DE60028768T2

DE60028768T2 - Verwendung des kammverfahrens zur identifizierung von dna replikationsstarts

Info

Publication number: DE60028768T2
Application number: DE60028768T
Authority: DE
Inventors: Aaron Bensimon; John Herrick; Olivier Hyrien
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-29
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2020-05-30
Also published as: AU6590400A; US20050142593A1; PT1192283E; DE60028768D1; US6248537B1; US20110159490A1; CY1105063T1; IL146796A0; DK1192283T3; EP1192283B1; EP1192283A2; WO2000073503A2; ES2265962T3; WO2000073503A3; CA2375534C; WO2000073503A9; ATE330035T1; CA2375534A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Analysieren der DNA-Replikation und insbesondere die Verwendung von molekularem Kämmen („molecular combing"), um die Detektion und die Identifizierung (d.h. Kartierung) von Replikationsstartpunkten und die Messung der dynamischen und strukturellen Beziehungen, welche die DNA-Replikation regulieren, zu vereinfachen.
Die Kontrolle der DNA-Synthese ist für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität essentiell (1, 2, 3). In höheren Eukaryoten ist genomische Instabilität, welche mit einem Verlust von Replikationskontrolle und einer fehlerhaften DNA-Synthese verbunden ist, ein Schlüsselmerkmal von verschiedenen Neoplasmen und genetisch bedingten Erkrankungen (4, 5, 28). In Hefe führt ein verändertes DNA-Synthese-Muster zu genomischen Abnormalitäten, einschließlich Aneuploidien und Translokationen (8, 7). Die effiziente und akkurate Replikation des Genoms in Eukaryoten wird durch die Aktivierung einer Mehrzahl von bidirektionalen Replikationsstartpunkten bewerkstelligt. Das zeitliche und räumliche Aktivierungsmuster oder Replikationsprogramm variiert je nach Entwicklungsstadium (8). Beispielsweise hängt in X. laevis die Dauer der DNA-Replikationsperiode während des Zellzyklus von der Replikongröße oder der Verteilung von Replikationsstartpunkten ab (9). Die Organisation und die Verteilung von Replikationsstartpunkten innerhalb des eukaryotischen Genoms sind jedoch nicht gut bekannt und folglich wird die Regulation des Replikationsprogramms in diesen Zellen nur schlecht verstanden (10). Dies ist primär auf verschiedene technische und grundlegende Hindernisse, die es schwierig machen, die DNA-Replikation auf der genomischen Ebene zu untersuchen, zurückzuführen (11). Obwohl für das Untersuchen der DNA-Replikation sowohl in höheren als auch niederen Eukaryoten verschiedene Techniken existieren, werden schnellere Verfahren für die quantitative Analyse der Dynamik der Genomverdopplung benötigt (11).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um die Frage der räumlichen und zeitlichen Organisation der DNA-Replikation in einem Genom anzusprechen, haben wir die Methode des molekularen Kämmens („molecular combing") eingesetzt (12, 13, 14). Die Methode des molekularen Kämmens („molecular combing") wird in dem U.S.-Patent Nr. 5,840,862 (Bensimon et al.) beschrieben. Das molekulare Kämmen erlaubt die physische Kartierung von speziellen genetischen Loci mit hoher Auflösung. Die Technik besteht aus dem gleichförmigen Ausrichten („Alignment") und Ausbreiten von genomischer DNA auf einem Substrat, wie einem Glas-Deckglas. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass alle Moleküle in einer Richtung ausgerichtet und identisch langgestreckt ausgebreitet sind. Das Ergebnis ist eine exakte Korrelierung zwischen der gemessenen Länge des langgestreckt ausgebreiteten Moleküls und dessen Größe in Kilobasen. Folglich liefert diese hochgradig re produzierbare und genaue Methode eine einzigartige Möglichkeit, zu untersuchen, wie DNA-Replikation mit anderen Zellzyklus-Ereignissen koordiniert ist.
Diese Erfindung stellt Verfahren zum Lokalisieren oder Identifizieren eines Replikationsstartpunkts in einem DNA-Molekül bereit. In diesem Verfahren werden Zwischenstufen der Replikation, welche DNA-Sequenzen in jeglichen und allen Regionen des Genoms (oder auf episomalen/extrachromosomalen replizierenden Einheiten, z.B. Plasmiden, Viren, Double-Minute-Chromosomen u.s.w.), welche eine DNA-Synthese durchlaufen, entsprechen, mit markierten Nukleotiden in vivo oder in vitro markiert. In vivo wird die DNA durch Einbau des markierten Nukleotids während der DNA-Synthese in allen Stadien des Zellzyklus markiert. In vitro werden die Replikations-Zwischenstufen unter Verwendung von zellfreien Extrakten eines jeglichen Organismus, einschließlich Extrakten aus HeLa-Zellen, embryonalen Xenopus laevis-Zellen (Eizell-Extrakt), Saccharomyces cerevisiae, S. pombe, Escherichia coli u.s.w., markiert, um die markierten Nukleotide in die sich replizierende DNA einzubauen.
Das Genom kann unterschiedlich markiert werden, um sich früher und später replizierende Regionen zu identifizieren, indem das gesamte Genom kontinuierlich mit einem markierten Nukleotid markiert wird, gefolgt von einer „Chase" unter Verwendung eines zweiten markierten Nukleotids in späteren Stadien der Replikation.
Geeignet markierte DNA wird dann auf einer Oberfläche für eine in situ-Analyse gekämmt. Spezieller wird, nachdem die DNA-Replikation zum Ende gekommen ist (eine effektive Runde von Genom- oder DNA-Verdopplung), die DNA gemäß etablierten Methoden extrahiert. Die gereinigte DNA wird dann in einen Puffer, wie MES-Puffer, bei dem gewünschten pH für das Kämmen, welcher im Allgemeinen zwischen einem pH von 5 und 8, spezieller zwischen einem pH von 5 und 6 und am meisten bevorzugt bei einem pH von ungefähr 5,5 liegt, gegeben. Die Proben-DNA wird dann durch molekulares Kämmen auf einer Oberfläche, wie Glas, langgestreckt ausgebreitet und ausgerichtet („Alignment"). Cosmid- oder PCR-Sonden werden dann mit der gekämmten und markierten DNA hybridisiert unter Verwendung von Protokollen, die im Labor entwickelt worden sind, um eine spezielle Region des Genoms zu identifizieren. Dies ist erforderlich, um die Replikations-Zwischenstufen zu bzw. bei einer jeglichen gegebenen Region des Genoms zu kartieren oder zu lokalisieren. Die hybridisierte DNA wird dann gewaschen und für eine Detektion vorbereitet.
Markierte DNA und hybridisierte Sonden können detektiert werden unter Verwendung von geeigneten (für die unterschiedlich markierten Nukleotide spezifischen) Antikörpern, welche mit einer Markierung, wie einem Fluorophor, konjugiert sind, um eine direkte Sichtbarmachung der markierten und hybridisierten DNA in einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop zu ermöglichen. Die Oberfläche, welche die Signale enthält, wird gewaschen, um Hintergrund und nicht-spezifische Detektion durch die Antikörper zu entfernen. Die Oberfläche wird dann in einem geeigneten Puffer eingedeckt und untersucht. Die detektierten Signale (Replikations-Zwischenstufen und hybridisierte Sonden) erscheinen als lineare fluoreszierende Signale. Bilder der Signale werden erfasst und unter Verwendung von Software, die im Labor entwickelt worden ist (CartographiX^©, Institut Pasteur 1995; 1997 und CI tool^©, Institut Pasteur 1999), analysiert, um eine hochauflösende Kartierung zu ermöglichen.
