JP2001521394A - 病原性大腸菌株検出用のＴａｑＭａｎ▲上ＴＭ▼−ＰＣＲ - Google Patents
病原性大腸菌株検出用のＴａｑＭａｎ▲上ＴＭ▼−ＰＣＲInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、サンプル中の病原性大腸菌を検出する方法であって、病原性大腸菌に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて前記サンプルから単離したDNAをPCR増幅することを具備する方法に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
病原性大腸菌株検出用のTaqManTM-PCR
本発明は、TaqManTM-PCR技術に基づく病原性大腸菌を検出するための迅速な高
性能アッセイ、及び特異的な至適化されたオリゴヌクレオチドプライマー、及び
該アッセイに有用なラベルされたオリゴヌクレオチドプローブに関する。
発明の背景
最近、腸出血性志賀様毒素(slt;shiga-like toxin)産生大腸菌(EHEC;Entero-h
emorrhaglc Escherichia Coli)は、重要なヒト及び動物の病原菌として認められ
るようになった(1-7)。EHECは、食物を介した幾つかの発生の原因となっている(
8)。最も顕著なのは、患者が600人を超え、ワシントンで３人が死亡したアメリ
カ西部諸州のファーストフードチェーンで起こった複数の州にわたる発生と(9)
、患者が6000人を超え、約８人の致死的な症例がみられた日本での流行性の発生
であった(10)。EHECへの感染は、下痢、出血性大腸炎、血栓性血小板減少性紫斑
病、及び急性腎不全、血小板減少症、及び細小血管障害性溶血性貧血を主な徴候
とする溶血性尿毒症症候群(HUS;hemolytic uremic syndrome)を引き起こす。HUS
は、最終的には、感染した児童及び免疫無防備状態の者に致死的な結果をもたら
し得る(3,11-17)。最近、ドイツの南東地方(ババリア)では、1995年10月から199
6年７月の間に、EHEC患者の増加が報告されており、少なくとも45の重症感染例
でHUSが発症し、そのうち７人が死亡している(18)。15のEHEC感染のうち約１がH
USをもたらすと概算すると、約600〜700人の患者を推定し得る。
これまで報告された殆どの発生では、汚染された挽き肉の消費が感染源である
のに対して(5,8,19-22)、日本ではカイワレが疑われている(10)。EHECは、牛乳(
6,19,23)、水(19)、鶏肉、豚肉、及びリンゴジュース(19,24,25)のみならず、ヒ
トの水平スメア感染も報告されている(15)。ウシは、保菌源であるように思われ
る(22,26)。交叉汚染、不適切な操作、及び不十分な調理は、全てEHECによって
引き起こされる食物を介した感染の原因となる。EHECは、ベロ毒素又は細胞毒と
しても知られている志賀様毒素(slt)を産生する(12,27)。大部分のEHECは、血清
群
O157:H7に属することが明らかとなっているが、特にヨーロッパでは、他の血清
群(O22、O26、O55、O111、O114、O145)に属する様々なEHECも多く報告されてい
る(12,15,28-32)。
EHEC以外に、他の大腸菌株も大腸炎又は胃大腸炎を引き起こすことができ、毒
素原性株(ETEC)(33-36)、病原株(EPEC)(37)、侵入性株(EIEC)(38,39)、及び凝集
性株(EaggEC;enteroaggregative)(40,41)に分類される。これらの株は重要な病
原体であり、深刻な公衆衛生上の問題も引き起こす。特異的で、感度のよいルー
チンな試験方法が存在しないために、これらの病原体の診断は、殆ど省みられて
いない。ETECは、コレラ菌の下痢と似た分泌性下痢(旅行者下痢)を引き起こし得
る易熱性エンテロトキシン及び/又は耐熱性エンテロトキシンを合成する(36,42,
43)。腸上皮細胞にETEC生物の表面が接着することが、毒素の産生に不可欠であ
る。毒素の産生は、プラスミドによって媒介され、通常は大腸菌血清群O6、O15
、O124、O136、O143、O145、及びO147が関与している(32)。
EPECは、主として幼児に下痢症状を引き起こす(32)。発症原因は不明であるが
、組織切片に観察される腸上皮の崩壊と炎症性の応答は、細菌の接着性特性の結
果起こるのかもしれない。
EPECの特異的な接着因子は、プラスミドにコードされている(EAF=EPEC接着因
子)(37,44)。EHECは、しばしば、ene(EHEC attaching and effacing gene)とし
て知られているEAFと近縁の接着因子を含有している(45,46)。EPECは、血清群O6
、O8、O25、O111、O119、及びO142に属する場合が最も多い(32)。
EIEC株は、腸上皮細胞を貫通して、侵入することができ、赤痢菌によって引き
起こされるのと類似の炎症性下痢をもたらす(38,47,48)。便のスメアは、血液、
粘液、及び分節状好中球を含有する。EIECは、さらなる病原性因子をコードする
ビルレンスプラスミドを含有する(48)。血清群O28、O112、O115、O124、O136、O
143、O145、及びO147は、最も一般的にEIEC上に見出される(32)。
EaggECは、児童への継続的な下痢と旅行者下痢を伴う。EaggECは、Hep-2細胞
の凝集を引き起こす粘着能力によって特徴づけられる。これらの効果には、ビル
レンスプラスミド(pCVD432)の存在が関連している。EaggECは、耐熱性エンテロ
トキシン(EAST1)も産生すると疑われている(49-53)。それらは、血清群O44と
O126に属し得る(32)。
EHECのための従来の検出方法は、大腸菌ブロス、ラウリル硫酸トリプトース4-
メチルウンベリフェリル-b-酸ブロス、エオシンメチレンブルーアガー、McConke
yソルビトール、及びエンテロヘモヘモリシンアガー(28,32,54-59)のような選択
的及び／又は指示培地を用いて濃縮と単離することを含む。残念なことにこれら
のアッセイは全て間接的で、EHEC又は他の病原性大腸菌株を特異的に同定する能
力に欠けている。EHECを生化学的に同定し、免疫学的に検出するための方法が幾
つか提案されてきたが(54,60-63)、病原性大腸菌株は、ユニークな発酵経路を有
しておらず、又は欠如してもいないことが広く認められている(58,64)。血清型
と病原性大腸菌群との絶対的な相関が確立できないので、血清型の決定はは、決
定的なものではない(12,27,32,58,65)。
DNAハイブリダイゼーション手法が、実験的な研究用に確立されているが、大
規模でルーチンな診断操作には適用できない(66,67)。PCRを用いたDNA増幅をベ
ースとするアッセイが、報告されてきた(68-72)。これらの方法の限界には、厄
介なポストPCR検出法(アガロースゲル電気泳動、ビオチン／アビジンをベースと
するELISA検出システム)が含まれる。
これらの問題を克服するために、PCR増幅の蛍光検出法に基づく、EHEC、ETEC
、EPEC、EIEC、及びEaggECに特徴的なビルレンス因子の特異的な決定を可能とす
るPCRアッセイを開発した。
該アッセイは、それぞれ5'及び3'末端に、蛍光リポーター色素(例えば、6-カ
ルボキシ−フルオレセイン[FAM];λem=518nm)及び蛍光消光色素(6-カルボキシテ
トラメチルローダミン[TAMRA];λem=582nm)が共有結合でコンジュゲートされた
内部オリゴヌクレオチドプローブを切断するために(74,75)、Taq-DNAポリメラー
ゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を利用する(73)。FAMからの蛍光は、同一の
インタクトなプローブ分子上に存在するTAMRAによって効率的に消光される(76)
。コグネート(cognate)PCR増幅が起こる場合には、Taqポリメラーゼは、特異的
なPCRプライマーから伸長し、テンプレートストランドにアニーリングした内部
蛍光オリゴヌクレオチドプローブを切断する。このため、レポーター色素と消光
色素が空間的に隔絶される。オリゴヌクレオチドの加水分解とレポーターと消光
色素との物理的な分離の
分離の結果、518nmの蛍光強度の測定可能な増加を観察できる。PCRサイクルによ
って、PCR産物が指数関数的に増幅され、その結果、蛍光強度も指数関数的に増
幅される。
TaqManTM-PCRは、PCRチューブを開けずに蛍光シグナルを測定し得る光学チュ
ーブの中で行われる。これは、ポストPCRプロセッシング時間を劇的に短縮し、
交叉PCR(cross-PCR)汚染の問題をほぼ完全に除去する。このアプローチを用いれ
ば、生物試料における、大腸菌株のビルレンス遺伝子の存在とビルレンス遺伝子
を有する他の腸内細菌の存在の同時テストを半自動化し、18時間以内に行うこと
ができる。
本発明によれば、病原性大腸菌を検出するためのTaqManTM-PCRが提供され、ル
ーチンな細菌研究室において、これらのビルレンス遺伝子を有するEHEC、ETEC、
EPEC、EIEC、EaggEC、及び関連する腸内細菌を特異的、迅速且つ高情報量なルー
チン検出をすることが初めて可能となった。
発明の目的
生物サンプル中の病原性大腸菌を検出及び同定するための迅速で、高性能なア
ッセイを提供することが本発明の目的である。
特異的な至適化されたプライマー、及び病原性大腸菌に特徴的なビルレンス因
子／毒素をコードする配列の増幅に有用なラベルされたオリゴヌクレオチドプロ
ーブを提供することも本発明のさらなる目的である。
発明の概要
それ故、本発明は、特に、以下のものを単独で、又は組み合わせて具備する。
毒素原性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、易熱性トキシン、又は
耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマー;
凝集性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、耐熱性トキシンをコード
する遺伝子とハイブリダイズするプライマー;
凝集性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、pCVD432プラスミドとハイ
ブリダイズするプライマー;
侵入性大腸菌に含有されたDNA配列を増幅するための、inv-プラスミドとハイ
ブリダイズするプライマー;
病原大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、EAFプラスミド、又はeae遺
伝子とハイブリダイズするプライマー;及び／又は
出血性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、志賀様毒素sltI又はsltII
をコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマー;
から選択される病原性大腸菌のビルレンス因子／トキシンに特異的な一組のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、サンプルから単離されたDNAをPCR増幅した
後に、従来の方法を用いて、増幅産物を検出及び同定することを具備するサンプ
ル中の病原性大腸菌の検出法。
毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイ
ズするプライマーの組が、
LT-1:5'GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3'、及び
