行RFLP分析’此係因為彼等有較高的區別能力之 故。使用前述兩種酵素（New England Biolabs，USA)分別 在37°C消化經放大的DNA(17微升1))2小時，然後在 65°C去活化酵素20分鐘。將消化所得片段在2%洋菜膠凝 膠中以150伏（V)電泳分離且在使用溴化乙錠（EtBr)染色 之後檢查。
φ 使用可特異地放大鮑氏不動桿菌ITS區之引子進行複式 PCR 將按照上面所述從基因組種1、2、3和13TU等參考 菌株所得到的序列進行排比分析以鑑定出對鮑氏不動桿菌 具有特異性的區。隨後，選出下列株序列作為特異性引子 以放大得自鮑氏不動桿菌ITS區的208鹼基對（base pair) 内部片段（P-Ab-ITSF:5’ CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG3’ ； 及 P-Ab-ITSB:5’ AGA GCA CTG TGC ACT TAA G3’）。於此 • 複式PCR策略中，目標也包括針對不動桿菌屬中具有高保 守性的recA基因之另一對引子（P-rAl: 5’ CCT GAA TCT TCT GGT AAA AC3，及 P-rA2:5’ GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC3’）。此recA基因内部片段的長度約為425鹼基對（base pair)。PCR係在20微升（// 1)的總體積内實施，反應混合 物為上面所述者，不過使用各2. 5微微克（pg)/微升（// 1) 的引子以及0. 5 U的聚合酶。反應溶液先經94°C、5 分鐘處理。然後進行30個放大循環，每一個循環的條件 15 1306508 為.反應溶液中的模板DNA在94°C、30秒的處理下變性； 反應溶液降溫到55°C作用低溫配對3〇秒；再於72°C作用 30秒進行引子延展。上述三步驟進行3〇個循環之後，再 將溶液在72°C作用7分鐘，進行最後的延展。將放大的產 物於1%洋菜膠進行DNA電泳，為了鑑定可以用此方法放大 的最小數目之細菌，將生長整夜的細菌培養液稀釋1〇倍且 使用各2微升（y 1)的稀釋液作為模板。在37°c培育整夜 以平板培養各稀釋液之後直接計數細菌數目。以三重複實 鲁 施此程序。 使用RiboPrimer進行鲍氏不動桿菌的鏗定與亞型測定 使用自動化RiboPrimerTM Microbial Characterizati on System(Qualicon，Wilmington, DE)根據製造商的指 示實施核糖核酸分類（ribotyping)。挑出菌落且裝載在Ri boPrimerTM Microbial Characterization Unit(MCU)中。 於該MCU内使用及酵素消化總ΜΑ，且將該DNA電泳分離 並直接轉移到尼龍膜上。經由與得自大腸桿菌的含有rRNA # 操縱子（r r η B )的化學致發光性D N A探針雜交以表現核糖核 酸圖樣（ribopatterns)。將該等圖樣自動造像且儲存在MC U電腦之内。使用標準標誌物的位置來校正條紋（b a n d )位置 的欄-對-欄（lane-to-lane)與膜-對-膜（membrane-to-mem brane)變異。將每一分離株的核糖核酸圖樣與RiboPrimer 以資料庫中的圖樣根據條紋數目、條紋位置、和在一所給 條紋位置的信號強度進行比對。若菌株的圖樣之間的相似 係數20. 93，且配定到一專一核糖核酸組，則判斷該等菌 16 1306508 株具有相同的圖樣。若該圖樣對RiboPrimer^資料庫中既 存的參考圖樣（DuPont Identification Pattern[DuPont ID])的相似係數在0. 85與0. 93之間，則RiboPrimer會自動 酉己疋一特定屬、種和菌株上的鑑定。使用1 ecu 1 ar Ana 1 yst Fingerprinting 、 Fingerprinting Plus 、和Fingerp rinting DST Software(Bio-Rad Laboratories, Richmon d，CA)來分析每一樣品的核糖核酸分類多形性。經由計算p earson相關係數來決定每一對生物之間的相似率。將樣品 • 分組，且使用算術平均（U P GM A )聚點技術以未權衡配對組法 從矩陣構成樹狀圖（dendogram)。 結果
