DE69737398T2

DE69737398T2 - Genetische Veränderungen im Zusammenhang mit Prostatakrebs

Info

Publication number: DE69737398T2
Application number: DE69737398T
Authority: DE
Inventors: Ronald H. Livermore JENSEN; Michael L. Huntington Woods CHER
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2017-05-31
Also published as: ATE354672T1; EP0954607B1; US20060147956A1; US7407759B2; EP0954607A4; CA2253562C; EP0954607A1; JP2000511433A; US5925519A; US6451529B1; CA2253562A1; DE69737398D1; US20030040005A1; JP4157164B2; WO1997046702A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Zytogenetik. Sie stellt insbesondere neue diagnostische Nucleinsäuremarker für Prostatakrebs bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die molekulargenetischen Mechanismen, die für die Entwicklung und das Fortschreiten von Prostatakrebs verantwortlich sind, sind großteils unbekannt. Die Identifikation von Stellen einer häufigen und wiederauftretenden Alleldeletion oder -zunahme ist ein erster Schritt hin zur Identifikation einiger der wichtigen Gene, die in den malignen Prozess involviert sind. Bereits an Retinoblastomen (Friend et al., Nature 323, 643-6 (1986)) und anderen Krebsarten (Cawthon et al., Cell 62, 193-201 (1990); Baker et al., Science 244, 217-21 (1989); Shuin et al., Cancer Res. 54, 2832-5 (1994)) durchgeführte Studien haben in umfassendem Ausmaß gezeigt, dass die Definition regionaler chromosomaler Deletionen, die in den Genomen menschlicher Tumoren auftreten, als nützliche diagnostische Marker für Erkrankungen dienen können und einen wichtigen anfänglichen Schritt hin zur Identifikation kritischer Gene darstellen können. Auf ähnliche Art und Weise wurden Regionen häufig auftretender chromosomaler Zunahmen mit der Amplifikation spezifischer Gene assoziiert (Visakorpi et al., Nature Genetics 9, 401-6 (1995)). Zusätzlich dazu kann die Definition des vollen Spektrums häufiger Allelveränderungen bei Prostatakrebs zu der Assoziation spezifischer Veränderungen mit einem klinischen Resultat führen, wie von kürzlich durchgeführten Studien an Kolonkrebs und Wilms-Tumor gezeigt wurde (Jen et al., N. Engl. J. Med. 331, 213-21 (1994); Grundy et al., Cancer Res. 54, 2331-3 (1994)).
Prostatakrebs-Alleltypisierungsstudien (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8751-5 (1990); Kunimi et al., Genomics 11, 530-6 (1991)), die kreiert wurden, um ein oder zwei Loci auf vielen chromosomalen Armen zu untersuchen, haben einen häufigen Verlust der Heterozygotie (LOH) auf Chromosomen 8p (50 %), 10p (55 %), 10q (30 %), 16q (31-60 %) und 18q (17-43 %) gezeigt. Vor kurzem führten mehrere Gruppen detailliertere Deletionskartierungsstudien in einigen dieser Regionen durch.
Auf 8p wurde die hohe Häufigkeit des Allelverlusts bestätigt, und die Regionen der herkömmlichen Deletion wurden eingeengt (Bova et al., Cancer Res. 53, 3869-73 (1993); MacGrogan et al., Genes Chromosom Cancer 10, 151-159 (1994); Bergerheim et al., Genes Chromosom Cancer 3, 215-20 (1991); Chang et al., Am. T. Pathol. 144, 1-6 (1994); Trapman et al., Cancer Res. 54, 6061-4 (1994); Suzuki et al., Genes Chromosom Cancer 13, 168-74 (1995)). Ähnliche Anstrengungen dienten auch dazu, die Region der herkömmlichen Deletion auf dem Chromosom 16q einzuengen (Bergerheim et al., Genes Chromosom Cancer 3, 215-20 (1991); Cher et al., J. Urol. 153, 249-54 (1995)). Andere Prostatakrebs-Alleltypisierungsstudien unter Verwendung einer kleineren Anzahl an polymorphen Markern zeigten keine neuen Gebiete von Interesse (Phillips et al., Br. J. Urol. 73, 390-5 (1994); Sake et al., Cancer Res. 54, 3273-7 (1994); Latil et al., Genes Chromosom Cancer 11, 119-25 (1994); Massenkeil et al., Anticancer Res. 14, 2785-90 (1994)). Im Moment werden alleltypisierende Studien durch die große Anzahl an studierten Loci, die niedrige Anzahl an Fällen, heterogene Patientengruppen, die Verwendung von Tumoren mit geringer oder unklarer Reinheit sowie das Fehlen einer Standardisierung der Experimentverfahren eingeschränkt. Aus diesen Gründen war es schwer, die Häufigkeit von Veränderungen zwischen Studien zu vergleichen, und die Erfinder müssen sich erst einen allgemeinen Überblick über regionale chromosomale Veränderungen verschaffen, die während dieser Erkrankung auftreten.