LT-2:5'AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3'であり;
毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイ
ズするプライマーの組が、
ST-1:5'TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3'、及び
ST-2a:5'TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3'であり;
凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズ
するプライマーの組が、
EASTI-1:5'AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3'、及び
EASTI-2:5'TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3'であり;
pCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、
EA-1:5'CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3'、及び
EA-2:5'TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'であり;
invプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、
EI-1:5'TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3'、及び
EI-2:5'CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3'であり;
EAFプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、
EP-1:5'CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3'、及び
EP-2:5'AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3'であり;
eae遺伝子とハィブリダイズするプライマーの組が、
EPeh-1:5'CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3'、及び
EPeh-2:5'AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3'であり;
志賀様トキシンSltIをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマーが、
Slt-1:5'ATG AAA AAA ACA TTA ATA GC 3'、及び
Slt-2:5'TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3'であり;
志賀様トキシンSltIIをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマーが
、
SltII-1:5'ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3'、及び
SltII-2:5'TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3'である(ここで
、WはA/Tであり、RはA/Gであり、DはA/G/Tであり、YはC/Tであり、KはG/Tである
)上記方法。
DNAを増幅するために、付加的に5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメ
ラーゼが使用され、
最も5'側の塩基が蛍光色素でラベルされ、最も3'側の塩基が蛍光消光色素でラ
ベルされた、標的DNA内部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが
増幅プロセスに含まれており;
前記ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが前記ポリメラーゼによる5'-3
'エキソヌクレアーゼ分解によって分解され得るものであって、蛍光発生検出方
法で検出可能な断片を産生する上記方法。
毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリ
ゴヌクレオチドプローブが、
5'AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3'であり;
毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリ
ゴヌクレオチドプローブが、
5'ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3'であり;
凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリゴ
ヌク
レオチドプローブが、
5'ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3'であり;
pCVD432プラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロー
ブが、
5'CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3'であり;
invプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが
、
5'CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3'であり;
EAFプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが
、
5'CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3'であり;
eae遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、
5'TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3'であり;
志賀様毒素SltI遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロ
ーブが、
5'TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3'であり;
志賀様毒素SltII遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプ
ローブが、
5'CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3'である上記方法。
蛍光レポーター色素が6-カルボキシフルオロセイン、テトラクロロ-6-カルボ
キシフルオロセイン、又はヘキサクロロ-6-カルボキシ-フルオロセインであり、
蛍光消光色素が6-カルボキシテトラメチルローダミンである上記方法。
PCR増幅プロセスが、5.2mmolのMgCl2濃度、55℃のアニーリング温度、65℃の
伸長温度での35PCRサイクルからなる上記方法。
毒素原性大腸菌の易熱性トキシン、又は耐熱性トキシンをコードする遺伝子と
ハイブリダイズする一組のプライマー;
凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする一組
のプライマー;
凝集性大腸菌のpCVD432プラスミドとハイブリダイズする一組のプライマー;
侵入性大腸菌のinv-プラスミドとハイブリダイズする一組のプライマー;
病原大腸菌のEAFプラスミド、又はeae遺伝子とハイブリダイズする一組のプラ
イマー;及び
出血性大腸菌の志賀様毒素sltI又はsltIIをコードする遺伝子とハイブリダイ
ズする一組のプライマー;
から選択される病原性大腸菌のビルレンス因子／トキシンに特異的なDNAをPCR増
幅するのに有用な一組のプライマー。
毒素原性大腸菌の易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプ
ライマーの組が、
LT-1:5'GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3'、及び
LT-2:5'AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3'であり;
毒素原性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプ
ライマーの組が、
ST-1:5'TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3'、及び
ST-2a:5'TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3'であり;
凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプラ
イマーの組が、
EASTI-1:5'AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3'、及び
EASTI-2:5'TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3'であり;
pCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、
EA-1:5'CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3'、及び
EA-2:5'TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'であり;
invプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、
EI-1:5'TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3'、及び
EI-2:5'CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3'であり;
EAFプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、
EP-1:5'CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3'、及び
EP-2:5'AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3'であり;
eae遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、
EPeh-1:5'CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3'、及び
EPeh-2:5'AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3'であり;
志賀様トキシンsltI遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、
Slt-1:5'ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3'、及び