將不動桿菌屬基因組物種1、2、3和13TU的部分 16S-23S rRNA ITS區經PCR放大之片段定序且用GCG
Pileup程式比對。根據比對分析決定出於此研究中使用的 專一性與通用性引子（第一圖）。於此探討中包括共84臨床 分離株’内含複合體和11種不動桿菌參考菌株。包括 • 如办複合體專一性引子（P-Acb-ITS)和一細菌通用引子 (P-23SU)之第一組引子可促成來自基因組物種1 (BCRC 11562)、2(BCRC 10591)、3(BCRC 15420)參考菌株和所有 臨床分離株的單一片段之放大。與此相異者，從不屬於jcZ? 複合體的不動桿菌菌種（第二圖）或從其他屬的細菌，包括 大腸得蛰（EscheHcfija coli)、 克雷伯式肺炎桿菌 {Klebsiella pneumoniae) > 綠赢择 M (Pseudomonas /7asa)和金黃色葡萄球菌 17 1306508 (數據沒有顯示出來）都沒有觀察到放大區 - (amplicon)。對84臨床分離株的的PCR放大片段進行核芽 酸定序。其結果揭露出彼等之中的82株為鮑氏不動桿菌， 且其於兩者為不動桿菌基因組物種13TU。 經由16S-23S ITS區的PCR-RFLP鑑定臨床分離株 對於來自複合體參考菌株的ITS區進行的序列分 析顯示出基因組種1(乙酸鈣不動桿菌）、基因組種2(鲍氏不 動桿菌）、基因組種3及基因組種13(13TU)的放大區分別為 • 723鹼基對（base pair)、693 鹼基對（base pair)、705 驗 基對（base pair)和701鹼基對（base pair)(表2)。在凝 膠電泳中也看出在彼等的尺寸之間幾乎沒有差異（第二 圖）。表2中顯示出使用θ/wll和Walll消化之後的預期片段 長度。在限制消化中的預期片段係以2%瓊脂糖凝膠電泳予 以確定。使用每一種酵素得到四個限制圖樣，彼等每一者 中有兩者可以用電泳稍微區別（第三圖）。在用消化之 後’基因組物種1和13TU的限制圖樣非常類似，且其差異只 鲁 有在最大片段中可看出（280驗基對（base pair)相對於 258鹼基對（base pair))。不過，在使用消化之後， 此兩基因組物種可以區別開（表2和第三圖（B))。隨後，檢 驗基因組物種13TU的2臨床分離株與39隨機選出的鮑氏不 動桿菌。值得注意者，所有接受檢驗的鮑氏不動桿菌分離 株於使用办/?Π(第三圖（A)的D2類型）或#/5111(第三圖（B) 的Ν 2類型）任一者作為限制酵素時都展現出獨特的限制圖 樣。此外，從屬於基因组物種13TU的分離株也產生一致的 1306508 圖樣（第三圖的D4和Μ)。 複式PCR在飽氏不動桿菌鐘定中的確認 根據對於參考菌株和屬於按照上面提及者獲得之 複合體之臨床分離株的ITS序列之分析在所有的鮑氏不動 桿菌分離株中都可以找到於專一性引子（p〜Ab_ITSF和 P-Ab-ITSB)的序列相同的序列，但是在其他物種的臨床分 離株中則沒有找到。為了驗證此分析，對所有的鮑氏不動 桿菌參考菌株與^^複合體的臨床分離株使用複式pCR檢 • 驗。對於相應於基因的的PCR内部對照片段（425鹼基 對（base pair))，所有參考菌株和臨床分離株都是陽性 者，但是只有鮑氏不動桿菌的參考菌株和臨床分離株具有 另一個相應於ITS區的片段（208鹼基對（base pair))(第四 圖）。於屬於其他菌屬的細菌’包括大腸桿菌（於 y)、克雷伯式肺炎桿菌、綠腹桿菌和金黃色葡萄球菌 之中都沒有發現放大產物（數據沒有顯示出），因此證實此 兩對引子分別對不動桿菌菌種（P-rAl和P-rA2)和鮑氏不動 參 桿菌（P-Ab-ITSF和P-Ab-ITSB)之專一性。此種複式pcR診斷 也已用於所有鮑氏不動桿菌臨床分離株的的鑑定且揭露出 100%的選擇率和專一性。 以自動核糖核酸分類系統鑑定鲍氏不動桿菌臨床分離株 針對一參考菌株（BCRC和0591)和所有鮑氏不動桿菌 臨床分離株評估以RiboPrinter自動鑑定之可行性。對於 參考菌株（DuPont ID 10102)和70臨床分離株（DuPont Π) 16336[45 分離株]、15423[22 分離株]、14509[2 分離株]、 1306508 14853[1分離株])都得到正確的鑑定。核糖核酸分類圖樣 的平均相似率為0. 92(範圍，〇· 86至0· 97)。其敏感度經 - 證實為70/82(85.4%)。基本上，將彼等分類為4個核糖核 酸組（ribogro叩）。