DE10204858A1

DE10204858A1 - Gensonden zum Nachweis von Spezies der Gattung Oenococcus

Info

Publication number: DE10204858A1
Application number: DE2002104858
Authority: DE
Inventors: Juergen Froehlich; Helmut Koenig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2003-08-21
Anticipated expiration: 2022-02-07
Also published as: WO2003066894A3; DE10204858B4; WO2003066894A8; AU2003205743A1; WO2003066894A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Sonden bzw. Sondengemische, die eine sichere und einfache Identifizierung von Spezies der Gattung Oenococcus ermöglichen. Gleichzeitig sollten die Sonden so konstruiert sein, daß sie ein zu einem Nachweis geeignetes Signal, wie zum Beispiel eine gute Fluoreszenzausbeute, zur Verfügung stellen. Weiterhin wird ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenocuccus und dessen Anwendung, z. B. in der Weinherstellung, beschrieben.

Description

Die Gram-positive Spezies Oenococcus oeni ist durch seine malolaktische Aktivität für den biologischen Säureabbau bei der Weinherstellung wichtig, da sie im Gegensatz zu anderen Stämmen das Aroma des Weines überwiegend günstig beeinflußt. Diese Eigenschaft führte zum Einsatz von Oenococcus oeni als Starterkulturen und hat für die Weinindustrie zunehmend Bedeutung.

Die bisher untersuchten Stämme von Oenococcus oeni (früher Leuconostoc oenos [Dicks, LMT, Dellaglio, F., Collins, M. D.: Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni [corrig.] gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 395-397 (1995)]) zeigten bei der DNA-DNA-Hybridisierung immer eine Homologie über 70% zueinander (Dicks LMT, von Vuuren HIJ, Dellaglio F. Taxonomy of Leuconostoc species, particularly Leuconostoc oenos as revealed by numerical analysis of total soluble cell protein patterns, DNA base compositions, and DNA-DNA-hybridizations. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 83-91 (1990), Garvie EI. Hybridization between the deoxyribonucleic acids of some strains of heterofermentative lactic acid bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 26: 116-122 (1976)). Die Gattung Oenococcus besteht somit bis heute aus nur einer einzigen Art, obwohl bisher mehrere tausend Stämme aus verschiedenen Regionen der Welt isoliert wurden. Dies zeigt sich gemäß der "goldenen Regel" auch für die Bakterienidentifizierung üblichen Analyse der SSU rDNA, bei der nahezu keine Sequenzunterschiede auf ca. 1500 bp auftreten.

Auch die Untersuchung der zur Bestimmung und dem Nachweis von vielen anderen Bakterien verwendeten Region zwischen dem für die 16S- und 23S-rRNA kodierenden Bereich der chromosomalen DNA erwies sich als ungeeignet für eine direkte Stammidentifizierung (Le Jeune C, Lonvaud-Funel A. Sequence of DNA 16S/23S spacer region of Leuconostoc oenos (Oenococcus oeni): application to strain differentiation. Res Microbiol. 148: 79-86 (1997)), ebenso wie die Hybridisierung mit genomischer DNA (Sohier D., Lonvaud-Funel A. Rapid and sensitive in situ hybridization method for detecting and identifying lactic acid bacteria in wine. Food Microbiology 15: 391-397 (1998)).

Aus der DE 100 21 947 ist ein allgemeines in-situ Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, insbesondere ribosomaler RNA-Moleküle, mittels einer Nachweissonde, Hybridisierung und der Verwendung von unmarkierten Helfersonden bekannt. Die DE 100 21 947 beschreibt keine Nachweissonden für Oenococcus oder ein Verfahren zu dessen Nachweis.