Slt-2:5'TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3'であり;
志賀様トキシンsltII遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、
SltII-1:5'ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3'、及び
SltII-2:5'TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3'である(ここで
、WはA/Tであり、RはA/Gであり、DはA/G/Tであり、YはC/Tであり、KはG/Tである
)上記方法。
標的DNAを増幅するためのプライマーに加えて、最も5'側の塩基が6-カルボキ
シ-フルオロセイン、テトラクロロ-6-カルボキシ-フルオロセイン、ヘキサクロ
ロ-6-カルボキシフルオロセインのような蛍光リポーター色素がラベルされ、最
も3'側の塩基が6-カルボキシテトラメチル-ローダミンのような蛍光消光色素で
ラベルされた被標識オリゴヌクレオチドプローブと、
毒素原性大腸菌の易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、
5'AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3';
毒素原性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、
、
5'ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3';
凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、
5'ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3';
pCVD432とハイブリダイズする、
5'CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3';
invプラスミドとハイブリダイズする、
5'CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3';
EAFプラスミドハイブリダイズする、
5'CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3';
eae遺伝子とハイブリダイズする、
5'TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3';
志賀様毒素SltI遺伝子とハイブリダイズする、
5'TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3';
志賀様毒素SltII遺伝子とハイブリダイズする、
5'CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3'から選択されるヌクレオチド
配列とを具備する上記プライマーの組。
ヒトを含む生きた動物の身体の大腸菌感染を診断するための上記方法の使用、
又は肉、ミルク、及び野菜のような消費材(consumables)の大腸菌汚染を検出す
るための上記方法の使用。
本発明
PCR増幅を検出するのに使用されている従来法は骨が折れ、発癌性の可能性が
ある物質を利用しており(エチジウムブロミドゲル電気泳動)、一般的な微生物の
研究室におけるルーチンアッセイ法として適していない(68-72)。これは、とり
わけ、病原性の可能性がある細菌が、特徴的な生化学的、血清学的、及び／又は
形態的な基準によって、条件的病原性細菌又は非病原性細菌と識別できない場合
に深刻な問題となる。このため、これらの種が有するビルレンス因子又はトキシ
ンを直接検出する、核酸をベースとする特異的な診断方法が必須である。このこ
とは、病原性大腸菌の診断の場合にも原則的に当てはまる。EHEC、EPEC、EIEC、
ETEC、及びEaggECの生化学的特性はユニークではなく、他の大腸菌株と区別する
ために使用できない(54,60-62)。さらに、大腸菌のビルレンスプラスミドは、他
の腸内細菌にも見出し得る(38,48,83,88,89)。血清学的構造が多様なために、血
清型による病原性大腸菌の同定も正確な同定手段ではない(12,15,28.32)。特徴
的なビルレンス因子及び／又はトキシン遺伝子に特異的なプローブを用いる古典
的なコロニーハイブリダイゼーションアッセイは骨が折れ、時間がかかる(66,67
)。古典的なPCR法は、標的遺伝子の特異的増幅が起こったかどうかを明らかにす
るために様々なポストPCRステップを必要とする(68-72)。TaqManTM-PCR検出シス
テム(74,75,90)は、病原性大腸菌株を他の大腸菌株と識別するための迅速、特異
的、高感度、且つ高処理量の診断を可能とする。該アッセイは、元の標的配列を
定量することができる。PCRサイクル後に、PCR反応チューブを開けなくてもよい
ので、交叉PCR汚染の
潜在的な危険性は皆無に近い。96サンプルをスキャンする時間は約８分であり、
テスト結果の計算は、市販のスプレッドシート(spred sheet)プログラムを用い
て自動化できる。このように、総ポストPCRプロセッシング時間が最小限に短縮
される。
TaqManTMシステムは、特異的な蛍光性内部オリゴヌクレオチドを添加する標準
的なPCR手法に依拠している。非特異的なPCR増幅が陽性の蛍光シグナルを発する
可能性は極めて低いので、従来のPCRと内部にハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチドプローブのTaqポリメラーゼ依存性分解との組み合わせは、この検出法に
特異性も与える。蛍光プローブを選択するには、いくつかのルールに従わなけれ
ばならない(74,75)。重要なのは、プローブの長さ、レポーター色素及び消光色
素の位置、及び5'末端にグアノシンが存在していないことである(74)。特異的な
PCRプライマプーの一つとプローブとの距離も重要である。これは、プローブをT
aqポリメラーゼによって切断するためには、プローブがテンプレートストランド
にアニールしたままでなければならないという事実による。少なくとも部分的に
は、アニーリングは、プローブのTmに依存するので、プローブは、プライマーよ
り高いTmを有するようにデザインすべきである。本発明によれば、これは、特異
的プライマーより3〜6bp長いプローブをデザインすることによって、解決された
(sltIIを除く)。PCR増幅には、プライマーのアニーリング後に標的配列を伸長す
ること、及び伸長したプライマーのTmが増加することが含まれる。
延長を回避するために3'末端がキャッピングされた蛍光オリゴヌクレオチドプロ
ーブでは、Tmは一定に保たれるので、Taqポリメラーゼによる分解前にプローブ
が解離しやすくなる。オリゴヌクレオチドプローブの分解は、蛍光プローブとプ
ライマーを空間的に近接させることによって至適化し得る。sltI用のプローブを
プライマーに対して121bpから9bpに近づけることによって、顕著に改善されたΔ
RQ値を得ることができる。TaqManTM-PCRを至適化する第二の戦略は、PCRの延長
を65℃で行うことであり、この場合にも、Taqポリメラーゼがプローブに到達し
、それを加水分解する前に、プローブがテンプレートストランドから解離する可
能性がより少ない。このため、ΔRQの値も約1.2〜1.5倍に増加し得る。ΔRQ値の
増加は、Taqポリメラーゼが到達したアニリーングしたオリゴヌクレオチドプロ
ーブの比、又はTaqポリメラーゼの加工性の増加によるかもしれない。
蛍光プローブの濃度は、TaqManTMの結果の精度に影響を与える。プローブ濃度
が、50pmol/PCR反応を超えると、比較的少ない割合がTaqポリメラーゼによって
加水分解されるにすぎなかった。分解されたプローブに対する分解されなかった
プローブの比は高いままであり、消光されないレポーター色素の蛍光発光は、ま
だ消光物質の近くにあるレポーター色素の蛍光強度に関して、著しく増加しない
。このように、プローブ濃度が高いと、プローブ濃度が中程度のときと比べてΔ
RQ値は低い(10-20pmol)。プローブ濃度が低すぎると、ΔRQ値は増加するが、お
そらくピペット操作の小さな誤差又はPCR反応間のごく僅かな差が決定的になる
ので、PCRの結果の変動が増加する。最小の変動と最高のRQ値を与えた至適プロ
ーブ濃度は、20pmolのプローブであることが分かった。TaqManTM-PCRはテンプレ
ート増幅を検出するための内部オリゴヌクレオチドプローブを用いるので、特異
的プライマーとプローブは、十分にデザインできる。ある遺伝子のヌクレオチド
配列に変異型が存在するときには、プライマーとプローブ配列のデザインは特に
重要である。これは、sltIとsltIIの場合に当てはまる。sltIの場合、全ての公
表された配列を並置して、３つの変異型全てに保存された領域に結合するように
、プライマーとプローブをデザインした。sltIIの場合、公表されている遺伝子
の一領域だけが保存されていたので、蛍光オリゴヌクレオチドプローブには該領
域を選択した。sltIIの増幅用プライマーは、公表されているsltII変異型の不確
かな位置における全ての可能なヌクレオチド配列を含有するようにデザインした
(degenerateプライマーアプローチ)(79-83)。degenerateプライマーを利用する
ことによって、一回のPCR反応で全ての公表されている変異型を検出することが
可能である。
テンプレートDNAの単離法は、PCRの性能に影響を与える。日常的に使用するた
めの迅速な精製ステップに適した二つの方法、すなわち煮沸調製又はスピン調製
を比較した。煮沸調製は、PCR反応に影響を与え得る幾つかの細菌成分をなお含
有しているかもしれないが、極めて速い。スピン調製法は、負の影響を与え得る
物質からDNAを精製するのに役立つ単離ステップを含む。ΔRQ値及び腸内細菌の
ビルレンス遺伝子に対するTaqManTM-PCRの感度は、スピン調製法によってテンプ
レートDNAを調製しても、煮沸調製に比べて、有意に増加しないことが分かった
。
全てのプライマー／プローブの組み合わせに対するTaqMan-PCRの総体的な感
度は、エチジウムブロミド染色したアガロースゲル電気泳動を用いた検出による
PCR産物の視覚的なスコアリングと同等であった。至適な粂件下では、PCR反応当
たり、107個の非病原性大腸菌から僅かに103cfuのsltI+EHECを検出することがで
きた。
最初のslt産生株がO157:H7陽性であることが見出されたので(1,2)、該血清群
の濃縮によるEHEC診断の感度を改善するための手段として、大腸菌O157の免疫磁
気検出法の使用が提案されている(54,91)。しかしながら、この方法では、O157
抗原陰性のEHECが見逃されることは明白である。近年のEHEC単離株の血清型決定
研究中に、O157+EHECの数は、現在では非O157EHECに比べて少ないことが明確と
なった(12,15,28,29,31)。南ドイツで行われた最近の研究では、13の単離株のう
ち２つだけがO157陽性であった(92)。他のO血清型に対する免疫磁気検出法は、
現在利用されていない。ビルレンス遺伝子の分析前の偏った濃縮操作の場合には
、志賀様毒素を有し得るシトロバクター属(83)及びエンテロバクター属(89)のよ
うな他の腸内細菌も見逃されるであろう。このように、全ての腸内細菌のビルレ
ンス遺伝子を検出するようにデザインされたTaqManTM-をベースとするPCRは、優
れていると思われる。
大部分の下痢性疾患の感染因子は知られていない。消化管中の細菌性病原体の
