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Priorität
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der Britischen Patentanmeldung
Nr. 9704054.7, die am 27. Februar 1997 eingereicht worden ist.
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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft einen Assay für
den Nachweis und die Identifizierung von Chromosomenaberrationen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Identifizierung und Analyse von Chromosomenpräparationen hing bislang von
Anfärbemethoden, die
charakteristische Chromosomenbandenfärbungsmuster, welche für jedes
Chromosom einzigartig sind, erzeugen, ab. Die Auflösung der
Methode ist gering und kleine Umlagerungen, einschließlich einiger
Deletionen und Duplikationen, sind nicht nachweisbar. Dies hat zu
der Einführung
von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs (FISH)-Techniken unter Verwendung
von DNA-Sonden, die mit komplementären Sequenzen auf Chromosomen
hybridisieren und folglich als spezifische Marker wirken können, geführt. Die
auf diese Weise hybridisierten Sonden sind gewöhnlich durch Haptene markiert
und werden indirekt durch fluoreszierende Antikörper nachgewiesen oder direkt
durch Fluorochrome, die in die Sonde selbst eingebaut sind, nachgewiesen.
Die Spezifität
der Sonde hängt
von ihrer DNA-Sequenz ab und die Größe des Signals hängt von
der Länge
der Sequenz ab. Viele Arten von DNR-Sonden werden in einem Plasmid, Cosmid,
künstlichen
Hefechromosom oder andersartigen Vektor kloniert.
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Eine
andere Klasse von DNA-Sonden verwendet gesamte genomische DNA aus
entweder vollständiger
nukleärer
DNA oder aus Fraktionen von nukleärer DNA, die ausgehend von
verschiedenen Quellen, einschließlich ganzer Zellen und spezieller
Chromosomen, erzeugt werden können.
Das übliche
Verfahren zur Herstellung dieser komplexen Sonden erfolgt durch
DNA-Amplifizierung
unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und von DNA-Primern
mit zufälliger
Sequenz („random"-DNA-Primer). Die
Markierung wird während
der Amplifizierungsprozedur oder durch Nick- Translation nach der Amplifizierung
eingebaut. Die Hybridisierung von diesen Sonden mit Chromosomen
resultiert in einer mehr oder weniger gleichförmigen Reihe von fluoreszierenden
Signalen über
die gesamte Länge
des Chromosoms hinweg. Dies ist als „chromosome painting" bezeichnet worden
und die Sonden, die diesen Effekt erzeugen, sind als „chromosome
paints" bezeichnet
worden.
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„Paints", die individuellen
Chromosomen entsprechen (chromosomenspezifische „Paints"), können aus
einer PCR-Amplifizierung von mittels Durchflusszytometrie sortierten
Chromosomen hergestellt werden. Sie haben sich als nützlich bei
dem Nachweis und der Identifizierung von Chromosomenaberrationen
unterhalb der Auflösung
von zytogenetischen Standard-Bandenfärbungsmethoden erwiesen. Es
können
mehrere Chromosomen-spezifische „Paints" zusammen verwendet werden, um eine
Mehrzahl von Zielchromosomen nachzuweisen vorausgesetzt, dass verschiedene
Fluorochrome für
die Markierung der Sonden, welche von verschiedenen Chromosomen
abgeleitet sind, verwendet werden. Für eine detailliertere Beschreibung
von modernen zytogenetischen Techniken siehe Ferguson-Smith und Andrews,
1996, „Cytogenetic
Analysis", Kapitel
12, in Emery & Rimoin's PRINCIPLES & PRACTICE OF MEDICAL
GENETICS, herausgegeben von D.L. Rimoin et al., Churchill-Livingstone,
London. Zusätzlich
sind für
humane Chromosomen spezifische „Paints" verwendet worden, um Homologien in
nicht-humanen Spezies durch vergleichende Genomanalyse zu identifizieren
(Wienberg & Stanyon,
1995, Curr. Opin. Gen. & Dev.
5:792-97).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Unter
einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen einer
Chromosomenaberration in einem Tier bereit, indem wenigstens eine
detektierbar markierte Chromosomen-spezifische Sonde aus einer ersten
Tierspezies mit einem oder mehreren Chromosomen von einer zweiten
Tierspezies hybridisiert wird; ein aus der Hybridisierung resultierendes
Bandenfärbungsmuster
detektiert wird; und das detektierte Bandenfärbungsmuster mit einem Bandenfärbungsmuster
für das
oder die entsprechende(n) nicht-aberrante(n) Chromosom(e) der zweiten
Spezies verglichen wird. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens
wird eine Mehrzahl (wenigstens zwei) von detektierbar markierten
Chromosomenspezifischen Sonden aus der ersten Tierspezies mit einem
oder mehreren Chromosomen einer zweiten Tierspezies hybridisiert
und wenigstens zwei der Chromosomen-spezifischen Sonden sind unterschiedlich
markiert.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung sind beide Tierspezies Vertebraten. In verschiedenen
Ausführungsformen
ist die erste Tierspezies ein nicht-humaner Primat, beispielsweise
ein nicht-humaner Primat aus der Gattung Hylobates, wie Hylobates
concolor und/oder Hylobates syndactylus. In einer Ausführungsform
der Erfindung ist die zweite Spezies ein Mensch. Die Hybridisierung
kann mit dem vollständigen
Karyotyp des zweiten Tiers erfolgen.
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Die
Sonden der Erfindung können
detektierbar markierte Sonden mit einer oder mehreren Hapten-Spezies,
einem Fluorochrom oder beidem sein. In bestimmten Ausführungsformen
ist das Hapten Biotin, Digoxigenin oder Fluorescein-isothiocyanat
(FITC). Beispiele von Fluorochromen sind FITC, Cyanin-2, Cyanin-3,
Cyanin-3,5, Cyanin-5, Cyanin-7, Fluorescein, Texas red, Rhodamin,
Lissamin und Phycoerythrin. Chromosomenspezifische Sonden der Erfindung
können
mit mehr als einer Markierung (z.B. 2, 3 oder mehr Haptenen, Fluorochrome
oder Kombinationen von Haptenen und Fluorochromen) markiert sein.
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Unter
einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt ist die Erfindung auf
Zusammensetzungen von detektierbar markierten Chromosomenspezifischen
Sonden aus wenigstens zwei unterschiedlichen Tierspezies gerichtet.
Die Spezies können
Vertebraten, wie nicht-humane Primaten (z.B. Spezies aus der Gattung Hylobates,
wie Hylobates concolor und Hylobates syndactylus), sein.
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Unter
einem anderen damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die
Erfindung Kits bereit, die nützlich
sind, um Chromosomenaberrationen nachzuweisen. In einer Ausführungsform
enthält
der Kit eine oder mehrere detektierbar markierte Chromosomen-spezifische
Sonden aus einer nicht-humanen Tierspezies und eine Photographie
oder eine Zeichnung eines normalen humanen Karyotyps, der mit den
Sonden gefärbt ist.
In einer Ausführungsform
enthält
der Kit der Erfindung detektierbar markierte Chromosomen-spezifische Sonden
aus zwei unterschiedlichen Spezies in dem gleichen Behälter. In
einer besonderen Ausführungsform sind
beide Spezies nicht-humane Primaten, wie Primaten der Gattung Hylobates.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
ein Idiogramm, welches die in situ-Hybridisierung an humane Chromosomen
durch Chromosomen-spezifische Sonden aus H. concolor zusammenfasst.
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2 zeigt
bivariate (zweidimensionale) Durchflusszytometer-Karyotypen („bivariate flow karyotypes") von (a) männlichen
Hylobates concolor- und (b) weiblichen H. syndactylus-Chromosomen
aus lymphoblastoiden Zellkulturen. Sonden, die durch mit degenerierten
Oligonukleotiden als Primer gestartete PCR („degenerate oligonucleotide
primed-PCR"; DOP-PCR)
ausgehend von mittels Durchflusszytometrie sortierten Chromosomen
und in situ-Hybridisierung von diesen Sonden an Gibbon-Metaphasen-Ausbreitungen
erzeugt worden sind, ermöglichten
die Zuordnung von jedem Peak zu einem Chromosom. Die Chromosomennummerierung
folgte Koehler et al., 1995, Genomics, 30:287-292, und Koehler et
al., 1995, Am. J. Phys. Anthropol., 97:37-47. Für den männlichen H. concolor wurde
ein Y-Chromosom aus der Nähe
des Debris-Spikes sortiert (nicht gezeigt).
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3 zeigt
ein Idiogramm, welches in situ-Hybridisierungsexperimente zusammenfasst,
welche humane Chromosomen mit Chromosomenspezifischen Sonden, welche
von zwei unterschiedlichen Gibbon-Spezies (H. concolor und H. syndactylus)
abgeleitet worden sind, in Form eines „Painting" anfärben.
Die Hybridisierungsstellen und die Anzahl der Gibbon-„Painting"-Sonden sind auf
der linken Seite jedes Chromosoms für den H. concolor-Gibbon und
auf der rechten Seite für
den H. syndactylus-Gibbon angegeben.
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4 zeigt
verschiedene Gibbon-Einzelchromosom-Sonden, welche Subregionen des
humanen Chromosoms 1 aus einem Patienten mit einer Transposition
(46,XY,inv(1)(p36.1;p31p32) voneinander abgegrenzt sichtbar machen.
Die Sonden stammten aus H. concolor (Concolor)-Gibbon-Chromosomen: (a) Chromosom 5;
(b) Chromosom 9; (c) Chromosom 12; und (d) Chromosom 24.
Das normale humane Chromosom befindet sich auf der linken Seite
jedes Bilds. Eine mit der Gibbon-Chromosom 12- Sonde nicht markierte Bande in (c) in
dem kurzen Arm entspricht dem mit einem Teil der Chromosom 5-Sonde
in Form eines „Painting" angefärbten Segment.
Dieses Segment ist transponiert und nahe des Telomers (a) inseriert,
wodurch das Signal der Gibbon-Chromosom 24-Sonde (d) zerstört wird.