Die erwähnte zunehmende Bedeutung der Oenokokken-Starterkulturen für die Weinindustrie verbunden mit der gesetzlichen Zulassung als säurereduzierende Maßnahme stellt hohe Anforderungen an die Reinheit der Kulturen, da nur die Starterkulturen als Ingredienzien zugelassen sind und keine kontaminierten Produkte. Bei Stichprobenuntersuchungen von bereits auf dem Markt verfügbaren lyophilisierten Oenokokken verschiedener Hersteller, erwiesen sich zwei von fünf Proben durch Kontamination mit bisher nicht weiter identifizierten Keimen als Mischkultur.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden bzw. Sondengemische zu entwickeln, die eine sichere und einfache Identifizierung von Spezies der Gattung Oenococcus ermöglichen. Gleichzeitig sollten die Sonden so konstruiert sein, daß sie ein zu einem Nachweis geeignetes Signal, wie zum Beispiel eine gute Fluoreszenzausbeute, zur Verfügung stellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum spezifischen Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus zur Verfügung zu stellen. Das Verfahren soll schnell, billig und zuverlässig sein und sich auch im industriellen Maßstab anwenden lassen.

Eine der genannten Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird durch ein Oligonukleotid, insbesondere DNA-Oligonukleotid, das selektiv an eine 16S rRNA spezifische Nukleinsäuresequenz einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus und entsprechenden Cistronen der 16S rRNA Gene hybridisiert und eine Sequenz oder Teilsequenz mit mindestens 9 Nukleotiden Länge, vorzugsweise 9-30 Nukleotiden Länge, ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen TTC TCT GAA TTC AGT TAT TC (Seq ID NO: 1), ATT CAG TTA TTC TTC CCT TA (Seq ID NO: 2), GTA CCG TCA AGC TGA A (Seq ID NO: 3), AGA TCA CAT GTG TGA TTT G (Seq ID NO: 4), TCA CTA GGA GGC GGA A (Seq ID NO: 5), TTA CAA AAG CGA TCA TTG G (Seq ID NO: 6) und TTA CCG TCG CCG GTT T (Seq ID NO: 7) oder dazu komplementärer Sequenzen umfaßt, gelöst.

Die Phylogenie des 16S-rRNA Gens von Oenococcus oeni zeigt eine stark exponierte Lage innerhalb der Milchsäurebakterien (Dicks et al. 1995, siehe oben). Das bedeutet, daß Sequenzunterschiede von über 10% zu den nächsten verwandten Gattungen bzw. Arten bestehen. Diese Unterschiede ermöglichten nach Vergleich der erhältlichen rRNA-Sequenzen die Konstruktion gattungsspezifischer Nachweissonden. Die erfindungsgemäßen Nachweissonden sind bevorzugterweise Oligonukleotide, die einen zur Zielnukleinsäure komplementären Bereich enthalten. Dieser Bereich umfaßt die in Seq ID Nr. 1 bis 7 angegebenen Sequenzen oder Abschnitte davon und erlaubt die selektive Hybridisierung an eine 16S rRNA spezifische Nukleinsäuresequenz einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus, d. h., an eine Nukleinsäre, die diese Basensequenz aufweist. Das verwendete Oligonukleotid kann bevorzugterweise DNA, aber auch jede andere Nukleinsäure, wie PNA, RNA oder Derivate davon sein, solange wie diese Nukleinsäuren mit der Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren können.

Bevorzugterweise umfaßt das erfindungsgemäße Oligonukleotid mindestens einen nachweisbaren Marker. Dieser Marker kann weiter bevorzugt ein Farbstoff-, Enzym-, Antikörper-, Radionuklid- oder Fluoreszenzmarker sein, der am 3'- und/oder 5'-Ende der Nachweissonde, aber auch als Modifikation innerhalb der Sequenz der Nachweissonde vorliegen kann. Besonders bevorzugt sind Marker wie Biotin, Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Carbocyanine (z. B. Cy3 oder Cy5), Phosphor, Digoxigenin, Peroxidase oder Texasred oder Derivate davon. Der Marker kann auch ein indirektes Nachweissignal erzeugen, beispielsweise über eine enzymatische Reaktion. Natürlich können auch verschiedene Marker gleichzeitig an einer Sonde verwendet werden, was die Flexibilität des Systems noch erhöht.

Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide weisen üblicherweise eine Länge von 10 bis 30 Nukleotiden auf, wobei der spezifische zur Zielnukleinsäure komplementäre Bereich mindestens 9 Nukleotide lang ist, um so eine selektive Hybridisierung zu erlauben. Es können aber auch längere Oligonukleotide verwendet werden, wobei diese Oligonukleotide weitere nicht spezifische Nukleinsäureabschnitte umfassen, wie zum Beispiel PNA- oder RNA-Abschnitte. Diese Abschnitte können den erfindungsgemäßen Nachweissonden weitere funktionelle Eigenschaften verleihen, die für die industrielle Anwendbarkeit von Vorteil sein können, zum Beispiel für eine selektive Bindung an einen Nukleinsäure-Chip.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus gelöst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von: a) in Kontakt bringen mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids mit einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Oenococcus-spezifische Nukleinsäuren enthält, unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung des mindestens einen Oligonukleotids an die Oenococcus-spezifische Nukleinsäuren erlauben, und b) Nachweisen der Hybridisierung des mindestens einen Oligonukleotids. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich nunmehr erstmals alle Oenococcus Stämme nachweisen, so unter anderem Oenococcus oeni Stamm JCM 6125, Oenococcus oeni Stamm DSM 20252 und/oder Oenococcus oeni Stamm NCDO 1674. Bevorzugterweise erfolgt der Nachweis und/oder die Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus auf Basis von Oenococcus-spezifischen Nukleinsäuren, die in Form einer (r)RNA oder (c)DNA in der Probe vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase, z. B. einen Chip, gebunden vorliegt. Die Verwendung der Chiptechnologie erlaubt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Hoch-Durchsatz-Technik, die für die industrielle Anwendung sinnvoll ist, da dort unter Umständen große Zahlen von Proben überprüft werden müssen. Gleichzeitig erlaubt die Chiptechnologie die Verwendung von Robotern und anderen geeigneten Maschinen, was die Zahl der manuell durchzuführenden erforderlichen Arbeitsschritte minimiert. Als andere Möglichkeit kann auch DNA oder RNA von Oenococcus auf eine feste Phase gebunden werden und mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert werden.

Gemäß einem besonders bevorzugten Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus der Erfindung erfolgt der Nachweis der Hybridisierung mittels Fluoreszenzmessung. Auch in diesem Fall ist diese Technik für eine Verwendung in großem Maßstab besonders geeignet und erlaubt gleichzeitig eine sichere und schnelle sowie kostengünstige Durchführung. Natürlich können auch verschiedene Marker an einer Sonde verwendet werden, was die Flexibilität des Systems noch erhöht.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus ist dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Hybridisierung mittels PCR, gegebenenfalls unter Verwendung eines zweiten unspezifischen, teilspezifischen oder spezifischen Oligonukleotids, erfolgt. PCR-Verfahren sind dem Fachmann aus der einschlägigen Fachliteratur bekannt. Mit dem Begriff "spezifisches" Oligonukleotid ist im Sinne der Erfindung ein Oligonukleotid gemeint, das selektiv an eine 16S rRNA spezifische Nukleinsäuresequenz einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus hybridisiert und eine Sequenz oder Teilsequenz mit mindestens 9 Nukleotiden Länge, ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen TTC TCT GAA TTC AGT TAT TC (Seq ID NO: 1), ATT CAG TTA TTC TTC CCT TA (Seq ID NO: 2), GTA CCG TCA AGC TGA A (Seq ID NO: 3), AGA TCA CAT GTG TGA TTT G (Seq ID NO: 4), TCA CTA GGA GGC GGA A (Seq ID NO: 5), TTA CAA AAG CGA TCA TTG G (Seq ID NO: 6) und TTA CCG TCG CCG GTT T (Seq ID NO: 7) oder dazu komplementärer Sequenzen umfaßt. "Teilspezifisch" bedeutet, daß ein Oligonukleotid verwendet wird, das nur unter wenig stringenten Hybridisierungsbedingungen an die Zielsequenz hybridisiert. Mit "unspezifischen" Oligonukleotiden werden alle Oligonukleotide bezeichnet, die mit den spezifischen Oligonukleotiden der Erfindung ein PCR-Produkt ergeben können und selber nicht zum spezifischen Nachweis einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus geeignet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens zwei markierte Oligonukleotide verwendet werden, die gegebenenfalls zueinander teilweise komplementär sind. Durch diese Verwendung von Oligonukleotiden als unterstützende Sonden wird die Ausbildung von Sekundärstrukturen während der Hybridisierung an die Zielnukleinsäure vermieden und gleichzeitig - durch die Verwendung einer zweiten Markierung - die Signalstärke erhöht. Natürlich können auch zwei verschiedene Marker verwendet werden, was die Flexibilität des Systems noch erhöht. Die genaue Konstruktion und Anpassung von solchen Sonden liegt im Können des Fachmanns und kann je nach Bedarf und Verwendung der Sonden und den dabei vorhandenen Bedingungen variieren.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus gemäß der vorliegenden Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die zu untersuchende Probe eine natürliche Probe, insbesondere eine Lebensmittelprobe, wie Fruchtsaft, Maische, Trauben, Blättern und/oder Wein ist. Es kann aber auch eine nicht aus der Natur gewonnene Probe, insbesondere eine Laborkultur, wie z. B. eine Starter- oder Anreicherungskultur verwendet werden. Dies dient in besonders bevorzugten Fällen zur Überprüfung der Reinheit von Stamm- und Laborkulturen, zur Isolierung neuer Stämme von Oenococcus, der Herstellung von Starterkulturen, der Verfolgung des Weinausbaus und/oder der Qualitätskontrolle und -sicherung. Die erfindungsgemäßen Sonden sind daher für die Qualitätskontrolle und Prozesssteuerung ein wichtiges Hilfsmittel.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit für den Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus, umfassend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Hilfs- und Zusatzstoffen. Geeignete Zusatzsoffe sind zum Beispiel Pufferlösungen für das Nachweisverfahren oder zur Hybridisierung der Oligonukleotide. Die Zusammenstellung von Kits erleichtert die industrielle Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und erlaubt auch die Durchführung an Einzelproben.

