DE10004147A1

DE10004147A1 - Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von 16S-rRNA-Genen von Bakterien

Info

Publication number: DE10004147A1
Application number: DE10004147A
Authority: DE
Inventors: Hans Juergen Bach; Michael Schloter; Jean-Charles Munch; Jitka Tomanova
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2001-08-09
Also published as: WO2001057055A3; WO2001057055A2; AU2001239234A1; EP1252174A2

Abstract

Die Erfindung beschreibt Oligonukleotide, die insbesondere im Rahmen einer TaqMan-PCR zur quantitativen Bestimmung von Bakterien einsetzbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen qualitativen und quantitativen Nachweis von 16r-rRNA-Genen, Genfragmenten und hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen aus Bakterien.

Bakterien spielen einerseits als Funktionsträger in natürlichen Ökosystemen eine wichtige Rolle, andererseits werden durch eine Vielzahl von Mikroorganismen Krankheiten hervorgerufen. Aus dem letzteren Grund wurden für viele natürliche Produkte (Lebensmittel, Trinkwasser etc.) Grenzwerte festgelegt, wieviele Bakterien sich in einer Probe befinden dürfen, um die Probe als hygienisch unbedenklich einzustufen.

Die bis dato zur Überprüfung angewandten Methoden beruhen meist auf der Kultivierung von Bakterien. Dieses Verfahren hat zwei gravierende Nachteile. Einerseits ist eine sichere Überprüfung der festgelegten Grenzwerte durch Kultivierung von Bakterien sehr langwierig (teilweise liegen die Ergebnisse erst 1 Woche nach der Untersuchung des jeweiligen Probenmaterials vor), andererseits ist es nicht möglich, alle unterschiedlichen Mikroorganismen, die teils sehr komplexe Ansprüche an Kulturbedingungen haben, als "colony forming units" zu isolieren. Die Quantifizierung durch Kulturmethoden ist daher immer mit erheblichen Unsicherheiten behaftet. In einigen Fällen (vor allem bei flüssigen Proben) ist es möglich, nach einer DAPI-Färbung die Mikroorganismen mikroskopisch auszuzählen und relativ zuverlässig zu bestimmen. Dies ist jedoch mit einem erheblichen Zeitaufwand verbunden und bei festen Proben wie z. B. Lebensmitteln wiederum sehr ungenau oder nicht möglich.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Oligonukleotide bereitzustellen, mit deren Hilfe in schneller, einfacher und reproduzierbarer Weise durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken nicht nur die Anwesenheit spezifischer Bakterien nachweisbar ist, sondern von Bakterien allgemein und die insbesondere eine quantitative Bestimmung ermöglichen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Anspruch 1 näher gekennzeichneten Oligonukleotide gelöst, die im beiliegenden Sequenzprotokoll mit SEQ ID-No. 1, 2 und 3 gekennzeichnet sind. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung mit den Ausführungsbeispielen.

Die 16S-rRNA ist eine für Bakterien spezifische ribosomale Komponente und wurde deshalb bereits in der Vergangenheit für Verfahren benutzt, mit denen die Anwesenheit von Bakterien in Probenmaterialien aufgezeigt werden sollte. Die bisher als Primer und Sonden benutzten Oligonukleotide unterscheiden sich jedoch von den erfindungsgemäß offenbarten Oligonukleotiden. Insbesondere vorteilhaft können die hier beschriebenen Oligonukleotide im Rahmen einer TaqMan-PCR eingesetzt werden. Es wurden zwar bereits mehrere Arbeiten veröffentlicht, in den auch die TaqMan-PCR zum quantitativen und qualitativen Nachweis von Bakterien eingesetzt wurde. Ein Beispiel hierfür ist Kimura et al., 1999, Journal of Food Protection 62: 329-335. In diesen Arbeiten wurden jedoch ausschließlich Sonden und Primer vorgestellt, die sich zum quantitativen und qualitativen Nachweis spezieller Organismen und Organismengruppen eigneten.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem, nicht nur einzelne bekannte Bakterienspezies, sondern alle, auch unbekannte Bakterien unterschiedlichster phylogenetischer Gruppen zu erfassen, wurde durch die aus dem Stand der Technik beschriebenen Oligonukleotidsequenzen nicht gelöst. Durch den Einsatz der hier vorgestellten Oligonukleotide, insbesondere in Verbindung mit der TaqMan-PCR, kann die absolute Anzahl aller bakterieller 16S-rDNA Kopien in einem zu untersuchenden DNA-Extrakt nachgewiesen werden. Hierunter fallen auch unbekannte Bakteriengattungen und -arten und sogar die nicht kultivierbaren Bakterien, die damit unabhängig von ihrem physiologischen Status erfaßbar sind. Die hier vorgestellten Oligonukleotide eignen sich in Form eines Oligonukleotid-Sets (Forward Primer, Reverse Primer und Sonde) zu einem quantitativen bakteriellen Nachweis und erfüllen hinsichtlich Annealingtemperaturen, Länge des generierten Amplicons und der Position der internen Sonde die optimalen Bedingungen zur Durchführung insbesondere einer TaqMan-PCR.