ルーチンスクリーニングには、サルモネラ属、シゲラ属、黄色ブドウ球菌、カン
ピロバクター属、ビブリオ属、エルシニア属、及びクロストリジウム・ディフィ
シル(C.difficile)(32)が含まれる。ETEC、EHEC、EIEC、及びEaggECのような病
原性大腸菌は下部消化管の重要な病原体であることはよく認められており、それ
故、下痢性感染症の数にかなり寄与しているかもしれない(32)。しかし、これら
の細菌用のルーチンな微生物診断操作は全く行われておらず、さらに多くの場合
には、これらの病原性大腸菌は、非病原性「片利共生フローラ」のカテゴリーに誤
診されている。この問題に対処するために、一組の特異的プライマーと蛍光プロ
ーブを開発し、TaqManTMをベースとするこれらの細菌が有するビルレンス因子の
検出のために最適化した(表２及び３)。患者のサンプル、テストした８つのビル
レンス遺伝子全てのポジティブコントロール、及び無テンプレートコントロール
を標準的な96穴マイクロタイターフォーマット中に配置して、サンプルDNAの調
製から蛍光測定までが５時
間を切る一回りの時間が達成され得る。このように、病原性大腸菌用のTaqManTM
をベースとするアッセイは、これらの細菌の極めて迅速に診断する手段を提供す
る。正確、高感度、特異的である一方、このアッセイは、従来の方法に比べて最
小のポストPCRプロセッシング時間を必要とする。光学チューブでTaqMan-TMPCR
を行うと、PCR反応の増幅産物との交叉汚染の危険も最小限に減る。病原性腸内
細菌によって含有されているビルレンスプラスミドの検出は、これらの細菌が宿
主に疾病を引き起こす可能性を証明するかもしれない。トキシン遺伝子又は付着
因子を含有する腸内細菌も常に宿主の外にそれらを発現するかどうかは明確でな
い。これは、sltI及び／又はsltII含有EHECが核酸をベースとする方法によって
検出できる多くのHUS患者で、志賀様毒素のELISAテストがネガティブであり得る
理由の説明となり得るかもしれない。
次に、7ヶ月の間に、一定の地域内(サザンババリア)の下痢の子供から得られ
た便のサンプルを調べるために、ルーチン診断環境で、病原性大腸菌を検出する
ための本発明によるTaqManTMアッセイをテストした。TaqManTM-PCRによって得ら
れた結果をPCR産物の標準的検出法(エチジウム染色したアガロースゲルの電気泳
動)と比較した。100個の便のサンプルを分析した(表４)。22％のサンプルが一以
上のビルレンス因子について陽性結果であることが明らかとなった。EHECが２症
例、ETECが５症例、EaagECが８症例、EPECが16症例であった。これは、下痢の子
供の1/5が、おそらく病原性大腸菌によって引き起こされた下痢を患っているこ
とを意味している。これらの数は、一般的にスクリーニングされる他の全ての細
菌性消化管病原体群の数よりもずっと多い。このグループでは、サルモネラは二
症例にすぎず、カンピロバクターは全く観察されなかった。
興味深いことに、EHECと診断された二人の子供は、極めて重篤な病状で、一人
は出血性大腸炎に罹患し、もう一人はHUSを発症しており、集中治療室での治療
が必要であった。
これらの調査を総合すると、児童及び成人の下痢疾患の大部分は、標準的な微
生物操作では片利共生と誤診されている病原性大腸菌を伴うことを示している。
本発明のTaqManTM法は、初めて、直接的、迅速、特異的、且つ高感度でこれらの
重要な病原体を検出することを可能とする。さらに、このアプローチによって検
出されるビ
ルレンス遺伝子は、大腸菌に限定されず、他の腸内細菌に対して自由に転用する
こともできる。これらの細菌内のビルレンス遺伝子の検出も本明細書に記載のTa
qManTM-PCRによってカバーされる。該アッセイは、最小のポストPCR検出時間し
か必要とせず、このため、18時間未満で実施することができ、PCR交叉汚染の問
題もない。
本発明において、大腸菌ビルレンス因子／トキシン遺伝子は、PCR増幅の標的
として使用した。PCRプライマーと蛍光プローブは、公表されている配列に基い
てデザインした。病原性大腸菌群及び関連腸内細菌を検出するための８つの異な
るプライマーとプローブのセットを特異的に選択した。表１を参照されたい。プ
ライマーの配列とそれらの位置及びGenBankの受付番号が表２に詳細に記載され
ている。EHECsltIの検出は、sltI相同遺伝子を並列した後のコンセンサスプライ
マー及びプローブ配列に基いている(Genhank受付番号Z36899、Z36900、及びZ369
01)(77,78)。sltII変異型の検出は、相同遺伝子の公表された配列に基いている(
Genbank受付番号M76738、Z37725、L11079、X67515、M59432、M29153、M36727、
及びM21534)(79-83)。sltIIの増幅には、degenerateプライマー群が最適である
ことが分かった。ETECの診断は、易熱性(LT)(84)又は耐熱性トキシン(ST)(36)の
何れかの増幅に基いており、EaggECはpCVD432プラスミド配列(40,50)、EIECはin
vプラスミド配列(38,48)、EPECは大腸菌付着遺伝子及び払拭(etffacing)遺伝子(
EAFプラスミド)(37,85)、又はEHEC付着タンパク質及び消去タンパク質の大腸菌
遺伝子(eae)(86)に基いている。DNA調製の完全性を調べるためのPCR対照増幅は
、大腸菌のparC遺伝子(トポイソメラーゼIV、Genbank受付番号M58408)(87)に特
異的なプライマーを用いて行った。
オリゴヌクレオチドプローブとそれらのGenbank参照番号は、表３に示されて
いる。(可能であれば)GC含量が40〜60％で、5'末端にGヌクレオチドがないオリ
ゴヌクレオチドプローブをデザインした。プローブの長さは27〜30bpであった。
プローブの最も5'側及び3'側にある塩基に、それぞれ、蛍光レポーター色素(例
えば、6-カルボキシフルオレセイン[FAM];λem=518nm)と蛍光消光色素(6-カルボ
キシテトラメチルローダミン[TAMRA];λem=582nm)を共有結合でコンジュゲート
した。全てのプライマーとプローブは、パーキンエルマー、ドイツから入手した
。
TaqManTM-PCRは、LT、ST、invプラスミド、pCVD342、EAF、eae、sltI、及びsl
tIIの遺伝子を有する大腸菌対照株からDNAを単離することによって、最適化した
(表１参照)。上記病原性大腸菌対照株を用いた場合の、PCR産物収量(アガロース
ゲル電気泳動によって確認)とRQ値(RQ=FAM蛍光強度／TAMRA蛍光強度)が最大とな
るようにMgCl2濃度を調整しナこ。5.2mmolのMgCl2濃度、35PCRサイクル、55℃の
アニーリング温度、及び65℃の伸長温度で、使用した全てのプライマー／蛍光プ
ローブに対する至適PCR反応が得られた。おそらくTaqポリメラーゼによる分解前
のテンプレート／蛍光プローブの解離速度がより低いために、65℃での伸長は、
より高いRQ値を与えることが見出された。
大腸菌sltI遺伝子は、PCRの確立及びPCRプライマーに対するプローブの異なる
位置を分析するための標的配列として使用した。プライマーは、sltI遺伝子の保
存された領域にアニーリングするようにデザインした(上記参照)。あるプライマ
ーの132bp上流に位置するslt-N0と該プライマーから21bpの距離に位置するsltI-
N1二つのプローブを比較した。プローブsltI-N1(RQm=6.3800)によって得られたR
Q値は、等しいテンプレート濃度の大腸菌sltI対照DNAにおけるプローブsltI-NO(
RQm=0.9620)で得られたRQ値に比べて、再現性よく高かった。一般的に、二つのP
CRプライマーのうちの一つに近接して(4〜20bp)位置する他の標的遺伝子に特異
的なプローブも、プライマーからより遠い距離に位置したプローブに比べて一貫
してより高いRQ値を与えた。
粗細菌ライゼートはPCRの性能に影響を及ぼし得る阻害因子を含有し得ること
が報告されているので、TaqManTM-PCRの性能に対するDNA調製物の影響をテスト
した。それ故、McConkeyプレート上で、一晩増殖させた後、細菌を採集した。DN
Aは、0.9% NaCl溶液に播種した細菌を煮沸することによって、又は市販のスピン
調製操作でゲノムDNAを単離することによって調製した(例、物質と方法参照)。T
aqManTM-PCRのRQ値と感度は、二つの調製法を比較したときに異ならなかった。
煮沸又はスピン調製によって調製された105sltI又はsltII含有EHECから得られた
DNAのPCR増幅に対して得られたRQ値は同等であった。
TaqManTM-PCR法は、加水分解後にプローブから遊離される遊離のレポーター色
素(FAM)の検出に依拠している。このため、PCRサイクル中に分解されたプロー
ブの画分に影響を与えることによって、プローブ濃度もアッセイ性能に影響を与
えるはずである。100〜0.1pmolの範囲でプローブ濃度を滴定し、ΔRQ値を決定し
た。至適プローブ濃度は、増幅される標的遺伝子に応じて、l0pmol〜20pmolの間
で変動した。
TaqMan-PCRの感度をテストするために、107cfuの大腸菌株ATCC11775を含有す
る懸濁液中に、sltI又はsltIIの何れかを含有するEHECをlogステップで希釈した
。至適条件下でPCRを行い、エチジウムブロミド染色したアガロースゲルの結果
をTaqManTMの結果と比較した。sltI含有EHEC株の最小検出限界は、107中103cfu
であった。sltIIの場合、検出限界は107の腸内細菌中103.5cfuであることが分か
った。両方法、アガロースゲル電気泳動によるPCR産物の検出とTaqMan法による
蛍光シグナルの測定は、同等の結果、すなわちΔRQ閾値を超えるΔRQでは、アガ
ロースゲルでPCR産物のバンドが見えるのに対して、ΔRQ閾値付近のΔRQ値では
、アガロースゲルPCR産物も検出限界以下という結果を与えた。全てのビルレン
ス因子／トキシンに対する検出試験を至適化した後、生物試料の病原性大腸菌の
存在をルーチンテストするために、TaqManTM-PCRをセットアップした。TaqManTM
-PCRの結果をアガロースゲル電気泳動と比較した。
以下の例により、本発明をさらに説明する。しかしながら、これは限定的に解
釈してはならない。
例
1.本発明の方法を用いて、下痢の子供から採取した便のサンプルにおける病原
性大腸菌の存在率を調べた。
TaqManTM-PCRの性能を確かめ、病原性大腸菌の発生率を調べるために下痢の臨
床症状を有する0〜10才子供から採取した100個の便のサンプルのスクリーニング
を行った。このテストに用いた物質と方法は、以下の第２項でさらに詳細に記載
されている。
サンプルの採集は、1996年の６月から10月にかけて行った。この研究で用いた
全てのサンプルは、サザンババリア地域から得られた。McConkey寒天上に便サン
プルをプレーティングして一晩インキュベートし、腸内細菌を採集した。DNAを
単離
し、sltI、sltII、LT、ST、EAF-プラスミド、eae遺伝子、invプラスミド、及びp
CVD432用の特異的なプライマーと蛍光プローブを含有するPCR反応でテンプレー
トとして使用した。各調製からのDNAの完全性を確かめるために、大腸菌のparC
遺伝子を増幅するためのプライマーと内部蛍光プローブを含有する対照PCR反応
をセットアップした。ポジティブアッセイ対照として、ポジティブコントロール
株から得たそれぞれのビルレンス因子／トキシンのDNAが存在する各アッセイの
中で一つのPCR反応を行った。この方法を適用すれば、全ての標的遺伝子の信頼
できる、特異的且つ高感度な検出が達成され得る。下痢を患っている子供から得
た100個の便のサンプルを体系的に分析すると、22のサンプルで、1、2、又は３