Erfindungsgemäß kann mindestens ein oben genanntes Oligonukleotid oder der oben genannte Kit zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus verwendet werden. Weiter bevorzugt ist die Verwendung zum Nachweis von allen Oenococcus Stämmen, insbesondere Oenococcus oeni Stamm JCM 6125, Oenococcus oeni Stamm DSM 20252 und/oder Oenococcus oeni Stamm NCDO 1674.

Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei der Nachweis und/oder die Differenzierung in einer natürlichen Probe, insbesondere einer Lebensmittelprobe, wie Fruchtsaft, Maische, Trauben, Blätter und/oder Wein oder einer nicht aus der Natur gewonnenen Probe, insbesondere einer Laborkultur, wie z. B. einer Starter- oder Anreicherungskultur, erfolgt. Dies dient in besonders bevorzugten Fällen zur Überprüfung der Reinheit von Stamm- und Laborkulturen, zur Isolierung neuer Stämme von Oenococcus, der Herstellung von Starterkulturen, der Verfolgung des Weinausbaus und/oder der Qualitätskontrolle und -sicherung. Die erfindungsgemäßen Sonden sind daher für die Qualitätskontrolle und Prozesssteuerung ein wichtiges Hilfsmittel.

So lassen sich mittels der erfindungsgemäßen Nachweissonden Starterkulturen und deren Reinheit überprüfen, die u. a. bei der Entsäuerung von Wein unter gleichzeitiger Beibehaltung und Verbesserung und Steuerung des Geschmacks und der Aromen des Weins eine wichtige Rolle spielen. Es ist dabei essentiell, daß die Starterkulturen in einer ausreichenden Reinheit zur Verfügung gestellt werden.

Ähnlich können mittels der erfindungsgemäßen Nachweissonden neue Oenococcus-Stämme isoliert werden, wobei die erfindungsgemäßen Sonden sich bisher bei allen untersuchten Oenococcus-Stämmen mit Erfolg verwenden ließen. Dies erlaubt auch ein effektives Screening von vielen zu untersuchenden Proben, ohne daß Falsch-Positive befürchtet werden müssen, oder daß neue Stämme nicht identifiziert werden können.