Die hier erstmals beschriebenen Oligonukleotide können in einer breiten Palette unterschiedlichster Technologien eingesetzt werden. Hierzu gehören:

a) Lebensmittelindustrie. Quantifizierung von Bakterien, die: Verderben verursachen können, humanpathogen sein können, Produkte veredeln können.
b) Gewässerschutz. Ermittlung von Keimtitern in Trinkwasser, natürlichen Gewässern, Badeanstalten.
c) Klinische Mikrobiologie. Unspezifische Infektionen bei Mensch und Tier.
d) Labordiagnostik.
In der ökologischen Forschung stellt diese Methode ein neues Mittel zur Quantifizierung von Bakterienpopulationen dar.
In Form eines Kits, welcher alle Ingredienzen für die TaqMan-PCR enthält, eignet sich dieser PCR-Assay für eine DIN-Vorschrift zur Ermittlung von bakteriellen Keimtitern.

Die hier beschriebenen Oligonukleotide können als Sonden und Primer eingesetzt werden, und sie sind so gestaltet, daß sie in Hybridisierungsverfahren und PCR-Verfahren, insbesondere bei der TaqMan-PCR, Verwendung finden können. Die Erfindung umfaßt auch ihre komplementären Sequenzen und die reversen und revers-komplementären Sequenzen sowie die hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen.

Erfindungsgemäß umfaßt werden auch Derivate der hier beschriebenen Oligonukleotide. Unter "Derivate" und "Abwandlungen" werden solche Sequenzen verstanden, bei denen zumindest ein Nukleotid, aber auch zwei oder drei Nukleotide, an einem oder an beiden Enden der Oligonukleotide oder im Innern der Oligonukleotide durch andere Oligonukleotide ersetzt oder deletiert wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an die 16S rDNA oder 16S rRNA von Bakterien stattfinden kann. Die beschriebenen Oligonukleotide können auch in größere, DNA- und RNA- Einheiten, beispielsweise in Vektoren und Plasmide, eingebaut werden, und an eines oder beide der Enden der Oligonukleotide können weitere Oligonukleotide angehängt werden, beispielsweise mit spezifischen Restriktionsenzymerkennungsstellen.

Ausgehend von den beschriebenen Oligonukleotidesequenzen kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate bzw. Abwandlungen für spezielle Anwendungsbedingungen, insbesondere PCR- und Hybridisierungsreaktionen, geeignet sind und welche nicht.

Verfahren, bei denen DNA und RNA gerichtete Sonden zum spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus eingesetzt werden, sind an sich bekannt. (DNA gerichtete Sonde: Bach et al. 1999, Appl. and Environ. Microbiol.; RNA: Bach et al. 1999, J. Microbiol. Methods). Der Fachmann kann diese an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Oligonukleotiden zur Anwendung bringen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten bakteriellen Gene zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide, die vorstehend näher beschrieben wurden, in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis über die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder der DNA der Probe durch PCR- Techniken oder durch Hybridisierungsreaktionen, um das Vorliegen spezifischer DNA und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle offenbarten Oligonukleotide sind auch als Primer für eine reverse Transkription von rRNA einsetzbar.

Erfindungsgemäß sind vielfältige Abwandlungen möglich, um die Sonden und Primer, hier je kurz auch Oligonukleotide genannt, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit einer Markierung versehen werden, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, Digoxigenin-, Peroxidase- oder Alkalische-Phosphatase- Markierung, oder einer fluoreszierenden Markierung, um eine spezifische Hybridisierung nachzuweisen. Primer und Sonden können auch z. B. mit Biotin markiert werden und für eine sequenzspezifische Isolierung von DNA oder RNA durch Magnetic capture-hydridization eingesetzt werden.

Weitere Abwandlungen bzw. Derivatisierungen der Sonden sind z. B. PNAs, bei denen die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat und nicht an ein Zucker-Phosphat-Rückgrat gebunden sind.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonukleotide an eine Matrix gebunden (reverse Hybridisierungen), und es wird mit beispielsweise fluoreszenzmarkierter DNA oder einem PCR-Amplifikator hybridisiert. Beispiele für derartige Matrices sind Mikrochips und Mitrotiterplatten.

Vorstehend wurden bestimmte Derivatisierungen der Oligonukleotide beschrieben. Von der Erfindung umfaßt werden auch hier nicht gesondert beschriebene Derivate, beispielsweise chemische Änderungen an den Oligonukleotiden, die das Nachweisverfahren erleichtern. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt, und sie können auf die erfindungsgemäß bereitgestellten Oligonukleotide angewandt werden.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe wird entweder aus den Probenorganismen isoliert oder die Organismen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen oder durchlässig gemacht, so daß ein direkter Kontakt der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen. Die Oligonukleotide der Erfindung sind in einer Ausgestaltungsform bei in situ Hybridisierungen und in situ PCR einsetzbar.

Die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen erfolgt unter stringenten Bedingungen, bevorzugt hoch-stringenten Bedingungen. Diese Bedingungen werden nachfolgend näher ausgeführt.

Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt:

a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH- Wertes zwischen 7 und 8 (z. B Tris/HCl)
b) Wasser als "Lösungsmittel"
c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen (z. B. Ca²⁺), die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt.
d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflächenspannung von wäßrigen Lösungen
e) Nichtionische, aprotische Detergenzien (z. B. Formamid) schwächen die Bindungsenergie von Nukleinsäure- Duplexmolekülen.
f) Salz (funktionelle Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nukleinsäure-Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren erleichtern (z. B. Na⁺ in NaCl).

Vier Faktoren haben Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus den Oligonukleotiden und Zielmolekül:
Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstärken von Nukleinsäure-Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebildeten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z. B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.

Eine geeignete Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride).

Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren), unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.

Unter stringenten Reaktionsbedingungen wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen Oligonukleotidschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA-Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 × SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Genen verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden erfolgen.