該4個臨床核糖核酸組的代表性分離株 為分離株219、215、229、和309。臨床分離株3〇4和313 揭露出不同於鮑氏不動桿菌的圖樣。對11不動桿菌菌種參 考菌株和6代表性分離株（219、215、229、304、309和313) 的核糖核酸圖樣施以UPGMA團簇分析（第五圖）。鮑氏不動 鲁杯囷的4代表性分離株和參考菌株以4〇%相似率組合在一 起。尤具有比其他者對鮑氏不動桿菌的 較接近之相似性。根據序列分析’臨床分離株3〇4和313 為基因組物種13TU，彼等經團簇分析為溶血不動桿菌（义 haemolyticus)。 綜上所述，本發明複式PCR鑑定鮑氏不動桿菌之方法 確實為一種快速且方便的鮑氏不動桿菌鑑定方法。對於上 文所述可能作出改變和修飾而不違離本發明旨意和範圍， ♦ 所有此等改變和修飾，以及等效物，理應都落於後附申請 專利範圍的範圍之内。 【圖式簡單說明】 第一圖：4種不動桿菌屬的核酸序列比對結果：對乙 酸妈不動桿菌基因組種丨、鮑氏不動桿菌基因組種2、基因 組種 3 及基因組種 13 的 (13TU)四種菌株位於16S-23S rRNA基因間隔區的部分序列 之比對結果。4種菌株未完全相同的核酸序列以反向字體 20 1306508 (黑底白字）及星號表示；如办複合體引子（P-Acb-ITS及 P-23SU)以黑色框圈選表示；對飽氏不動桿菌具有專一性的 引子（P-Ab-ITSF及P-Ab-ITSB)在其序列加以底線表示。 第二圖：利用對複合體具有專一性的引子 (P-Acb-ITS及P-23SU)進行PCR放大不動桿菌屬的部分 16S-23S rRNA基因間隔區（ITS)序列。分別以乙酸妈不動 桿菌（第1欄）、鮑氏不動桿菌（第2欄）、基因組種3(第3 欄）、溶血不動桿菌（第4攔）、尤力//7/y (第5欄）、基 Φ 因組種6(第6欄）、儿ye必(第7欄）、魯氏不動 桿菌（儿/『〇////)(第8攔）、基因組種1〇(第9攔）、基 因組種 11 (第 10 攔）、J·厂3i//ores7sie/7s·(第 11 攔）、 基因組種13TU (第12欄）等菌株為模板以及陰性對照組〜未 加入模板（第13攔），加入引子P-Acb-ITS及P-23SU進行 PCR後，經MA電泳檢查放大片段。由圖中可知：第i_3及 12欄為如办複合體菌株，所以經引子P-Acb-ITS及P-23SU 進行PCR後可以得到放大片段’而其他不動桿菌屬非办 • 複合體菌株則無。乙酸鈣不動桿菌（第1攔）--723鹼基對 (base pair)、鮑氏不動桿菌（第2欄）--693鹼基對（base pair)、基因組種3(第3襴）—705鹼基對（base pair)、基 因組種13TU(第12欄）一701鹼基對（base pair)。 第三圖：RFLP-PCR的限制酶切割dna電泳圖。乙酸在弓 不動桿菌（基因組種1)、鮑氏不動桿菌（基因組種2)、基因 組種 3 及基因組種 13 sensu Tjernberg and Ur sing (13TU)四種菌株經位於基因間隔區（ITS)5，端保守序列引 21 I3%508
子P-Acb-ITS及位於23S rRNA基因共用區域的引子P-23SU - 進行PCR放大再經限制酶你/7Π或Λ^ΙΠ切割後所得到的片 -段大小。 第三圖（Α)(以々ρ/?Π切割）中D卜D4以及第三圖 (Β)(以瓜切割）中Ν1-Ν4分別表示乙酸鈣不動桿菌（基 因組種1)、鮑氏不動桿菌（基因組種2)、基因組種3及基 因組種 13 sensu Tjernberg and Ursing 四蝮議 株（亦可對照表2) ’每一個切割片段的鹼基對標示於電泳 % 條紋（band)上。 第四圖：利用對鲍氏不動桿菌具有專一性的引子 (P-Ab-ITSF與P-Ab-ITSB)以及對不動桿菌屬基因具 有專一性的引子（P-rAl與P-rA2—為對照組）進行複式 PCR。第1攔到第13攔所表示菌株與圖二相同。對鮑氏不 動桿菌具有專一性的放大片段為208鹼基對，而内在對照 組（internal control)中放大的recA基因片段為425鹼基 對。 _ 第五圖.不動样菌屬中11種參考菌株（ref erence strains)及6種臨床上典型的分離菌經核糖核酸分類系統 比對後所產生的樹狀圖。其中臨床上分離的304、313已被 故實為屬於不動才干函屬基因組種13 so/isu Tjemberg 377 //7g ( 1 3 T U )。 【主要元件符號說明】 叙 22 0.8 . 