Auf Basis der vorliegenden Erfindung wurden Sonden bzw. Sondengemische entwickelt, die eine sichere Identifizierung mit hoher Fluoreszenzausbeute gewährleisten. Das Hybridisierungsprotokoll wurde dabei so modifiziert und gekürzt, daß innerhalb von vier bis fünf Stunden ein Ergebnis vorlag. Dieser Zeitraum gewährleistet eine schnelle Überprüfung der Reinheit während der Kultivierung ebenso wie die Kontrolle des spontanen bzw. biologischen Säureabbaus durch Oenokokken in der Kellerwirtschaft. Die herkömmliche Methode, das Plattengussverfahren und die Beobachtung von koloniebildenden Einheiten ist vergleichsweise ungeeignet, da sich erst nach fünf bis sieben Tagen sichtbare Kolonien bilden.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand von Beispielen unter bezug auf das beigefügte Sequenzprotokoll näher beschrieben werden. Es zeigt:
Seq ID NO: 1: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo1";
Seq ID NO: 2: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo2";
Seq ID NO: 3: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo3";
Seq ID NO: 4: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo4";
Seq ID NO: 5: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo5";
Seq ID NO: 6: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo6"; und
Seq ID NO: 7: Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Sonde "Sonde_Oo7"';

Verwendete Stämme

Die zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Oligonukleotide verwendeten Stämme waren: Oenococcus oeni Stamm B1, Oenococcus oeni Stamm B139^T (DSM-Nr. 20252), Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus casei und Pediococcus damnosus.

Herstellung des verwendeten Mediums (30°C)

Zur Herstellung Trypton (2%), Hefeextrakt (0,5%), Pepton (0,5%), Glucose (0,5%), Tween 80 (0,005%) in 1 : 4 verdünntem Tomatensaft lösen, auf pH 5,2-5,5 einstellen und 15 min autoklavieren. Als alternatives Medium wurde DSMZ 59 verwendet.

Aufbau der Sonden

Die Sonden wurden entsprechend der zweidimensionalen Alignment-Technik (Fröhlich, J., Dissertation: Entwicklung und Einsatz von Isoliertechniken zur phylogenetischen Charakterisierung symbiontischer Mikroorganismen im Darm von Termiten, Universität Ulm (1999)) entworfen. Hierbei wird die zu untersuchende 16S-Sequenz mit einer Sequenz einer möglichst verwandten Art, zu der eine Sekundärstruktur bekannt ist, verglichen. Die 16S-Sekundärstruktur-Diagramme sind auf folgenden Webseiten erhältlich:
http:/ / rdpwww.life.uiuc.edu/RDP/data/SSU_secstruct.html, und
http:/ / www.rna.icmb.utexas.edu/cgi-bin/update/seq_info.pl

Die Positionen der Sonden wurden so gewählt, daß eine möglichst gute Fluoreszenzausbeute gemäß Fuchs et al. 2000 erwartet wurde. Die Sondensequenzen wurden auf ihre Spezifität mit der RDP-Datenbank verglichen (http:/ / rdp.cme.msu.edu/cgis/probe_match.cgi?su = SSU). Die Sonden wurden anschließend synthetisiert und die 5'-Position mit CY3 markiert (MWG- BIOTECH AG, Ebersberg). Tabelle 1 zeigt die Sequenzen und Charakteristika der so konstruierten Oligonukleotide. Tabelle 1 Sequenzen und Charakteristika der konstruierten Oligonukleotide

Datenbankvergleich

Die Sondensequenzen wurden um die Spezifität zu prüfen mit der RDP-Datenbank verglichen (http:/ / rdp.cme.msu.edu/cgis/probe_match.cgi?su = SSU). Dabei zeigten alle Sonden bis auf Sonde 7 eine ausreichende Spezifität (mehr als 3 Fehlpaarungen), bei der sich eine 100%-ige Übereinstimmung mit der SSU-rRNA von Xanthomonas sp. ergab. Sonde 7 wurde trotzdem als Oenococcus-spezifische Nachweissonde verwendet, da das gemeinsame Vorkommen von Oenococcus und Xanthomonas sp. aufgrund der verschiedenen Habitate als unwahrscheinlich gelten kann.