Weitere Beispiele für stringente Bedingungen sind in den nachfolgenden Beispielen aufgeführt. Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonukleotide als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt.

Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:

- Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 3 Minuten lang;
- Bindung der als Primer fungierenden Oligonukleotide 1 Minute lang bei 60°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA;
- zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase;
- 30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA- Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang), gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (2 Minuten lang);
- Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3'-Enden am Reaktionsprodukt bei 70°C (ca. 5-8 Minuten lang).

Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel elektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.

In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Stringente Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die nachfolgend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungsreaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende Mikroorganismus-DNA oder -RNA nur einen sehr kleinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise verunreinigt mit weiteren Bestandteilen. Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Oligonukleotiden durchführbar.

Bei der RT-PCR werden die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung zur PCR-Amplifikation von Fragmenten an cDNA- Matrizen eingesetzt, die nach reverser Transkription mit oligo (dT) oder mit diesen Oligonukleotiden am 3'-Ende erzeugt werden. Die Expression kann dann qualitativ, in Verbindung mit geeigneten Standards und Techniken, wie einem internen Standard und insbesondere, mit einer quantitativen PCR, auch quantitativ ausgewertet werden.

Die Oligonukleotide können auch als Sonden auf DOT BLOTS oder DNA-Microarrays zur qualitativen und/oder quantitativen Analyse auf das Vorliegen der 16S rDNA von Bakterien eingesetzt werden.

Die Herstellung der Oligonukleotide der Erfindung erfolgt in an sich üblicher und bekannter Weise. Die Sonden können beispielsweise in Vektoren insertiert und nach Vermehrung wieder herausgeschnitten werden oder sie können in Form einer Matrize durch PCR oder synthetisch hergestellt werden. Auch eine Herstellung in Form von nicht-Nukleinsäuren, z. B. PNA oder derivatisierten Nukleinsäuren, um die Stabilität, die Hybridisierungseigenschaften oder Bindungseigenschaften an feste Träger zu verändern, ist möglich.

Die in dieser Anmeldung beschriebenen Oligonukleotide eignen sich in hervorragender Weise zum Einsatz bei der TaqMan-PCR. "TaqMan" ist eine registrierte Marke. Nachfolgend werden die Grundlagen der TaqMan-PCR beschrieben. Weiterhin wird im Rahmen eines Beispiels die konkrete Anwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide im Rahmen einer TaqMan-PCR beschrieben. Wie bereits oben ausgeführt ist es aber auch möglich, die hier vorgestellten Primer und Sonden, allgemein Oligonukleotide, oder Abwandlungen und Derivate dieser Oligonukleotide in den anderen, an sich bekannten Hybridisierungs- und PCR-Verfahren einzusetzen.

Die Mitte der Achtziger Jahre entwickelte Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ist zwar eine schnelle und sehr sensitive Methode in der DNA-Analytik, bei der durch sich wiederholende Zyklen eine annähernd exponentielle Amplifikation der Zielsequenz erreicht wird. Trotz der wesentlichen Erleichterungen in der täglichen Laborarbeit, die diese verhältnismäßig leicht zu automatisierende Methode mit sich gebracht hat, bedeutet der sensitive, reproduzierbare und spezifische Nachweis der PCR-Produkte noch immer einen hohen Zeit- und Arbeitsaufwand: Methoden, wie Southern-, Dot- und reverse Dot Blotting bestehen aus mehreren Fixierungs- und Waschschritten. Andere Techniken wiederum, wie z. B. Restriktionsanalysen, erfordern zusätzliche Inkubations- sowie gelelektrophoretische Arbeiten. Neben dem hohen Zeitaufwand dieser und anderer Techniken, sind außerdem zum Teil sehr hohe Reagenzienkosten sowie die Gefahr der Carry-Over-Kontamination zu berücksichtigen.

Um das Automatiserungsniveau der PCR zu erhöhen, wurde ein sogenannter homogener Assay entwickelt, bei dem Amplifikation und der Nachweis des PCR-Produkts simultan in einem Reaktionsgefäß ermöglicht werden.

Dies gelang erstmals 1991 mit dem von HOLLAND et al. (1991) beschriebenen 5'-Nuclease PCR Assay unter Ausnützung der 5'- Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase zur Detektion der sequenzspezifischen Amplifikation. Allerdings erforderte diese Technik noch ein aufwendiges Post-PCR-Processing. Erst mit den von Lee et al. (1993) entwickelten fluorogenen Sonden wurde es möglich, den Abbau der Sonde ohne aufwendige Post-PCR-Schritte zu detektieren. Dieses sogenannte TaqMan™ PCR Assay basiert auf dem ursprünglichen 5'-Nuclease-Assay und macht sich zunächst ebenfalls die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq DNA Polymerase zu Nutze. Hierfür wird eine spezielle fluorogene Sonde eingesetzt, die aus einem Oligonukleotid besteht, dessen 5'-Ende einen Quencher-Farbstoff (Rhodamin- Derivat) trägt und außerdem mit einem Phosphatrest blockiert ist. Abwandlungen dieser Ausgestaltungen sind selbstverständlich möglich.

