CN114657272A - 用于肺炎链球菌rpa-lfs检测法的引物探针组合及其应用 - Google Patents

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王蕾
黄关宏
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Abstract

本发明公采用RPA结合LFS技术，建立了一种快速、灵敏的肺炎链球菌现场检测方法。该方法根据肺炎链球菌自溶素基因(lytA)设计引物探针，并且在37℃，30min内完成检测。通过对22株肺炎链球菌的临床分离株及20株其它常见病原菌进行检测，验证了该方法的特异性。对RPA‑LFS方法的灵敏度进行了10次独立实验，最低检测限为3.32个集落形成单位(CFU)/反应。最后，对所建立的肺炎链球菌RPA‑LFS检测方法进行了临床标本的检测，与PCR方法相比，检测结果准确一致。总之，本研究开发了一种快速、灵敏和特异的肺炎链球菌RPA‑LFS检测方法，在偏远和资源有限地区的初步医疗诊断中有很好的应用前景。

Description

用于肺炎链球菌RPA-LFS检测法的引物探针组合及其应用
技术领域
本发明涉及肺炎链球菌的检测，具体为用于肺炎链球菌RPA-LFS检测法的引物探针组合及其应用。
背景技术
肺炎链球菌(S.Pneumoniae)是一种革兰染色阳性，无鞭毛，常为成对或短链状排列的细菌，其外面由多糖组成的荚膜为致病的物质基础。这种细菌在自然界中分布广泛，常定殖在人上呼吸道器官黏膜，主要侵害的对象是免疫力低下的人群，例如儿童和老年人，感染后会引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等侵袭性疾病，在全球每年肺炎链球菌感染导致了极高的发病率与死亡率；随着越来越多高耐药性肺炎链球菌临床分离株的出现，肺炎链球菌感染的防治变得越发困难。而及时准确的病原学诊断，对临床治疗药物的选择和治疗方案的制定起到十分重要的作用。
在患者患病早期，通过及时准确的诊断出病原体，及早反映出临床感染，有利于对患者进行后续的正确治疗。然而，目前检测肺炎链球菌的金标准方法是基于表型的，包括培养、显微镜检查和生化鉴定。肺炎链球菌的生长和鉴定通常需要两天以上，并且该方法通常具有检测时间长、操作复杂以及容易出现假阴性的缺点。
目前阳性鉴定可能通常发生在感染过程的后期；这种延误的诊断可能会导致感染该病原菌患者的预后不佳。因此，开发和验证一种快速、准确的肺炎链球菌鉴定方法势在必行。已经开发了几种用于检测肺炎链球菌的非培养方法，包括质谱法、免疫分析、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、聚合酶螺旋反应(PSR)和环介导等温扩增(LAMP)；与金标培养法相比，这些肺炎链球菌鉴定试验可以节省相当多的时间。然而，这样的分析反过来依赖于技术人员或复杂的设备，而这在某些情况下可能是不可用的。
重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA)是由重组酶聚合酶介导的扩增，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增。该技术主要依赖于三种酶：T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32及Bsu DNA聚合酶。其中，重组酶蛋白可以与引物结合，形成DNA核蛋白微丝，微丝可以结合匹配的DNA片段，并紧密结合发生重组，在单链结合蛋白的帮助下,模板DNA开始解链,在BsuDNA聚合酶的作用下进行复制延伸,对模板上的目标区域进行指数式扩增。整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可完成，与PCR相比，整个过程不需要高温变性和低温退火，反应简单、快速高效。将包被金纳米颗粒(AuNPs)的侧向流动带(LFS)与RPA结合起来对标记的扩增产物进行目视检测，用肉眼即可在LFS上半定量地观察彩色信号。该技术进一步简化了检测过程，实现了无需仪器的现场检测。
发明内容
本发明采用RPA结合LFS技术，建立了一种快速、灵敏的肺炎链球菌现场检测方法。
用于鉴定肺炎链球菌的分子靶点包括多种基因，包括Spn9802片段(Abdeldaim,
Figure BDA0003565362520000021
Olcén,Blomberg,and Herrmann,2008)，RecA基因(Zbinden,
Figure BDA0003565362520000022