Die Lage von Replikationsstartpunkten kann kartiert werden, indem die Lage der markierten Replikations-Zwischenstufen bezogen auf die hybridisierten Sonden verglichen wird. Spezieller werden Messungen bezüglich der Größen der fluoreszierenden Replikations-Zwischenstufen-Signale und deren Abständen von den hybridisierten Sonden in der Region vorgenommen. Startpunkte werden identifiziert, indem die bidirektionale Entwicklung der markierten Replikations-Zwischenstufen ausgehend von einem Kinetik-Experiment, welches eine „Chase" in mehreren unterschiedlichen aufeinanderfolgenden Replikationsstadien umfasst, überwacht wird. Startpunkte werden im Zentrum der fluoreszierenden Signale lokalisiert (die Auflösung der Kartierung beträgt ungefähr 1 bis 4 kb), gefolgt von einer Klonierung der entsprechenden Sequenz unter Verwendung einer etablierten physischen Karte der Region. Die klonierten Sequenzen werden auf ihre Fähigkeit, episomalen Elementen (z.B. Plasmiden) eine autonome Replikation zu verleihen, getestet. Die entsprechenden Nukleotidsequenzen werden dann durch Standard-Sequenzanalyseprogramme der Bioinformatik analysiert, um Sequenzmotive zu identifizieren. Zusätzlich kann ein „CI tool" verwendet werden, um die räumlich-zeitliche Organisation der Replikationsstartpunkts-Aktivitäten während des Zellzyklus zu ermitteln (CI tool^©, Institut Pasteur, 1999).
Insbesondere umfassen die Verfahren der Erfindung zum Kartieren eines Replikationsstartpunkts in einem DNA-Molekül die Schritte:

a) Inkubieren von DNA, welche eine Replikation durchläuft, in Gegenwart von markierten Nukleotiden, die in die sich replizierende DNA eingebaut werden;
b) Alignment der DNA aus Schritt a) auf einem Substrat;
c) Hybridisieren der dem Alignment unterzogenen DNA mit einer Nukleotidsonde; und
d) Messen der Abstände zwischen den markierten Nukleotiden, die in die DNA während der Replikation eingebaut wurden, und der Nukleotidsonde, um die Lage des Replikationsstartpunkts bezogen auf die Nukleotidsonde zu bestimmen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Detektieren eines Replikationsstartpunkts in einem DNA-Molekül, welche die Schritte umfassen:

a) Inkubieren von DNA, welche eine Replikation durchläuft, in Gegenwart von markierten Nukleotiden, die in die sich replizierende DNA eingebaut werden;
b) Alignment der DNA aus Schritt a) auf einem Substrat; und
c) Detektieren der markierten Nukleotide, die in die DNA während der Replikation eingebaut wurden, wobei die markierten Nukleotide in einer Region, die dem Replikationsstartpunkt entspricht, lokalisiert sind.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft das Messen der dynamischen und strukturellen Beziehungen, die die DNA-Replikation regulieren. Insbesondere umfasst dieser Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Messen der DNA-Replikationsrate, welches die Schritte umfasst:

a) Zugeben eines ersten markierten Nukleotids zu einer Reaktionsmischung mit sich replizierender DNA, wobei das erste markierte Nukleotid in die sich replizierende DNA eingebaut wird;
b) Zugeben eines zweiten markierten Nukleotids zu der Reaktionsmischung in unterschiedlichen Zeitabständen nach der Zugabe des ersten markierten Nukleotids, wobei das zweite markierte Nukleotid in die sich replizierende DNA eingebaut wird;
c) Alignment der DNA aus der Reaktionsmischung auf einem Substrat;
d) Detektieren der ersten und der zweiten markierten Nukleotide, die in die DNA während der Replikation eingebaut wurden; und
e) Messen der Verteilung der ersten und der zweiten markierten Nukleotide in der dem Alignment unterzogenen DNA, um die DNA-Replikationsrate zu bestimmen.

Um die Verfahren dieser Erfindung in der Praxis auszuführen, können die markierten Nukleotide detektiert werden mit einer markierten Sonde, wie einem mit einer Markierung konjugiertem Antikörper, wobei die Sonde die Markierung in dem markierten Nukleotid erkennt und bindet. Beispiele von markierten Nukleotiden, die bei der praktischen Ausführung dieser Erfindung nützlich sind, umfassen Biotin-dUTP und Digoxigenin-dUTP („dig-dUTP"). Der Begriff „markierte Nukleotide" umfasst auch modifizierte Nukleotide, wie Bromdesoxyuridin, Chlordesoxyuridin, Ioddesoxyuridin u.s.w. Die DNA kann mit den markierten Sonden inkubiert werden, bevor oder nachdem die DNA auf dem Substrat durch das Verfahren des molekularen Kämmens („molecular combing") dem Alignment unterzogen wird bzw. worden ist. Die DNA kann auch gewaschen werden, bevor sie auf dem Substrat dem Alignment unterzogen wird, oder nach der Inkubation mit der markierten Sonde, um nicht-spezifische Reagenzien, wie nicht-gebundene markierte Sonde oder nicht eingebaute markierte Nukleotide, zu beseitigen.
Es versteht sich, dass sowohl die vorangegangene allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft sind und der Erläuterung dienen und die Erfindung, wie sie beansprucht wird, nicht einschränken.
Die begleitenden Zeichnungen, die in diese Unterlagen aufgenommen werden und einen Teil von dieser bilden, veranschaulichen mehrere Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Grundzüge der Erfindung zu erläutern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A stellt das experimentelle Schema der Erfindung dar. Zellkerne von Xenopus-Sperma wurden in Gegenwart von Biotin-dUTP bei t = 2' inkubiert, um das gesamte Genom zu markieren. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Beginn der S-Phase wird zusätzlich zu dem Biotin-dUTP dig-dUTP zugegeben, um die sich später replizierenden DNA-Sequenzen unterschiedlich zu markieren. Sich früher replizierende Sequenzen (jene, die sich vor der Zugabe von dig-dUTP repliziert haben) werden als rote lineare Signale erscheinen, während sich später replizierende Sequenzen (jene, die sich nach der Zugabe von dig-dUTP replizieren) gleichzeitig dig-dUTP und Biotin-dUTP einbauen werden und folglich als gelbe lineare Fluoreszenzsignale (Mischen von grün + rot) erscheinen werden. Man lässt die DNA dann die Replikation vollständig abschließen (120 min nach der Zugabe des Extrakts) und die Zellkerne werden geerntet. Dann wird genomische DNA extrahiert und auf Glas-Deckglas gekämmt. Die gekämmte DNA wird unter Verwendung von entweder mit roten (z.B. Texas Red) oder grünen (z.B. FITC) Fluorphoren konjugierten Antikörpern detektiert. Die markierte DNA wird in einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop (Axioskop, Zeiss, Plan Neofluar 100X-Objektiv) mit einer angefügten kalten CCD-Kamera beobachtet. Messungen werden dann an einem jeglichen individuellen Molekül, das in einer Reihe von zufällig ausgewählten Betrachtungsfeldern vorhanden ist, ausgeführt. Individuelle Messungen wurden sowohl an sich früher als auch später replizierenden Sequenzen (rot für sich früher replizierende Sequenzen und gelb für sich später replizierende Sequenzen) vorgenommen. Messungen wurden in gleicher Weise an den Sequenzen zwischen den Mittelpunkten der angrenzenden rot markierten Abschnitte vorgenommen. Zusammen liefern diese Messungen eine Bestimmung der Replikationseinheitsgrößen und replizierten Größen ausgehend von zufällig ausgewählten Regionen des Genoms. Jede Probe enthielt ungefähr 20000 haploide Genome und über 10 Mb DNA wurden für jeden Zeitpunkt analysiert.