Wird die intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Währen der PCR hybridisiert die Sonde mit den Primern zunächst an den Matrizen-Strang. In der Extensionsphase trifft die Taq Polymerase nun auf diese Sonde und beginnt sie zu verdrängen. Es entsteht eine Y-förmige Sekundärstruktur, wodurch die 5'- 3'-Exonuklease Aktivität der AmpliTaq DNA Polymerase aktiviert und die Sonde geschnitten wird. Freie, nicht-hybridisierte Sonde wird hingegen nicht hydrolisiert. Kommt es jedoch zur Sondenhydrolyse, so wird die räumliche Nähe - und damit auch der FET - zwischen Reporter und Quencher unterbrochen. Entsprechend der Akkumulation von PCR-Produkt steigt die Fluoreszenz des Reporters also mit jedem PCR-Zyklus an. Das dabei gebildete Signal ist strikt sequenzspezifisch, da nicht 100%ig bindende Sondenmoleküle verdrängt werden noch bevor die Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase aktiviert wird. Die Veränderung der Fluoreszenz der verschiedenen Farbstoffe kann schließlich mit Hilfe geeigneter Detektoren im geschlossenen Reaktionsgefäß Zyklus für Zyklus erfaßt werden.

Wie bereits beschrieben, besitzt eine TaqMan-PCR Sonde die folgenden Charakteristika:

- 5'-Reporter-Farbstoff,
- 3'-Quencher-Farbstoff,
- 3'-OH-blockierendes Phosphat.

Der fluoreszente Reporterfarbstoff ist kovalent an das 5'-Ende der Sonde geknüpft. Standardmäßig wird FAM als Reporter eingesetzt. Weitere Optionen können Tab. 2 entnommen werden. Diese verschiedenen Reporterfarbstoffe, die auch eine Multiplex-Anwendung des TaqMan-PCR Systems erlauben, werden jeweils durch den Quencher-Farbstoff TAMRA gequencht. TAMRA wird über ein Linker-Arm-modifiziertes Nukleotid (LAN) an das 3'-Ende der Sonde gebunden. Schließlich wird die Sonde noch chemisch phosphoryliert, um eine Extension des 3'-Endes während der PCR zu vermeiden. Weitere Ausgestaltungen durch Einsatz anderer Reporter und Quencher-Farbstoffe oder anderer Polymerasen sind möglich und liegen im Bereich des Könnens und Wissens des Fachmanns.

Reaktionsbedingungen

Da die Hybridisierung der Sonde im Gegensatz zu den PCR- Primern während der Extensionsphase nicht zusätzlich durch die AmpliTaq DNA Polymerase stabilisiert wird, hat dies folgende Konsequenzen für die TaqMan™-Reaktion:

- der T_m der Sonde sollte mindestens 5°C über dem der PCR- Primer liegen,
- möglichst keinen 72°C Extensionsschritt, sondern besser 2- Schritt-PCR mit kombiniertem Annealing/Extensions-Schritt (< 55°C) bei einer Temperatur unter dem T_m der Sonde,
- höhere MgCl₂-Konzentrationen (3,5-6 mM), um die Anbindung der Sonde zu stabilisieren und so die Anwendung höherer Temperaturen beim kombinierten Annealing/Extensionsschritt (höhere Extensionsrate der AmpliTaq DNA Polymerase) zu ermöglichen.

Es empfiehlt sich den tatsächlichen T_m, bei dem optimale Ergebnisse erzielt werden, empirisch zu bestimmen (wobei größere Abweichungen vom berechneten T_m auftreten können). Der TaqMan™-Sonde wird üblicherweise in Konzentrationen im Bereich von 50-200 nM/50 µl Reaktion eingesetzt. Die optimale Sondenkonzentration ist vom Fluoreszenz-Hintergrund sowie der Primer Konzentration abhängig. Das Reporter-Fluoreszenz-Signal der Ohne-Template-Kontrollen sollte mindestens dreimal so hoch sein, wie das Signal der Buffer-Blank.

Für die Auswahl der PCR-Primer gelten die allgemein gültigen Regeln:

- Länge 18-30 Basen
- G + C-Gehalt: ca 50%
- möglichst keine Poly(T)-Beriche (unspezifische Bindungen)
- möglichst keine palindromischen Sequenzabschnitte
- keine 3'-Komplementarität (Primer-Dimer-Gefährdung)
- HPLC-Aufreinigung

Übliche Primerkonzentrationen in der TaqMan™ PCR liegen bei 0,2 bis 0,5 µM. Es empfiehlt sich jedoch, die tatsächliche optimale Konzentration durch Austesten der Primer im Bereich von 0,1 bis 1,0 µM zu ermitteln.

Von der Menge der zu Beginn der PCR eingesetzten Matrizen- Moleküle hängt die Zahl der PCR-Zyklen ab, die benötigt werden, um ein ausreichendes Signal zu erhalten. Etwa 10.000 Startkopien und 25-30 Zyklen sind für den Beginn einer Optimierung ausreichend.