andBloemberg,2011)，16SrRNA基因(El Aila,et al.,2010)，以及毒力因子基因，如溶气素(Ply)(Carvalho Mda et al.,2007；El Aila,et al.,2010)。虽然这些靶标已被证明对肺炎链球菌的检测有用，但它们明确识别肺炎链球菌的能力仍然存在问题。例如，PLY[30]和Spn9802[23]都与假阴性结果相关。自溶素lytA基因在肺炎链球菌株中保守，遗传变异有限(0.11～0.32％)，具有较高的敏感性和特异性，并且几乎存在于所有临床分离的菌株中，因此选择该基因用于肺炎链球菌的鉴定。
RPA检测具有高度特异性，22株临床分离株检测结果均为阳性，而其他20种常见病原菌则全部为阴性，表明，我们建立的RPA-LFS能够特异性地检测肺炎链球菌。Probit回归分析用于计算该方法的LOD(95％置信度)。结果表明，肺炎链球菌的RPA-LFS的LOD为每反应3.32CFU。这与其他高灵敏度的分子检测方法的LOD相当。
合理设计检测肺炎链球菌的引物是从对lytA基因序列进行BLAST搜索开始的。引物只与肺炎链球菌匹配。如表1所示，以lytA基因为靶序列设计了lytA-1，lytA-2，lytA-3，lytA-4，lytA-5五对引物。以肺炎链球菌标准菌株基因组DNA为模板，进行基础的RPA反应，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。从lytA-1到lytA-5的5组引物均产生了清晰的靶向条带，大小分别为456、456、456、275和204bp。虽然无模板对照(NTC)中没有非特异性扩增条带，但仍然出现了小于100bp的引物二聚体，引物lytA-2和lytA-4能扩增出较亮的目标条带，具有较少的引物二聚体。因此，我们选择引物对lytA-2和lytA-4进行后续RPA-LFS反应中探针进行进一步的设计。
表2引物和探针组合
Figure BDA0003565362520000031
Figure BDA0003565362520000041
突变的位点下划线标注，F和R分别代表正向和反向引物。
RPA-LFS最佳引物与探针组合的修改与确定
在lytA-2和lytA-4的序列内设计探针P1,P2，进行了RPA–LFS测试，以查看引物探针组合lytA-2/F/R/P1和lytA-4/F/R/P2的扩增性能及假阳性的情况。二个引物-探针的组合都提供了正确的阳性信号(测试线和控制线上都有两条可见的红色条带)，这表明这两个引物-探针组合具有良好的扩增性能。然而，在无模板对照中，它们在测试线上也显示出一条可见的弱化红带，表明这两个引物探针组合都存在假阳性信号
LFS能特异性识别探针和反向引物产生的FITC和生物素标记的RPA产物。因此，在设计RPA-LFS探针时，应完全抑制NTC信号。此前的研究表明，RPA反应可以容忍引物/探针与模板之间的一些不匹配。利用primer Premier 5软件对探针反向引物二聚体进行分析，并添加错配(见下划线处文本)，对有五个以上连续碱基或3'端三个以上碱基的位点进行替换。表2中列出了改良的反向引物(mR)和探针(mP)的序列，替换的碱基用红色表示。然后使用改良后的探针和引物进行RPA-LFS测定。当使用肺炎链球菌基因组DNA扩增lytA基因时，两对引物探针组合在NTC组的检测线上均无信号，在含有肺炎链球菌基因组DNA组的检测线上有明显信号。因lyt-2-F/mR/mP1组合中错配碱基数少，所以，我们认为该组合的性能更佳。通过琼脂糖凝胶电泳对RPA扩增产物进行分析，发现两组引物探针组合的扩增产物都有两条清晰的条带，分别代表正向-反向引物和探针-反向引物的产物。总体而言，获得了最佳的引物-探针组合为lyt-2-F/mR/mP1，用于肺炎链球菌的RPA-LFS检测。
本发明所达到的有益效果是：本发明根据肺炎链球菌自溶素基因(lytA)设计引物探针，并且在37℃，30min内完成检测。通过对22株肺炎链球菌的临床分离株及20株其它常见病原菌进行检测，验证了该方法的特异性。对RPA-LFS方法的灵敏度进行了10次独立实验，最低检测限为3.32个集落形成单位(CFU)/反应。最后，对所建立的肺炎链球菌RPA-LFS检测方法进行了临床标本的检测，与PCR方法相比，检测结果准确一致。总之，本研究开发了一种快速、灵敏和特异的肺炎链球菌RPA-LFS检测方法，在偏远和资源有限地区的初步医疗诊断中有很好的应用前景。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是RPA引物集筛选结果；
图2是用RPA-LFS反应测试的引物-探针组的性能；
图3是RPA-LFS检测的特异性结果；
图4是肺炎双球菌RPA-LFS检测方法的检测限(LOD)的确定结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