補充序列表 <110>生物鎵科技股份有限公司 120丨央速檢測鮑氏不動桿菌(/—之方法與用於此方法的引子 <130>1323TW-Pjjja <140> 95107118 <141 > 2008-07-07 <160> 6 <210> 1 <211> 18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>基因間隔區(ITS)5’端保守序列弓丨子 <400> 1 gtcagaccca ccatgact <210> 2 <211> 684 <212> DNA <213> 乙酸錦不動桿菌 <400> 2 ttgactggtt gaagttatag aaaagaagat acataactga tgatgtaagc tggggactta 60 gcttagttgg tagagcgcct gctttgcacg caggaggtca ggagttcgac tctcctagtc 120 tccaccagaa cttaagagaa gttcggatta cagaaattag taaataaaga tttgatcttg 180 gtttattaac ttctgtgatt taagtatcac ggtattaagc atgacctgac gaaggcatgt 240 ttattcatta acagattggc aaaattgagt ctgaaataaa ttgttcactc aataatgaag 300 ag^gaagaag iaattctgat cttggaatta attgagaact agcaaattaa ctgaatcaag 300 cgttttggt辽 tatgaatt辽g attgaagctg t汉cagtgttt aaat注cacag tacttcaaac 420 tgtaagagat tgatgagaaa tcattaatca tgtcttatta ctccttgtag gtaataacga 480 ctg^gggg ttgtatagtc aagtaattaa gtgcatgtgg tggatgcctt ggcagtcaga 540 1306508 * ^cgatgaaa gacgtaatag cctgcgataa gctccgg^a ggc^caaat atcctttgat ctg^atg^g gaacccacct actttaaggt aggtattgca acatgaatac atagtgttgc aaggcgaacg aggg 600 660 <210> 3 <211> 654 <212> DNA<213〉鮑氏不動桿菌(y4A你厶伽观腫>)
<400> 3 ttgactggtt gaagttatag ataaaagata catgattgat gatgtaagct ggggacttag cttagtt^t agagcgcctg ctttgcacgc aggaggtcag gagttcgact ctcctagtct ccaccagaac ttaagataag ttcggattac agaaattagt aaataaagat tgagatcttg gtttattaac ttctgtgatt tcattatcac ggtaattagt gtgatctgac gaagacacat taactcatta acagattggc aaaattgagt ctgaaataaa ttgttcactc aagagtttag gttaagcaat taatctagat gaattgagaa ctagcaaatt aactgaatca agcgttttgg tatgtgaatt tagattgaag ctgtacagtg cttaagtgca cagtgctcta aactgaaatg ttgaagttac taacttgtgg gtaacatcga ctgtttgggg ttgtatagtc aagtaattaa gtgcatgtgg tggatgcctt ggcagtcaga ggcgatgaaa gacgtgatag cctgcgaaaa gctccgggga ggcggcaaat atcctttgat ccggagatgt ctgaatgggg gaacccacct actttaaggt aggtattgca acatgaatac atagtgttgc aaggcgaacg aggg <210> 4 <211> 687 <212> DNA <213>不動桿菌屬基因組種3(/4«_w/—i^g6nomc«p.3) 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 <400> 4 ttgactggtt gaagttatag ataaaagata catgactgat gatgtaagct ggggacttag cttagttggt agagcgcctg ctttgcacgc aggaggtcag gagttcgact ctcctagtct ccaccagaac ttaagagaag ttcggattac agaaattagt aaatagagat ttcggtcttg gtttattaac ttctgtgatt taagtatcac ggtattaagc atgacctgac gaaggcgtgt ttattcatta acagattggc aaaattgagt ctgaaataaa ttgttcactc aagagtttag attaagcaat taatctagat gaattgagaa ctagcaaatt aactgaatca agcgttttgg tatatgaatt tagattgaag ctgtacagtg tttaagtaca cagacaacag atagtagcga tgaagaatcg cacggacaac actcacttgt aggtgttgac gactgtttgg ggttgtatag tcaagtaatt aagtgcgtgt ggtggatgcc ttggcagtca | gagaacccac ctactttaag gtaggtattg caacatgaat acatagtgtt gctaggcgaa cgaggggaac tgaaacatct 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 2 660 660
1306508 aaggCgatga aagacgtgat agCCtgCgaa aagctccggg gaggcggcaa atatcctttg atccggagat ttctgaatgg gggtacc
<210> 5 <211>662 <212> DNA <213>不動桿菌屬基因組種擔rgenomosp.13) <400> 5 ttgactggtt aaagttatag ataaaagata catgactgat gatgtaagct gggacttagc ttagttggt agagcgcctg ctttgcacgc aggaggtcag gagttcgact ctcctagtct ccaccagaac ttaagataag ttcggattac agaaattagt aaatagagat ttcgatcttg gtttattaac ttctgtgatt taagtatcac ggtattaagc atgacctgac gaaggcatgt ttattcatta acagattggc aaaattgagt ctgaaataaa ttgttcactc aataacaaag agagatgaag taattctgat cttggagtta attgagaact agcaaattaa ctgaatcaag cgttttggta tatgaattta gattgaagct gtacagtgtt taaatacaca gtgctctaaa ctaaaatgtt gaagttacta acttgtaggt aacgtcgact gtttggggtt gtatagtcaa gtaattaagt gcatgt^tg gatgccttgg cagtcagagg cgatgaaaga cgtgatagcc tgcgaaaagc tccggggagg cggcaaatat cctttgatcc ggagatgtct gaatggggaa acccacctac tttaaggtag gtattgcaac atgaatacat agtgttgcaa ggcgaacgag gg <210> 6 <211> 21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>23S rRNA基因共用區域之引子 <400> 6 gaactgaaac atctaagtac c 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 3