Denaturierung

Es empfiehlt sich, vor der PCR eine einleitende Denaturierung von ≧ 1 min bei 94-96°C durchzuführen, um sicherzustellen, daß die DNA auch tatsächlich aufgeschmolzen wird. Dies gilt insbesondere dann, wenn ein hoher GC-Gehalt der DNA- Doppelhelix zusätzliche Stabilität verleiht. In diesem Fall kann es sogar nützlich sein, in den ersten PCR Zyklen eine Denaturierungstemperatur von 95°C oder 96°C zu wählen, um sicherzustellen, daß die Strangtrennung effizient verläuft. Nach wenigen Zyklen sollte die Denaturierungstemperatur jedoch wieder auf ≧ 94°C reduziert werden, da dann genügend PCR- Produkt angereichert worden ist, welches kürzer ist als die genomische DNA und daher auch effizienter denaturiert. Ein weiterer Grund hierfür ist, daß die Halbwertszeit der Taq DNA Polymerase bei 95°C 40 min beträgt und bei 97,5°C sogar auf nur 10 min sinkt. Eine zu hohe Denaturierungstemperatur über die ganze PCR würde also die Effizienz der Reaktion und damit auch die Signalintensität negativ beeinflussen. Für die Amplifikation GC-reicher Sequenzen sollten daher folgende Punkte berücksichtigt werden:

1. Erhöhte Denaturierungstemperatur in den ersten PCR-Zyklen;
2. Höhere Annealing-Temperaturen (≧ 65°C);
3. Einsatz von PCR-Additiven wie Glycerin und/oder Formamid,
4. u. U. Einsatz von 7-Deaza-2'-desoxy-GTP neben dGTP.

Annealing-Temperatur

Auch für die TaqMan™ PCR gilt, daß mit höheren Annealing Temperaturen (< 55°C) generell spezifischeres Produkt generiert werden kann. Die Annealing-Temperaturen der Primer sowie der Sonde sollten zunächst nach der Nearest-Neighbour- Methode bestimmt werden. Bei der Optimierung der Reaktion muß die tatsächliche Annealing-Temperatur dann in z. B. 2°C- Intervallen empirisch ermittelt werden.

Extensions-Temperatur

Die Dauer der Extension ist von der Länge des zu generierenden PCR-Produkts abhängig: Die Extensionsrate der AmpliTaq Gold beträgt zwischen 2000 und 4000 Basen pro Minute bei Temperaturen von 70°C bis 80°C.

Bei der Extension muß berücksichtigt werden, daß nicht nur die PCR-Primer stabil hybridisieren, sondern auch insbesondere die TaqMan™-Sonde. Aus diesem Grund sollte der T_m der Sonde um ≧ 5°C dem T_m der Primer liegen. Eine höhere Mg-Ionenkonzentration wirkt stabilisierend auf die Hybridisierung der Sonde. Soll eine 3-Schritt-PCR etabliert werden, so empfiehlt es sich die Extensions-Temperatur ≦ 70°C zu wählen, um die Hybridisierung der Sonde nicht zusätzlich zu destabilisieren und somit höhere R_n+-Werte zu erzielen.

Auswahl der PCR-Primer und -Sonden

16S rDNA Sequenzen wurden aus der NCBI-Datenbank bezogen. Alignments wurden unter Verwendung des Genomatix DiAlign- Programms (http://genomatix.gsf.de/cgi-bin/dialign/dialign.pl) durchgeführt. Der Vergleich der so gestalteten degenerierten Oligonukleotide mit bekannten DNA-Sequenzen unter Verwendung des Genotamix Matinspektor Programms (http://genomatix.gsf.de/cgi-bin/matinspector/matinspector.pl) zeigte, daß das Nachweissystem für bakterielle 16S rDNA Gene spezifisch und auch in der Lage ist, die bakteriellen Gene von Pilzgenen und mitochondrialen Genen zu diskriminieren. Die so ausgewählten Oligonukleotide sind in der Tabelle 2 beschrieben. Abänderungen dieser Oligonukleotide sind, bei gleicher Spezifität, dem Fachmann möglich. Die 16S rDNA und 18S rDNA Sequenzen der nachfolgenden Spezies wurden für die Alignments berücksichtigt:
Azospirillum sp. X92464, Escherichia coli J01859, Burkholderia cepacia M2251, Bacillus clausii X76440, Clostridium paradoxum L06838, Corynebacterium flavescens X84441, Desulfobacter postgatei M26633, Enterobacter agglomerans Z96082, Flavobaterium salegens M92279, Basidiosporogene Hefe M2 D86910, Zoophthora radicans D61381, mitochondriale 16S rDNA von Toxoneuron abdominalis AF029113.

DNA-Gewinnung

DNA aus Bakterien und Pilzen zur Bestimmung der Spezifität der gegen die 16S rDNA gerichteten Oligonukleotide wurde mit Standardverfahren extrahiert (Marmur 1961; Henrion et al. 1994) oder von der Firma Sigma, Deisenhofen, Deutschland, bezogen. DNA aus Reinkulturen für eine nachfolgende TaqMan- PCR-Quantifizierung wurde unter Verwendung des QIAamp Tissue Kits (Quiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. DNA aus Pseudomonas fluorescens wurde entsprechend den Angaben der Firma Quiagen extrahiert. Um eine effiziente Lysis zu erreichen, wurde das Verfahren bei Verwendung von Bacillus spp.leicht modifiziert eingesetzt: Die Pellets wurden in 1 ml Lysispuffer resuspendiert und in 2 ml Glasröhrchen überführt, die je 2 g an Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,17-0,18 µm (Braun, Melsungen, Deutschland) enthielten. Während der 30 minütigen Inkubation bei 37°C wurden die Suspensionen 3 mal 90 Sek. lang nach 0,15 und 30 Min in einem Bead Beater (Homogenisator) (Braun, Melsungen, Deutschland) bei 2000 UpM homogenisiert. DNA aus Boden wurde unter Verwendung des FastDNA SPIN Kits für Böden (Bio 101, Vista, USA) entsprechend den Herstellerangaben extrahiert und gereinigt.