以肺炎链球菌的标准菌株(ATCC 49619)为研究对象，建立检测肺炎链球菌的RPA-LFS方法。收集22株肺炎链球菌的临床分离株和其他20种常见病原菌，包括大肠杆菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、富尔顿摩根杆菌、粘质沙雷氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、嗜麦芽窄食单胞菌、副溶血性弧菌、乳酸链球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、凝固酶阴性葡萄球菌、奇异芽孢杆菌用来验证RPA-LFS方法的特异性。
细菌基因组的提取
对于使用纯化的基因组DNA作为模板的反应，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，中国)提取基因组DNA，并保存在-20℃备用。如果使用细菌培养物作为模板，则使用加热沸腾法提取细菌DNA。将各个菌落悬浮在50μL Tris-EDTA缓冲液中沸煮10min使细菌基因组DNA完全释放。
RPA反应的引物设计
使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Primer-BLAST在线设计软件设计了基于肺炎链球菌种属特异性自溶素lytA基因序列的特定RPA引物。引物设计参数为：大小设置为30-35bp，产物大小为100-500bp，GC含量为20％-80％，Tm值设置为50-100,生物体被设定为肺炎链球菌。其他参数均采用默认设置。从中选择五对引物进行测试(通用生物系统有限公司，安徽，中国)。
RPA程序
使用TwistAmp Liquid DNA amplification Kit(TwistDx Inc.,Maidenhead,United Kingdom)进行RPA扩增，从而初步筛选出最佳的正反向引物对。每50μL混合物中含有25μL 2×Reaction buffer，5μL 10×Basice-mix，2.5μL 20×core mix，2.1μL上游引物和2.1μL下游引物(10μM)，9.8μL ddH2O，1μL的基因组作为模板。为了保证所有反应体系同时反应，2.5μL的280mM醋酸镁加到PCR管盖上，通过瞬时离心使所有反应管中的醋酸镁同时加入反应体系中。将反应体系涡旋离心后立即放入37℃恒温加热器孵育30min。使用DNA纯化试剂盒(北京天根)纯化对扩增产物进行纯化，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测产物的扩增效果。
RPA-LFS探针设计
PRA扩增和PCR扩增一样需要一对正反向引物，当使用横向流动条带(LFS)作为扩增DNA靶点的端点视觉读出时，还需在正向引物的下游设计一条探针，该探针的5’端用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记，中间有一个四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)位点，末端再进行封闭。当反应体系中积累一定量的产物时，探针将结合在产物上，此时反应体系中的Nfo酶识别到[THF]位点，并对其进行切割。由于Bsu聚合酶具有链置换活性，将[THF]位点后的DNA链置换出去，从而起始扩增。最终所得到的产物一端带有FITC，另一端带有生物素。
利用Primer Premier 5软件在正向和反向引物靶向序列之间设计特定探针，理论上应尽量避免探针和反向引物之间形成二聚体结构。原则为：(1)探针大小为46-51bp，Tm为57-80℃，GC含量为20-80％；(2)最大引物-二聚体分数设为9，最大发夹分数为9，最大聚X设置为5，其他参数设置为默认值；(3)5'端用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，在3'端用C3间隔物阻断，探针中间位置的某个碱基用四氢呋喃(THF)取代，THF位点前至少有30bp的碱基，而后至少有15bp的碱基；(4)反向引物的5'端用生物素标记。
RPA-LFS程序
用
Figure BDA0003565362520000071