Die vergleichende Hybridisierung von Genomen (CGH) ist ein relativ neues molekulares Verfahren, das verwendet wird, um DNA von Tumoren auf regionale chromosomale Änderungen zu screenen (Kallioniemi et al., Science 258, 818-21 (1992), und WO 93/18186)). Im Gegensatz zu Mikrosatelliten- oder Southern-Analyse-Alleltypisierungsstudien, die typischerweise viel weniger als 0,1 % des vollständigen Genoms testen, besteht ein signifikanter Vorteil von GCH darin, dass alle Chromosomenarme auf Verluste und Zunahmen gescannt werden. Weiters sind alle Regionen informativ, da CGH nicht auf natürlich vorkommenden Polymorphismen beruht, wohingegen polymorphismusbasierte Verfahren durch homozygote (nicht informative) Allele in einen Teil an Tumoren limitiert sind, die an jedem Locus studiert werden.
CGH kann Einzelkopieverluste und -zunahmen in Prostatakrebs im Vergleich zu den Standardverfahren des Alleltypisierens mit einem hohen Genauigkeitsgrad detektieren und kartieren (Cher et al., Genes Chromosom Cancer 11, 153-162 (1994)). Karyotypkarten mit Kopieanzahl wurden für Prostatakrebs erzeugt und zeigten mehrere, wiederholt veränderte Regionen des Genoms (Cher et al., Genes Chromosom Cancer 11, 153-162 (1994); Visakorpi et al., Cancer Res. 55, 342-347 (1995)).
Joos et al. (Genes, Chromosomes Cancer 14, 267-276 (1995)) verwendeten CGH, um zehn Fälle an Prostatakrebs zu analysieren. Häufige chromosomale Zunahmen, die durch CGH detektiert wurden, umfassten die chromosomalen Arme 7q, 8q, 9q und 16p und die Chromosomen 20 und 22 sowie häufige Verluste von Chromosomenarmen 16q und 18q, und zwar in zumindest drei von zehn Fällen.
Visakorpi et al. (Amer. J. Pathology 145, 624-630 (1994)) studierten 23 Prostatakrebs-Proben und 10 Proben von Fällen mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) mittels In-situ-Fluoreszenzhybridisierung (FISH), und zwar unter Verwendung pericentromerspezifischer wiederholungsspezifischer Sonden für 10 verschiedene Chromosomen. Eine abnormale Kopieanzahl der Chromosomen 8, X und 7 trat am häufigsten auf.
Obwohl vorherige Studien begonnen haben, ein genomumspannendes Bild der chromosomalen Änderungen zu enthüllen, die bei Primär- und wiederauftretendem Prostatakrebs anzutreffen sind, wurde metastatischer Prostatakrebs nicht ausführlich untersucht. Die vorliegende Erfindung nimmt sich dieser und anderer Notwendigkeiten auf dem Gebiet der Erfindung an.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Detektion genetischer Veränderungen bereit, die mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehen. Die Verfahren umfassen das Kontaktieren einer Nucleinsäureprobe eines Patienten mit einer Sonde, die selektiv an eine Ziel-Polynucleotidsequenz bindet, die mit Pros tatakrebs korreliert. Die Erfindung stellt die chromosomalen Regionen bereit, die in Prostatakrebszellen deletiert sind, oder Regionen, die Zunahmen der Kopienanzahl in Prostatakrebszellen aufweisen.
Die Sonden der Erfindung werden mit der Probe unter Bedingungen kontaktiert, unter denen die Sonde selektiv mit der Ziel-Polynucleotidsequenz bindet, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Die Bildung des Hybridisierungskomplexes wird anschließend detektiert.
Alternativ dazu kann eine Proben-DNA des Patienten fluoreszenzmarkiert werden und kompetitiv gegen fluoreszenzmarkierte, normale DNA an normale Lymphozyten-Metaphasen hybridisiert werden. Änderungen der DNA-Kopienanzahl in der Proben-DNA werden anschließend als Zunahmen oder Abnahmen in der Proben-DNA im Vergleich zur normalen DNA detektiert.
Die Chromosomen-Abnormalität besteht typischerweise in einer Deletion oder einer Zunahme der Kopienanzahl. Die Verfahren können verwendet werden, um sowohl metastatische Prostatakrebsarten als auch androgenunabhängige Prostatakrebsarten zu detektieren.