Plasmid-Standard zur absoluten Quantifizierung

Plasmid-Standards wurden wie nachfolgend hergestellt: Das entsprechende 16S rDNA Genfragment wurde durch herkömmliche PCR mit in der Tabelle 2 angegebenen Primern hergestellt, wobei an die Primer an den 5'-Enden sticky ends angefügt wurden, und zwar die Restriktions-Erkennungssequenz für BamHI mit dem Überhang-CGC- an den Vorwärtsprimer und die Restriktions-Erkennungssequenz für XbaI mit dem Überhang -GC an den reversen Primer. Genomische DNA aus E. coli wurde als Template eingesetzt. Das so erhaltene Fragment wurde verdaut und in den high copy-Vektor Triple Helix™pHelix™Vektor 1(+) (Roche, Mannheim, Deutschland) kloniert und in E. coli JM 105 transformiert. Die Reinigung der Plasmid DNA wurde mit dem Plasmid Midi Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) ausgeführt. Die quantitative Bestimmung der Plasmid DNA wurde durch Vergleich der Banden mit Lambda DNA/EcoRI + HindIII Marker 3 (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen) auf Agarosegel nach Ethidiumbromid Färbung geschätzt. Es wurden 10-fach Verdünnungen hergestellt und als externe Standards bei der TaqMan-PCR eingesetzt.

PCR-Bedingungen

Die eingesetzten Primer und Sonden sind in der Tabelle 2 angegeben. Die Amplifikation wurde mit dem ABI 7700 Sequenz- Nachweis-System (Perkin Eimer, Norwalk, Connecticut, USA) in 50 µl Endvolumina mit 5 µl Template DNA, 200 nM pro Primer, 150 mM TaqMan Sonde, 200 pM Desoxynukleotidtriphosphate, 5 ml 10 × Reaktionspuffer, 4,5 mM MgCl₂ und 1,25 U Ampli Taq Gold DNA Polymerase (Perkin Eimer), durchgeführt. Das PCR Programm war wie folgt: Ein Hold bei 95°C für 10 Min zur Denaturierung der DNA und Aktivierung der Polymerase, 35 Zyklen bei 95°C für 15 Sek. und 62°C für 60 Sek.

Ergebnisse Spezifität der 16S rDNA gerichteten Primer

Herkömmliche PCR wurde durchgeführt, um empirisch die Eignung der erfindungsgemäß beschriebenen Primer zur spezifischen Amplifikation bakterieller 16S rDNA-Sequenzen und ihre Fähigkeit, rDNA-Gene aus Pilzen zu diskriminieren, zu bestätigen. Mit der genomischen DNA der nachfolgenden Spezies wurde je ein einzelnes PCR Produkt mit der erwarteten Länge erhalten: Burkholderia cepacia DSMZ 7288, Pseudomonas fluorescens DSMZ 50090^T, Ochrobactrum anthropi LMG 2136, Alcaligenes faecalis DSMZ 30030^T, Azospirillum brasiliense IBOE Sp7, Agrobacterium tumefaciens DSMZ 30205^T, Herbaspirillum seropedicae IBOE Z 67, Cytophaga xantha DSMZ 3661, Sinorhizobium meliloti DSMZ 1981, Bacillus thuringiensis DSMZ 2046^T, Arthrobacter citreus IBOE BI 90, Streptomyces anulatus DSMZ 40361^T, Corynebacterium glutamicum DSMZ 20300^T, Nocardia carnea DSMZ 43397^T, Flavobacterium sp. DSMZ 1048, Escherichia coli (genomische DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Clostridium perfrigens (genomische DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Micrococcus luteus (genomische DNA, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Bei Verwendung genomischer DNA aus Kälbertymus, Mucor mucedo DSMZ 809, Aspergillus niger DSMZ 1988, Penicillium funiculosum DSMZ 1960 oder Irpex lacteus DSMZ 1183 wurden keine Produkte erhalten. Die Amplifizierbarkeit eukaryotischer DNA-Proben wurde durch Inter-LINE PCR (Smida et al., 1996) mit Random-Primern bestätigt. Aufgrund dieser Versuche kann geschlossen werden, daß die hier beschriebenen Oligonukleotide (Primer) eine spezifische Amplifikation der bakeriellen 16S rDNA-Gene ermöglichen.

TaqMan-PCR zur Quantifizierung der 16S rDNA Gene aus Bakterien in Flüssigkultur

Standardplasmid DNA mit 2 × 10⁷ - 1 × 10³ Kopien des 16S rDNA Fragments aus E. coli in 10-fachen und einfachen Verdünnungen wurden eingesetzt, um die in der Abb. 1 gezeigte Kalibrierungskurve aufzustellen. Für jede Probe wurden 2 Replikate gemessen. Die log-Kopienanzahl des 16S rDNA (x) kann wie folgt berechnet werden: C_t = -3,503x + 40,679. Der Korrelationskoeffizient betrug 0,997. Ct-Werte in Abhängigkeit von der Anzahl an Startkopien bei der TaqMan-PCR; von allen Proben wurden zwei Replikate gemessen.

Wenn man davon ausgeht, daß bei einer 100% PCR Effizienz der C_t-Wert bei einer Verdoppelung der Ausgangskopienanzahl um 1,0 abnehmen sollte, zeigt der berechnete Delta C_t-Wert von 1,055 pro einfacher Verdünnung der Standard DNA eine sehr hohe Effizienz der vorliegenden PCR Amplifikation an.

Nachfolgend wird ein Beispiel beschrieben, in welchem die Oligonukleotide der Erfindung eingesetzt und die Reaktionsbedingungen, unter denen diese Oligonukleotide zur Quantifizierung von Bakterien in der TaqMan-PCR verwendet wurden, erläutert werden.