DNA Amplification nfo Kit进行RPA-LFS实验，反应体系共50μL，依次向含有酶组分的冻干粉管内加入以下体系：29.5μL Rehydration buffer，12.2μLddH2O，2.1μL上游引物(10μM)和2.1μL下游引物(10μM)，0.6μL探针。为保证所有反应体系同时起始反应，1μL的模板和2.5μL 280mM醋酸镁加到管盖中，瞬时离心使模板和280mM醋酸镁同时加入反应体系中，瞬时离心，并立即在37℃的恒温加热器中孵育30分钟。然后，用5μL的扩增产物在5min内进行LFS(Ustar BioTechnologies Ltd.，中国杭州)视觉检测。LFS上显示两条红线，即控制线(上)和测试线(下)。控制线存在于每一项测试中，以确保LFS的有效性，而测试线只能观察到阳性反应。
特异性分析Specificity Assay
利用22株临床分离的肺炎链球菌和20种常见的病原微生物的基因组DNA，评估了RPA-LFS对肺炎链球菌的特异性。
检出限(LOD)分析Limit of Detection(LOD)Assay
制备3×104CFU/mL～3×10-1CFU/mL的肺炎链球菌基因组10倍系列稀释液进行RPA-LFS反应。通过对10个独立实验的概率回归分析，确定了该方法的最低检出限(LOD)。
检查临床标本
通过与传统的培养-生化法以及PCR两种方法比较，评价RPA-LFS法在临床标本中的检测符合率。临床样本在选择性培养基上培养，包括血琼脂、巧克力琼脂和麦康基琼脂，37℃培养18-48小时。使用VITEK 2机器(bioMérieux，法国)进行细菌鉴定，必要时进行额外的生化试验。PCR法也是根据lytA基因设计引物进行检测。不同方法之间的符合率计算公式为:{(两种方法的阳性样本数+两种方法的阴性样本数)/总样本数}×100％。测定kappa指数值来评价本试验。
图1为RPA引物集筛选图。以肺炎链球菌标准菌株基因组DNA为模板，采用RPA法筛选lytA-1-5对的引物。每一组引物的无模板对照(NTC)作为阴性对照。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测等体积扩增产物(5μL)。如图1所示。相比之下，引物lytA-2和lytA-4能扩增出较亮的目标条带，具有较少的引物二聚体。因此，我们选择引物对lytA-2和lytA-4进行后续RPA-LFS反应中探针进行进一步的设计。
图2为用RPA-LFS反应测试的引物-探针组的性能。图2中A处显示错配前RPA扩增产物的LFS检测结果。B处显示错配后RPA扩增产物的LFS检测结果。C处琼脂糖凝胶结果。每个引物-探针组合的名称显示在相应条带的上方。NTC条带是对应RPA的无模板控件。测试线和控制线的位置标记在条的右侧。反应在37℃下进行30min。这张图片代表了三个独立实验的结果。
由图2可见，二个引物-探针的组合都提供了正确的阳性信号(测试线和控制线上都有两条可见的红色条带)，这表明这两个引物-探针组合具有良好的扩增性能。然而，在无模板对照中，它们在测试线上也显示出一条可见的弱化红带，表明这两个引物探针组合都存在假阳性信号图2中A处；当使用肺炎链球菌基因组DNA扩增lytA基因时，两对引物探针组合在NTC组的检测线上均无信号，在含有肺炎链球菌基因组DNA组的检测线上有明显信号图2中B处，因lyt-2-F/mR/mP组合中错配碱基数少，所以，我们认为该组合的性能更佳。通过琼脂糖凝胶电泳对RPA扩增产物进行分析，发现两组引物探针组合的扩增产物都有两条清晰的条带，分别代表正向-反向引物和探针-反向引物的产物(图2中C处。总体而言，获得了最佳的引物-探针组合为lyt-2-F/mR/mP，用于肺炎链球菌的RPA-LFS检测。
RPA-LFS检测的特异性分析
为了验证引物-探针组合的包容性和特异性，对22株肺炎链球菌的临床分离菌株和其他20种病原菌进行了RPA-LFS扩增。
图3为RPA-LFS检测的特异性。A处为对临床分离的肺炎链球菌检测，B处为和其他常见病原菌进行检测。参考肺炎链球菌(ATCC 49619)作为阳性对照。每种细菌的种类名称都显示在每个条带的顶部。NTC带是一个无模板控件。反应在37℃进行30分钟。
如图3中A处所示，当使用分离的肺炎链球菌基因组DNA作为模板时，测试线上出现了明显的阳性信号，但相反，当使用来自其他常见呼吸道病原体的基因组DNA作为模板时，测试线上没有出现条带。结果表明，所建立的RPA-LFS检测体系对肺炎链球菌具有良好的特异性，与其他病原菌无交叉反应。
为了评估RPA-LFS检测的检测限，我们用灭活的肺炎双球菌培养物的10倍稀释液作为模板，相当于细菌数量从3×104CFU到3×10-1CFU(1μL，反应体积为50μL)进行评估。图4为肺炎双球菌RPA-LFS检测方法的检测限(LOD)的确定。A处为已建立的肺炎双球菌RPA-LFS检测的LOD由10个独立的检测确定，使用肺炎双球菌基因组DNA的连续稀释，相当于104到10-1CFU。图片显示了RPA-LFS检测的结果，条形图的顶部表示模板的数量。B处为除了牙龈炎基因组DNA外，还添加了10ng人类基因组DNA的组。C处为使用SPSS软件，对从10次重复中收集的数据进行Probit回归分析。