Definitionen
Eine „Nucleinsäureprobe" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf eine Probe, die DNA in einer Form umfasst, die für die Hybridisierung an Sonden der Erfindung geeignet ist. Die Nucleinsäureprobe kann z.B. eine Gewebe- oder eine Zellprobe sein, die für die unten beschriebenen Standard-In-situ-Hybridisierungsverfahren hergestellt wird. Die Probe wird so hergestellt, dass einzelne Chromosomen im Wesentlichen intakt bleiben, und umfasst typischerweise das Ausbreiten der Metaphase oder Interphasen-Nuclei, die gemäß Standardverfahren hergestellt werden.
Die Probe kann auch aus isolierten Nucleinsäuren bestehen, die auf einer festen Oberfläche (z.B. Nitrozellulose) zur Verwendung in Southern- oder Dot-Blot-Hybridi sierungen und dergleichen immobilisiert sind. In einigen Fällen können die Nucleinsäuren unter Verwendung von Standardverfahren, wie z.B. PCR, vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Die Probe wird typischerweise einem Patienten entnommen, bei dem der Verdacht auf Prostatakrebs in Assoziation mit der detektierten Abnormalität besteht.
„Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer, entweder in einzel- oder doppelsträngiger Form, und umfasst, falls nicht auf andere Art und Weise eingeschränkt, bekannte Analoga natürlicher Nucleotide, die auf eine ähnliche Art und Weise wie natürlich vorkommende Nucleotide wirken können.
„Subsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz an Nucleinsäuren, die einen Teil einer längeren Sequenz an Nucleinsäuren umfassen.
Eine „Sonde" oder eine „Nucleinsäure-Sonde" ist laut Definition, wie hierin verwendet, eine Ansammlung aus einem oder mehreren Nucleinsäurefragmenten, deren Hybridisierung an ein Ziel detektiert werden kann. Die Sonde ist, wie unten beschrieben, markiert, so dass ihre Bindung an das Ziel detektiert werden kann. Die Sonde wird aus einer Quelle an Nucleinsäuren aus einem oder mehreren spezifischen (im Vorhinein ausgewählten) Abschnitten des Genoms, z.B. einem oder mehreren Klonen, einem isolierten ganzen Chromosom oder Chromosom-Fragment oder einer Ansammlung an Polymerase-Kettenreaktion-(PCR-)Amplifikationsprodukten, hergestellt. Die Sonden der vorliegenden Erfindung werden aus Nucleinsäuren hergestellt, die, wie zuvor beschrieben, in den Regionen genetischer Veränderungen zu finden sind. Die Sonde kann auf eine gewisse Art und Weise weiterverarbeitet worden sein, z.B. durch Blockieren oder durch die Entfernung sich wiederholender Nucleinsäuren oder durch die Anreicherung an einzigartigen Nucleinsäuren. Daher kann das Wort „Sonde" hierin verwendet werden, um sich nicht nur auf die detektierbaren Nucleinsäuren zu beziehen, sondern auch auf die detektierbaren Nucleinsäuren in der Form, in der sie auf das Ziel aufgebracht werden, z.B. mit den blockierenden Nucleinsäuren etc. Auf die blockierende Nucleinsäure kann auch separat Bezug ge nommen werden. Worauf sich „Sonde" spezifisch bezieht, geht aus dem Kontext hervor, in dem das Wort verwendet wird.
„Hybridisieren" bezieht sich auf die Bindung von zwei einzelstränigigen Nucleinsäuren durch komplementäre Basenpaarung.
„Bindet/binden im Wesentlichen" oder „bindet spezifisch" oder „bindet selektiv" oder „spezifisch hybridisierend an" bezieht sich auf die komplementäre Hybridisierung zwischen einer Sonde und einer Zielsequenz und umfasst geringe Fehlpaarungen, die durch Reduzieren der Stringenz der Hybridisierungsmedien aufgenommen werden können, um die gewünschte Detektion der Ziel-Polynucleotidsequenz zu erreichen. Diese Begriffe beziehen sich auch auf die Bindung, Duplexierung oder Hybridisierung eines Moleküls an nur eine bestimmte Nucleotidsequenz, und zwar unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch aus (z. B. vollständiger zellulärer) DNA oder RNA vorhanden ist. Der Ausdruck „stringente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde an ihre Ziel-Subsequenz, jedoch nicht an andere Sequenzen hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und ändern sich den Umständen entsprechend. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen mit einer Temperatur von etwa 5 °C unter dem Wert des thermischen Schmelzpunkts (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer/einem definierten Ionenstärke und pH ausgewählt. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter/m Ionenstärke, pH und Nucleinsäurekonzentration), bei der 50 % der Sonden, die komplementär zu der Zielsequenz sind, im Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration zumindest bei etwa 0,02 Na-Ionenkonzentration (oder anderen Salzen) mit einem pH von 7,0 bis 8,3 liegt und die Temperatur zumindest bei etwa 60 °C liegt. Stringente Bedingungen können auch mit der Hinzufügung von destabilisierenden Mitteln, wie z.B. Formamid, erreicht werden.