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5 zeigt eine Kreuz-Spezies-Farb-Bandenfärbung („cross-species
color banding"; „CSC-banding") unter Verwendung
von für
Gibbon-Chromosomen spezifischen „Paints" an humanen Chromosomen. (a) Karyotyp
von normalen humanen Chromosomen unter Verwendung des von H. syndactylus
abgeleiteten Sondensatzes. (b)-(c) Chromosomen-Umlagerungen aus
Patienten, die durch CSC-Bandenfärbung
(„CSC-banding") sichtbar gemacht
wurden; (b) CSC-Bandenfärbung
mit dem H. syndactylus (Siamang)-Sondensatz, welche eine Metaphase
mit einer Translokation t(1;2)(g37;q42.3)) zeigt. In der Metaphase
sind die Chromosomen 1 und 2 durch Pfeilspitzen
markiert. In dem umrahmten Feld werden umgelagerte Chromosomen durch
Pfeile angegeben; (c) CSC-Bandenfärbung mit dem von H. concolor
(Concolor)-Gibbon abgeleiteten Sondensatz, welche eine Metaphase
mit einer perizentrischen Inversion auf Chromosom 2 (inv(2)(p23g13)
zeigt. Das normale Chromosom wird mit einer Pfeilspitze angegeben,
während
das aberrante Chromosom mit einem Pfeil markiert ist; (d) ausgewählte Prophase-Chromosomen
aus einer Hybridisierung mit einer unterschiedlichen Farbkombination,
welche für
die Chromosomen-Markierung verwendet wird.
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Beschreibung der Erfindung
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Vor
der Erfindung ist die Nützlichkeit
des „chromosome
painting" für die Karyotypen-Analyse
begrenzt gewesen. Obwohl ein herkömmliches „chromosome painting" verwendet werden
kann, um interchromosomale Umlagerungen, wie Translokationen, nachzuweisen,
kann es keine intrachromosomalen Umlagerungen, wie Inversionen,
Amplifikationen und Deletionen identifizieren. Dementsprechend würde ein
Verfahren, das die Detektion von intrachromosomalen Umlagerungen
vereinfacht, die Analyse von Chromosomen-Aberrationen stark verbessern.
Eine andere Einschränkung
von früheren
Methoden des „chromosome
painting" ist die Kreuzhybridisierung,
die zwischen bestimmten nicht-homologen Chromosomen aufgrund der
Anwesenheit von verschiedenen Klassen von repetitiver DNA auftritt.
Einige, aber nicht alle, der Kreuzhybridisierungen können beseitigt
werden, indem mit Cot-1-DNA blockiert wird oder ermöglicht wird,
dass man die Sonde mit sich selbst reassoziieren lässt, bevor
sie mit der Chromosomen-Präparation
hybridisiert wird (Wienberg et al., 1997, „Chromosome painting without
competitor DNA",
Technical Tips Online (http//www.elsevier.com/locate/tto). Bei einer
Verwendung dieser Methoden wird jedoch bei Sonden, die von bestimmten
Chromosomen abgeleitet sind, nach wie vor ein Hintergrund (Kreuzhybridisierung)
beobachtet.
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Die
Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Nachweisen einer Chromosomen-Aberration
in einem Tier unter Verwendung von Chromosomenspezifischen „Paints" (z.B. hergestellt
durch die unterschiedliche Markierung von Chromosomenarmen, -regionen
und -subregionen), hergestellt aus Spezies, die sich hinsichtlich
der repetitiven DNA auseinanderentwickelt haben, bereit. Zusätzlich wird
eine Charakterisierung auf subregionaler Ebene erzielt, wenn Chromosomenumlagerungen
während
der Auseinanderentwicklung (Divergenz) aufgetreten sind. In einer
Ausführungsform
wird ein in situ-Hybridisierungs-FISH-System verwendet, um jede
Chromosomen-spezifische Sonde mit einem unterschiedlichen Spektrum
von Fluorochromen zu markieren. Dies wird erreicht, indem Fluorochrome
in unterschiedlichen Kombinationen und Verhältnissen für jedes Chromosom kombiniert
werden. Die Chromosomen-spezifischen Sonden werden zu einer Hybridisierungssondenmischung
(die CSC-Bandenfärbungssonde)
gepoolt und mit der Chromosomen-Präparation aus der Spezies, die
sich davon weg entwickelt hat (Divergenz), hybridisiert. Abhängig von
der Anzahl von Chromosomenumlagerungen, die während der Divergenz der beiden
Spezies aufgetreten sind, wird sich unter dem Fluoreszenzmikroskop
zeigen, dass jedes Zielchromosom aus einer Reihe von unterschiedlich
gefärbten
Blöcken von
konservierter DNA zusammengesetzt ist. Diese unterschiedlich gefärbten Blöcke werden
hier als „Banden" bezeichnet und das
Verfahren zur Herstellung von diesen wird als „Kreuz-Spezies-Farb-Bandenfärbung" („cross-species
color banding")
oder CSC-Bandenfärbung
(„CSC-banding") bezeichnet. Durch
Vergleichen des Bandenfärbungsmusters
des untersuchten Chromosoms oder Karyotyps mit jenem eines normalen
oder nicht-aberranten Chromosoms oder Karyotyps werden Chromosomen-Abnormalitäten identifiziert.
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Das
Verfahren und die neuen Reagenzien der Erfindung sind neben anderen
Verwendungen für
die Analyse von humanen Chromosomen-Aberrationen bei der klinischen
Diagnose und bei der Krebs-Zytogenetik nützlich. Zusätzliche Anwendungen umfassen
Untersuchungen im Rahmen der Tier-Zytogenetik und als biologisches Dosimeter
für klastogene
Agentien in Mutationsuntersuchungen unter Verwendung von Zellkulturen oder
Tiermodellen. Das Verfahren hat gegenüber der herkömmlichen
Bandenfärbung
(z.B. durch 4,6-Diaminido-2-phenylindol [DAPI)-Färbung) oder herkömmlichen
FISH-Methoden zahlreiche Vorteile, welche umfassen:
- 1) Intrachromosomale Umlagerungen können zusätzlich zu interchromosomalen
Aberrationen und Aneuploidien identifiziert werden.
- 2) Die Kreuz-Hybridisierung zwischen nicht-homologen Chromosomen
wird stark verringert, teilweise aufgrund der intensiven Divergenz
von repetitiven DNA-Sequenzen zwischen den Spezies. DNR mit einzigartiger
Sequenz ist auf der anderen Seite zwischen den Spezies konserviert.
Die Verringerung der Kreuzhybridisierung ermöglicht eine verbesserte Spezifität, eine
Voraussetzung für
eine automatisierte Chromosomenanalyse.
- 3) Da stabile Quellen für
Chromosomen-spezifische DNR-„Paint"-Sonden verwendet
werden, ist das Verfahren hochgradig reproduzierbar.
- 4) Das Verfahren kann in Verbindung mit vielen Techniken, einschließlich Standardfluoreszenzmikroskopie, kombinatorischer
Multi-Fluoreszenz-FISH und mit spektraler Karyotypisierung, verwendet
werden.
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Die
Erfindung wird jetzt noch detaillierter beschrieben.
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I. Definitionen
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Der
Ausdruck „Chromosomen-Bandenfärbung („chromosome
banding") bezieht
sich auf eine unterschiedliche Färbung
von Chromosomen, die in einem Muster von quer verlaufenden Banden
von unterscheidbaren (z.B. unterschiedlich oder abwechselnd gefärbten) Regionen,
das für
das individuelle Chromosom oder die individuelle Chromosomenregion
charakteristisch ist (d.h. das „Bandenfärbungsmuster" („banding
pattern")), resultiert.
Herkömmliche
Bandenfärbungstechniken
umfassen G-Bandenfärbung
(Giemsa-Färbung), Q-Bandenfärbung (Quinacrin-Senf
(„Quinacrine
mustard")-Färbung),
R-Bandenfärbung
(Reverse Giemsa-Färbung)
und C-Bandenfärbung (Zentromer-Bandenfärbung).
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Der
Ausdruck „Karyotyp" bezieht sich auf
die Chromosomencharakteristik einer individuellen Zelle oder Zelllinie
einer gegebenen Spezies, die sowohl durch die Anzahl als auch die
Morphologie der Chromosomen definiert wird. Typischerweise wird
der Karyotyp als eine systematische Anordnung von Prophase- oder Metaphase-
(oder auf andere Weise kondensierten) Chromosomen aus einer Mikrophotographie
oder einem mittels Computer erzeugten Bild dargestellt. Alternativ
können
Interphase-Chromosomen
als von Histonen befreite DNA-Fasern, die aus Interphase-Zellkernen freigesetzt
worden sind, untersucht werden.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich „Chromosomen-Aberration" oder „Chromosomen-Abnormalität" auf eine Abweichung
zwischen der Struktur des untersuchten Chromosoms oder Karyotyps
und einem normalen (d.h. „nicht-aberranten") homologen Chromosom
oder Karyotyp. Die Ausdrücke „normal" oder „nicht-aberrant", wenn sie sich auf
Chromosomen oder Karyotypen beziehen, beziehen sich auf den vorherrschenden
Karyotyp oder das vorherrschende Bandenfärbungsmuster, welcher bzw.
welches bei gesunden Individuen einer bestimmten Spezies und Gattung
gefunden wird. Chromosomen-Abnormalitäten können numerischer oder struktureller
Natur sein und umfassen Aneuploidie, Polyploidie, Inversion, Translokation,
Deletion, Duplikation und dergleichen. Chromosomen-Abnormalitäten können mit
der Anwesenheit eines pathologischen Zustands (z.T. Trisomie 21
bei Down-Syndrom, Chromosom 5p-Deletion bei dem Cri-du-chat-Syndrom
und eine große
Vielzahl von unbalancierten Chromosomenumlagerungen, die zu Dysmorphologie
und mentalen Schädigungen führen) oder
mit einer Veranlagung dafür,
einen pathologischen Zustand zu entwickeln, korreliert sein.