1B ist eine Photographie von gekämmter DNA, die unter Verwendung von FITC- und Texas Red-konjugierten Antikörpern sichtbar gemacht worden sind. Rot angefärbte Sequenzen entsprechen entweder Replikationsblasen oder Molekülen, die die Replikation vor der Zugabe von dig-dUTP beendet haben.
2A ist ein Graph, welcher den Auge-zu-Auge-Abstand gegenüber dem replizierten Prozentsatz darstellt. Messungen wurden an einer Population von individuellen Molekülen von jedem Zeitpunkt vorgenommen. Die Replikationsaugengrößen wurden als lineare rote Signale gemessen. Das Ausmaß, bis zu welchem jedes Molekül die Replikation durchlaufen hatte (Prozent repliziert), wurde bestimmt, indem die Augengrößen für jedes Molekül aufsummiert und dann durch die Gesamtlänge des Moleküls dividiert wurden (siehe Schema). Moleküle wurden dann als Histogramme gemäß der Augengröße gegenüber der prozentualen Replikation analysiert. Dies erfolgte individuell für jeden Zeitpunkt (Daten nicht gezeigt) und für die gesamte Probe (alle Zeitpunkte). Die Geschwindigkeit der Replikationsgabel wurde geschätzt, indem die Rate, mit welcher die linearen roten Signale (Replikationsaugen) in der Größe während der S-Phase zunahmen, gemessen wurde. Dies erfolgt, indem die Zunahme in der Steigung der Kurve für Moleküle, die zu zwischen 0 und 80% repliziert sind, bestimmt wird. Auf diese Weise wurde festgestellt, dass die Geschwindigkeit der Replikationsgabel 300 bp/min betrug. Dies ist ein niedrigerer Schätzwert der Gabelgeschwindigkeit, da dies ein Durchschnittswert über die gesamte Population von Molekülen ist. Es ist aufgrund der Tatsache, dass die DNA-Synthese bezogen auf die Population von Zellkernen asynchron beginnt, nicht möglich, die Zunahme der Augengröße direkt zu messen.
2B ist ein Graph, welcher die Replikationsgabeldichte gegenüber dem replizierten Prozentsatz darstellt. Moleküle wurden gemäß ihrem Replikationsstadium (% repliziert) in Behälter („bin") gruppiert und die Gabeldichte wurde ausgehend von der Anzahl von Augen pro Behälter („bin"), geteilt durch die gesamte Länge aller Moleküle in jedem Behälter („bin") berechnet. Dies wiederum ergibt die Anzahl von Replikationsgabeln, die (bei einer bidirektionalen Replikation) einfach das Doppelte der Anzahl von Replikationsaugen ist. Die mittlere Replikationsgabeldichte nimmt um mehr als das 3-fache zu, wenn die DNA zu zwischen 6% und 60% repliziert ist, und nimmt schnell ab, nachdem mehr als 87% der Moleküle repliziert worden sind.
3A ist eine computer-erzeugte Rekonstruktion von allen Molekülen, die während des Experiments gemessen wurden. Moleküle wurden direkt ausgehend von den an der gekämmten DNA vorgenommenen Messungen rekonstruiert. Die rekonstruierten Moleküle wurden dann zufallsgesteuert ausgewählt und einem Ende-an-Ende-Alignment je nach ihrem jeweiligen Replikationsstadium unterzogen. Replikationsaugen oder sich früher replizierende Sequenzen werden in rot sichtbar gemacht, während sich später replizierende Sequenzen in grün sichtbar gemacht werden. Insgesamt wurden 77 Mb DNA während des Experiments gemessen und in 200 kb-Säulen gemäß deren prozentualer Replikation ausgerichtet (Alignment). Auf diese Wei se ist es möglich, die unterschiedlichen Replikationsstadien, die die DNA durchlaufen hat, direkt sichtbar zu machen, wobei jedes Stadium einem gegebenen Prozentsatz Replikation entspricht.
3B stellt den Bruchteil der gesamten gemessenen Länge (77 Mb) gegenüber dem replizierten Prozentsatz dar. Moleküle wurden gemäß ihren Prozent Replikation, die sie durchlaufen hatten, gruppiert und ihre Längen aufsummiert, um den jeweiligen Prozentsatz der Gesamtlänge, den sie repräsentieren, zu bestimmen. Dies ergibt die Verteilung der Gesamtlänge, gemessen während des Experiments, als Prozent Replikation, die in 2A visuell dargestellt ist. Es ist anzumerken, dass der kleinste Bruchteil der Probe auftritt, wenn die Moleküle zu zwischen 40 und 50% repliziert sind. Dies zeigt an, dass die maximale Rate der DNA-Synthese auftritt, wenn 40% bis 50% der DNA synthetisiert worden sind.
4 ist ein Graph, welcher den mittleren Auge-zu-Auge-Abstand gegenüber dem replizierten Prozentsatz darstellt. Es wurden die Abstände zwischen den Mittelpunkten von benachbarten Replikationsaugen gemessen. Messungen wurden an individuellen Molekülen in jeder Probe vorgenommen und in Hinblick auf das Ausmaß, bis zu welchem sie eine Replikation durchlaufen hatten, analysiert. Auge-zu-Auge-Abstände gegenüber dem Prozentsatz von replizierter DNA pro Molekül lieferten eine Einschätzung, wie Replikationsstartpunkte verteilt sind und während der S-Phase aktiviert werden. Gemäß dem Histogramm tritt zwischen 37% und 87% Replikation ein Plateau auf. Dieses Plateau entspricht einer durchschnittlichen Auge-zu-Auge-Größe von 14 bis 16 kbp innerhalb des gesamten Genoms während der S-Phase. Dementsprechend kann die durchschnittliche Replikongröße in dem X. laevis-Genom in diesem Entwicklungsstadium auf ungefähr 15 kb geschätzt werden. Die rote Kurve zeigt die Entwicklung von Auge-zu-Auge-Abständen unter der Annahme, dass Augengrößen zwischen 3 und 8 kb Gabeln, die aus einem einzelnen Initiationsereignis hervorgehen, entsprechen. Auge-zu-Auge-Abstände zwischen Augen in diesem Größenbereich zeigen an, dass Initiationen mit einem minimalen durchschnittlichen Abstand von ungefähr 6 kb auftreten.
5A ist ein Graph, welcher die Anzahl von Verkernungs- oder Nukleationsereignissen (/100 kb) gegen die Zeit darstellt. Verkernungs- oder Nukleationsereignisse wurden als benachbarte Replikationsgabeln, die weniger als 8 kb voneinander entfernt sind, definiert. Dieser obere Wert entspricht einer Hälfte des mittleren Auge-zu-Auge-Abstands (14 bis 16 kb) und dient als ein Schätzwert für jene Gabeln, die höchstwahrscheinlich aus einem einzelnen Initiationsereignis hervorgegangen sind. Eine Untergrenze von 3 kb wurde durch Quantifizierung des in einer doppelt substituierten Probe von gekämmter genomischer DNA beobachteten Hintergrunds ermittelt (Daten nicht gezeigt). Diese Messungen stimmen überein mit früheren Beobachtungen hinsichtlich der Auflösung von molekularem Kämmen, welche bekanntermaßen 1 bis 4 kb be trägt. Aus der Augengröße (rote Segmente des aktuell gemessenen Moleküls) und der Replikationsgabel-Geschwindigkeit kann der Zeitpunkt, zu welchem ein gegebenes Auge mit der Replikation begann, bestimmt werden (Pfeil). Der Bruchteil des Moleküls, der zu dem Zeitpunkt von jenem Verkernungsereignis noch repliziert werden muss, wird für jedes rekonstituierte Molekül als nächstes bestimmt. Dies ergibt den relativen Bruchteil von nicht-replizierter DNA pro Verkernung pro Molekül; und der Kehrwert von diesem Wert ergibt wiederum die Verkernungsdichte (Ereignis pro Kilobase). Dies erfolgte für jedes Molekül in einer gegebenen Probe und die entsprechende Verkernungsdichte wurde in Bezug auf die Zeit graphisch aufgetragen. Die rote Linie zeigt die mittlere Dichte über aufeinanderfolgende Intervalle von 3 min.