Ein Fachmann erkennt, dass die genaue Sequenz der hierin beschriebenen spezifischen Proben in einem gewissen Ausmaß modifiziert werden kann, um Sonden zu erzeugen, die „im Wesentlichen identisch" mit den offenbarten Sonden sind, jedoch die Fähigkeit beibehalten, im Wesentlichen an die Zielsequenzen zu binden. Solche Modifikationen werden spezifisch durch Verweis auf die einzelnen Sonden hierin abgedeckt. Der Begriff „wesentliche Identität" von Polynucleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95 %, im Vergleich zu einer Referenzsequenz aufweist, und zwar unter Verwendung von unten beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Standardparametern.
Zwei Nucleinsäuresequenzen werden als „identisch" bezeichnet, wenn die Nucleotidsequenz in den beiden Sequenzen dieselbe ist, wenn sie, wie unten beschrieben, für die maximale Übereinstimmung angeordnet ist. Der Begriff „komplementär zu" wird hierin verwendet, um auszudrücken, dass die komplementäre Sequenz identisch mit der ganzen oder einem Teil einer Referenz-Polynucleotidsequenz ist.
Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynucleotiden werden typischerweise durch Vergleichen von Sequenzen der zwei Sequenzen über ein „Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Regionen mit Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf ein Segment mit zumindest etwa 20 zusammenhängenden Positionen, normalerweise etwa 50 bis etwa 200, noch häufiger etwa 100 bis etwa 150, in denen eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit derselben Anzahl an zusammenhängenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die beiden Sequenzen optimal angeordnet wurden.
Die optimale Anordnung von Sequenzen zum Vergleich kann durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), durch den Homologie-Anordnungs-Algorithmus von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), durch die Suche entsprechend der Ähnlichkeitsmethode von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 2444 (1988), durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen durchgeführt werden.
Der „Prozentsatz der Sequenzidentität" wird durch Vergleichen von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei der Abschnitt der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h., Lücken) im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für die optimale Anordnung der zwei Sequenzen aufweisen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmen der Anzahl der Positionen, an denen die identische Nucleinsäure-Base oder der Aminosäure-Rest in beiden Sequenzen auftritt, berechnet, um die Anzahl der übereinstimmenden Positionen zu ergeben, wobei die Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl der Positionen im Vergleichsfenster dividiert wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu ergeben.
Ein anderer Hinweis, dass die Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen an dieselbe Sequenz hybridisieren. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich je nach den Umständen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen mit einer Temperatur von etwa 5 °C unter dem Wert des thermischen Schmelzpunkts (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer/einem definierten Ionenstärke und pH ausgewählt. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter/m Ionenstärke und pH), bei der 50 % der Zielsequenz an eine perfekt übereingestimmte Sonde hybridisiert. Typischerweise sind stringente Bedingungen jene, wie sie oben beschrieben sind.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt ein Diagramm dar, das die Einstellung des t-Schwellenwerts zeigt, basierend auf Kontroll-, Normal-/Normal-Hybridisierungen. Für 5 Kontrollhybridisierungen, jede mit 1247 t-Werten, die sich entlang des Genoms von 1pter bis Yqter erstrecken (eine Gesamtsumme von 6235 t-Werten), gibt die y-Achse den Prozentsatz der t- Werte mit absolutem Wert an, der größer ist als der angegebene Schwellenwert auf der x-Achse.
2 zeigt ein Balkendiagramm, das den Prozentsatz des Genoms mit Änderungen angibt. Der Prozentsatz des gewonnenen (schraffiert) und des verlorenen Genoms (einheitlich) ist für jede Tumorprobe angegeben.
3 zeigt ein Diagramm, das einen Vergleich von zwei CGH-Analysen auf einer einzigen DNA-Probe darstellt. Eine Tumor-DNA-Probe wurde mittels CGH-Analyse zwei Mal blind analysiert. Das gesamte CGH-Verfahren, unter anderem das Markieren, Hybridisieren und das Analysieren, wurde für jede Probe unabhängig durchgeführt. Jede Linie zeigt t-Werte für die 55 Datenkanäle von Chromosom 10 für einen einfachen Durchlauf. Der Schwellenwert von 1,6 wird durch strichlierte Linien angezeigt. Die x-Achse zeigt die Datenkanalanzahl (aus insgesamt 1247), und die dicke Linie stellt die Region des Centromers dar.