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„Chromosomen-spezifische
Sonde" oder „Chromosomen-spezifische „Paint"" bezieht sich auf eine Kombination von
detektierbar markierten Polynukleotiden, die Sequenzen aufweisen,
die den Sequenzen von DNA aus einem bestimmten Chromosom oder einer
bestimmten subchromosomalen Region eines bestimmten Chromosoms (z.B.
einem Chromosomarm) entsprechen (z.B. im wesentlichen die gleichen
sind). Die Chromosomen-spezifische Sonde wird typischerweise durch
Amplifizierung (z.B. unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion)
der entsprechenden chromosomalen DNA hergestellt. Eine Chromosomen-spezifische
Sonde wird in einem im wesentlichen gleichförmigen Muster entlang des Chromosoms
oder der subchromosomalen Region, von welchem bzw. von welcher sie
abgeleitet ist, hybridisieren.
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Der
Ausdruck „CSC-Bandenfärbungssonde" oder „CSC-Bandenfärbungs„Paint"" bezieht sich auf eine Mischung von
Chromosomen-spezifischen Sonden. Die CSD-Bandenfärbungssonden der Erfindung
umfassen typischerweise eine Mischung von wenigstens zwei, üblicherweise
vielen Chromosomen-spezifischen Sonden.
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Der
Ausdruck „detektierbare
Markierung" bezieht
sich in einem allgemeinen Sinne auf eine Gruppierung, wie ein radioaktives
Isotop oder eine Gruppe, welche ein solches enthält, und auf Nicht-Isotopen-Markierungen, wie
Enzyme, Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxigenin, lumineszierende
Agentien, Farbstoffe, Haptene und dergleichen. Lumineszierende Agentien
können
abhängig
von der Quelle der Anregungsenergie als radiolumineszierend, chemolumineszierend,
biolumineszierend und photolumineszierend (einschließlich fluoreszierend
und phosphoreszierend) klassifiziert werden. Der Ausdruck „fluoreszierend" bezieht sich auf
die Eigenschaft einer Substanz (wie eines Fluorophors), Licht zu
erzeugen, während
auf diese Strahlungsenergie, wie ultraviolettes Licht oder Röntgenstrahlen,
einwirkt. Eine Sonde oder „Paint" ist „detektierbar
markiert", wenn
sie mit einer detektierbaren Markierung chemisch verknüpft oder
assoziiert ist.
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Der
Ausdruck „direkt
markiert" bezeichnet
eine Polynukleotidsonde mit einer detektierbaren Markierung, die
nach einer Hybridisierung mit einer Zielnukleinsäure ohne weitere reaktive Verarbeitung
detektierbar ist. Ein Beispiel ist ein Polynukleotid, das mit mit
Fluoresceinisothiocyanat konjugiertem dUTP markiert ist.
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Der
Ausdruck „indirekt
markiert" bezeichnet
eine Polynukleotidsonde mit einer detektierbaren Markierung, die
nach Hybridbildung mit einem Ziel im Rahmen einer nachfolgenden
Verarbeitung weiter umgesetzt werden muss mit einem oder mehreren
Reagenzien, damit damit eine oder mehrere Gruppierungen assoziieren,
die schließlich
in einer detektierbaren Struktur resultieren. Ein Beispiel ist ein
Polynukleotid, das mit Digoxigenin-konjugiertem dUTP markiert ist,
welches unter Verwen dung eines mit einem Fluorochrom konjugierten anti-Digoxigenin-Antikörpers sichtbar
gemacht werden kann.
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Nukleinsäuresonden
sind „abgeleitet" von einem speziellen
Chromosom oder einer speziellen Chromosomenregion, wenn die Sonden
Nukleotidsequenzen aufweisen, die im wesentlichen die gleichen sind
wie jene der DNA des Ausgangschromosoms oder der Ausgangschromosomenregion
und die spezifisch mit der DNA des Chromosoms oder der Region hybridisieren.
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Es
versteht sich, dass hier Bezugnahmen auf „Hybridisieren einer Sonde
oder „Paint" mit einem Chromosom" und dergleichen
sich auf eine Hybridisierung oder ein Reassoziierenlassen von Nukleinsäuresonden an
die DNA des Zielchromosoms beziehen.
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II. Kreuz-Spezies-Farb-Bandenfärbungssonden
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Die
Kreuz-Spezies-Farb-Bandenfärbung
(„cross-species
color banding"; „CSC-banding") hat die Hybridisierung
von detektierbar markierten Sonden (CSC-Bandenfärbungssonden), welche von den
Nukleinsäuren
von einer oder mehreren Spezies abgeleitet sind, mit den Chromosomen
(z.B. Metaphase-Ausbreitungen) einer unterschiedlichen Spezies zur
Folge. Das oder die Chromosom(en), ausgehend von welchem bzw. welchen
die Sonden abgeleitet werden, werden manchmal als „Ausgangschromosom(en)" bezeichnet. Das
Chromosom oder die Chromosomen, mit dem bzw. den die detektierbar
markierten Sonden hybridisiert werden, werden manchmal als „Ziel"chromosome bezeichnet.
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Die
Herstellung von CSC-Bandenfärbungssonden
umfasst (1) die Auswahl von einer oder mehreren Spezies, ausgehend
von welchen Chromosomenspezifische oder Subchromosonregion-spezifische
Sonden hergestellt werden sollen, (2) Isolierung von Chromosomen
und differenzielle Markierung der von den Chromosomen abgeleiteten
Chromosomen-spezifischen Sonden und (3) Kombinieren von zwei oder
mehreren Chromosomenspezifischen Sonden, die von Chromosomen von
einer oder mehreren Spezies abgeleitet sind, um die CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung herzustellen.
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Die
CSC-Bandenfärbung
kann ausgeführt
werden unter Verwendung von Sonden und Zielchromosomen aus jeglichen
geeigneten Kombinationen von Spezies. Aus Gründen der Klarheit konzentriert
sich die folgende Beschreibung jedoch überwiegend auf die Verwendung
von CSC-Bandenfärbungssonden,
die von Nukleinsäuren
von einer oder mehreren nichthumanen Spezies abgeleitet worden sind,
um eine oder mehrere Chromosomen-Aberration(en) in Zielchromosomen
aus einem Menschen nachzuweisen. Es versteht sich, dass nicht beabsichtigt
ist, dass dies den Umfang der Erfindung, der durch die beigefügten Ansprüche definiert wird,
beschränkt.
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A. Ausgangschromosomen
für CSC-Handenfärbungssonden
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Die
CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung werden ausgehend von anderen DNA-Quellen als jener
der Zielchromosome hergestellt. Dementsprechend werden, wenn das
Ziel darin besteht, eine Chromosomenabnormalität in einem humanen Chromosom
oder Karyotyp nachzuweisen, die CSC-Bandenfärbungssonden ausgehend von
DNA aus einer nicht-humanen Spezies, wie einem nicht-humanen Tier
(z.B. einem nicht-humanen Vertebraten), hergestellt. Die Sonden
aus dem nicht-humanen Chromosom werden mit entsprechenden (homologen)
nicht-repetitiven Sequenzen in den humanen Chromosomen hybridisieren.
Wichtig ist, dass viele nicht-humane Chromosomen Umlagerungen von
Chromosomenregionen bezogen auf die homologen Regionen von humanen
Chromosomen aufweisen. So wird, wenn DNA-Sonden aus einem bestimmten nicht-humanen
Chromosom gleichförmig
markiert und mit einem oder mehreren humanen Chromosomen hybridisiert
werden, ein nicht-gleichförmiges
Hybridisierungsmuster resultieren (welches das Muster der Umlagerungen
reflektiert), wodurch einem Praktiker erlaubt wird, zwischen verschiedenen
Regionen des Zielchromosoms zu unterscheiden. Anders gesagt, wird
eine Chromosomen-spezifische „Paint" aus einem Chromosom
einer nicht-humanen Spezies, das Umlagerungen bezogen auf das humane
Chromosom aufweist, bei einer Hybridisierung mit dem humanen Karyotyp
ein Bandenfärbungsmuster
bei den humanen Chromosomen erzeugen.
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Eine
gleichförmig
markierte Sonde aus einem einzelnen Chromosom ermöglicht jedoch
eine begrenzte Auflösung
der Struktur des oder der humanen Chromosoms oder Chromosome und
ist für
die Diagnose oder Prognose von humanen Krankheiten von begrenzter
Nützlichkeit.
Die Auflösung
wird beträchtlich
verbessert durch Verwendung einer Mischung von Chromosomen-spezifischen
Sonden, die von mehreren unterschiedlichen Chro mosomen abgeleitet
sind, von denen wenigstens einige unterschiedlich markiert sind.
Zwei Chromosomen-spezifische Sonden sind bezogen aufeinander unterschiedlich
markiert, wenn sie unterscheidbare detektierbare Markierungen, unterschiedliche
Kombinationen von detektierbaren Markierungen, unterschiedliche
Verhältnisse
von detektierbaren Markierungen tragen oder ansonsten nach einer
Hybridisierung mit dem oder den Zielchromosom(en) unterschieden
werden können
(z.B. aufgrund der Emission von unterschiedlichen Spektren). Techniken
für die
unterschiedliche Markierung sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt
(z.B. Speicher et al., 1996, Nature Genet. 12:368-75) und werden
weiter unten weiter beschrieben.
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So
werden in einer Ausführungsform
Chromosomen-spezifische Sonden, die jedem Chromosom einer nicht-humanen
Spezies entsprechen, mit einer unterschiedlichen detektierbaren
Markierung markiert und für eine
CSC-Bandenfärbung an
humanen Chromosomen verwendet. Häufiger
wird weniger als der vollständige Satz
von Chromosomen aus der nicht-humanen Spezies verwendet werden und
zwei oder mehrere Chromosomen können
die gleiche detektierbare Markierung tragen.