5B ist ein Graph, welcher die Anzahl von Verkernungsereignissen gegenüber dem replizierten Prozentsatz darstellt. Verkernungsereignisse wurden bestimmt, wie für 5A beschrieben. Die Anzahl von Ereignissen pro Molekül wurde dann gegen den Prozentsatz, zu welchem jedes Molekül repliziert worden war, aufgetragen. Die rote Linie entspricht der mittleren Dichte in Bezug auf die prozentuale Replikation.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Das in vitro-DNA-Replikationssystem von Xenopus laevis wurde als Modell ausgewählt, um das gesamte Potential des molekularen Kämmens zum Untersuchen der DNA-Replikation zu untersuchen. Dieses System verwendet Eiextrakte, um exogene DNA zu replizieren, und unterstützt eine vollständige Replikationsrunde (15, 16). In diesem Versuchssystem wurde Xenopus laevis-Sperma-Chromatin mit Biotin-dUTP und dig-dUTP markiert. Biotin-dUTP wurde unmittelbar nach dem Extrakt (t = 2') zugegeben, um das gesamte Genom zu markieren. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten (d.h. t = 25, 29, 32, 39 und 45 min) nach der Zugabe des Extrakts wurde dig-dUTP zugegeben, um die sich später replizierende DNA unterschiedlich zu markieren (16). Dann wurde genomische DNA extrahiert und auf der Glasoberfläche gekämmt.
Spezieller wurden in dem hier verwendeten Versuchssystem ungefähr 20000 Zellkerne unter Verwendung von 20 μl Eiextrakt in Gegenwart von 20 μM Biotin-dUTP kontinuierlich markiert. Die DNA-Synthese begann innerhalb von 15 min, nachdem der Extrakt zu dem Sperma-Chromatin zugesetzt worden war, und 90% der Zellkerne beendeten die DNA-Synthese 45 min später (Daten nicht gezeigt). Zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nach der Zugabe des Extrakts wurden 50 μM dig-dUTP zugegeben, was eine Reihe von fünf Proben mit unterschiedlich markierter DNA ergab. Jede Probe wurde dann gemäß Standardprotokollen vorbereitet, mit YOYO-1 (einem dimeren Cyanin-Farbstoff, der nach Bindung an Nukleinsäuren fluoresziert) angefärbt und auf einem Substrat, wie Glas, gekämmt (13).
Die gekämmte DNA wurde in einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop untersucht, um die durchschnittliche Anzahl und Größe der gekämmten Moleküle pro Betrachtungsfeld (FOV; „field of view") zu bestimmen. In diesem Falle betrug die durchschnittliche Anzahl von Molekülen pro FOV 20 und die durchschnittliche Größe der Moleküle betrug 200 kb. Dies entspricht ungefähr 30 haploiden Genomen, die pro 22 mm × 22 mm-Deckglas gekämmt wurden.
Sich früher und später replizierende Regionen des Genoms wurden dann unter Verwendung von Antikörpern, mit welchen unterschiedliche Fluorochrome konjugiert waren, detektiert. Es wurden beispielsweise mit Texas Red konjugierte Antikörper verwendet, um die sich früher replizierenden Sequenzen, die mit Biotin-dUTP markiert worden waren, zu detektieren, während mit FITC konjugierte Antikörper verwendet wurden, um die sich später replizierenden, mit dig-dUTP markierten Sequenzen zu detektieren. Es sollte angemerkt werden, dass die sich später replizierenden Sequenzen sowohl mit Biotin-dUTP als auch mit dig-dUTP markiert sind.
Alle fünf Proben wurden dann in einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop analysiert. Bilder der gekämmten Moleküle wurden unter Verwendung einer CCD-Kamera erhalten. Dann wurden Messungen an individuellen Molekülen unter Verwendung von Software, die im Labor entwickelt worden war, vorgenommen. Ungefähr 10 Mb von jeder Probe wurden auf diese Weise gemessen und die jeweiligen Längen der alternierenden roten und grünen Segmente wurden genau bestimmt und ihre Verteilungen als Histogramme analysiert.
Es wurde kein signifikanter systematischer Fehler in Bezug auf den Einbau von markiertem Nukleotid beobachtet. Der Einbau betrug 84,41% für Biotin-dUTP und der dig-dUTP-Einbau betrug 84,93%. Es wurde festgestellt, dass die Geschwindigkeit der Replikationsgabel sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Biotin-dUTP die gleiche war. Als Kontrolle wurde eine Probe kontinuierlich sowohl mit Biotin-dUTP als auch dig-dUTP markiert, so dass das gesamte Genom unter Verwendung entweder des roten oder des grünen Fluoreszenzfilters sichtbar gemacht werden konnte. An dieser Probe vorgenommene Messungen wurden verwendet, um die Effizienz des Nukleotideinbaus und der Detektion zu bestimmen.
Auf diese Weise wurden Replikationseinheiten unter Verwendung von rot fluoreszierenden Antikörpern (z.B. Texas Red) sichtbar gemacht, während jene Regionen, die sich nach den verschiedenen Zeitpunkten repliziert hatten (d.h. nach der Zugabe von dig-dUTP), doppelt markiert sind und so unter Verwendung von sowohl grün (z.B. FITC) als auch rot fluoreszierenden Antikörpern sichtbar gemacht wurden (1B). Dieser Ansatz erlaubt eine direkte Kartierung und quantiative Analyse der alternierenden roten und grünen Replikationseinheiten entlang von jedem individuellen DNA-Molekül.
Eine der Hauptschwierigkeiten bei der Untersuchung der DNA-Replikation in Metazoen-Genomen ist das offensichtliche Fehlen von gut definierten Replikationsstartpunkten (17, 18). In diesen Zellsystemen kann offensichtlich eine jegliche DNA-Sequenz repliziert werden vorausgesetzt, dass sie lang genug ist (17, 18). Dies legt nahe, dass die Initiation der DNA-Replikation in Bezug auf die Sequenz zufällig erfolgt. Diese sequenzunabhängige Aktivierung der DNA-Synthese wirft die Frage auf, ob DNA gemäß einem stochastischen Prozess (19, 20) oder gemäß einem Mechanismus, der eine regelmäßige zeitliche und räumliche Organisation auf dem in Replikation befindlichen Chromatin erfordert (21), repliziert wird oder nicht. Da Startpunkte eng benachbart angeordnet sein müssen, um die DNA-Replikation synchron mit dem Zellzyklus abschließen zu können, war ein Mechanismus vorgeschlagen worden, gemäß welchem eine periodische Chromatinfaltung den regelmäßigen Abstand und die regelmäßige Aktivierung von Replikationsstartpunkten innerhalb des gesamten Genoms sicherstellt, eine Organisation, die dementsprechend die vollständige Verdoppelung des Genoms vor dem Eintritt in die Mitose garantiert (21).