Primer und Sondendesign

Die bevorzugten Oligonukleotide der Erfindung sind in Tabelle 2 aufgeführt, zusammen mit den bevorzugten Reaktionsbedingungen, unter denen diese Oligonukleotide zur Quantifizierung von Bakterien in der TaqMan-PCR eingesetzt werden können.

Temperaturprogramm

1 × 95°C, 10 min
35 × 95°C, 15 sec; 62°C, 1 min

Reaktionslösung

Die verwendeten Reagenzien und Röhrchen stammen von der Fa. Applied Biosystems, mit Ausnahme der verwendeten dNTPs, die von der Fa. Roche bezogen wurden.

Herstellung eines externen Standards für die Real Time TaqMan- PCR

Zur Konstruktion eines stabilen Standards, der als Referenz für die Quantifizierung der Kopienanzahl in einer Probe dient, wurde das zu amplifizierende DNA-Fragment aus Escherichia coli in den high copy number pUC19-Vektor (DNA plasmid, pHelix 1(+), Roche, Mannheim, Deutschland) inseriert und kloniert. Für die Vorbereitung des Inserts wurde eine PCR mit den in Tabelle 1 aufgeführten primer durchgeführt, die jedoch jeweils am 5'Ende durch sticky ends verlängert waren (Vorwärtsprimer: Überhang (5'CGC) und Restriktionsschnittstelle für BamHI (5'GGATCC); Rückwärtsprimer: Überhang (5'GC) und Restriktionsschnittstelle für XbaI (5'TCTAGA). Das Produkt aus dieser PCR sowie der Vektor wurden mit den beiden Restriktionsenzymen verdaut und in einer Ligation vereinigt. Der so veränderte Vektor wurde anschließend in E. coli vervielfältigt und extrahiert. Nach einer genauen Bestimmung der Konzentration dieses Vektors, der je eine Kopie des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts enthält, wurden nun Verdünnungen hergestellt, von denen die Kopienanzahl bekannt war und die als Standards für die TaqMan-PCR eingesetzt wurden.

Validierung

Der entscheidende Parameter bei der Quantifizierung von DNA- Kopien ist der Ct-Wert. Dieser gibt die Nummer des PCR-Zyklus an, bei dem das Fluoreszenzsignal zum ersten mal über das Hintergrundsignal ansteigt.

Abb. 1 zeigt die aus den Standards (schwarze Punkte) generierte Standardkurve und die darauf eingetragenen Probenwerte (rote Punkte). Durch die hohe Reproduzierbarkeit des Ansatzes sind die einzelnen Punkte für die Replikate miteinander verschmolzen und daher nicht alle sichtbar. Die sehr genaue Eichgerade (R² = 0,997) erlaubt einen zuverlässigen Messbereich von 10³ bis 2 × 10⁷ Kopien pro PCR-Ansatz.

Bestimmung der Bakterienkonzentration in einer Reinkultur von Bacillus subtilis während des Kulturverlaufs

Aus einer Flüssigkultur von B. subtilis wurden zu bestimmten Zeiten Proben entnommen. Zur Validierung der PCR- Quantifizierung wurden folgende Keimzahlbestimmungen durchgeführt:

- KBE (Kolonie-bildende Einheiten)
- Mikroskopische Auszählung der Bakterien nach DAPI-Färbung
- Quantifizierung der Kopienzahlen nach der Extraktion genomischer DNA mit dem QIAamp Tissue Kit (Quiagen, Hilden). Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.

Die über die PCR ermittelten Bakterienkonzentrationen stimmen exakt mit denen aus den DAPI-Zählungen überein. Die KBE-Werte liegen zu allen Probenahmezeiten etwas niedriger, was darauf zurückzuführen ist daß diese Bestimmungsmethode mit einigen Unsicherheiten behaftet ist. So könnte es sein, daß entweder nicht alle Organismen auf Agarplatten zum Wachstum kommen oder daß Bakterienketten, dir vor allem in der exponentiellen Wachtumsphase gehäuft vorkommen, jeweils nur eine Kolonie bilden.

Literatur

Bach, H.-J., D. Errampelli, K. T. Leung, H. Lee, A. Hartmann, J. T. Trevors, J. C. Munch (1999): Specific Detection of the Gene for the Extracellular Neutral Protease of Bacillus cereus by PCR and Blot Hybridization. Applied and. Environmental Microbiology. 65: 3226-3228.
Bach, H.-J., A. Hartmann, J. T. Trevors, J. C. Munch (1999): Magnetic-capture-hybridization method for purification and probing of mRNA for neutral protease of Bacillus cereus. Journal of Microbiological Methods. 37: 187-192.
Henrion, B., G. Chevalier and F. Martin. 1994. Typing truffle species by PCR amplification of the ribosomal DNA spacers. Mycological Research 98: 37-43.
Holland, P. M., R. D. Abramson, R. Watson, and D. H. Gelfand (1991): Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing 5'→3'exonuclease activity of Thermus aquaticus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280.
Lee, L. G., C. R. Connell, and W. Bloch (1993): Allelic discrimination by nick tranlation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids. Res. 21: 3761-3766.
Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 3: 208-218.
Schmidt, T. M. (1998): Multiplicity of Ribosomal RNA Operons in Prokaryotic Genomes. In: F. J. de Bruijn; J. R. Lupski and G. M. Weinstock (eds.). Bacterial Genomes, Physical Structure and Analysis. Chapman and Hall, New York. pp. 221-229.
SMIDA J.; S. LEIBHARD; A. M. NICKEL; F. ECKARDT-SCHUPP and L. HIEBER (1996): Application of repetitive sequence-based PCR (Inter-LINE PCR) for the analysis of genomic rearrangements and for the genome characterization on different taxonomic levels. Genetic Analysis: Biomolecular Engeneering. 13: 95-98.