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Mit
der Maßgabe
bestimmter Zielchromosomen (z.B. dem humanen Karyotyp) wird die
Auswahl von bestimmten Kombinationen von Chromosomen (z.B. nicht-humanen
Chromosomen), ausgehend von welchen geeignete Chromosomen-spezifische
Sonden hergestellt werden sollen, die Kombination von Chromosomen-spezifischen
Sonden und die Auswahl von bestimmten detektierbaren Markierungen
von dem durch den Praktiker gewünschten
Auflösungsausmaß abhängen. Geeignete
Kombinationen von nicht-humanen Chromosomen, ausgehend von welchen
Chromosomen-spezifische Sonden hergestellt werden sollen, können gemäß der Lehre
der Beispiele I und II weiter unten identifiziert werden. Typischerweise
werden im Falle von humanen Zielchromosomen für Sonden geeignete Chromosome
identifiziert durch:
- (1) Isolierung von Chromosomen
aus der nicht-humanen Spezies (z.B. unter Verwendung von durchflusszytometrischen
Methoden, wie weiter unten beschrieben);
- (2) Herstellung von detektierbar markierten Sonden aus jedem
isolierten Chromosom (z.B. unter Verwendung von DOP-PCR, wie weiter
unten beschrieben);
- (3) Hybridisieren der markierten Sonden mit dem humanen Karyotyp,
um Regionen mit Homologie zu identifizieren (z.B. unter Verwendung
von Standard-in situ-Hybridisierungstechniken, wie weiter unten
beschrieben)
- (4) Kartieren von Regionen mit Homologie zwischen dem Ziel-Karyotyp
und den Chromosomen oder dem Karyotyp und den Ausgangschromosomen;
- (5) Identifizieren, welche Banden auf dem humanen Karyotyp jeder
nicht-humanen Chromosomen-spezifischen Sonde entsprechen und
- (6) Auswählen
von Kombinationen von Chromosomen-spezifischen Sonden, um die gewünschte Anzahl (z.B. üblicherweise
wenigstens 40) und Verteilung von Banden auf den Zielchromosomen
bereitzustellen.
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Kombinationen
von Chromosomen-spezifischen Sonden werden für ein Poolen ausgewählt, um
die CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung herzustellen derart, dass mehrere unterschiedliche
Abschnitte oder Regionen der (z.B. humanen) Zielchromosomen voneinander
abgegrenzt sichtbar gemacht werden (unter der Annahme, dass jede
Chromosomen-spezifische Sonde unterschiedlich markiert ist). Typischerweise werden
wenigstens ungefähr
40 unterschiedliche Abschnitte voneinander abgegrenzt sichtbar gemacht,
häufiger
wenigstens ungefähr
70, noch häufiger
wenigstens ungefähr
80 und sehr häufig
wenigstens ungefähr
90 oder mehr unterschiedliche Abschnitte des Zielchromosoms (z.B.
des humanen Karyotyps) voneinander abgegrenzt sichtbar gemacht.
Es versteht sich, dass ein detaillierteres Bandenfärbungsmuster
höhere
Auflösungsausmaße ermöglicht und
die Identifizierung von Chromosomenabnormalitäten vereinfacht.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung enthalten die CSC-Bandenfärbungssonden Chromosomen-spezifische
Sonden, die von einer nichthumanen Spezies (z.B. H. concolor) abgeleitet
sind; in alternativen Ausführungsformen
können
Chromosomen-spezifische Sonden, die von mehr als einer nicht-humanen Spezies
abgeleitet sind, kombiniert werden, wie in Beispiel II weiter unten
beschrieben, um die Auflösung
(Anzahl von unterscheidbaren Banden) nach einer Hybridisierung der
CSC-Bandenfärbungssonden
mit den Zielchromosomen zu erhöhen.
So umfassen in verschiedenen Ausführungsformen die CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung eine Mischung von Nukleinsäuren oder Chromosomen-spezifischen
Sonden aus mehr als einer, z.B. 2, 3, 4 oder mehr unterschiedlichen Spezies,
von denen jede von der Spezies der Zielchromosome verschieden ist
(z.B. nicht-humane Spezies, wenn die Zielchromosomen human sind).
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Wenn
die Zielchromosomen human sind, umfassen geeignete nicht-humane
Tiere für
die Erzeugung von CSC-Bandenfärbungssonden
nicht-humane Primaten, andere Säugetiere,
Reptilien, Amphibien, Vögel und
Fische. In einer Ausführungsform
ist das nicht-humane Tier ein nicht-humaner Primat, wie ein Affe
(z.B. aus der Subfamilie Hylobatinae oder Ponginae), beispielsweise
ein Gibbon (Gattung Hylobates), Orang-Utan (Gattung Pongo), Schimpanse
(Gattung Pan, z.B. Pan troglodytes) und/oder Gorilla (Gattung Gorilla).
In einer anderen Ausführungsform
ist das nichthumane Tier ein Altwelt-Affe (d.h. Familie Cercopithecidae,
wie Paviane, Mandrills, Makaken, Meerkatzen, Mohrenaffen, Languren,
Seidenaffen und die afrikanische grüne Meerkatze (Cercopithecus
aethiops) oder ein Neuwelt-Affe, wie Krallenaffen, Brüllaffen,
Klammeraffen, Kapuzineraffen, Nachtaffe und wollige Klammeraffen
und andere.
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Nicht-humane
Primaten sind besonders gute Quellen für CSC-Bandenfärbungssonden,
da (1) sie mit Menschen ein hohes Ausmaß an Konservierung in kodierenden
Sequenzen und ein hohes Ausmaß an
Divergenz in nichtkodierenden Sequenzen gemeinsam haben und (2)
viele zahlreiche Umlagerungen bezogen auf Menschen zeigen. Beispielsweise
zeigen die Karyotypen von Gibbons (z.B. H. hoolock, 2n=38; H. lar,
2n=44; H. syndactylus, 2n=50 und H. concolor, 2n=52) umfassende
Chromosomenreorganisationen (z.B. Translokationen) im Vergleich
zu humanen Chromosomen. Ein anderes Beispiel für geeignete nicht-humane Primaten sind
die Cercopithecus-Affen, bei denen Chromosomenspaltungen vorherrschen
(Karyotypen variieren von 2n = 48 bis 72; siehe Dutrillaux et al.,
1979, Hum. Genet. 48:251-314). So sind Sonden, die von den Chromosomen
dieser Spezies abgeleitet sind, besonders nützlich, um für Chromosomenarme
spezifische Sonden für
die Analyse des humanen Karyotyps zu erzeugen.
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Wie
weiter oben angegeben, werden in einigen Ausführungsformen Chromosomen-spezifische
Sonden aus zwei oder mehreren Spezies in den CSC-„Paints" kombiniert, um zusätzliche
Auflösung
zu ermöglichen.
So sind in einer Ausführungsform
die CSC-Bandenfärbungssonden
eine Mischung von Hylobates concolor- und H. syndactylus-Sequenzen.
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B. Isolation von spezifischen
Chromosomensequenzen
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Um
Chromosomen-spezifische Sonden herzustellen, die unterschiedlich
markiert sind, ist es erforderlich, DNA aus dem bzw. den zu markierenden
Chromosom(en) in einer Weise von der DNA der anderen Chromosomen
(d.h. jenen, die unmarkiert bleiben sollen oder andersartig markiert
werden sollen) zu isolieren. In einer Ausführungsform der Erfindung werden
individuelle Chromosomen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung
von wohletablierten Methoden isoliert (siehe z.B. Collins et al.,
1991, Genomics 11:997-1006; Rabbitts et al., 1995, Nat. Genet. 9:369-75;
und Ferguson-Smith, 1997, Europ. J. Hum. Genet. 5:253-65).
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In
anderen Ausführungsformen
können
die Chromosomen körperlich
getrennt, fragmentiert und die Fragmente als Klone wie in Van Dilla
et al., 1986, Bio/Technology 4:537-52, und Cox et al., 1990, Science 250:245-50
vermehrt werden. Alternativ kann ein vollständiges Chromosom körperlich
von der Oberfläche
eines Mikroskop-Objektträgers
abgeschabt, fragmentiert und die Fragmente als Klone vermehrt werden
(Ludeck et al., 1989, Nature 338:348-50) oder es können mikropräparierte
Fragmente von Chromosomen verwendet werden (siehe z.B. Trautman
et al., 1991, Hum. Genet. 87:495-97). Einzelne Chromosomen aus einer
bestimmten Spezies können
auch in somatischen Zellhybriden vermehrt und die Sequenzen des
Chromosoms von Interesse unter Verwendung von Spezies-spezifischen
PCR-Primern amplifiziert werden (z.B. unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden,
die zu im Überfluss
vorhandenen, polydispersen wiederholten DNA-Sequenzen, die in den
Zielchromosomen, nicht aber in den Chromosomen der Wirtszelle vorhanden sind,
komplementär
sind (siehe z.B. Nelson et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:6686-90, welche die Amplifizierung von humanen Sequenzen aus
Mensch-Nager-Zellhybriden unter Verwendung von Alu-spezifischen
Primern beschreiben). Es versteht sich, dass die spezielle Methode
zum Abtrennen von Chromosomen von Interesse von anderen für die Erfindung
nicht kritisch ist und dass andere Methoden verwendet werden können.
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Nach
der Isolierung oder Reinigung von speziellen Chromosomenpräparationen
(die z.B. ein oder einige wenige Chromosomen enthalten) können Chromosomen-spezifische
Sonden ausgehend von chromosomaler DNA unter Verwendung von enzymatischen
Amplifizierungsmethoden, wie der Polymerasekettenreaktion (z.B.
mit degenerierten Oligonukleotiden als Primer gestartete PCR; Telenius
et al., 1992, Genes, Chromosomes & Cancer
4:257-63) hergestellt werden. Ist einmal ein Satz von amplifizierten
Nukleinsäuresonden
(z.B. DOP-PCR-Fragmente) hergestellt, können die Sonden reamplifiziert
werden. Typischerweise werden die Sonden (deren Länge z.B.
vorzugsweise von ungefähr
400 bis ungefähr
1000 Basen reicht) während
des Reamplifizierungsschritts markiert.