つ病原性大腸菌のビルレンス因子／トキシンを検出することができた。詳細には
、２人の患者はEHECを有していた(１人は出血性大腸炎を有し、１人はHUSを発症
していた)。３人の患者がETECに、16人がEPECに、１人がEIECに、８人がEaggEC
に陽性であることが試験の結果明らかとなった(表４参照)。出血性大腸炎の患者
はsltIとeaeが陽性であり、HUSを発症している患者はsltI、sltII、及びeaeが陽
性であることが明らかとなった。ETEC(LT+,ST+)、EPEC(eae+)、及びEaggEC(pCVD
342+)を同時に有する患者が１人、EIEC(inv+)とEaggEC(pCVD342+)陽性であるこ
とが明らかとなった患者が１人いて、２つの便のサンプルがEPEC(eae+)とEaggEC
(pCVD342)を含有していた。
EHECを有する２人の患者から得た腸内細菌は、TaqManTM-PCRの正確さ及び特異
性をテストするためのsltI及びsltII遺伝子プローブとハイブリダイズした。Taq
ManTM-PCRがsltI陽性である患者１の場合、sltIとハイブリダイズするコロニー
のみを見出すことができた。TaqManTM-PCRがsltIとsltII陽性である患者２のコ
ロニーは、sltIとsltIIのプローブとハイブリダイズした。陽性コロニーを取り
出し、生化学的に大腸菌と決定した。
抗生物質感受性テストによって、EHEC株は、広いスペクトルのペニシリン類、
セファロスポリン頚、及びジャイレース阻害剤に感受性があることが明らかとな
った。
2.物質と方法
a）細菌株、培地、培養、及びDNAの調製正確なPCR増幅のために、H．
Karch，ビュルツブルグ，ドイツとH．Beutin、ベルリン、ドイツの好意により戴
いた多数のEHEC、ETEC、EPEC、EIEC、及びEaggEC大腸菌株をコントロールとして
使用した(表１参照)。これらのビルレンス遺伝子を有していない株として、大腸
菌ATCC11775を使用した。TaqManTM-PCRを最適化するために、McConkey寒天(Bect
on Dickinson，Germany)上で、37℃でポジティブコントロール株を増殖させた。
一晩培養した後、細菌を集め、0.9％のNaCl溶液中に再懸濁した。濁りは、マッ
クファーランド0.5に調整した。DNAは、煮沸(95℃、10分)によって調製するか、
又はQiaAmp組織キットスピン調製カラム(Qiagen，Germany)を用いて単離した。1
0μＬのDNA懸濁液をPCRに使用した。ヒト又はウシの便のサンプルから得た病原
性大腸菌株の検出は、適切な量の便をMcConkeyプレート上に広げた後に行った。
一晩培養した後、McConkeyプレートの表面から全ての細菌コロニーを集めて、上
述したようにプロセッシングした。
b）PCRサイクル:PCR反応は、70μＬの最終容量で、薄い壁の0.2mL「光学PCRチ
ューブ」(Perkin Elmer，Germany)にセットアップした。反応混合物は、10μＬの
細菌ライゼート、5.25μＬの25mmol MgCl2、7μＬの10×PCR緩衝液、40pmolのプ
ライマー、20pmolの特異的蛍光プローブ、150μＭの各dATP、dTTP、dGTP、dCTP(
Perkin Elmer)、1UのAmpli-Taq-ポリメラーゼ(Perkin Elmer)を含有していた。P
CRサイクルのために、パーキンエルマーモデル9600サーマルサイクラーを用いた
。細菌DNAの最初の変性は、5分間94℃に加熱することによって行った。全てのサ
イクルは、94℃15秒の変性ステップ、１分30秒55℃のアニーリング、及び１分30
秒65℃の伸長を含んでいた。35サイクルを実施した。
c）ポストPCRプロセッシングサイクル完了後、プレートリーダーを取り付け、
光学チューブ中でのPCR反応の蛍光測定用に改変したパーキンエルマーLS50B発光
分光光度計を用いて、レポーター色素FAMと消光色素TAMRAの蛍光強度を決定した
。ΔRQ値は、(74)に記載されているように算出した。ΔRQ閾値値は、無テンプレ
ートコントロールの３回の平均を超える99％信頼区間に基いて算出した(ΔRQ閾 値
=6.95×std無テンプレートコントロールの平均）。ΔRQサンプル＞RQ閾値が与
えられれば、PCR反応を陽性とした。。TaqManTM-PCR測定の感度を確かめるため
に、PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。2μＬのサンプル緩衝液を用い
て、15μＬの
サンプルをロードした。エチジウムブロミドを含有する2％のアガロースゲルの
中で、100Vで35分間PCR産物を分離した。UV光の下でDNAを可視化して、Eagle Ey
eII System(Stratagene)を用いてデジタルイメージファイルを得た。
d）PCR増幅物の確認:PCR増幅の特異性を確認するために、各ポジティブコント
ロール株のテンプレートから得られたPCR産物をTAクローニングベクター(Invitr
ogen,Germany)中に直接サブクローニングした。DH5α細菌にライゲーション産物
をトランスフェクト(CaCl2法)した後、細菌を含有するプラスミドをアンピシリ
ン(Sigma，Germany)含有LBプレート上で選択した。QiagenDNA精製カラム(Quiage
n，Germany)を用いて、プラスミドDNAを精製した。4つの色素にコンジュゲート
されたジデオキシヌクレオチドを用いて(DNA色素ターミネーターサイクルシーク
エンスキット、パーキンエルマー、ドイツ)、インサートに対してPCRサイクルシ
ークエンスを行った。アプライド・バイオシステムズ・モデル373A(AppliedBiosys
tems，Germany)を用いて配列を得た。挿入配列をMcDNAsisプログラム(Appligene
，Great Britain)を用いて、表１に参照されている公表された配列と並置した。
配列の比較によって、PCR産物が各ビルレンス因子又はトキシンと同一であるこ
とが明らかとなった。
e）TaqManTM技術の感度:TaqMan法の感度を決定するために、107cfuの大腸菌参
照株ATCC 11775を含有する溶液で、ポジティブコントロール株の連続logステッ
プ希釈を行った。DNAは、煮沸法(上記参照)によって調製するか、又はゲノム細
菌DNAの単離にデザインされたスピン調製カラム(Qiagen，Germany)を用いて精製
した。精製は、製造者のプロトコールに従った。sltI含有株の検出限界は、107
大腸菌中103cfu、sltII含有株の検出限界は、107大腸菌中103.5と決定された。
f）EHEC細菌のコロニーハイブリダイゼーションと単離:EHEC細菌株と患者から
採取した便のサンプルがsltI又はsltII陽性であるかテストするために、TaqManT M
-PCRをコロニーハイブリダイゼーションに供した。簡潔に述べれば、シングル
コロニーを見ることができるように、McConkey寒天プレート上に細菌を播種した
。ナイロン膜(Genescreen Plus，NEN，Germany)上に細菌をブロッティングして
、クラックし(1% SDS)、変性させ(0.5M NaOH，1.5M NaCl)、中和し(1M
TRIS，1.5M NaCl)、洗浄(20×SSC)した。80℃で２時間膜を焼いた。sltI又はslt
II特異的DNAプローブをフルオレセイン(Gene-Images random prime labelling m
odule,Amersham,Germany)でラベルした。続いて、ラベルしたプローブを用いて
、フィルターをハイブリダイズした。抗FITCペルオキシダーゼmAbとECL検出モジ
ュール(Gene-Images CDP-Star detection module,Amersham Germany)を用いる非
放射性検出システムによって、ハイブリダイゼーションを確認した。プローブと
ハイブリダイズした細菌コロニーとハイブリダイズしないコロニーを採取して、
TaqMan-PCRで確認し、抗生物質の感受性をテストした。抗生物質感受性テストsl
tI又はsltII又は両毒素の遺伝子をコロニーハイブリダイゼーションでテストし
た後、EHECと非EHEC大腸菌をMcConkeyプレートから採取して、腸内細菌のための
NCCLSガイドラインに従って、MICテストを行った。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１１年７月１４日（１９９９．７．１４）
【補正内容】
請求の範囲
1．サンプル中の病原性腸内細菌を検出する方法であって、病原性大腸菌株の
各グループに特徴的なビルレンス因子／トキシン遺伝子を増幅することにより、
少なくとも２グループの病原性大腸菌株の識別を可能とする１セットのオリゴヌ
クレオチドプライマー対を用いて、前記サンプルから単離されたDNAをPCR増幅す
ることを具備する方法。
2．オリゴヌクレオチドプライマー対のセットが、
−易熱性トキシン又は耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする
、毒素原性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するためのプライマー対;
−耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、凝集性大腸菌に特
徴的なDNA配列を増幅するためのプライマー対;
−pCVD432プラスミドとハイブリダイズする、凝集性大腸菌に特徴的なDNA配列を
増幅するためのプライマー対;
−inv-プラスミドとハイブリダイズする、侵入性大腸菌が含有するDNA配列を増
幅するためのプライマー対;
−EAFプラスミド又はeae遺伝子とハイブリダイズする、腸病原性大腸菌に特徴的
なDNA配列を増幅するためのプライマー対;
−志賀様毒素sltI又はsltIIをコードする遺伝子とハイブリダイズする、腸出血
性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するためのプライマー対;
から選択される２以上のプライマー対を含んでなる請求項１に記載の方法。
3．−毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブ
リダイズするプライマー対が、
LT-1:5'GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3'、及び
LT-2:5'AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3'であり;
−毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイ
ズするプライマー対が、
ST-1:5'TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3'、及び
ST-2a:5'TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3'であり;
−凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズ
する
プライマー対が、
EASTI-1:5'AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3'、及び
EASTI-2:5'TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3'であり;
−pCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマー対が、