Um die räumliche Verteilung der rot und grün gefärbten Replikationseinheiten zu untersuchen, wurden Bilder der durch Alignment ausgerichteten markierten Moleküle erfasst und es wurden systematisch Messungen an der markierten DNA für jeden Zeitpunkt ausgeführt (1B). Die Messungen wurden an allen Molekülen in jedem zufällig ausgewählten Betrachtungsfeld für jeden Zeitpunkt ausgeführt und es wurde eine Probengesamtlänge von über 77 Mb analysiert. Dementsprechend liefern diese Messungen eine statistische Bewertung der Verteilungen von Replikationseinheitsgrößen wie auch die Abstände zwischen diesen. Augengröße ist der Begriff, der hier verwendet wird, um auf die früheren rot gefärbten Replikationseinheiten zu verweisen, während Inter-Augen-Größe der Begriff ist, welcher verwendet wird, um auf die späteren grün und rot gefärbten Replikationseinheiten zu verweisen.
Der Auge-zu-Auge-Abstand ist in ähnlicher Weise als der Abstand (in kb) zwischen den Mittelpunkten von zwei aneinander angrenzenden Augen definiert (1A). Das Ausmaß, bis zu welchem jedes Molekül vor der Zugabe des zweiten markierten Nukleotids die Replikation durchlaufen hatte, wurde als die Summe der Längen der Replikationsaugen (rot), geteilt durch die Gesamtlänge des gemessenen linearen Moleküls, bestimmt. Auf diese Weise können Auge-zu-Auge-Abstände und Augengrößen in Hinblick auf das Ausmaß, bis zu welchem die Moleküle die Replikation durchlaufen haben, analysiert werden. Dies ist erforderlich, da die Genome der Zellkerne mit der Replikation bezogen auf die Population asynchron beginnen.
Die Messungen enthüllten, dass Augengröße linear zunehmen, bis 87% der Probe repliziert worden sind, an welchem Punkt die Augen aufgrund der Verschmelzung von benachbarten Replikationsgabeln schnell an Größe zunehmen (2A). Gemäß den in 2 aufgeführten Daten wurde die Geschwindigkeit der Replikationsgabeln ausgehend von der mittleren Zunahme der Augengröße abgeschätzt und es wurde festgestellt, dass sie ungefähr 300 bp/min betrug. Dieser Wert ist konsistent mit früher berichteten Werten (9, 22). Es ist jedoch ein niedrigerer Schätzwert der Gabelgeschwindigkeit, da der asynchrone Verlauf der Replikation der Population von Zellkernen zu einer Zunahme bei den beobachteten Augengrößen, die langsamer als erwartet erfolgt, führen wird. Es ist darüber berichtet worden, dass dieser asynchrone Verlauf zu einer Überschätzung von 10 bis 20 min bei der Länge der S-Phase führt (9, 23). Wenn der Zeitraum, während welchem DNA-Synthese innerhalb der gesamten Population auftritt, 20–30 min entspricht, dann wird für ein individuelles Genom die durchschnittliche S-Phase ungefähr 10 bis 15 min dauern. Dementsprechend entspricht die aktuelle Replikationsgabelgeschwindigkeit ungefähr 600 bp/min (22).
Wir betrachteten als nächstes die Replikationsgabeldichte, die einfach das Doppelte der Anzahl von Augen/kb ist, und wir beobachteten, dass die Gabeldichte während der ersten Hälfte des Zeitraums der DNA-Synthese (d.h. von 25 min bis 32 min) um mehr als das Dreifache zunimmt. Die Replikationsgabeldichte nimmt dann schnell ab, wenn die Augen zu verschmelzen beginnen (2B). Obwohl dies nahe legt, dass die Replikation primär während der ersten Hälfte der S-Phase initiiert wird, enthüllten an den sich später replizierenden Proben vorgenommene Messungen auch, dass eine gewisse restliche Initiation sogar dann noch auftritt, nachdem 96% der DNA in der Probe repliziert worden sind. Tatsächlich sind bei Molekülen, die zu über 90% repliziert sind, bis zu 28% der Replikationsaugen zwischen 3 und 8 kb. Unter der Annahme, dass diese Gabeln aus einem einzelnen Initiationsereignis hervorgehen, zeigt diese Beobachtung an, dass eine signifikante Anzahl von Initiationsereignissen zu späten Zeitpunkten in der S-Phase auftritt (Tabelle 2).
3 ist eine Computerrekonstruktion von allen während des Experiments gemessenen Molekülen. Sie zeigt die Entwicklung des Replikationsprogramms, wenn die DNA-Synthese fortschreitet. Dies kann quantifiziert werden als ein Histogramm, welches den Bruchteil (bezogen auf die Länge) der gesamten Probe in einem gegebenen Replikationsstadium zeigt (3B).
Gemäß den 2B und 3B hängt die Rate der DNA-Replikation von der Replikationsgabeldichte in einem jeglichen gegebenen Stadium der Replikation ab. Die Gabeln korrelieren mit Startpunkten, und wie Startpunkte beabstandet sind, ist ein wichtiger Parameter bei der Bestimmung der Dauer der S-Phase. Dementsprechend ist es nützlich, die Abstände zwischen den Mittelpunkten von benachbarten sich früher replizierenden Segmenten zu bestimmen, da diese Messungen Informationen über die räumliche Verteilung von Replikationsstartpunkten liefern (24).
Auge-zu-Auge-Abstände wurden gemessen und separat gegen das Ausmaß, bis zu welchem die jeweiligen Moleküle bereits die Replikation durchlaufen hatten, graphisch aufgetragen (siehe oben). Die Korrelation zwischen dem mittleren Auge-zu-Auge-Abstand und dem Ausmaß der DNA-Replikation enthüllt ein Plateau bei einem Durchschnittswert von 14 bis 16 kbp (4). Das Plateau tritt auf, wenn die DNA die Replikation zu zwischen 37% und 87% durchlaufen hat. Dies entspricht dem Intervall zwischen 32 und 39 min und zeigt an, dass die meiste DNA innerhalb eines engen Fensters von ungefähr 10 min repliziert wird. Dies steht im Gegensatz zu dem beobachteten 20- bis 30-minütigen Zeitraum, während welchem die DNA synthetisiert wird, und ist konsistent mit früheren Abschätzungen der Länge der S-Phase in diesem Entwicklungsstadium (siehe oben; 4). Es sollte festgehalten werden, dass die schnelle Zunahme der Auge-zu-Auge-Abstände, welche bei 87% Replikation auftritt, konsistent ist mit dem gleichen Wert, der für die schnelle Zunahme der Augengrößen, die oben erwähnt worden ist, beobachtet wird. Dies zeigt die Genauigkeit des molekularen Kämmens, da Augengrößen und Auge-zu-Auge-Abstände zwei unabhängige Messungen des gleichen biologischen Phänomens darstellen.
Wir untersuchten als nächstes Veränderungen bei den mittleren Auge-zu-Auge-Abständen für jede Probe und beobachteten, dass der durchschnittliche Abstand von 25 bis 32 min schnell abnimmt und dann zunimmt, wenn sich die Replikationsaugen ausdehnen und benachbarte Gabeln zu verschmelzen beginnen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
TABELLE 1
In Tabelle 1 entspricht jede Probe einem gegebenen Zeitpunkt (d.h. t = 25', 29', 32', 39' und 45'), zu welchem dig-dUTP zu der sich replizierenden DNA hinzugegeben worden ist. Man ließ die unterschiedlich markierte DNA (Biotin-dUTP und Biotin-dUTP/dig-dUTP) dann die Replikati on vollständig abschließen (t = 120'). Proben wurden individuell hergestellt und auf einem Deckglas gekämmt. Dann wurden Messungen an jeder individuellen Probe vorgenommen. Es wurden durchschnittlich 10 Mb pro Probe analysiert und die Mittelwerte für jeden Probenparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die zweite Spalte repräsentiert die Menge an DNA-Replikation, die vor der Zugabe des zweiten Nukleotids aufgetreten war und durch Messen der rot markierten Segmente in jedem Molekül und dann Teilen von diesem durch die gesamte Länge des Moleküle bestimmt worden war. Dies erfolgte für jedes Molekül in der Probe, um die mittlere prozentuale Replikation bezogen auf die Probe sicherzustellen.