Hybridisierung (Leitch et al. (1994) In situ-Hybridisierung, Spektrum akademischer Verlag GmbH Heidelberg, Berlin, Oxford, Bettenhausen B (Hrsg.) ISBN 3-86025-225-9)

Die Zellen wurden bei 5000 U/min abzentrifugiert (Zentrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg). Das überstehende Medium wurde verworfen. Die Bakterien wurden anschließend mit entsalztem Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in Wasser resuspendiert und auf epoxidbeschichtete Objektträger (Menzel-Gläser, Braunschweig) aufgetragen. Nach dem Antrocknen bei Zimmertemperatur wurden die Objektträger für 10 min bei 90°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben in aufsteigender Reihenfolge mit 50%-70% Ethanol/1 × PBS-Puffer-Gemisch und abschließend 2 × mit 96%-igem Ethanol für jeweils 5 min entwässert.

Nach dem Verdampfen des Ethanols wurden 99 µl des Hybridisierungspuffers mit 1 µl 50 pmol/µl Sondenlsg. versetzt und auf die Objektträger im Dunkeln aufgetragen. Die Puffer/Sonden-Mischungen wurden zuvor für 10 min bei 70°C denaturiert und anschließend auf Eis gekühlt. Der Hybridisierungspuffer (berechnet für 1 ml-Hybridisierlösung) bestand aus 100 µl 200 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7.2), 333.4 µl 2.7 M NaCl-Lsg., 1 µl 10% SDS-Lsg., 0.1 g Dextransulfat, 565.6 µl entsalztem Wasser. Die Objektträger wurden mit Deckgläser abgedeckt und in vorgewärmte Hybridisierungskammern, die mit 2 ml Puffer befeuchtet wurden, (50 ml Falkontubes, Becton Dickinson Labware, NJ, USA) eingebracht und im Hybridisierungsofen (Hybaid, Heidelberg) bei 36°C für 1 h inkubiert. Die Waschlösung hatte die gleiche Zusammensetzung wie der Hybridisierungspuffer bis auf das Dextransulfat. Die Objekträger wurden bei 38°C für 10 min in der Waschlösung belassen und ein zweites Mal für weitere 10 min bei 40°C gewaschen. Die Objektträger wurden mit 100 µl (2 µg/ml) DAPI-Lsg. überschichtet und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem kurzen Waschschritt mit entsalztem Wasser gibt man 50 µl DABCO-Lsg. zu und deckt mit einem Deckglas ab.

Die Objektträger wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop Axiophot 2 (Zeiss, Göttingen) bei 1000-facher Vergrößerung mit den Filtersätzen 01 (Anregung: 365 nm, Emission: 397 nm, und Cy3 (Anregung: 550 nm, Emission: 610-675 nm) untersucht.

Sondenauswahl

Das Funktionieren der Sonden und die Fluoreszenzausbeute hängen direkt mit der Übertragbarkeit der Ergebnisse von Fuchs et al. (Flow cytometric analysis of the in situ accessability of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labelled oligonucleotide probes; Appl Environ Microbiol 64: 4973-82 (1998)) auf andere Bakterien als Escherichia coli zusammen. Für diese Fragestellung wurden die Bindungsstudien der SSU rRNA von E. coli und Bacillus subtilis verglichen (SSU rRNA-Sekundärstrucktur von E. coli und B. subtilis) (siehe http:/ / www.rna.icmb.utexas.edu/ANALYSIS/16S.FOLD/16sfold.html, und Konings und Gutell, A comparison of thermodynamic foldings with comparatively derived structures of 16S and 16S-like rRNAs. RNA 1: 559-74 (1995)). Die Sekundärstrukturen sind weitestgehend übereinstimmend im Aufbau. Allerdings liegen alle sieben generierte Sonden in stärker gebundenen Bereichen.