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C. Markierung von CSC-Bandenfärbungssonden
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1. Markierungsmethode
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Die
in den CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung verwendeten Chromosomen-spezifischen Sonden werden
mit einer oder einer Kombination von detektierbaren Markierungen
markiert (z.B. kann die Sonde direkt markiert, indirekt markiert
oder beides werden). Methoden zum Einbauen (Inkorporieren) von detektierbaren
Markierungen in Nukleinsäuresonden
sind wohlbekannt. Typischerweise werden detektierbare Markierungen
(z.B. als Hapten- oder Fluorochrom-konjugierte Desoxyribonukleotide)
in eine Polynukleotid-Sonde während
eines Polymerisations- oder Amplifizierungsschritts eingebaut, z.B.
durch PCR, Nick-Translation, Random-Primer-Markierung, Anfügung eines
Schwanzes mittels einer terminalen Transferase und andere (siehe
Ausubel et al., 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene
Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ein bevorzugtes Verfahren
zum Erzeugen der markierten CSC-Bandenfärbungssonden der Erfindung
erfolgt durch mit degenerierten Oligonukleotiden als Primer gestartete
PCR („degenerate
oligonucleotide primed-PCR";
DOP-PCR) in Gegenwart eines markierten dNTP (z.B. Cy3-dUTP). Siehe
Telenius et al., 1992, a.a.O. Gemäß diesem Verfahren wird ein
degenerierter PCR-Primer für
eine im wesentlichen zufallsgesteuerte Amplifizierung von Ziel-DNA
aus einer beliebigen Quelle verwendet. Wie weiter oben angegeben,
werden die detektierbar markierten Chromosomen-spezifischen Sonden der
Erfindung typischerweise durch Reamplifizierung von isolierten Chromosomen-spezifischen
Nukleinsäuren
erzeugt.
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In
einer Ausführungsform
werden die Sonden der Erfindung fluoreszierend markiert. Geeignete
Fluorochrome für
eine Markierung umfassen Fluoresceinisothiocyanat [FITC] (z.B. FITC-dUTP);
Cyanin-Farbstoffe, z.B. Cy3 (z.B. Cy3-dUTP), Cy2, Cy3.5, Cy5, Cy5.5,
Cy7 [Amersham]; Fluorescein, Texas red, Rhodamin, Lissamin, Phycoerythrin,
F1uorX [A mersham], SyBR Green I & II
[Molecular Probes], Spectrum Green (z.B. Spectrum-Green-dUTP), Spectrum
Orange und dergleichen. Beispiele von indirekten Markierungen, die
für die Detektion
verwendet werden können,
umfassen Haptene, wie Biotin (z.B. Biotin-dUTP); Digoxigenin (z.B.
Digoxigenin-dUTP) und Fluoresceinisothiocyanat. Haptene können nach
der Hybridisierung der CSC-Bandenfärbungssonde mit den Zielchromosomen
unter Verwendung eines markierten Anti-Haptens detektiert werden. Es
wird beispielsweise Avidin verwendet, um Biotin-markierte Sonden
zu detektieren (z.B. Avidin-Cy-5 [Amersham], Avidin-FITC, Avidin-C-3); Digoxigenin
wird mit anti-Digoxigenin-Antikörpern
detektiert (z.B. FITC-konjugierter anti-Digoxigenin-Antikörper; Rhodamin-anti-Digoxigenin-Antikörper, unmarkierter
primärer Kaninchen-anti-FITC-Antikörper, der
unter Verwendung eines sekundären
FITC-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpers detektiert wird) und
dergleichen. Für
die Fachleute auf diesem Gebiet werden zahlreiche Markierungssysteme
ersichtlich sein.
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Wenn
eine gegebene Sonde (z.B. eine Chromosomen-spezifische Sonde) mit
mehr als einer Markierung markiert wird, kann dies beispielsweise
durch Amplifizieren der Sonde in Gegenwart von mehr als einem markierten
Nukleotid (z.B. DOP-PCR in Gegenwart von Cy3-dUTP und FITC-dATP)
bewerkstelligt werden. Häufiger
wird jedoch die Markierung bewerkstelligt werden, indem die Chromosomen-spezifische
Sonde in mehrere (z.B. 2) Abschnitte aufgeteilt wird, ein Abschnitt
mit einer Markierung markiert wird (z.B. DOP-PCR in Gegenwart von
Cy3-dUTP), der andere Abschnitt mit einer unterschiedlichen Markierung
markiert wird (z.B. DOP-PCR in Gegenwart von FITC-dATP) und die
beiden Markierungsreaktionsmischungen zusammengegeben werden, um
eine mehrfach markierte Sonde herzustellen.
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2. Kombinatorische Mehrfarb-FISH
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Wie
weiter oben angegeben, umfassen die CSC-Bandenfärbungssonden der Erfindung
eine Mehrzahl von Chromosomen-spezifischen Sonden (z.B. aus nicht-humanen
Chromosomen), die unterschiedlich markiert sind (d.h. wenigstens
zwei der Chromosomen-spezifischen Sonden sind unterschiedlich markiert).
Dies erlaubt die Identifizierung von zahlreichen Chromosomen-Subregionen
in einem einzigen FISH-Experiment. In einer Ausführungsform wird jedes Chromosom
aus einem nicht-humanen Primaten verwendet, um eine einzigartig
markierte Chromosomen-spezifische Sonde herzustellen, wobei jede
Sonde eine unterschiedliche Farbe erzeugt, wenn sie mit den Ziel-Chromosomen
hybridisiert wird (und geeignet behandelt wird, z.B. durch Hinzugeben
eines Avidin-Fluorochrom-Konjugats zu hybridisierten Sonden, die
eine Biotin-Markierung umfassen). Wie weiter oben angegeben und
wie in den Beispielen nachfolgend veranschaulicht wird, wird häufiger weniger
als der vollständige
Satz von Chromosomen aus einer bestimmten nicht-humanen Spezies
verwendet werden und zwei oder mehrere Chromosome können die
gleiche detektierbare Markierung tragen. Zusätzlich zu den in den Beispielen
veranschaulichten Methoden sind im Stand der Technik verschiedene
Ansätze
für ein Mehrfarben-„chromosome
painting" beschrieben
worden und können
für die
Erfindung adaptiert werden, indem den hier bereitgestellten Leitlinien
gefolgt wird. Beispiele einer solchen differenziellen Markierung
(„multicolor
FISH") umfassen
jene, die von Schröck
et al., 1996, Science 273:494-97, und Speicher et al., 1996, Nature
Genet. 12:368-75 beschrieben worden sind). Schröck et al., a.a.O., beschreiben
eine spektrale Bildgebungsmethode, bei welcher Epifluoreszenzfiltersätze und
Computersoftware verwendet werden, um eine Mehrzahl von unterschiedlich
markierten DNA-Sonden, die gleichzeitig mit einem Zielchromosomsatz
hybridisiert worden sind, zu detektieren und zwischen diesen zu
unterscheiden. Speicher et al., a.a.O., beschreiben die Verwendung
von verschiedenen Kombinationen von 5 Fluorochromen, um jedes der
humanen Chromosome (oder Chromosomenarme) in einer 27-Farb-FISH,
welche als „combinatorial
multifluor-FISH" bezeichnet wird)
zu markieren. Es können
auch andere geeignete Methoden verwendet werden (siehe z.B. Ried
et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92).
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Für die Fachleute
auf diesem Gebiet versteht sich, dass die Farbauflösung des
CSC-Bandenfärbungsmusters
teilweise von der Anzahl von Markierungen oder Haptenen, die verwendet
wird, abhängt.
Eine Verwendung von drei Haptenen vereinfacht die Analyse des CSC-Bandenfärbungsmusters,
da die Sonden in einem einfachen rot/grün/blau (RGB)-Format, welches
für die
meisten Fluoreszenzmikroskope und die übliche Bildverarbeitungscomputersoftware
zugänglich
ist, angezeigt werden können
(Nederlof et al., 1990, Cytometry 11:126-31; Ried et al., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92). Dieses Arrangement verringert
jedoch die Möglichkeit
zur Identifizierung von kleinen telomeren Transpositionen aufgrund
von Redundanz bei der Farbzuordnung.
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III. In situ-Hybridisierung
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Eine
Hybridisierung der CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung an Zielchromosomensequenzen (z.B. Metaphasen-Ausbreitungen)
erfolgt durch Standard-in situ-Hybridisierungs (ISH)-Techniken (siehe
z.B. Gall und Pardue, 1981, Meth. Enzym. 21:470-80; Henderson, 1982,
Int. Review of Cytology 76:1-46). Im Allgemeinen umfasst eine in
situ-Hybridisierung die folgenden hauptsächlichen Schritte: (1) Fixierung
der zu analysierenden biologischen Struktur (z.B. eine Metaphasen-Chromosomen-Ausbreitung),
(2) Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen Struktur, um die
Zugänglichkeit
von Ziel-DNA zu erhöhen
(z.B. Denaturierung mit Wärme
oder Alkali), (3) gegebenenfalls Vorhybridisierungsbehandlung, um
eine nicht-spezifische Bindung zu verringern (z.B. durch Blockieren
des Hybridisierungsvermögens
von repetitiven Sequenzen, z.B. unter Verwendung von humaner genomischer
DNA), (4) Hybridisierung der Mischung von Nukleinsäuren mit
den Nukleinsäuren
in der biologischen Struktur oder dem biologischen Gewebe, (5) Nachhybridisierungs-Wäschen, um bei der Hybridisierung
nicht gebundene Nukleinsäurefragmente
zu entfernen, und (6) Detektion der hybridisierten Nukleinsäurefragmente.