In Spalte 3 wurde die mittlere Augengröße für jede Probe aus direkten Messungen der Augengröße für jedes analysierte Molekül erhalten. Da die DNA während ihrer Präparation geschert werden kann, wurden markierte Segmente an den Enden des Moleküls in die Bestimmung der mittleren Augengröße, der Inter-Augen-Größe oder des Auge-zu-Auge-Abstands nicht mit aufgenommen.
In Spalte vier wurden Inter-Auge-Segmente gemessen, wie oben für die mittlere Augengröße diskutiert. Diese Segmente entsprechen Sequenzen, die sich nach der Zugabe des zweiten Nukleotids repliziert haben und dementsprechend Sequenzen repräsentieren, die zu dem Zeitpunkt, zu welchem das zweite Nukleotid zugegeben wurde, unrepliziert waren. In der fünften Spalte wurden Auge-zu-Auge-Größen als der Abstand zwischen den Mittelpunkten von zwei benachbarten Augen, welche ein dazwischenliegendes Inter-Auge-Segment flankieren, berechnet.
Wie in der letzten Spalte aufgeführt, wurde die mittlere Gabeldichte als das Doppelte der Anzahl von Augen pro Einheitsmoleküllänge bestimmt. Wenn die Anzahl von neuen Gabeln pro Einheitslänge zunimmt, nehmen die Auge-zu-Auge-Abstände ab und die Initiationsfrequenz übersteigt die Terminationsfrequenz (Gabel-Verschmelzungen). Die relative Gabeldichte nimmt von Zeitpunkt zu Zeitpunkt um das ungefähr 1,5-fache zu, bis t = 39', zu welchem Zeitpunkt die Termination zu dominieren beginnt.
Wie in Tabelle 1 angegeben, nahm der mittlere Auge-zu-Auge-Abstand für jede Probe bis um das Dreifache ab, bis das Plateau erreicht war. Diese Abnahme ist konsistent mit der dreifachen durchschnittlichen Zunahme bei der Replikationsgabeldichte, die bei jeder aufeinanderfolgenden Probe beobachtet wurde. In ähnlicher Weise ist die durchschnittliche Rate, mit welcher sich Gabeln pro kb bilden, konsistent mit der durchschnittlichen Rate, mit welcher Auge-zu-Auge- Abstände abnehmen. Tatsächlich entspricht die mittlere Gabeldichte im Bereich des Plateaus (zwischen 40% und 80% repliziert) 15 Gabeln pro 100 kb (2B). Ein Durchschnittswert von 7 Replikationsaugen (15 Gabeln) alle 100 kb würde dementsprechend einen durchschnittlichen Auge-zu-Auge-Abstand von ungefähr 15 kb ergeben, wie beobachtet wurde (4).
Unsere Analysen von Auge-zu-Auge-Abständen enthüllen kein regelmäßiges Replikationsmuster während der DNA-Synthese, was nahe legt, dass das Genom tatsächlich gemäß einem zufallsgesteuerten Replikationsprozess verdoppelt wird (Daten nicht gezeigt). In einem zufallsgesteuerten Prozess werden einige Replikationen zu groß sein, um in einem 10- bis 15-minütigen Zeitintervall vollständig repliziert werden zu können, wenn die Replikationsgabelgeschwindigkeit konstant ist (19, 20). Wir untersuchten dementsprechend die Größen von sich später replizierenden Sequenzen (Inter-Auge-Größen) für jede Probe als Funktion des Ausmaßes, bis zu welchem das Molekül die Replikation durchlaufen hatte.
Unter der Annahme, dass keine neuen Replikationsgabeln gebildet werden, wird ein Molekül, das zu 70% repliziert ist, normalerweise 3 min (S-Phase = 10 min) benötigen, um seine Verdoppelung bei einer Gabelgeschwindigkeit von 600 bp/min vollständig abzuschließen. Wir haben jedoch festgestellt, dass 72% der Moleküle, die zu zwischen 70% und 99% repliziert sind, Inter-Auge-Abstände enthielten, deren Größen mehr Zeit zur Replikation benötigen würden, als tatsächlich beobachtet wird (Daten nicht gezeigt). Der Bruchteil des Genoms am Ende der S-Phase, der bei Fehlen von neuen Initiationsereignissen unrepliziert bleiben würde, ist in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
In Tabelle 2 werden neue Gabeln als jene Gabeln, welche Replikationsaugen, die zwischen 3 und 8 kb groß sind, entsprechen, definiert. Der Bruchteil von neuen Gabeln in jeder Probe wurde als Prozentsatz von neuen Gabeln in Bezug auf die gesamte Anzahl von Gabeln in der Probe berechnet.
Die Spalten drei und vier listen den Bruchteil (F) der gesamten Sequenzlänge in jeder Probe auf, welcher Inter-Auge-Segmente (zu dem Zeitpunkt, zu welchem das zweite Nukleotid zugegeben wurde, nicht-replizierte Sequenzen) enthält, deren Replikationszeit die verbleibende Zeit, um das jeweilige Molekül zu replizieren, übersteigen würde (gezeigt als % der gesamten Länge der Probe).
Die letzte Spalte listet die größte beobachtete unreplizierte Sequenz für jeden Zeitpunkt bezogen auf die Menge an Zeit, um welche deren Replikation jene des entsprechenden Moleküls übersteigen würde, auf. Obwohl die meisten Moleküle, die zu zwischen 70% und 99% repliziert sind, Sequenzen enthalten, die zu groß sind, um sich in dem 10- bis 15-minütigen Intervall der S-Phase zu replizieren, wird nur eine bestimmte Anzahl von diesen als signifikant angesehen. In den meisten Fällen benötigen diese Sequenzen eine zusätzliche Replikationszeit von 30 bis 40% der Länge der S-Phase.
Wie oben diskutiert, entsprechen die Bruchteile (F), die in Tabelle 2 aufgelistst sind, Inter-Auge-Segmenten, die eine Replikationszeit zusätzlich zu der Zeit, die normalerweise benötigt wird, um das jeweilige Molekül zu replizieren, benötigen. Nach einer verstrichenen Zeit von beispielsweise 10 min würden ungefähr 12% der gesamten Länge der Probe, welche die Replikation zu 96% durchlaufen hat (t = 45'), bei Fehlen von neuen Initiationen unrepliziert bleiben. Tatsächlich würde, wenn nur zwei Gabeln eingesetzt würden, das größte, sich später replizierende Segment (für ein Molekül, das bereits zu 82% repliziert war) eine Replikationszeit benötigt haben, die 17 min länger ist als die beobachtete Verdopplungszeit des Genoms. Diese Beobachtung zusammen mit den großen Standardabweichungen, die bei den Augengrößen und Auge-zu-Auge-Abständen beobachtet wurden, legt nahe, dass Startpunkte innerhalb des gesamten Genoms zufällig gemäß einem stochastischen Prozess verteilt sind. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass diese Beobachtungen nicht die Möglichkeit einer auf höherer Ebene nicht-zufälligen Organisation der DNA-Replikation ausschließen und sich auf Segmente des Genoms, die im Allgemeinen zwischen ungefähr 10 und 300 kb Größe variieren (25), beziehen.
