DE10021947A1 - Helferoligonukleotide für die in situ Hybridisierung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung mit einer markierten Nachweissonde und zur Durchführung des Verfahrens geeignete Reagenzienkits.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung mit einer markierten Nachweissonde und zur Durchführung des Verfahrens geeignete Reagenzienkits.

Der Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung mit Nachweissonden ist heute ein weit verbreitetes Verfahren sowohl zur genotypischen Charakterisierung von Mikroorganismen als auch zur quantitativen Analyse ihrer Diversität in natürlichen Habitaten. Bei der in situ Hybridisierung wird eine kurze Nachweissonde an ganzen, fixierten Zellen gegen eine komplementäre Nukleinsäure beispielsweise auf der ribosomalen RNA hybridisiert. Die Spezifität der Sonde kann dabei auf eine gewünschte Spezies oder Gruppe von Zielorganismen eingestellt werden.

Häufig auftretende methodische Probleme sind im Wesentlichen eine geringe Permeabilität der Zellwand (Bidnenko et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998), 3059-3062), eine geringe Zahl von Zielmolekülen (Binder und Liu, Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998), 3346-3351); Fegatella et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998), 4433-4438) sowie unzugängliche Bereiche im Zielmolekül aufgrund der Ausbildung von Sekundärstrukturen.

Untersuchungen von Fuchs et al. (Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998), 4973-4982) haben am Beispiel der ribosomalen RNA gezeigt, dass potenzielle Zielregionen der Nachweissonden oft vermutlich durch rRNA- rRNA oder rRNA-Protein Wechselwirkungen blockiert sind und kein oder nur ein schwaches Signal nach Hybridisierung mit spezifischen Nachweissonden ergeben.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, diese aus dem Stand der Technik bekannten Probleme bei der in situ Hybridisierung auszuräumen und insbesondere die Zugänglichkeit von Zielmolekülen für die Nachweissonden zu verbessern.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine oder mehrere Helfersonden zusammen mit der spezifischen Nachweissonde eingesetzt werden. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, die Helfer einzusetzen, nämlich ungerichtete Sonden mit zufälliger Sequenz oder/und einzelne bzw. mehrere Helfersonden, die gegen Regionen auf der Zielnukleinsäure gerichtet sind, die zur Bindungsstelle der Nachweissonde benachbart oder/und komplementär sind.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung einer Zielnukleinsäure mit markierten Nachweissonden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zusätzlich eine oder mehrere unmarkierte Helfersonden eingesetzt werden.

Die Verwendung von Helfersonden führt bei der in situ Hybridisierung überraschenderweise zu einer erheblichen Verbesserung in der Sensitivität beim Nachweis von Zielnukleinsäuren, wobei als Zielnukleinsäuren vorzugsweise RNA-Moleküle und besonders bevorzugt ribosomale RNA- Moleküle, beispielsweise die bakteriellen 23S oder/und 16S ribosomalen RNA-Moleküle verwendet werden. Die Probe, in der die in situ Hybridisierung durchgeführt wird, kann eine beliebige biologische Probe sein, beispielsweise eine aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten oder Geweben stammende Probe, eine pflanzliche Probe oder eine aus natürlichen oder nicht natürlichen Habitaten stammende Probe.