Tab. 1

Zusammenfassung der Daten der fluoreszenten Farbstoffe, die bei der TaqMan-PCR eingesetzt werden können (R = Reporter, Q = Quencher, P = passiver Referenzfarbstoff).

Tab. 3

Quantifizierung von Bacillus subtilis mit verschiedenen Methoden

SEQUENZPROTOKOLL

(R = Reporter, Q = Quencher, P = passiver Referenzfarbstoff).

Claims

1. Oligonukleotide zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von 16S rRNA-Genen, -Genfragmenten und hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen und der Transkription dieser Gene, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eines der nachfolgenden Oligonukleotide oder ihre komplementäre oder reverse oder reverse komplementäre Sequenz oder eine Kombination hiervon sowie die hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder Derivate dieser Sequenzen umfassen, die je spezifisch an für 16S rRNA-Gene oder -Genfragmente kodierende DNA oder hiervon abgeleitete RNA binden, wobei die Oligonukleotide die nachfolgenden Nukleotidsequenzen umfassen:
SEQ ID No. 1, 2, 3.

2. Oligonukleotide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Oligonukleotid ist, welches unter stringenten Bedingungen, insbesondere 62°C, 4,5 mM MgCl₂ unter TaqMan PCR-Bedingungen mit einem der Oligonukleotide hybridisiert.

3. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Nukleotid hinzugefügt, deletiert und/oder ausgetauscht wurde, wobei die spezifische Bindung an 16S RNA-Gene oder -genfragmente oder hiervon abgeleitete RNA beibehalten bleibt.

4. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei, drei oder vier der Nukleotide, zusammenhängend oder einzeln, an einem oder beiden Enden oder im Innern der Oligonukleotide durch ein anderes Nukleotid ersetzt oder deletiert sind, wobei je die spezifische Bindung an 16S rRNA-Gene oder -genfragmente oder davon abgeleitete RNA beibehalten bleibt.

5. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierung aufweist.

6. Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung einer radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Alkalische-Phosphatase-Markierung ist.

7. Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Sonden, Vorwärtsprimer und/oder Rückwärtsprimer eingesetzt werden.

8. Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Sondenoligonukleotid am 5'-Ende mit einem Reporter- Farbstoff und am 3'-Ende mit einem Quencher-Farbstoff markiert ist.

9. Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.

10. Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat gebunden vorliegen.

11. Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid chemisch modifiziert vorliegt.

12. Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation von 16S rDNA-Genen, Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene mit den nachfolgenden Schritten:

- Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche; und
- Nachweis der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder DNA der Probe, um das Vorliegen 16S rRNA- spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aus Bakterien aufzuzeigen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide als Primer und/oder Sonden in PCR- Verfahren oder als Sonden in Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß entweder

a) die zu untersuchende DNA in einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) in Kontakt gebracht wird mit einem der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und im Verlauf der PCR-Amplifikation durch Verlängerung der Oligonukleotidsequenzen (Primer-Sequenzen) ein charakteristisches DNA-Markerfragment entsteht und dieses Fragment nachgewiesen wird;

oder

a) zumindest eines der Oligonukleotide mit der zu untersuchenden DNA oder RNA zur Hybridisierung gebracht wird und das Produkt dieser Hybridisierungsreaktion nachgewiesen wird.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen bei einer TaqMan-PCR wie folgt definiert sind: 62°C, 4,5 mM MgCl₂.

17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA in isolierter Form eingesetzt wird oder im biologischen Material in für die Hybridisierungsreaktion oder Polymerase-Ketten-Reaktion zugänglicher Form vorliegend eingesetzt wird.

18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die zu untersuchenden DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten;
b) das Oligonukleotid an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden wird;
c) das Oligonukleotid mittels einer DNA-Polymerase verlängert wird;
d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs- und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR-Produkts zu erhalten; und
e) das erhaltene PCR-Produkt nachgewiesen wird.

19. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten;
b) das als Primer eingesetze Polynukleotid und das als Sonde eingesetzte Oligonukleotid, welches am 5'-Ende mit einem Reporter-Farbstoff, am 3'-Ende mit einem Qeuncher-Farbstoff markiert und am 3' OH mit einem blockierenden Phosphat versehen ist, an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden werden;
c) das Primeroligonukleotid mit einer DNA- Polymerase, bevorzugt einer TaqMan-Polymerase, verlängert wird;
d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid- Bindungs- und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR- Produkts zu erhalten; und
e) das erhaltene PCR-Produkt quantitativ über die Veränderung der Fluoreszenz nachgewiesen wird.

20. Test-Kit zum Nachweis von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest ein Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche enthält.

21. Microarray, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest ein Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.

22. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zum spezifischen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis oder zur Amplifikation von 16S rRNA-Genen oder -Genfragmenten oder hiervon abgeleiteter RNA von Bakterien oder der Transkription von 16S rRNA-Genen in Bakterien.

23. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 22 in einer TaqMan-PCR.

24. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 22 zur Quantifizierung bakterieller Kontamination.