EA-1:5'CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3'、及び
EA-2:5'TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'であり;
−inv-プラスミドとハイブリダイズするプライマー対が、
EI-1:5'TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3'、及び
EI-2:5'CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3'であり;
−EAFプラスミドとハイブリダイズするプライマー対が、
EP-1:5'CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3'、及び
EP-2:5'AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3'であり;
eae遺伝子とハイブリダイズするプライマー対が、
EPeh-1:5'CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3'、及び
EPeh-2:5'AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3'であり;
志賀様毒素SltIをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマー対が、
Slt-1:5'ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3'、及び
Slt-2:5'TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3'であり;
志賀様毒素SltIIをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマー対が、
SltII-1:5'ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3'、及び
SltII-2:5'TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3'である(ここで
、WはA/Tであり、RはA/Gであり、DはA/G/Tであり、YはC/Tであり、KはG/Tである
)
請求項２に記載の方法。
4．DNAを増幅するために、付加的に5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポ
リメラーゼが使用され、
最も5'側の塩基が蛍光色素でラベルされ、最も3'側の塩基が蛍光消光色素でラ
ベルされた、標的DNAの内にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが
増幅プ
ロセスにおいて含有され、
前記ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが前記ポリメラーゼによる5'-3
'エキソヌクレアーゼ分解に対して感受性があり、蛍光検出方法で検出可能な断
片を産生する請求項1〜3の何れか１項に記載の方法。
5．ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが検出すべき各ビルレンス因子
／トキシン遺伝子に特異的である請求項４に記載の方法。
6．請求項５に記載の方法であって、
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、毒素原性大腸菌に特徴的な易熱
性トキシンの検出に特異的である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱
性トキシンの検出に特異的である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性
トキシンの検出に特異的である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、pCVD432プラスミドの検出に特
異的である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、inv-プラスミドの検出に特異的
である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、EAFプラスミドの検出に特異的
である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、eae遺伝子の検出に特異的であ
る;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、志賀様毒素SltI遺伝子の検出に
特異的である;
ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、志賀様毒素SltII遺伝子の検出
に特異的である;
請求項５に記載の方法。
7．毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンを検出するためのラベルされた
オリゴヌクレオチドプローブが、
5'AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3'であり;
毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリ
ゴ
ヌクレオチドプローブが、
5'ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3'であり;
凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリゴ
ヌクレオチドプローブが、
5'ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3'であり;
pCVD432プラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロー
ブが、
5'CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3'であり;
invプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが
、
5'CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3'であり;
EAFプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが
、
5'CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3'であり;
eae遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、
5'TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3'であり;
志賀様毒素SltI遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロ
ーブが、
5'TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3'であり;
志賀様毒素SltII遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプ
ローブが、
5'CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3'である
請求項６に記載の方法。
8．蛍光レポーター色素が6-カルボキシフルオロセイン、テトラクロロ-6-カル
ボキシフルオロセイン、又はヘキサクロロ-6-カルボキシ-フルオロセインであり
、蛍光消光色素が6-カルボキシテトラメチルローダミンである請求項4〜7の何れ
か１項に記載の方法。
9．増幅プロセスが、5.2mmolのMgCl2濃度、55℃のアニーリング温度、65℃の
伸長温度での35PCRサイクルを含む請求項1〜8に記載の方法。
10.病原性大腸菌株の各グループに特徴的なビルレンス因子／トキシン遺伝子
を増幅することにより、少なくとも２つの異なるグループの病原性大腸菌の識別
を可能
とする、病原性腸内細菌のDNAをPCR増幅するのに有用な１セットのプライマー対
。
11.毒素原性大腸菌の易熱性トキシン又は耐熱性トキシンをコードする遺伝子
とハイブリダイズするプライマー対;
凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプラ
イマー対;
凝集性大腸菌のpCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマー対;
侵入性大腸菌のinv-プラスミドとハイブリダイズするプライマー対;
病原大腸菌のEAFプラスミド、又はeae遺伝子とハイブリダイズするプライマー
対;及び
出血性大腸菌の志賀様毒素sltI又はsltIIをコードする遺伝子とハイブリダイ
ズプライマー対;
から選択される２以上のプライマー対を含む請求項10に記載のプライマー対のセ
ット。
12．毒素原性大腸菌の易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズす
るプライマー対が、
LT-1:5'GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3'、及び
LT-2:5'AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3'であり;
毒素原性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプ
ライマー対が、
ST-1:5'TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3'、及び
ST-2a:5'TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3'であり;
凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプラ
イマー対が、
EASTI-1:5'AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3'、及び
EASTI-2:5'TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3'であり;
pCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマー対が、
EA-1:5'CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3'、及び
EA-2:5'TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'であり;
invプラスミドとハイブリダイズするプライマー対が、
EI-1:5'TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3'、及び
EI-2:5'CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3'であり;
EAFプラスミドとハイブリダイズするプライマー対が、
EP-1:5'CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3'、及び
EP-2:5'AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3'であり;