Die in situ Hybridisierung wird vorzugsweise zur Bestimmung des Vorhandenseins von Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien oder Protozoen, in der Probe eingesetzt und kann zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen beispielsweise in klinischen Proben oder Lebensmitteln dienen. Sofern erforderlich, kann die Probe für die in situ Hybridisierung auf bekannte Weise vorbehandelt, z. B. fixiert oder/und permeabilisiert werden.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nachweissonden sind vorzugsweise Oligonukleotidsonden, die einen zur Zielnukleinsäure komplementären Hybridisierungsbereich enthalten. Die Länge des Hybridisierungsbereichs ist vorzugsweise 10 bis 30 Nukleotide, besonders bevorzugt 15 bis 25 Nukleotide. Anstelle von Oligonukleotidsonden können auch Nukleinsäureanaloga, wie etwa peptidische Nukleinsäuren (PNA) eingesetzt werden. Die Nachweissonden werden mit der Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen eine spezifische Hybridisierung der Nachweissonden mit in der Probe vorhandenen Zielnukleinsäuren erfolgen kann. Für den jeweiligen Fall geeignete Hybridisierungsbedingungen kann der Fachmann nach bekannten Methoden ermitteln.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Nachweissonden tragen eine oder mehrere Markierungsgruppen. Als Markierungsgruppen können Direktmarkierungen eingesetzt werden, die direkt, vorzugsweise durch konvalente Bindung mit der Sonde verknüpft sind. Andererseits können auch indirekt markierte Sonden verwendet werden, d. h. Sonden, die eine mit einer Markierungsgruppe bindefähige Gruppe tragen. Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Markierungsgruppen sind an sich beliebig, sofern sie einen ausreichend sensitiven in situ Nachweis ermöglichen. Bevorzugt sind Farbstoff-, Fluoreszenz- oder/und Enzymmarkierungsgruppen. Besonders bevorzugt sind Fluoreszenzmarkierungsgruppen. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarkierungsgruppen sind Fluorescein, Rhodamin, Texas Red, Phycoerythrin, sowie Carbocyanine wie das Cy3 und Cy5, sowie Derivate davon.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung von einer oder mehreren unmarkierten Helfersonden, die bei einer in situ Hybridisierung mit der Probe in Kontakt gebracht werden. Die Helfersonden haben - ebenso wie die Nachweissonden - vorzugsweise eine Länge im Bereich von 10 bis 30 und besonders bevorzugt von 15 bis 25 Nukleotiden. Anstelle von Helferoligonukleotiden können auch hier Nukleinsäureanaloga wie etwa PNA eingesetzt werden. Die Helfersonden werden günstigerweise so gewählt, dass sie unter den für die jeweiligen Nachweissonden verwendeten Hybridisierungsbedingungen ebenfalls an eine komplementäre Nukleinsäure hybridisieren können.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden ungerichtete Helfersonden mit zufälliger Sequenz eingesetzt. In einer weiteren und bevorzugten Ausführungsform werden gerichtete Helfersonden verwendet, d. h. Helfersonden, die gegen die Bereiche der Zielnukleinsäure oder dazu komplementäre Sequenzen gerichtet sind. Auf diese Weise können Erkennungssequenzen, die an sich für eine Bindung der Nachweissonden unzugänglich sind, auf gezielte Weise in eine zur Hybridisierung mit den Nachweissonden zugänglichere Form überführt werden. Vorzugsweise binden die Helfersonden an Regionen der Zielnukleinsäure, die benachbart zur Erkennungssequenz der Nachweissonde sind. So können eine oder mehrere Helfersonden verwendet werden, die gegen 5'- oder/und 3'-seitig der Erkennungssequenz der Nachweissonde befindliche Bereiche der Zielnukleinsäure gerichtet sind. In dieser Ausführungsform werden die Helfersonden so gewählt, dass keine Überlappung mit der Erkennungssequenz der Nachweissonde auf der Zielnukleinsäure besteht. Vorzugsweise binden die Helfersonden in benachbarten Bereichen, die nicht mehr als 10, besonders bevorzugt nicht mehr als 5 Nukleotide Abstand von der Erkennungssequenz der Zielnukleinsäure haben.

In noch einer weiteren Ausführungsform werden Helfersonden verwendet, die gegen einen zur Erkennungssequenz der Nachweissonde oder einer . benachbarten Region davon komplementären Sequenz gerichtet sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit einer oder mehreren Nachweissonden - und entsprechend - mit einer oder mehreren Helfersonden für jede Nachweissonde durchgeführt werden. Vorzugsweise wird eine Kombination mehrerer Helfersonden für eine Nachweissonde eingesetzt, z. B. eine Helfersonde, die gegen den 5'-seitig der Erkennungssequenz der Nachweissonde befindlichen Bereich der Zielnukleinsäure gerichtet ist und eine Helfersonde, die gegen einen 3'-seitig der Erkennungssequenz der Nachweissonde befindlichen Bereich der Zielnukleinsäure gerichtet ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe eingesetzt, beispielsweise zum differenziellen Nachweis einer Ordnung, Familie, Gattung oder einer Art von Mikroorganismen, wie etwa den Cytophagales, Enterobacteriaceae, Helicobacter, Corynebacterium, Nitrosomonas, Nitrospira, Roseobacter, Vibrio, Alteromonas, Haloarcula, Acanthamoeba, Escherichia coli sowie von bisher noch nicht benannten Mikroorganismen.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung, umfassend (a) mindestens eine markierte Nachweissonde zur Hybridisierung mit einer Zielnukleinsäure und (b) mindestens eine unmarkierte Helfersonde, wobei die Helfersonde oder die Helfersonden so gewählt sind, dass sie die Hybridisierung der Nachweissonde mit der Zielnukleinsäure vorzugsweise um mindestens den Faktor 2 und besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 5 verbessern.