4 ist ein Ideogramm, das die Korrelation von CGH- und Alleltypisierungs-Daten darstellt. Die Daten aus zwei repräsentativen Tumoren (Nr. 50 und Nr. 344) werden dargestellt. Es wurde die Mikrosatelliten- und Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-Analyse an 9 separaten Loci auf dem Chromosom 13q verwendet. Die kartierten Orte jedes Polymorphismus (aufgelistet mittels D13S-Nr.) werden durch die strichlierten Linien, die zu dem Ideogramm führen, angezeigt. Die CGH-Interpretation für jeden Tumor wird durch den schraffierten Balken angezeigt, der die Länge und die Position der Verluste in jedem Tumor im Vergleich zum Ideogramm angibt. Alleltypisierungs-Resultate werden wie folgt dargestellt: leere Kreise = erhalten; ausgemalte Kreise = verloren; U = nicht informativ. Die berechneten t-Statistiken werden als kontinuierliche Linien für beide Tumoren dargestellt. Die x-Achse wird bei t = –1,6 gezogen, und die vertikalen Linien, welche die Linien mit dem Ideogramm verbinden, geben die Termini der Chromosom-13q-Verluste an, die in diesen beiden Tumoren zu finden sind.
5 zeigt die relativen Häufigkeits-Histogramme genetischer Veränderungen in der DNA aus den Proben aus Gruppe I. Die relative Häufigkeit der Zunahmen und der Verluste wird als regionspezifisches Histogramm entlang jedes Chromosomenarms dargestellt. Die y-Achse zeigt den Anteil der Proben (der 20 analysierten Metastasen) mit t > 1,6 über der zentralen Achse und mit t < –1,6 unter der zentralen Achse. Centromere und heterochromatische Regionen wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Die Histogramme werden Ideogrammen eines jeden Chromosoms zugeordnet, basierend auf den Datenkanälen, welche die geeigneten Daten enthalten, die entlang der Länge eines jeden Chromosoms verteilt sind. Die Chromosomen-Identifikationszahlen scheinen im linken oberen Teil eines jeden Felds auf.
6 zeigt Häufigkeits-Histogramme chromosomaler Veränderungen in den Proben aus Gruppe II. Beispiele für Häufigkeits-Histogramme der beiden Chromosomen, die in den Proben aus Gruppe II am häufigsten abgeändert waren, werden zum Vergleich zu Gruppe I gezeigt (siehe 5). Die Häufigkeit der Zunahmen und der Verluste wird wie in 5 beschrieben dargestellt.
Die 7A und 7B zeigen Balkendiagramme, die einen Vergleich der Häufigkeit von Veränderungen der am häufigsten veränderten Regionen für die gesamte Reihe (leere Balken); für Proben der Gruppe I (ausgefüllte Balken) und für Proben der Gruppe II (schraffierte Balken) darstellen. 7A) Zunahmen. 7B) Verluste.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung basiert auf einer umfassenden molekularen zytogenetischen Analyse der Genome von Prostatakrebszellen, und zwar unter Verwendung der vergleichenden Hybridisierung von Genomen (CGH). Insbesondere wird ein neues quantitatives Statistikverfahren der CGH bereitgestellt, um mehrere neue Regionen mit häufiger Deletion oder Zunahme der DNA-Kopienanzahlen bei Prostatakrebs zu identifizieren. Die hierin bereitgestellten Resultate helfen auch bei der Klarstellung der relativen Bedeutung einiger anderer Regionen mit Verlust oder Zunahme, über die bereits zuvor berichtet wurde. Die modifizierte Funktion von Genen, die in den am häufigsten veränderten Regionen enthalten sind, kann großteils für das maligne Verhalten von Prostatakrebs verantwortlich sein.
Genetische Veränderungen, die mit Prostatakrebs assoziiert sind
Genomische Regionen, von denen herausgefunden wurde, dass sie Stellen mit erhöhter DNA-Kopienanzahl in einem großen Anteil der Zelllinien sind, enthalten wahrscheinlich Onkogene, die in erhöhter Kopienanzahl vorhanden und daher überexprimiert werden. Eine Überexpression dieser Gene kann zu unkontrolliertem Wachstum führen. Regionen, die häufig eine verringerte Anzahl an DNA-Kopien aufzeigen, können Tumorsuppressor-Gene enthalten, die durch die Mutation eines Allels und die Deletion des anderen zu einem Verlust von Wachstums- oder Anordnungssteuerung führen (Weinberg, Science 254, 1138-1146 (1992)). Natürlich können einige der Abnormitäten der DNA-Kopienanzahl als sekundäre Konsequenzen der allgemeinen genomischen Instabilität auftreten, die auf die frühen Stadien der Tumorgenese zurückzuführen ist. Solche Veränderungen treten den Erwartungen nach zufällig auf und werden daher wahrscheinlich nicht in einem hohen Prozentsatz an Tumoren und Zelllinien anzutreffen sein.