eae遺伝子とハイブリダイズするプライマー対が、
EPeh-1:5'CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3'、及び
EPeh-2:5'AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3'であり;
志賀様毒素sltI遺伝子とハイブリダイズするプライマー対が、
Slt-1:5'ATG AAA AAA ACA TTA ATA GC 3'、及び
Slt-2:5'TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3'であり;
志賀様毒素sltII遺伝子とハイブリダイズするプライマー対が、
SltII-1:5'ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3'、及び
SltII-2:5'TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3'である(ここ
で、WはA/Tであり、RはA/Gであり、DはA/G/Tであり、YはC/Tであり、KはG/Tであ
る)
請求項11に記載のプライマー対のセット。
13．病原性大腸菌株のビルレンス因子／トキシン遺伝子に特異的なTaqManTM-P
CRによる病原性腸内細菌の検出に有用なラベルされた１セットのラベルされたオ
リゴヌクレオチドプローブ。
14．毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンの検出に特異的なラベルされた
オリゴヌクレオチドプローブ;
毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンの検出に特異的なラベルされたオリ
ゴヌクレオチドプローブ;
凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンの検出に特異的なラベルされたオリゴ
ヌクレオチドプローブ;
pCVD432プラスミドの検出に特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプロー
ブ;
inv-プラスミドの検出に特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ;
EAFプラスミドの検出に特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ;
eae遺伝子の検出に特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ;
志賀様毒素SltI遺伝子の検出に特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプロ
ーブ
志賀様毒素SltII遺伝子の検出に特異的なラベルされたオリゴヌクレオチドプ
ローブ;
を含む請求項13に記載のプローブのセット。
15．毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンを検出するためのラベルされた
オリゴヌクレオチドプローブが、
5'AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3'であり;
毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリ
ゴヌクレオチドプローブが、
5'ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3'であり;
凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリゴ
ヌクレオチドプローブが、
5'ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3'であり;
pCVD432プラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロー
ブが、
5'CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3'であり;
invプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが
、
5'CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3'であり;
EAFプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが
、
5'CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3'であり;
eae遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、
5'TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3'であり;
志賀様毒素SltI遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロ
ーブが、
5'TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3'であり;
志賀様毒素SltII遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプ
ローブが、
5'CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3'である請求項14に記載のプロ
ーブのセット。
16．請求項10〜12に記載の１セットのプライマー対と請求項13〜15に記載の１
セットのオリゴヌクレオチドプローブとを具備するTaqManTM-PCR法による、ヒト
を含む生きた動物の身体に由来するサンプル中の腸内細菌感染の診断に有用なキ
ット。
17．ヒトを含む生きた動物の身体に由来するサンプルの腸内細菌感染を診断す
るための、又は肉、ミルク、及び野菜のような消費材の腸内細菌汚染を検出する
ための請求項1〜9に記載の方法の使用。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1．毒素原性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、易熱性トキシン、又 は耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマー; 凝集性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、耐熱性トキシンをコード する遺伝子とハイブリダイズするプライマー; 凝集性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、pCVD432プラスミドとハイ ブリダイズするプライマー; 侵入性大腸菌に含有されたDNA配列を増幅するための、inv-プラスミドとハイ ブリダイズするプライマー; 病原大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、EAFプラスミド、又はeae遺 伝子とハイブリダイズするプライマー;及び／又は 出血性大腸菌に特徴的なDNA配列を増幅するための、志賀様毒素sltI又はsltII をコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマー; から選択される病原性大腸菌のビルレンス因子／トキシンに特異的な一組のオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いて、サンプルから単離されたDNAをPCR増幅した 後に、従来の方法を用いて、増幅産物を検出及び同定することを具備するサンプ ル中の病原性大腸菌の検出法。 2．毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリ ダイズするプライマーの組が、 LT-1:5'GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3'、及び LT-2:5'AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3'であり; 毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイ ズするプライマーの組が、 ST-1:5'TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3'、及び ST-2a:5'TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3'であり; 凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズ するプライマーの組が、 EASTI-1:5'AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3'、及び EASTI-2:5'TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3'であり; pCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、 EA-1:5'CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3'、及び EA-2:5'TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'であり; invプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、 EI-1:5'TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3'、及び EI-2:5'CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3'であり; EAFプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、 EP-1:5'CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3'、及び EP-2:5'AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3'であり; eae遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、 EPeh-1:5'CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3'、及び EPeh-2:5'AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3'であり; 志賀様トキシンSltIをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマーが、 Slt-1:5'ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3'、及び Slt-2:5'TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3'であり; 志賀様トキシンSltIIをコードする遺伝子とハイブリダイズするプライマーが 、 SltII-1:5'ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3'、及び SltII-2:5'TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3'である(ここで 、WはA/Tであり、RはA/Gであり、DはA/G/Tであり、YはC/Tであり、KはG/Tである ) 請求項１に記載の方法。 