Der Reagenzienkit kann darüber hinaus weitere Komponenten, beispielsweise Pufferlösungen etc. enthalten.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1. Material und Methoden 1.1 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Escherichia coli K12 (DSM 30083) und Azospirillum brasilense (DSM 1690) wurden gemäß den Angaben im Katalog der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig (DSM) kultiviert und anschließend wie bei Fuchs et al. (supra) beschrieben mit 4% Paraformaldehyd für die FISH fixiert. Es wurden die gleichen 5'- Carboxyfluorescein-markierten Oligonukleotidsonden (Interactiva, Ulm, Deutschland) wie bei Fuchs et al. (Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998), 4973-4982) beschrieben, verwendet. In der neuen Sonde Eco603x wurde ein zentraler A-C-Mismatch eingeführt. Die unmarkierten Helferoligonukleotide waren in ihrer Sequenz identisch mit den entsprechenden Sonden z. B. H119 hat dieselbe Sequenz wie die Sonde Eco119 bei Fuchs et al., mit folgenden Ausnahmen: Helfer H440-2 war um zwei Nukleotide verkürzt; H621azo war im Vergleich zu H621 verändert um vollständig mit der Sequenz von A. brasilense (EMBL Akzessionsnummer Z29617) übereinzustimmen und H621L und H621azoL waren 21 Nukleotide lange Versionen der normalerweise 18 Nukleotide langen Helfer. Die Sequenzen aller in dieser Untersuchung verwendeten Sonden und Helfer sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Oligonukleotidkonzentrationen und die Qualität der Markierung wurden spektrofotometrisch bestimmt. Die FISH an den suspendierten Zellen erfolgte wie bei Wallner et al., Cytometry 14 (1993), 136-143) beschrieben in einem Standardhybridisierungspuffer (0,9 M NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 0,01% SDS). Die Sonden und Helfer wurden in Endkonzentrationen von 2,5 ng/µl zugesetzt unter der Annahme, dass 1 OD (260 nm) 20 µg/ml entspricht. Bei den Dissoziationsuntersuchungen wurden Hybridisierungsbedingungen von 37, 41 und 46°C verwendet. Höhere theoretische Temperaturen wurden durch Zugabe von Formamid zum Hybridisierungspuffer erreicht, wobei ein Anstieg der effektiven Hybridisierungstemperatur von 0,5°C pro 1% zugegebenes Formamid angenommen wurde (Stahl und Amann, Development and application of nucleic acid probes, in: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, E. Stackebrandt und M. Goodfellow (Hrsg.), Seiten 205-248, John Wiley and Sons Ltd. (1993), Chichester, UK).

1.2 Durchflusscytometrische Analyse

Zur quantitativen Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten von hybridisierten Zellen wurde ein FACStar Plus Durchflusscytometer (Becton Dickinson, Mountain View, Kalifornien, USA) eingesetzt. Die durch die Sonden erzeugte Fluoreszenz ist relativ gegenüber der hellsten Sonde Eco 1482 wie bei Fuchs et al., supra, beschrieben, angegeben. Die Einstellungen des Durchflusscytometers, die Datenerfassung und Prozessierung waren ebenfalls wie bei Fuchs et al. beschrieben. Grünfluoreszente Polystyrolbeads (0,5 µm Durchmesser, Polysciences, Warrington, USA, Katalognr. 17152) wurden zur Überprüfung der optischen Ausrichtung des Durchflusscytometers und zur Standardisierung der Fluoreszenzmessungen verwendet. Alle Messungen erfolgten als vollständig unabhängige Dreifachmessungen, von denen der Mittelwert berechnet wurde. Der Variationskoeffizient der Dreifachbestimmungen war in allen Fällen < 10%. Die Dissoziationstemperaturen wurden durch sigmoidale Abgleichungen mit dem Softwareprogramm Origin (Microcal, Northampton, MA) bestimmt.

2. Ergebnisse

Der Einfluss unmarkierter Helferoligonukleotide auf die durch Sonden erzeugte Fluoreszenz wurde in drei variablen Regionen der 16S rRNA untersucht, den Helices 6, 18 und 22/23. Es wurden sechs Sondenzielsequenzen mit geringer in situ Zugänglichkeit ausgewählt, die gemäß den nach Fuchs et al., supra, definierten Helligkeitsklassen entweder der Klasse V (20 bis 6% Maximalfluoreszenz; Eco84, Eco603) oder VI (5 bis 0% maximale Fluoreszenz; Eco474, Eco585, Eco621, Eco639) angehörten (Tabelle 1).

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Während die Sonde Ecoß4 ohne Helfer nur 8% relative Fluoreszenzintensität ergab, konnte durch gleichzeitige Hybridisierung mit dem Helfer H66 (gegen die 5'-angrenzende Region von Eco84 gerichtet) eine 6-fache Erhöhung auf 45% und mit dem Helfer H102 (3'-benachbart) eine 5-fache Erhöhung auf 38% erzielt werden (Tabelle 2). Die Helferwirkung war bei dem weiter entfernten Helfer H119 geringer (2-fach auf 17%) und fehlte bei H48 (6%). Die gleichzeitige Verwendung der zwei benachbarten Helfersonden H66 und H102 führte zu einem 11-fachen Anstieg auf 87%. Mit allen vier Helfersonden zeigte Eco84 eine Intensitität von 70%.