Die in jedem dieser Schritte verwendeten Reagenzien und ihre Verwendungsbedingungen
variieren abhängig
von der jeweiligen Situation. Ein beispielhaftes Protokoll für eine Hybridisierung von
CSC-Bandenfärbungssonden
wird in Beispiel III weiter unten bereitgestellt. Hybridisierungsbedingungen werden
ebenfalls im U.S.-Patent Nr. 5,447,841 beschrieben. Es versteht
sich, dass zahlreiche Variationen von in situ-Hybridisierungsprotokollen
und -bedingungen bekannt sind und in Verbindung mit der Erfindung
durch Praktiker, indem den hier bereitgestellten Leitlinien gefolgt
wird, verwendet werden können.
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Herkömmlicherweise
wird eine Hybridisierung von „chromosome
paints" mit Chromosomen
ausgeführt,
indem ein Blockierungsschritt verwendet wird, z.B. eine Vorhybridisierung
mit unmarkierter Kompetitor-DNA (z.B. Cot-1-DNA). Eine Hybridisierung
in Abwesenheit von Kompetitor-DNA,
aber unter Verwendung eines vorab erfolgenden Reassoziierungs- oder Annealingschritts
ist von Wienberg et al., 1997, a.a.O., beschrieben worden. Wenn
diese Methoden verwendet werden, wird bei Son den, die von bestimmten
Chromosomen (z.B. 13 und 21) abgeleitet sind, ein Hintergrund (Kreuzhybridisierung)
beobachtet. Wenn jedoch die CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung verwendet werden, ist kein Cot-1-DNA- oder vorab erfolgender Reassoziierungsschritt
erforderlich und die Kreuzhybridisierung ist für alle Chromosomen minimal.
Ohne sich auf einen bestimmten Mechanismus festlegen zu wollen,
wird angenommen, dass der primäre
Faktor, der zu dem Fehlen von Hintergrund-Kreuzhybridisierung beiträgt, wenn
CSC-Bandenfärbungssonden
aus nicht-humanen Primaten in Abwesenheit von Kompetitor-DNA verwendet
werden, die höhere
evolutionsbedingte Sequenzdivergenz und höhere Variation der Kopienzahlen
und chromosomalen Lagen von repetitiver DNA verglichen mit hochkonservierter
Einzelkopie-DNA unter Tierspezies ist.
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Die
hier offenbarten in situ-Hybridisierungsmethoden der Erfindung zum
Nachweisen von Chromosomenabnormalitäten (z.B. FISH) können an
einem ganzen Spektrum von biologischen oder klinischen Proben, in
Zellen in Mitose und Meiose oder in Interphase-Zellen ausgeführt werden.
Beispiele umfassen alle Arten von Zellkulturen, Lymphozyten des
peripheren Bluts, Bukkalabstriche, Berührungspräparate („touch preparations"), hergestellt aus
unkultivierten primären
Tumoren, Krebszellen, Knochenmark, aus Aspirationsbiopsie erhaltene
Zellen oder Zellen in Körperflüssigkeiten
(z.B. Blut, Harn, Sputum und dergleichen), Zellen aus Amnionflüssigkeit,
Zellen aus mütterlichem
Blut (z.B. fötale
Zellen), Zellen aus Testes und Ovar und dergleichen.
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IV. Detektion und Bildanalyse
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Die
verwendete(n) Detektionsmethode(n) werden von den jeweiligen detektierbaren
Markierungen, die in der CSC-Bandenfärbungssonde verwendet wurden,
abhängen.
Wenn fluoreszierend markierte CSC-Bandenfärbungssonden verwendet werden,
kann eine Fluoreszenzphotomikroskopie verwendet werden, um die Ergebnisse
einer in situ-Hybridisierung unter Verwendung von Routinemethoden,
die in diesem Fachgebiet bekannt sind, zu detektieren und aufzuzeichnen.
Alternativ kann eine digitale (mittels Computer durchgeführte) Fluoreszenzmikroskopie
mit Bildverarbeitungsvermögen
verwendet werden.
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In
einer Ausführungsform
werden Bilder der fluoreszierend markierten Chromosome detektiert
und aufgezeichnet unter Verwendung eines compu tergestützten Bildgebungssystems,
wie des Applied Imaging Corporation CytoVision System (Applied Imaging
Corporation, Santa Clara, CA) mit Modifikationen (z.B. Software,
Chroma 84000 Filtersatz und ein verstärkter Filterrevolver). Andere
geeignete System umfassen ein computergestütztes Bildgebungssystem unter
Verwendung einer gekühlten
CCD-Kamera (Photometrics, NU200-Serie,
ausgerüstet
mit Kodak KAF 1400 CCD), gekoppelt mit einem Zeiss-Axiophot-Mikroskop,
wobei Bilder verarbeitet werden, wie von Ried et al., 1992, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92 beschrieben). Andere geeignete
Bildgebungs- und Analysensysteme werden von Schröck et al., 1996, Science 273:494-97,
und Speicher et al., 1996, Nature Genet. 12:368-75 beschrieben.
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V. Kits
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Die
CSC-Bandenfärbungssonden
der Erfindung werden bequemerweise in Kitform bereitgestellt. In
einer Ausführungsform
umfasst der Kit einen Behälter,
umfassend eines oder mehrere des Folgenden:
- (a)
wenigstens ein Fläschchen
oder wenigstens einen Behälter,
welches bzw. welcher Chromosomen-spezifische Sonden (z.B. „Painting"-Sonden) aus einem
nicht-humanen Tier (z.B. einem nicht-humane Primaten) umfasst, wobei
die Sonden entweder detektierbar markiert oder nicht markiert sein
können;
- (b) wenigstens ein Fläschchen
oder wenigstens einen Behälter,
welches bzw. welcher Chromosomen-spezifische Sonden (z.B. „Painting"-Sonden), die markiert
oder unmarkiert sein können,
aus zwei oder mehreren unterschiedlichen nicht-humanen Tieren (z.B.
zwei oder mehreren unterschiedlichen nicht-humanen Primaten) umfasst;
- (c) wenigstens ein Fläschchen
oder wenigstens einen Behälter,
welches bzw. welcher Chromosomen-spezifische Sonden aus einem oder
mehreren humanen Chromosomen umfasst;
- (d) wenigstens ein Fläschchen
oder wenigstens einen Behälter,
wie in (a)–(c)
weiter oben beschrieben, welches bzw. welcher ferner Formamid umfasst;
- (e) wenigstens ein Fläschchen
oder wenigstens einen Behälter,
wie in (a)–(d)
weiter oben beschrieben, welches bzw. welcher ferner NaCl und/oder
Natriumcitrat umfasst;
- (f) ein separates Fläschchen,
das wenigstens eines der folgenden Reagenzien umfasst: Formamid,
4,6-Diamidino-2-phenylindol (DRPI), einen anti-Hapten-Antikörper (z.B.
anti-FITC-Antikörper),
einen detektierbar markierten sekundären Antikörper gegen das anti-Hapten
(z.B. anti-FITC)-Antikörper, Fluorochrom-konjugiertes
Avidin, ein Fluoreszenz-Antiverblassungsreagens
(z.B. Citifluor oder Vectasheild);
- (g) gedruckte Anweisungen zum Nachweisen einer Chromosomenaberration
in einem humanen Chromosom durch CSC-Bandenfärbung;
- (h) eine Photographie oder eine Zeichnung eines normalen humanen
Karyotyps, welcher mit den in dem Kit bereitgestellten Sonden (oder
deren Äquivalent)
angefärbt
worden ist.
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Für die Fachleute
auf diesem Gebiet versteht sich, dass zahlreiche andere Reagenzien
oder Zusammensetzungen und Kombinationen von Reagenzien oder Zusammensetzungen
in Kitform bereitgestellt werden können.
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VI. BEISPIELE
-
Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen und sie
in keiner Weise beschränken.
-
Beispiel I
-
Metaphase-Ausbreitungen
wurden ausgehend von Lymphozyten des peripheren Bluts und von lymphoblastoiden
Zelllinien hergestellt und Blutproben wurden von einer normalen
humanen männlichen
Person und aus klinischen Fällen,
die Chromosomen-Abnormalitäten
zeigten, erhalten. Eine lymphoblastoide Zelllinie wurde von einem
männlichen
Concolor-Gibbon (Hylobates concolor, 2n=52) erhalten. Ein durchflusszytometrisches
Sortieren von Concolor-Gibbon (HCO)-Chromosomen wurde an einem mit
zwei Lasern ausgestatteten Laser-Zellsorter (FACStar Plus, Becton
Dickinson ImmunoCytometry Systems) ausgeführt. Bivariate (zweidimensionale)
Durchflusszytometrie lieferte 25 Peaks, die durch Vergleich von
deren Hybridisierungsmustern mit Homologien, die durch für humane
Chromosomen spezifische „Paints" auf HCO-Chromosomen
aufgedeckt worden waren, identifiziert wurden. Dies enthüllte, dass
für einzelne
Chromosomen spezifische „Paints" aus 17 Chromosomen
erhalten werden konnten (Tabelle 1). Vier Peaks enthielten zwei
Chromosomen (HCO X + 5, HCO 9 + 11, HCO 12 + 15 und HCO 6 + 7).
Die Chromosomennummerierung folgte jener von Koehler et al., 1995,
Genomics 30:287-92. Dreihundert bis fünfhundert Chromosomen von jedem
Typ wurden durch eine vorab erfolgende Runde von DOP-PCR amplifiziert,
gefolgt von einer sekundären Amplifizierung,
welche markiertes dUTP einbaute, wie in Telenius et al., 1992, Genes,
Chromosomes & Cancer,
4:257-263, beschrieben.
-
Das
Sondenmarkierungsschema zur Erzeugung der fluoreszierenden Sonden,
die in den Mehrfarbexperimenten verwendet wurden, ist in Tabelle
1 weiter unten gezeigt. (Beispiele für alternative Markierungsschemata
sind in den Tabellen 2 und 3 weiter unten gezeigt). In diesem Beispiel
wurden drei Markierungen verwendet, nämlich Cy-3, FITC und Biotin.