In den unten stehend beschriebenen Beispielen werden Tumoren aus einer Reihe an 31 fortgeschrittenen Fällen von Prostatakrebs verwendet, um genetische Veränderungen zu definieren, die sowohl in die Initiierung als auch in die Progression von Prostatakrebs involviert sind. Die CGH-Analyse wurde auch mit einer parallel durchgeführten Southern- und Mikrosatelliten-Analyse eines Allelungleichgewichts auf derselben DNA bestätigt. Die gute Übereinstimmung zwischen diesen beiden analytischen Verfahren erbringt die Versicherung, dass die neue, standardisierte CGH-Analyse hohe Empfindlichkeit und Spezifität aufweist.
In den unten beschriebenen Beispielen wurden mehrfache CGH-Analysen für jedes Chromosom in jedem Tumor erhalten, und ein Punkt-für-Punkt-Vergleich des mittleren Tumor/Normal-Farbverhältnisses zu einem Kontroll-Normal/Normal-Farbverhältnis in jedem der 1247 gleichmäßig verteilten Datenkanäle, umfassend das gesamte menschliche Genom, wurde als Verlust, Zunahme oder als keine Veränderung der Anzahl der Kopien im Tumorgenom interpretiert.
Das Gewebe der Gruppe I wurde aus Prostatakrebs-Metastasen von 20 Patienten erhalten, von denen 19 zuvor keine Prostatakrebsbehandlung erhalten hatten. Diese Proben, die hochgradig angereicherte Tumor-DNA enthielten, zeigten die hohen Veränderungsraten in mehreren chromosomalen Regionen, deren häufige Veränderung bei Prostatakrebs bekannt ist: 8q Zunahme (85 %), 8p Verlust (80 %), 13q Verlust (75 %), 16q Verlust (55 %), 17p Verlust (50 %) und 10q Verlust (50 %).
Das Gewebe der Gruppe II wurde von 11 Patienten erhalten, die mit Langzeit-Androgendeprivationstherapie behandelt wurden und eine androgenunabhängige metastatische Erkrankung entwickelten. Eine quantitative CGH-Analyse der DNA aus diesen Geweben zeigte chromosomale Veränderungen, die den in Gruppe I gefundenen sehr ähnlich waren, was darauf hindeutet, dass unbehandelte metastatische Tumoren den Großteil der chromosomalen Veränderungen enthalten, die für das Wiederauftreten während der Androgendeprivation erforderlich sind.
In der gesamten Datengruppe wurde eine Reihe zuvor undetektierter Regionen mit häufigem/häufiger Verlust oder Zunahme identifiziert, umfassend Verluste der Chromosomen 2q (42 %), 5q (39 %), 6q (39 %) und 15q (39 %) sowie Zunahmen der Chromosomen 11p (52 %), 1q (52 %), 3q (52 %) und 2p (45 %).
Eine Zusammenfassung dieser Resultate ist in 7 bereitgestellt. Wie hierin verwendet, besteht eine „Region" aus zumindest 5 zusammenhängenden Kanälen. Eine besondere Abnormalität wird als „häufig" auftretend bezeichnet, wenn sie in mehr als 20 % der getesteten Tumoren auftritt.
Verlustregionen
Von diesen Regionen wird vermutet, dass sie zumindest ein rezessives Onkogen in sich tragen; tatsächlich enthalten viele der am häufigsten verlorenen Regionen be kannte oder Kandidaten-Tumorsuppressorgene. Das meiststudierte Tumorsuppressorgen, p53, befindet sich z.B. auf 17p, und es wurde zuvor eine Mutation davon in 20-25 % der Fälle an metastatischem Prostatakrebs gezeigt (Bookstein et al., Cancer Res. 53, 3369-73 (1993)). Es wurde weiters berichtet, dass es in 8/16 (50 %) der Prostatakrebs-Knochenmarksmetastasen mutiert war (Aprikian et al., J. Urol. 151, 1276-80 (1994)), und es wurde gezeigt, dass es in vitro das Wachstum von Prostatakrebszelllinien unterdrückte (Isaacs et al., Cancer Res. 51, 4716-20 (1991)). Der Verlust von 17p wurde in 50 % der Gruppe-I-Tumoren entdeckt im Vergleich zu 65 % der Gruppe-II-Tumoren. Die Gesamtheit dieser Daten unterstützt die Ansicht, dass der Verlust der normalen p53-Funktion mit der Prostata-Tumorprogression assoziiert ist, und es scheint eine Änderung zu sein, die am häufigsten in den späten Stadien der Erkrankung auftritt.