Die gegen eine Sequenz in Helix 18 gerichtete Sonde Eco474 ergab Signale im Hintergrundbereich (2%). Durch die Helfer H440-2 und H492, konnten die Signale auf 43% bzw. 34% der maximalen Fluoreszenz verbessert werden. Im Gegensatz dazu zeigte H422 keine (2%) und H455 nur eine geringe Wirkung (6%). Eine Kombination der zwei benachbarten Helfersonden H455 und H492 mit Eco474 ergab 47% der maximalen Fluoreszenz. Die Verwendung aller vier Helfersonden ergab eine Verbesserung auf 75%.

Die Wirkungen von Helfern auf die in situ Zugänglichkeit von Helix 22 wurden ausführlich an den Sonden Eco585, Eco603, Eco621 und Eco639 untersucht. Ohne Helfer hatten alle Sonden nur geringe Signale (3 bis 9%). Das Paar Eco585/H567 ergab 47% der maximalen Fluoreszenz, das Paar Eco585/H603 41% und das Paar Eco603/H585 39%. Der Signalanstieg für ein gegebenes Oligonukleotidpaar war unabhängig davon, welches Oligonukleotid in markierter Form eingesetzt wurde. Dies konnte auch bei Eco603/H621 und Eco621/H603 mit Signalen von 49% bzw. 42% und bei Eco621/H639 (11%) und Eco639/H621 (9%) bestätigt werden. H657 erhöhte das Signal der Sonde Eco639 auf 39%.

Für jede der getesteten Sonden war das mit vier benachbarten Helfern erreichte Signal höher als bei einem einzigen Helfer. Mit vier Helfern erreichten alle Sonden mindestens 60% der Maximalfluoreszenz (Tabelle 2).

Tabelle 1: Sonden- und Helfersequenzen und Lokalisierung der Erkennungssequenz bezüglich Escherichia coli 16S rRNA nach Brosius et al. (J. Mol. Biol. 148 (1981), 107-127). Sternchen bedeuten gegenüber Fuchs et al. (Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998) 4973-4982) modifizierte Sequenzen.

Tabelle 2

Relative Fluoreszenzintensitäten von Sonden und Sonde/Helferkombinationen

^a Fluoreszenzintensitäten ausgedrückt als Prozent der hellsten Sonde Eco1482.
^b Die Sonden wurden gemäß ihrer relativen Fluoreszenz in sechs Helligkeitsklassen eingeordnet: Klasse I (100 bis 81% relative Fluoreszenz), Klasse II (80 bis 61%), Klasse III (60 bis 41%), Klasse IV (40 bis 21%), Klasse V (20 bis 6%) und Klasse VI (5 bis 0%).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung einer Zielnukleinsäure mit einer markierten Nachweissonde, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine oder mehrere unmarkierte Helfersonden eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäuren aus RNA-Molekülen ausgewählt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäuren aus rRNA-Molekülen ausgewählt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aus menschlichen oder tierischen Geweben stammende Probe, eine pflanzliche Probe oder eine aus Habitaten stammende Probe untersucht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweissonde einen 10 bis 30 Nukleotide langen, mit der Zielnukleinsäure komplementären Hybridisierungsbereich enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweissonde eine Markierungsgruppe, ausgewählt aus Fluoreszenz-, Farbstoff- oder Enzymmarkierungsgruppen enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweissonde eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ungerichtete Helfersonden eingesetzt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Helfersonden verwendet werden, die gegen 5'- oder/und 3'- seitig der Erkennungssequenz der Nachweissonde befindliche Bereiche der Zielnukleinsäure gerichtet sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Helfersonden verwendet werden, die gegen eine zur Erkennungssequenz der Nachweissonde oder einer benachbarten Region komplementäre Sequenz gerichtet sind.

11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe.

12. Verwendung nach Anspruch 11 zum differenziellen Nachweis eines Genus oder einer Spezies von Mikroorganismen.

13. Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe durch in situ Hybridisierung, umfassend

• a) mindestens eine markierte Nachweissonde zur Hybridisierung mit einer Zielnukleinsäure und
• b) mindestens eine unmarkierte Helfersonde, wobei die Helfersonde oder die Helfersonden so gewählt sind, dass sie die Hybridisierung der Nachweissonde mit der Zielnukleinsäure verbessern.