Hybridisierung und Detektion erfolgten unter Verwendung einer Modifikation
der von Pinkel et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9138-42
beschriebenen Vorgehensweise. Jedoch wurden alle Hybridisierungen
in Abwesenheit von unmarkierter Kompetitor-DNA (z.B. Cot-1-DNR) ausgeführt. Mehrfarb-in
situ-Hybridisierungsexperimente erforderten 150 ng von jeder DNA-Sonde,
die in Ethanol ausgefällt
und in 15 μl
Hybridisierungspuffer resuspendiert wurden. DNA-Sonden wurden bei
68°C 7 min
denaturiert und man ließ sie
durch Inkubation bei 37°C
für 30
min vorab reassoziieren. Die Chromosomen-Präparationen wurden in 70% Formamid/2XSSC
bei 68°C
1 min denaturiert und über
Nacht mit der DNA-Sondenmischung
bei 37° hybridisiert.
Wäschen
nach der Hybridisierung umfassten 2 × 5 min in 50% Formamid/1 × SSC bei
45°C und
2 × 5
min in 2 × SSC
bei 45°C.
Biotinylierte Proben wurden durch Avidin-Cy5 detektiert. Metaphasen
wurden mit der gekühlten
CCD-Kamera (Photometrics NU2000, ausgestattet mit einem KAF1400-Chip),
welche mit einem Fluoreszenzmikroskop gekopppelt war, analysiert.
Kamerakontrolle und digitale Bilderfassung erfolgten, wie von Ried
et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92, beschrieben. Das
Zusammenfügen
von Chromosomenbildern erfolgte unter Verwendung der Adobe PhotoShop
3.0-Software.
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Wenn
die HCO-Chromosomen-spezifische „Paint"-Mischung mit einer Probe von normalen
humanen Metaphasen hybridisiert wurde, wurde das Chromosomenkomplement
in 80 separat gefärbte
Abschnitte differenziert, die mit früheren Einzelchromosom-„Painting"-Experimenten unter
Verwendung von für
humane Chromosomen spezifischen „Paints" an Gibbon-Chromosomen (Koehler et al.,
1995, a.a.O.) konsistent waren. Die Hybridisierungseffizienz und
-reproduzierbarkeit waren vergleichbar mit jenen der für den Mensch
spezifischen „Paints". Abgesehen von den
humanen Chromosomenregionen 4g27-gter, 22q und dem Y-Chromosom (homolog
zu dem Gibbon- Chromoson
7 und Y, die in der Sondenmischung in diesen Beispiel nicht repräsentiert waren),
wurden humane euchromatische Regionen in ihrer Gänze durch die HCO-Chromosomen-spezifische „Paint"-Mischung in Form
eines „Painting" angefärbt (1).
Die HCO-„Paints" zeigten keine Kreuzhybridisierung
mit heterochromatischen Regionen von unterschiedlichen menschlichen
Chromosomen.
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Mit
Ausnahme der humanen Chromosomen 15, 18, 21, 22 und
dem X wurde jedes humane Chromosom durch mehr als eines und bis
zu sechs unterschiedliche Gibbon-Chromosome in Form eines „Painting" angefärbt. Zusätzlich zeigten
9 humane Chromosomen (1, 3, 7, 9, 10, 11, 14, 17 und 19)
zwei oder mehrere Signale, die sich von einem Gibbon-Chromosom abgeleiteten.
Dies zeigt das Auftreten von sowohl Inversionen wie auch Translokationen
während
der Divergenz der humanen und der Gibbon-Spezies an.
-
TABELLE
1 Markierungsschema
für für Gibbon-Chromosomen
spezifische Sonden
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TABELLE
2 Markierungsschema
für für Gibbon-Chromosomen
spezifische Sonden
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TABELLE
3 Markierungsschema
für für Gibbon-Chromosomen
spezifische Sonden
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Beispiel II
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a) Herstellung und Charakterisierung
von Chromosomen-spezifischen Sonden
-
Unter
Verwendung von FACS und nachfolgender DOP-PCR wurden Chromosomen-spezifische
Sonden aus Hylobates concolor- und H. syndactylus-Chromosomen hergestellt.
Kurz zusammengefasst, wurden Gibbon-Chromosomen unter Verwendung eines durchflusszytometrischen
Sortierungssystems mit zwei Lasern sortiert, wie für andere
Spezies beschrieben (Rabbitts et al., 1995, Nature Genet. 9:369-75;
Ferguson-Smith,
1997, Europ. J. Hum. Genet. 5 253-65). Chromosomen-spezifische Sonden
wurden durch mit degenerierten Oligonukleotiden als Primer gestartete
PCR („degenerate
oligonucleotide primed PCR"; DOP-PCR)
direkt ausgehend von den durch Durchflusszytometrie sortierten Chromosomen
unter Verwendung von PCR-Primern und Amplifizierungsbedingungen,
wie beschrieben (Telenius et al., 1992, Genes, Chromosomes Cancer
4:257-63), erzeugt.
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Um
den Inhalt jedes Peaks in dem Durchflusszytometrie-Karyotyp zu identifizieren,
wurden mit Haptenen markierte Sonden, die von den individuellen
Peaks abgeleitet worden waren, mit den mittels DAPI gefärbten Chromosomen
der speziellen Spezies hybridisiert. 2 zeigt
den Durchflusszytometrie-Karyotyp der beiden Spezies. Viele Peaks
enthielten nur einzelne Chromosomen, jedoch konnte, insbesondere
bei H. syndactylus, eine Anzahl von Chromosomen nicht individuell
aufgelöst
werden, was zu zusammengesetzten Sonden führte. Es wurden die Gibbon-Sonden, die aus der
primären
Reaktion abgeleitet worden waren, und die gleichen Primer verwendet,
um die „chromosome
paints" mit einem
oder mehreren von Biotin-dUTP (Vector Laboratories), FITC-dUTP (Amersham)
und Cy3-dUTP (Amersham), wie in Tabelle 4 gezeigt, in 50 μl-Standard-DOP-PCR-Reaktionen
(Rabbitts et al., a.a.O.) zu markieren.
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TABELLE
4 Fluoreszenzmarkierungsschema
für für Gibbon-Chromosomen
spezifische Sonden (HCO=Hylobates
concolor, HSY=H. syndactylus)
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Die
in situ-Hybridisierung von Sonden mit menschlichen und Gibbon-Chromosomen wurde
ausgeführt,
wie zuvor beschrieben (Rabbitts et al., 1995, a.a.O.). Es war keine
Cot-1-DNA für
eine Suppression notwendig, sowohl für die Hybridisierungen von
Gibbon-Sonden an Gibbon-Chromosomen als auch von Gibbon an humane
Chromosomen. Die mit Biotin markierten „chromosome paints" wurden mit Avidin-Cy-5 (Amersham)
detektiert. Digitale Bilder wurden unter Verwendung einer gekühlten CCD-Kamera
(Photometrics NU200-Serie, ausgerüstet mit Kodak KAF 1400 CCD),
gekoppelt mit einem Zeiss-Axiophot-Mikroskop erhalten. Kamerakontrolle
und Erfassung des digitalen Bilds (8 Bit-Grauskala) setzten einen
Apple Macintosh-Computer ein. Die Bilder wurden verarbeitet, wie
beschrieben (Ried et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92).
Photographien aus den Bildern wurden direkt aus dem Computer aufgenommen.
Für jedes
in Form von „Painting" angefärbte Chromosom
wurden wenigstens zehn Metaphasen ausgewertet, um die mit einer
jeglichen speziellen Sonde hybridisierten Bereiche zu definieren.
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Eine
Hybridisierung von Gibbon-„Painting"-Sonden mit humanen
Chromosomen zeigte, dass mit Ausnahme der humanen Chromosomen 15, 18, 21, 22 und
der Geschlechtschromosomen jedes Chromosom in wenigstens zwei und
bis zu sechs Subregionen differenziert wurde. Einige humane Chromosomen
zeigten nur schlechte subregionale Differenzierung mit Sonden, die
von beiden Spezies abgeleitet worden waren, während andere humane Chromosomen
hochgradig differenziert wurden. Insgesamt konnte der humane Karyotyp in
81 homologe Segmente mit Sonden, die von H. concolor abgeleitet
worden sind, und 74 Segmente mit Sonden, die von H. syndactylus
abgeleitet worden sind, differenziert werden. 3 liefert
eine Zusammenfassung der Ergebnisse in einem Idiogramm von humanen
Chromosomen. Um zwischen identischen und lediglich ähnlichen
Subregionen, die durch Sonden aus unterschiedlichen Gibbon-Spezies
im Rahmen eines „Painting" angefärbt werden,
zu unterscheiden, wurden auch Hybridisierungen zwischen Gibbons
ausgeführt.
Dies zeigte beispielsweise, dass das auf dem humanen Chromosom 19 mit
Sonden, die sowohl von H. concolor als auch H. syndactylus abgeleitet
worden sind, erhaltene Muster identisch war (3), wohingegen
auf dem humanen Chromosom 17 die Hybridisierung zwischen
den beiden Gibbons klar unterschiedliche Umlagerungen anzeigte.
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b) Verwendung von für Gibbon-Chromosomen
spezifischen Sonden, um humane Chromosomen-Aberrationen zu identifizieren
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Für Gibbon-Chromosomen
spezifische „Paints" wurden als diagnostische
Werkzeuge bei verschiedenen Patienten angewendet, um Chromosomenumlagerungen,
einschließlich
Inversionen, Transpositionen und Aneuploidien, zu identifizieren.
Bei einem der Patienten identifizierten H. concolor-„Painting"-Sonden eine Umlagerung
innerhalb des Chromosoms 1 (4). Die
Ergebnisse zeigen eine Transposition von Chromosom 1 p31
p32-Material in die Bande 1 p36.1 an. Bemerkenswerterweise fallen
die Deletionsbruchstellen sowohl in 1 p31 und 1 p32 mit den Grenzen
von H. concolor-Chomosom 5-Material, welches zu dieser Region homolog ist,
zusammen, was auf ähnliche
Bruchstellen sowohl bei der Entwick lung des Gibbon-Chromosoms als
auch bei der humanen Pathologie hinweist.