Das Chromosom 10q22.1-qter enthält das Kandidaten-Tumorsuppressorgen Mxi1, von dem zuvor eine Mutation in vier Fällen von Prostatakrebs berichtet wurde (Eagle et al., Nature Genetics 9, 249-255 (1995)). Da das Mxi1-Protein in Verdacht steht, die c-Myc-Aktivität zu unterdrücken (Zervos et al., Cell 72, 223-32 (1993)), kann der Verlust der Mxi1-Aktivität zu der Aktivierung von c-Myc führen. Zusammen mit einer potentiell erhöhten Kopienanzahl des Chromosoms 8q (unten stehend beschrieben) kann eine erhöhte c-Myc-Aktivität Prostatakrebsarten gemein sein.
Das Chromosom 5q enthält das α-Catenin-Gen (5q31) (Furukawa et al., Cytogen Cell Geriet. 65, 74-8 (1994)), das ein notwendiger Bestandteil des E-cadherinvermittelten Zelladhäsionskomplexes ist. Es wurde zuvor bereits gezeigt, dass fünf der sechs menschlichen Prostatakrebszelllinien reduzierte oder fehlende Mengen an α-Catenin oder E-Cadherin im Vergleich zu den normalen Prostataepithelzellen aufwiesen (Morton et al., Cancer Res. 53, 3585-90 (1993)).
Zwei andere, häufig verlorene Regionen, die bekannte Kandidaten-Tumorsuppressorgene enthalten, sind das Chromosom 13q (enthält Rb1) und 16q (enthält E-Cadherin). Interessanterweise deutet eine genaue Analyse der Verlustmuster auf diesen chromosomalen Armen darauf hin, dass mehr als ein wichtiges Prostatakrebs-Tumorsuppressorgen auf 13q und 16q lokalisiert sein kann. Obwohl die Häufigkeit des Verlusts bei allen 31 studierten Tumoren von 40 % auf 60 % über 13q14, wo sich Rb1 befindet, ansteigt, scheint der Peak-Wert genau distal von 13q14 angeordnet zu sein und wird nahe 60 % über 13q21.1-q31 gehalten (siehe 5 und 6). Während vorhergehende Studien gezeigt haben, dass der Verlust der Rb1-Expression (Bookstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7762-6 (1990)) und der Allelverlust dieses Gens (Brooks et al., Prostate 26, 35-9 (1995)) tatsächlich in Prostatatumoren auftreten, erhöhen die CGH-Resultate die Möglichkeit der Existenz eines zweiten wichtigen Prostatakrebs-Tumorsuppressorgens auf dem Chromosom 13q distal zu Rb1. Auf ähnliche Art und Weise gibt es, während eine verringerte E-Cadherin-Expression mit einer schlechten Prognose bei Prostatakrebs assoziiert ist (Umbas et al., Cancer Res. 54, 3929-33 (1994); Umbas et al., Cancer Res. 52, 5104-9 (1992)) und 30 % der insgesamt 31 Tumoren in dieser Studie einen Verlust in dieser Region aufweisen, eine separate Region mit 40 % Verlust auf 16q24, welche die Bedeutung der Stelle eines anderen wichtigen Prostatakrebs-Tumorsuppressorgens besitzen kann. Diese regionale Kartierung steht in Einklang mit einer zuvor durchgeführten Cosmid-Deletionskartierungsstudie auf 16q (Cher et al., J. Urol. 153, 249-54 (1995)).
Die anderen Regionen mit häufigem Verlust besitzen keine Gene, die zuvor als Kandidaten-Tumorsuppressorgene identifiziert wurden. Die Tatsache, dass diese Regionen jedoch in fortgeschrittenen Tumoren in hoher Häufigkeit verloren werden, deutet darauf hin, dass die Detektion dieser Regionen in diagnostischen und prognostischen Anwendungen von Nutzen ist. Der Beweis deutet auch stark darauf hin, dass Gene, die für die Progression dieser Krankheit von Bedeutung sind, an diesen Stellen anzutreffen sein können. Insbesondere gibt es ein großes Interesse an dem häufigen Verlust des Chromosoms 8p, und eine Reihe an Forschungsgruppen untersuchen diese Region auf die Gegenwart eines wichtigen Tumorsuppressorgens (Bova et al., Cancer Res. 53, 3869-73 (1993); MacGrogan et al., Genes Chromosom Cancer 10, 151-159 (1994); Chang et al., Am. T. Pathol. 144, 1-6 (1994); Trapman et al., Cancer Res. 54, 6061-4 (1994); Cher et al., Genes Chromosom Cancer 11, 153-162 (1994); Matsuyama et al., Oncogene 9, 3071-3076 (1994)). Die Regionen 2q, 6q, 10p und 15q fallen auch in diese Kategorie. Diese Regionen sind daher als genetische Marker von Nutzen und sollten ausführlicher auf Tumorsuppressorgene analysiert werden.