3．DNAを増幅するために、付加的に5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポ リメラーゼが使用され、 最も5'側の塩基が蛍光色素でラベルされ、最も3'側の塩基が蛍光消光色素でラ ベルされた、標的DNA内部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが 増幅プロセスに含まれており; 前記ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが前記ポリメラーゼによる5'-3 'エキソヌクレアーゼ分解によって分解され得るものであって、蛍光検出方法で 検出可能な 断片を産生する請求項１又は２に記載の方法。 4．毒素原性大腸菌に特徴的な易熱性トキシンを検出するためのラベルされた オリゴヌクレオチドプローブが、 5'AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3'であり; 毒素原性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリ ゴヌクレオチドプローブが、 5'ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3'であり; 凝集性大腸菌に特徴的な耐熱性トキシンを検出するためのラベルされたオリゴ ヌクレオチドプローブが、 5'ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3'であり; pCVD432プラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロー ブが、 5'CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3'であり; invプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが 、 5'CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3'であり; EAFプラスミドを検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが 、 5'CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3'であり; eae遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、 5'TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3'であり; 志賀様毒素SltI遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプロ ーブが、 5'TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3'であり; 志賀様毒素SltII遺伝子を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドプ ローブが、 5'CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3'である請求項３に記載の方法 。 5．蛍光レポーター色素が6-カルボキシフルオロセイン、テトラクロロ-6-カル ボキシフルオロセイン、又はヘキサクロロ-6-カルボキシ-フルオロセインであり 、蛍光消光色素が6-カルボキシテトラメチルローダミンである請求項３又は４に 記載の方法。 6．PCR増幅プロセスが、5.2mmolのMgCl2濃度、55℃のアニーリング温度、65℃ の伸長温度での35PCRサイクルからなる請求項1〜5に記載の方法。 7．毒素原性大腸菌の易熱性トキシン、又は耐熱性トキシンをコードする遺伝 子とハイブリダイズする一組のプライマー; 凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする一組 のプライマー; 凝集性大腸菌のpCVD432プラスミドとハイブリダイズする一組のプライマー; 侵入性大腸菌のinv-プラスミドとハイブリダイズする一組のプライマー; 病原大腸菌のEAFプラスミド、又はeae遺伝子とハイブリダイズする一組のプラ イマー;及び 出血性大腸菌の志賀様毒素sltI又はsltIIをコードする遺伝子とハイブリダイ ズする一組のプライマー; から選択される病原性大腸菌のビルレンス因子／トキシンに特異的なDNAをPCR増 幅するのに有用な一組のプライマー。 8．毒素原性大腸菌の易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズす るプライマーの組が、 LT-1:5'GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3'、及び LT-2:5'AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3'であり; 毒素原性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプ ライマーの組が、 ST-1:5'TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3'、及び ST-2a:5'TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3'であり; 凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズするプラ イマーの組が、 EASTI-1:5'AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3'、及び EASTI-2:5'TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3'であり; pCVD432プラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、 EA-1:5'CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3'、及び EA-2:5'TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'であり; invプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、 EI-1:5'TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3'、及び EI-2:5'CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3'であり; EAFプラスミドとハイブリダイズするプライマーの組が、 EP-1:5'CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3'、及び EP-2:5'AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3'であり; eae遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、 EPeh-1:5'CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3'、及び EPeh-2:5'AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3'であり; 志賀様トキシンsltI遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、 Slt-1:5'ATG AAA AAA ACA TTA ATA GC 3'、及び Slt-2:5'TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3'であり; 志賀様トキシンsltII遺伝子とハイブリダイズするプライマーの組が、 SltII-1:5'ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3'、及び SltII-2.5'TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3'である(ここで 、WはA/Tであり、RはA/Gであり、DはA/G/Tであり、YはC/Tであり、KはG/Tである )請求項７に記載の方法。 9．標的DNAを増幅するためのプライマーに加えて、最も5'側の塩基が6-カルボ キシ-フルオロセイン、テトラクロロ-6-カルボキシ-フルオロセイン、ヘキサク ロロ-6-カルボキシ-フルオロセインのような蛍光リポーター色素がラベルされ、 最も3'側の塩基が6-カルボキシテトラメチル-ローダミンのような蛍光消光色素 でラベルされた被標識オリゴヌクレオチドプローブと、 毒素原性大腸菌の易熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、 5'AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3'; 毒素原性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、 、 5'ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3'; 凝集性大腸菌の耐熱性トキシンをコードする遺伝子とハイブリダイズする、 5'ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3'; pCVD432とハイブリダイズする、 5'CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3'; invプラスミドとハイブリダイズする、 5'CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3'; EAFプラスミドハイブリダイズする、 5'CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3'; eae遺伝子とハイブリダイズする、 5'TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3'; 志賀様毒素SltI遺伝子とハイブリダイズする、 5'TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3'; 志賀様毒素SltII遺伝子とハイブリダイズする、 5'CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3'から選択されるヌクレオチド 配列とを具備する請求項８に記載のプライマーの組。 10．ヒトを含む生きた動物の身体の大腸菌感染を診断するための上記方法の使 用、又は肉、ミルク、及び野菜のような消費材の大腸菌汚染を検出するための請 求項1〜6に記載の方法の使用。
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