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c) Verwendung von CSC-Bandenfärbungssonden
für die
Karyotypen-Analyse
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Für Gibbon-Chromosomen
spezifische „Paints" wurden nicht nur
in Einzelhybridisierungsexperimenten, sondern auch in Pools, welche
kombinatorisch markierte Sonden aus individuellen Spezies enthielten,
verwendet. In einem Einzel-Experiment wurde der gesamte humane Karyotyp
in einem Mehrfarb-Format abgrenzend sichtbar gemacht, was zu einem
Bandenfärbungsmuster
(d.h. Kreuz-Spezies-Farb-Bandenfärbung)
führte.
In diesen Experimenten wurden einzelne Gibbon-„Paints" zu drei Sondensätzen (wie in den Tabellen 1–3), die
mit entweder Cy-3-dUTP, FITC-dUTP, Biotin-cUTP (detektiert mit AvidinCy-5)
oder Cy5-dUTP markiert waren und Falschfarben in rot, grün und blau
(RGB) zeigten, gepoolt. Vier Mikroliter (enthaltend ungefähr 300 ng) von
jeder individuellen Gibbon-Sonde wurden gepoolt, mittels Ethanol
präzipitiert
und in 15 μl
50% Formamid, 2 × SSC,
10% Dextransulfat resuspendiert. Die boolesche Kombination von diesen
Sondenpools (Nederlof et al, 1990, Cytometry 11:126-31; Ried et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92) führte zu
einem sieben Farben-CSC-Bandenfärbungsmuster.
Regionen des humanen Karyotyps, mit welchen Chromosonen-spezifische
Sonden, die in nur einem Pool vorhanden waren, hybridisierten, erschienen
entweder rot, grün oder
blau; Regionen, mit welchen Chromosomen-spezifische Sonden aus mehr
als einem Pool hybridisierten, zeigten definierte gemischte Farben
des RGB-Spektrums. Jedes humane Chromosom zeigte ein einzigartiges Bandenfärbungsmuster,
das für
den Sondensatz, welcher von den zwei Gibbon-Spezies abgeleitet worden war,
unterschiedlich war. Das beobachtete CSC-Bandenfärbungsmuster entsprach jenem,
das aufgrund der „Painting"-Daten unter Verwendung
von individuellen Sonden (3) erwartet
worden war.
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5a zeigt
einen humanen Karyotyp, der unter Verwendung von aus H. syndactylus-Chromosomen hergestellten
Sonden gefärbt
worden ist. In diesem Karyotyp wurden keine Chromosomenaberrationen
detektiert. Klinische Fälle,
die mit der CSC-Bandenfärbung
analysiert wurden, sind in 5b und 5c gezeigt. 5b zeigt
eine CSC-Bandenfärbung
mit einem H. syndactylus-Sondensatz, welcher eine Metaphase mit
einer Translokation (t(1;2)(g27;q42.3)) zeigt, und 5c zeigt eine
CSC- Bandenfärbung mit
einem Sondensatz, der von dem H. concolor-Gibbon abgeleitet worden
ist, welche eine Metaphase mit einer perizentrischen Inversion auf
Chromosom 2 (inv(2)(p23g13) zeigt. Eine sogar noch differenziertere
CSC-Bandenfärbung
wurde erzielt, indem Sonden aus den beiden unterschiedlichen Spezies
gemischt wurden (Tabelle 4 und 3). Dies
verbesserte die Auflösung
von Chromosomen-Subregionen über
jene, die bei Verwendung einer einzigen Spezies erzielt wurde, hinaus.
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Beispiel III
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Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung einer H. concolor-CSC-Bandenfärbungssonde
bei der humanen Karyotypisierung. Die CSC-Bandenfärbungssonde wird hergestellt,
wie in Beispiel 1 weiter oben beschrieben und wird gemäß dem Schema
von Tabelle 2 markiert. Die Sonde wird suspendiert, typischerweise zu
einer Konzentration von ungefähr
10–30
Nanogramm pro Mikroliter von jeder Chromosomen-spezifischen Sonde,
in Formamid-Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 10% Dextransulfat,
2 × SSC,
40 mM NaPO4 (pH 7), 1 × Denhardt's Lösung (Ausubel
et al., 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing
and Wiley-Interscience, New York), 120 ng/μl Lachssperma-DNA).
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Metaphase-Präparationen
werden aus einer humanen Lymphozyten-Zellkultur unter Verwendung von Standardmethoden
hergestellt. Die Zellsuspension wird sanft gemischt und ein Tropfen
auf den Objektträger durch
Auftropfen aus ungefähr
einem Zoll oberhalb des Objektträgers
aufgetragen. Ein Tropfen von frisch hergestelltem, bei 4°C befindlichem
Methanol-Eisessig (3:1)-Fixiermittel wird hinzugefügt und man
lässt den
Objektträger
an der Luft trocknen. Nach der Untersuchung der Metaphasen unter
einem Phasenkontrastmikroskop lässt
man die Objektträger über Nacht
bei Raumtemperatur lufttrocknen.
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Die
Objektträger
werden in einem 65°C-Ofen
1 h vor der Hybridisierung inkubiert. Sie werden dann in 100 Ethanol
5 min dehydratisiert und man lässt
sie lufttrocknen. Um die Chromosomen zu denaturieren, werden die
Objektträger
in einem Coplin-Gefäß, welches
Denaturierungslösung
enthält,
bei 65°C
90 s inkubiert. Die Denaturierungslösung wird hergestellt, indem
5 ml 20 × SSC,
10 ml gereinigtes Wasser und 35 ml Formamid gemischt werden und
der pH auf 7,0 eingestellt wird. Die Objektträger werden dann durch Eintauchen
in eiskaltes 70%-iges Ethanol für 2
min gequencht. Die Proben werden in einer Ethanol-Reihe (70, 70,
90, 90, 100 Ethanol, jeweils 2 min) dehydratisiert.
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Um
die CSC-Bandenfärbungssonde
zu denaturieren, wird sie bei 37°C
5 min erwärmt,
durch sanftes Vortexen gemischt und zentrifugiert. 12 μl Sonde werden
in ein 0,5 μl-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und
durch Inkubieren bei 65°C
für 10
min denaturiert. Die denaturierte Sonde wird auf 37°C gebracht
und innerhalb von 2 h verwendet. Die denaturierte Sonde wird auf
die Objektträger
pipettiert und ein 22 mm × 22 mm-Deckgläschen wird
darauf gelegt. Das Deckgläschen
wird unter Verwendung von Kautschukzement versiegelt und der Objektträger wird über Nacht
bei 37–42°C inkubiert.
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Nach
der Hybridisierung und ohne dass man die Objektträger auf
irgendeiner Stufe austrocknen lässt, wird
der Kautschukzement entfernt und die Deckgläschen werden durch Inkubieren
des Objektträgers
in einem Coplin-Gefäß, welches
2 × SSC
enthält,
für 5 min
fortgeschwemmt (20 × SSC
wird hergestellt, indem 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat in
800 ml gereinigtem Wasser gelöst
werden, der pH auf 7,0 eingestellt wird und das Volumen auf 1 l
eingestellt wird). Die Objektträger
werden 2 × 5
min bei 45°C
in 50% Formamid in 1 × SSC, 2 × 5 min
in 2 × SSC
bei der gleichen Temperatur gewaschen und 10 min bei 45°C in 4XT-Lösung (4 × SSC, 0,05% Tween-20) inkubiert.
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200 μl einer 1:200-Verdünnung von
Kaninchen-anti-FITC in 4XT werden auf den Objektträger pipettiert,
mit einem 25 mm × 40
mm-Parafilm-Deckgläschen und
Parafilm bedeckt und in einer befeuchteten Kammer bei 37°C 20–30 min
inkubiert. Nach Waschen für
3 × 5
min in 4XT bei 45°C
werden 200 μl
einer 1:200-Verdünnung
einer 1:100-Verdünnung
von Ziegeanti-Kaninchen-FITC in 4XT hinzugesetzt und der Objektträger wird
in einer befeuchteten Kammer bei 37°C 20–30 min inkubiert und 3 × 5 min
in 4XT bei 45°C
gewaschen. (Beide Immunglobulin-Präparationen sollten bei Raumtemperatur
inkubiert, bei 12000 Upm 10 min zentrifugiert und das Pellet vor
der Verwendung verworfen werden.)
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Die
Objektträger
werden dann in 2 × SSC,
welches 0,1 μg/ml
DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol)
enthält,
wenigstens 2 min inkubiert, abtropfen gelassen, in Eindeckmedium
(wie VectaShield) eingedeckt, trocken getupft und mit Nagellack
versiegelt. Die FISH-Signale werden dann unter Verwendung eines
Applied Imaging Corporation (AIC) CytoVision System (Kat.Nr. CKS1102
oder CUS1402), ergänzt
mit geeigneter Software, einem Chroma 84000 Filtersatz und einem
verstärkten
Filterrevolver (z.B. dem AIC RxFISH CytoVision System) gemäß den Anweisungen
des Herstellers untersucht. Der resultierende Karyotyp wird mit
jenem einer normalen humanen Metaphase, die mit den gleichen Reagenzien
(nicht notwendigerweise gleichzeitig) behandelt worden ist, verglichen
und Chromosomenaberrationen in der untersuchten Metaphase werden
aufgezeichnet.
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Die
Erfindung stellt neue Verfahren und Materialien, welche sich auf
die Karyotypen-Analyse und die Diagnose und Behandlung von Krankheiten
beziehen, bereit. Obwohl spezielle Beispiele bereitgestellt worden sind,
dient die obige Beschreibung der Veranschaulichung und nicht der
Beschränkung.
Den Fachleuten auf diesem Gebiet werden nach der Prüfung dieser
Unterlagen viele Variationen der Erfindung ersichtlich sein. Der Umfang
der Erfindung sollte dementsprechend nicht unter Bezugnahme auf
die obige Beschreibung bestimmt werden, sondern sollte stattdessen
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Ansprüche
bestimmt werden.