Die zufällige Größenverteilung von Replikationsaugen und Auge-zu-Auge-Größen für jeden Zeitpunkt (Daten nicht gezeigt) zeigt an, dass Startpunkte während der S-Phase ohne eine jegliche offensichtliche zeitliche oder räumliche Organisation aktiviert werden. Da ein jegliches Segment des Genoms einmal und nur einmal repliziert wird, legt die Beobachtung, dass neue Gabeln während der gesamten S-Phase gebildet werden, nahe, dass die Anzahl von neu gebildeten Gabeln pro Kilobase potentiell zunimmt, wenn die S-Phase fortschreitet (2B; Tabelle 2). Der kritische Faktor ist in diesem Falle der Bruchteil von DNA, der zu dem Zeitpunkt, zu wel chem Gabeln gebildet werden, noch repliziert werden muss. Dieser Bruchteil entspricht den grün gefärbten oder Inter-Auge-Segmenten des Moleküls. Dementsprechend ist es unter der Annahme, dass zwei neue Gabeln einem einzelnen Initiationsereignis entsprechen, erforderlich, die Anzahl von Initiationsereignissen, die pro nicht-repliziertem Bruchteil von jedem Molekül auftreten, zu berechnen.
Dies erfolgt, indem in der Zeit zurückgerechnet wird ausgehend von den Größen der Replikationsaugen und dann der Bruchteil von DNA bestimmt wird, der zu jenem Zeitpunkt noch zu replizieren ist. Spezieller wird die Initiationsfrequenz berechnet, indem Replikationsaugen gemäß ihrer Größe sortiert werden und dann die Dichte von Replikationsaugen, die zwischen einer Größe von 3 und 8 kb liegen, bestimmt wird. Dieses Intervall ist ein Schätzwert der Anzahl von Augen, die aus einem einzelnen Initiationsereignis hervorgegangen sind, unter der Annahme, dass die mittlere Replikongröße 14 bis 16 kb ist. Initiationsereignisse für jedes Molekül werden dann zeitlich kartiert, indem aus der Replikationsaugengröße zurückgerechnet wird: t₁ = L_Auge/(2 × Gabelgeschwindigkeit). Die Anzahl von Initiationsereignissen pro Molekül wird dann in Bezug auf den Bruchteil des Moleküls, der zu dem Zeitpunkt, zu welchem die Ereignisse aufgetreten sind, noch zu replizieren ist, bestimmt. Die Anzahl von Ereignissen pro nicht-repliziertem Segment, hier als die Nukleationsdichte bezeichnet, wird dann mit der Menge von DNA, die zu jenem Zeitpunkt für jenes bestimmte Molekül bereits repliziert worden ist, verglichen.
Auf diese Weise haben wir herausgefunden, dass die Anzahl von Nukleationsereignissen pro nicht-repliziertem Bruchteil der DNA sowohl bezüglich der Zeit als auch in Bezug auf den Prozentsatz von bereits replizierter DNA in jeder Probe zunahm (5A und 5B). Es wurde festgestellt, dass die mittlere Zunahme von dem Beginn der Replikation bis zur Beendigung der DNA-Synthese wenigstens 3,5-fach war. In einigen Fällen war die Zunahme sogar bis zu 9-fach.
Die Initiationsfrequenz, die unter Verwendung dieses Ansatzes berechnet wird, ergibt eine untere Grenze bezüglich der Anzahl von Ereignissen pro Kilobase pro Minute. Gemäß diesem Verfahren wird angenommen, dass alle Replikationsaugen, die kleiner als 8 kb sind, individuellen Initiationsereignissen entsprechen, wohingegen dies nicht der Fall ist, wenn Initiationen gemäß einem stochastischen Prozess auftreten. Dieser systematische Fehler beeinflusst jedoch die Messung der durchschnittlichen Zunahme der Initiationsfrequenz während der S-Phase nicht signifikant.
Interessanterweise wurde beobachtet, dass die späteren Zeitpunkte (d.h. t = 39' und t = 45') eine insgesamt höhere Nukleationsdichte in allen Stadien der Replikation aufwiesen (Tabelle 2). Diese Beobachtung zeigt an, dass durchschnittlich Replikongrößen von sich später replizieren den DNA-Regionen kleiner sind als jene von sich früher replizierenden Regionen. Die Zunahme der Dichte von neuen Gabeln führt zu einer entsprechenden Verringerung von Auge-zu-Auge-Abständen. Ein durchschnittlicher Auge-zu-Auge-Abstand von 6 kb wurde für Moleküle, die zu zwischen 80 und 95% repliziert waren, beobachtet (4). Unter der Annahme einer S-Phase von 10 min und einer Gabelgeschwindigkeit von 600 bp/min werden diese Sequenzen in ungefähr 5 min repliziert. Diese beobachtete Beschleunigung bei der DNA-Syntheserate kann in adäquater Weise die Verdoppelung des Genoms erklären ohne die Notwendigkeit, einen Mechanismus zu postulieren, der die DNA in regelmäßig beabstandete Replikationseinheiten organisiert.
Die längste über die S-Phase hinaus andauernde Replikationszeit betrug 17 min für ein Molekül, das zu ungefähr 82% repliziert war. Unter der Annahme von keinen neuen Initiationen werden nur zwei Gabeln dieses Segment, welches zu Beginn der S-Phase 38,4 kb groß ist, replizieren. Für ein Molekül, das zu 82% repliziert ist, werden wenigstens 2,7 min benötigt, um dessen Replikation zu vervollständigen, wieder unter der Annahme, dass nur zwei Gabeln an dem Molekül vorhanden sind. Die Größe des unreplizierten Segments beträgt in jenem Stadium 23,6 kb. Wenn die Initiationsfrequenz jedoch bis zum 4-fachen zunimmt, werden sich dann 8 Gabeln bilden, um das Segment zur replizieren (mittlere Auge-zu-Auge-Größe = 6 kb). Wenn zwei Gabeln 19,7 min benötigen, dann wird das Segment mit 8 Gabeln in ungefähr 4,9 min repliziert werden (23,6 kb/(8 × 600 bp pro min). Dies stimmt in vernünftiger Weise überein mit der Zeit, welche benötigt wird, um das Molekül selbst zu replizieren (d.h. 2,7 min) während einer S-Phase, die 15 min dauert. Tatsächlich würde eine 7-fache Zunahme der Frequenz zu der Replikation des Segments in lediglich 2,8 min führen.
Die vorliegenden Ergebnisse erweitern unser Verständnis der Mechanismen der DNA-Replikation, insbesondere in Eukaryoten und spezieller in frühen Embryos von Xenopus laevis. Diese Daten bestätigen Ergebnisse, über die bereits früher berichtet worden war, welche die Dynamik der S-Phase und die räumliche Organisation von Replikons in dem frühen X. laevis-Embryo betreffen. Für die rDNA-Region ist in diesem Entwicklungsstadium über eine zufällige räumliche Organisation von Replikationen berichtet worden (27). Unsere Ergebnisse erweitern diese Beobachtung auf das Genom selbst und zeigen an, dass Replikationsstartpunkte innerhalb des gesamten Genoms in unregelmäßigen Abständen, aber mit einem durchschnittlichen Abstand von 15 kb verstreut sind. Unter der Annahme, dass die Replikationsgabelgeschwindigkeit 600 bp/min beträgt, wird die durchschnittliche Länge der S-Phase ungefähr 12,5 min betragen. Diese kurze S-Phase würde nahe legen, dass das Replikationsprogramm durch einen nicht-zufallsgesteuerten Mechanismus, der einen regelmäßigen Abstand zwischen Replikationsstartpunkten erfordert, kontrolliert wird (21).