Fluoreszenzsignale

Die Hybridisierungsversuche wurden mit folgenden Organismen durchgeführt: Oenococcus oeni Stamm B1, Oenococcus oeni Stamm B139^T (DSM Nr. 20252), Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus casei und Pediococcus damnosus. Die Sonden sollten dabei so spezifisch sein, daß sich nur bei den verschiedenen Oenokokken Signale ergeben. Um die Hybridisierung zu beschleunigen und die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren wurde auf eine Fixierung mit Formaldehyd verzichtet und der Hybridisierungsbeschleuniger Dextransulfat verwendet (Leitch et al., 1994; siehe oben).

Die Fluoreszenzsignale der Sonden 1 und 7 waren vergleichbar mit der Sonde Eub338, die allgemein bei allen Eubakterien bindet. Die anderen Sonden zeigten nur ein schwaches bzw. kein Signal. Die Ergebnisse bestätigen in etwa die Annahmen von Fuchs et al., 1998 und Konings und Gutell, 1995. Lediglich Sonde 2 und Sonde 4 sollten stärkere Signale oder überhaupt Signale ergeben. Bei Sonde 2 konnte der Bereich, den Fuchs et al. 1998 vorgeschlagen hatte, nicht exakt eingehalten werden, sondern die Sonde mußte, um spezifisch zu sein, leicht in einen Bereich mit geringer Signalstärke verschoben werden. Bei Sonde 4 liegt der Fall in sofern anders, weil bei E. coli dieser Bereich als weniger stark gebunden beschrieben wurde, während bei Bacillus und Oenoccocus dieser Bereich stark gebunden ist.

Der Bereich der SSU rRNA, an den die Sonde 1 hybridisiert, ist bei Oenococcus noch weniger gebunden als bei Bacillus oder Escherichia und auch wesentlich A/T-reicher. Daher zeigt diese Sonde ein starkes Fluoreszenzsignal. Da Sonde 3 ein mäßiges Signal ergab, jedoch mit einem Bereich hybridisiert, der teilweise komplementär zum Sondenbereich 1 ist, sollte die Mischhybridisierung mit Sonde 1 und 3 ein besonders starkes Fluoreszenzsignal ergeben, da Sonde 1 während der Hybridisierung den Bereich für Sonde 3 freilegt. Die Ergebnisse übertrafen unsere Erwartungen. Lactobacillus casei zeigte durch sein leichte Pigmentierung eine höhere Eigenfluoreszenz unter UV-Licht. (Daher sollten die schwächeren Sonden nicht verwendet werden.) Bei PNAs entfällt dieses Problem mit stark ausgeprägten Sekundärstruktur des 16S rRNA.

Anwendungsbeispiel des Sondengemisches Oo1 und Oo3

Die Sonden Oo1 und Oo3 wurden aufgrund der genannten Ergebnisse auf 84 Stämme der Stammsammlung des Instituts für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz angewendet. Die Stämme kommen aus unterschiedlichen Regionen Deutschlands, Portugals (B281, B283, B289, B290, B302) und Südaustraliens (B4, B5). Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 dargestellt.

Die Sonden zeigen trotz unterschiedlicher Fluoreszenzausbeuten bei der in situ- Hybridisierung, daß Oenokokken-Stämme sicher identifiziert werden können. Die aufgrund ihres Proteinspektrums als Oenokokken identifizierten Stämme aus Portugal ergaben mit den Sonden kein Signal (siehe Tabelle 2). Nach Sequenzierung der PCR-Amplifikate der 16S rDNS-Sequenzen wurden diese Stämme gesamt als Vertreter der Art Lactobacillus casei bestimmt. Die Sondensequenz und 5'-Markierungen waren wie folgt:
Sonde 1: CY3-TTC TCT GAA TTC AGT TAT TC
Sonde 3: CY3-GTA CCG TCA AGC TGA A Tabelle 2 Ergebnisse der Hybridisierungen der untersuchten Oenokokken mit den Sonden 1 und 3