在3×104CFU的检测线上可以看到一条清晰的红带，信号随着模板数量的减少而减弱，在3×10-1CFU的样品中完全消失(图4中A处)。为了测试该系统是否能抵抗人类基因组的干扰，在RPA反应中加入10ng的人类DNA和稀释的肺炎双球菌基因组DNA。检测灵敏度不受人类DNA的影响(图4中B处)。当使用相当于3×100CFU的模板(10个样品中有9个阳性结果)或3×10-1CFU(10个样品中有1个阳性结果)时，并非所有检测都产生阳性结果。为了更准确地确认RPA-LFS检测的LOD，对10个独立检测的数据进行了probit回归分析。统计分析是用SPSS软件进行的。每个反应的LOD为3.32CFU，概率为95％(图4中C处)。
为评价所建立的RPA-LFS检测系统的临床应用价值，连云港市第二人民医院临床实验室采集110例患者临床标本，采用RPA-LFS法，PCR法和培养-生化法进行检测。如下表所示，采用RPA-LFS法和PCR法检测到样品中有31份肺炎链球菌阳性，而采用培养-生化法检测110份样品中有30份肺炎链球菌阳性。建立的RPA-LFS检测方法与PCR法的的符合率为100％。RPA-LFS法与传统培养-生化方法的符合率为98.18％，计算kappa指数值为0.977，说明两种方法比较差异无统计学意义(p>0.05)。这些结果表明，具有高度特异性和敏感性的肺炎链球菌RPA-LFS应用于患者临床样本的可行性和可靠性。
Figure BDA0003565362520000101
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 连云港市第二人民医院(连云港市临床肿瘤研究所）
<120> 用于肺炎链球菌RPA-LFS检测法的引物探针组合及其应用
<141> 2022-03-25
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa cgcttgatac agggac 46
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caatctagca gatgaagcag gtttgccgaa acgcttgata cagggc 46
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggataagggt caacgtggtc tgagtggttg gttg 34
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtggtctga gtggttgttt ggttggttag tcg 33
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtctagcag atgaagcagg tttgccgaaa cgctagatac agggac 46
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caatgtagct gatgaagcag gtttgctgaa acgcttgata cagggc 46

Claims (2)

1.用于肺炎链球菌RPA-LFS检测法的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合为lyt-2-F/mR/mP1，其序列如下：
lyt-2-F：
GGATAAGGGTCAACGTGGTCTGAGTGGTTGTTTG；
lytA-2-mR：
Biotin-GGATAAGGGTCAACGTGGTCTGAGTGGTTGGTTG；
mP1：
FITC-AGTCTAGCAGATGAAGCAGGTTTGCCGAAA[THF]CGCTAGATACAGGGA-/C3-spacer/。
2.权利要求1所述的引物探针组合在肺炎链球菌RPA-LFS法检测中或检测试剂盒的制备中的应用。
CN202210306348.8A 2022-03-25 2022-03-25 用于肺炎链球菌rpa-lfs检测法的引物探针组合及其应用 Pending CN114657272A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117778603A (zh) * 2023-12-28 2024-03-29 上海仕欧炆基因科技有限公司 一种同时检测六十种微生物的引物及探针组合及检测方法

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