Jedoch enthält ein signifikanter Bruchteil der hier analysierten Moleküle unreplizierte Sequenzen zusätzlich zu jenen, die für eine S-Phase von 10 bis 15 min erwartet werden würden. Dies zeigt an, dass sogar in späteren Stadien der Replikation eine signifikante Anzahl von Startpunkten zu weit verstreut sind, als dass die dazwischenliegenden Sequenzen in dem zugewiesenen Zeitraum repliziert werden könnten. Jedoch legt unsere Beobachtung, dass die Nukleationsdichte zunimmt, wenn die S-Phase fortschreitet, nahe, dass die relative Rate der DNA-Synthese gegen Ende der S-Phase schneller wird. Diese Beobachtung kann erklären, wie ein offensichtlich zufallsgesteuertes Replikationsprogramm erfolgreich das gesamte Genom vor dem Beginn der Mitose verdoppeln kann.
Dementsprechend stellen diese Ergebnisse die erste sich auf das gesamte Genom erstreckende Analyse der DNA-Replikation in X. laevis dar und zeigen, dass ein Vorteil einer Verwendung von molekularem Kämmen, um die DNA-Replikation zu analysieren, die Fähigkeit ist, eine statistisch signifikante Anzahl von Messungen unter Verwendung einer relativ kleinen DNA-Probe zu erhalten. Dies erlaubt eine statistisch signifikante quantitative Analyse der DNA-Replikation. Wir haben die Verlässlichkeit des Ansatzes unter Verwendung des zellfreien Xenopus laevis-Systems als Modell gezeigt. Es versteht sich jedoch, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um eine jegliche Art von genomischer DNA, einschließlich menschlicher DNA, zu analysieren. Dementsprechend ist dieser Ansatz nützlich für ein breites Spektrum von Untersuchungen, die die Kontrolle der DNA-Replikation, die Genomstabilität und die dynamischen und strukturellen Beziehungen, welche die DNA-Replikation und Gentranskription während der Entwicklung regulieren, umfassen.
Die hier zitierten Referenzen werden auf den folgenden Seiten aufgelistet.
Andere Ausführungsformen der Erfindung werden den Fachleuten auf diesem Gebiet unter Berücksichtigung der Unterlagen und aus der praktischen Ausführung der hier offenbarten Erfindung ersichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass die Unterlagen und Beispiele nur als exemplarisch angesehen werden.
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Claims

Verfahren zum Detektieren eines Replikationsstartpunkts in einem DNA-Molekül, umfassend: a) Inkubieren von DNA, welche eine Replikation durchläuft, in Gegenwart von markierten Nukleotiden, wobei die markierten Nukleotide in die sich replizierende DNA eingebaut werden; b) Alignment der DNA aus Schritt a) auf einem Substrat durch molekulares Kämmen; und c) Detektieren der markierten Nukleotide, die in die DNA während der Replikation eingebaut wurden, wobei die markierten Nukleotide in einer Region, die dem Replikationsstartpunkt entspricht, lokalisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die markierten Nukleotide mit einer markierten Sonde, die an die markierten Nukleotide bindet, detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die markierte Sonde ein mit einer Markierung konjugierter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Markierung fluoreszierend ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die DNA mit der markierten Sonde inkubiert wird, bevor die DNA auf dem Substrat dem Alignment unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA mit einer markierten Sonde inkubiert wird, nachdem die DNA auf dem Substrat dem Alignment unterzogen worden ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, welches des Weiteren umfasst, die DNA nach der Inkubation mit der markierten Sonde zu waschen, um nicht-spezifische Reagenzien zu beseitigen.
Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren umfasst, die DNA vor dem Alignment von dieser auf dem Substrat zu waschen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA genomische DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat Glas ist.
Verfahren zum Messen der DNA-Replikationsrate, umfassend a) Zugeben eines ersten markierten Nukleotids zu einer Reaktionsmischung, wobei die Reaktionsmischung DNA umfasst, welche eine Replikation durchläuft, und wobei das erste markierte Nukleotid in die sich replizierende DNA eingebaut wird; b) Zugeben eines zweiten markierten Nukleotids zu der Reaktionsmischung in unterschiedlichen Zeitabständen nach der Zugabe des ersten markierten Nukleotids, wobei das zweite markierte Nukleotid in die sich replizierende DNA eingebaut wird; c) Alignment der DNA aus der Reaktionsmischung auf einem Substrat durch molekulares Kämmen; d) Detektieren der ersten und der zweiten markierten Nukleotide, die in die DNA während der Replikation eingebaut wurden; und e) Messen der Verteilung der ersten und der zweiten markierten Nukleotide in der dem Alignment unterzogenen DNA, um die DNA-Replikationsrate zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das erste markierte Nukleotid mit einer ersten markierten Sonde, die an das erste markierte Nukleotid bindet, detektiert wird und das zweite markierte Nukleotid mit einer zweiten markierten Sonde, die an das zweite markierte Nukleotid bindet, detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die erste markierte Sonde ein mit einer ersten Markierung konjugierter Antikörper ist und die zweite markierte Sonde ein mit einer zweiten Markierung konjugierter Antikörper ist, wobei die erste und die zweite Markierung unterschiedlich sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste und die zweite Markierung fluoreszierend sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die DNA mit der ersten und der zweiten markierten Sonde inkubiert wird, bevor die DNA auf dem Substrat dem Alignment unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die DNA mit der ersten und der zweiten markierten Sonde inkubiert wird, nachdem die DNA auf dem Substrat dem Alignment unterzogen worden ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, welches des Weiteren umfasst, die DNA nach der Inkubation mit der ersten und der zweiten Sonde zu waschen, um nicht-spezifische Reagenzien zu beseitigen.
Verfahren nach Anspruch 11, welches des Weiteren umfasst, die DNA zu waschen, bevor sie auf dem Substrat dem Alignment unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die DNA genomische DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Substrat Glas ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das erste markierte Nukleotid Biotin-dUTP ist und das zweite markierte Nukleotid Digoxigenin-dUTP ist.
Verfahren zur Kartierung eines Replikationsstartpunkts in einem DNA-Molekül, umfassend: a) Inkubieren von DNA, welche eine Replikation durchläuft, in Gegenwart von markierten Nukleotiden, die in die sich replizierende DNA eingebaut werden; b) Alignment der DNA aus Schritt a) auf einem Substrat durch molekulares Kämmen; c) Hybridisieren der dem Alignment unterzogenen DNA mit einer Nukleotidsonde; d) Detektieren der markierten Nukleotide und der Nukleotidsonde; und e) Messen der Abstände zwischen den markierten Nukleotiden, die in die DNA während der Replikation eingebaut wurden, und der Nukleotidsonde, um die Lage des Replikationsstartpunkts bezogen auf die Nukleotidsonde zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die markierten Nukleotide mit einem mit einer Markierung konjugierten Antikörper detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Markierung fluoreszierend ist.
Verfahren nach Anspruch 23, welches des Weiteren umfasst, die DNA nach der Inkubation mit dem Antikörper zu waschen, um nicht-spezifische Reagenzien zu beseitigen.
Verfahren nach Anspruch 23, welches des Weiteren umfasst, die DNA vor dem Alignment von dieser auf dem Substrat zu waschen.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die DNA genomische DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Substrat Glas ist.