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Oligonukleotid, insbesondere DNA-Oligonukleotid, das selektiv an eine 16S rRNA spezifische Nukleinsäuresequenz einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus hybridisiert und eine Sequenz oder Teilsequenz mit mindestens 9 Nukleotiden Länge, ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen TTC TCT GAA TTC AGT TAT TC (Seq ID NO: 1), ATT CAG TTA TTC TTC CCT TA (Seq ID NO: 2), GTA CCG TCA AGC TGA A (Seq ID NO: 3), AGA TCA CAT GTG TGA TTT G (Seq ID NO: 4), TCA CTA GGA GGC GGA A (Seq ID NO: 5), TTA CAA AAG CGA TCA TTG G (Seq ID NO: 6) und TTA CCG TCG CCG GTT T (Seq ID NO: 7) oder dazu komplementärer Sequenzen umfaßt.

2. Oligonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen nachweisbaren Marker umfaßt.

3. Oligonukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker ein Enzym-, Antikörper-, Radionuklid- oder Fluoreszenzmarker sind.

4. Oligonukleotid nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker Biotin, Fluorescein, Carbocyanine (z. B. Cy3 oder Cy5), Phosphor, Digoxigenin, Peroxidase oder Rhodamin, Texasred oder Derivate davon ist.

5. Oligonukleotid nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid eine Länge von 9 bis 30 Nukleotiden aufweist.

6. Oligonukleotid nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid weitere nicht spezifische Nukleinsäureabschnitte umfaßt, wie zum Beispiel PNA oder RNA-Abschnitte.

7. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus, umfassend
in Kontakt bringen mindestens eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Oenococcus-spezifische Nukleinsäuren enthält, unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung des mindestens einen Oligonukleotids an die Oenococcus-spezifische Nukleinsäuren erlauben, und
Nachweisen der Hybridisierung des mindestens einen Oligonukleotids.

8. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß alle Oenococcus Stämme nachgewiesen werden, insbesondere Oenococcus oeni Stamm JCM 6125, Oenococcus oeni Stamm DSM 20252 und/oder Oenococcus oeni Stamm NCDO 1674.

9. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Oenococcus-spezifische Nukleinsäuren in Form einer RNA, PNA oder DNA in der Probe vorliegt.

10. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid oder die Oenococcus-spezifische Nukleinsäure an eine feste Phase, z. B. einen Chip, gekoppelt vorliegt.

11. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Hybridisierung mittels Fluoreszenzmessung erfolgt.

12. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Hybridisierung mittels PCR, gegebenenfalls unter Verwendung weiterer unspezifischer, teilspezifischer oder spezifischer Oligonukleotids, erfolgt.

13. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei markierte Oligonukleotide verwendet werden, die gegebenenfalls zueinander teilweise komplementär sind.

14. Verfahren zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine natürliche Probe, insbesondere eine Lebensmittelprobe, wie Fruchtsaft, Maische, Trauben, Blätter und/oder Wein oder eine nicht aus der Natur gewonnene Probe, insbesondere eine Laborkultur, wie z. B. eine Starter- oder Anreicherungskultur, ist.

15. Kit für den Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus, umfassend mindestens ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Hilfs- und Zusatzstoffen.

16. Verwendung mindestens eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Kits nach Anspruch 15 zum Nachweis und/oder der Differenzierung einer Spezies von Bakterien der Gattung Oenococcus.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zum Nachweis von allen Oenococcus Stämmen, insbesondere Oenococcus oeni Stamm JCM 6125, Oenococcus oeni Stamm DSM 20252 und/oder Oenococcus oeni Stamm NCDO 1674.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Nachweis und/oder die Differenzierung in einer natürlichen Probe, insbesondere einer Lebensmittelprobe, wie Fruchtsaft, Maische, Trauben, Blättern und/oder Wein oder einer nicht aus der Natur gewonnenen Probe, insbesondere einer Laborkultur, wie z. B. einer Starter- oder Anreicherungskultur, erfolgt.

19. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 18 zur Überprüfung der Reinheit von Stamm- und Laborkulturen, zur Isolierung neuer Stämme von Oenococcus, der Herstellung von Starterkulturen, der Verfolgung des Weinausbaus und/oder der Qualitätskontrolle und -sicherung.