Zunahmeregionen
In diesen Regionen wird mit dem Auffinden dominanter Onkogene gerechnet, die eine erhöhte Expression mit einer erhöhten Anzahl an Kopien aufzeigen. Das beachtenswerteste dieser ist das Chromosom 8q, in dem sich das c-Myc-Onkogen befindet. Es wurde bereits zuvor gezeigt, dass eine Amplifikation dieser Region mit einer nachteiligen Prognose bezüglich Prostatakrebs korrelierte (Van Den Berg et al., Clin. Ca. Res. 1, 11-18 (1993)). Die Häufigkeit der Zunahme von 8q, die durch CGH detektiert wurde, ist um vieles höher als zuvor in kleineren Reihen berichtet wurde (Bova et al., Cancer Res. 53, 3869-73 (1993); Van Den Berg et al., Clin. Ca. Res. 1, 11-18 (1993)) und kann die bessere Fähigkeit, die Zunahme unter Verwendung der CGH zu detektieren, widerspiegeln.
Das Chromosom 11p zeigt Zunahmen in 52 % der Proben in den unten angeführten Daten, und das starke Onkogen H-Ras befindet sich auf 11p15.5. Während diese Region nicht als die am häufigsten anzutreffende Region der Zunahme (11p13-p15.3) identifiziert ist, ist die CGH in der Nähe von Telomeren aufgrund der Fluoreszenzintensitätsverluste an den Termini unzuverlässig. Es kann daher sein, dass dieses Onkogen in einer Region inkludiert ist, die bei fortgeschrittenem Prostatakrebs häufig dazugewonnen wird. Es wurde beachtenswerterweise bestimmt, dass 40 % (8/20) der Metastasen Zunahmen an 11p15.5 aufweisen (siehe 5). Während es möglich ist, dass diese Zunahme der Kopienanzahl für die H-Ras-Aktivierung bei Prostatakrebs verantwortlich sein könnte, könnte eine Mutation oder eine Promotorinduktion auch zu der Aktivierung führen, obwohl bereits durchgeführte Studien nur 3 H-Ras-Genmutationen in 94 analysierten Proben gezeigt haben (Isaacs et al., Sem. Oncol. 21, 514-21 (1994)).
Eine andere Region, die ein bekanntes Onkogen enthält, ist das Chromosom 7p, worin sich erbB-1 (= EGFR) befindet. Obwohl gezeigt wurde, dass eine Trisomie im Chromosom 7 mit einem höheren Grad und Stadium an Prostatakrebs assoziiert ist (Bandyk et al., Genes Chromosom Cancer 9, 19-27 (1994); Stephenson et al., Cancer Res. 47, 2504-7 (1987)), wurden keine aussagekräftigen Beweise veröffentlicht, die auf spezifische(s) Gen(e) auf diesem Chromosom hindeuten, die für den Phänotypen von Bedeutung sind.
7 zeigt, dass Chromosom 7q Zunahmen in bis zu 40 % der Proben sowohl der Metastasen als auch der androgenunabhängigen Tumoren aufweist. Es wurde vor kurzem gezeigt, dass das c-met-Onkogen, das an 7q31 kartiert, in den Basalepithelzellen von 36/43 Primärprostatakrebs-Proben, 4/4 Lymphknoten-Metastasen und 23/23 Knochenmark-Metastasen exprimiert wird (Pisters et al., Journal of Urology 154, 293-8 (1995)).
7 weist darauf hin, dass die Zunahmen mit einer Häufigkeit von 0,39 in einer Region des Chromosoms 17q auftreten, die BRCA1 umfasst, während Gao et al. vor kurzem eine häufige PCR-basierte LOH auf BRCA1 auf Chromosom 17q bei Prostatakrebs aufzeigten (Gao et al., Cancer Res. 55, 1002-5 (1995)). Wiederum konnten diese Resultate durch somatische Rekombination erklärt werden, gefolgt von Zunahme oder inkorrekter Interpretation von PCR-Allelbanden.
Das Onkogen erbB-2 befindet sich auf 17q12, das in der Nähe der Region mit einer hohen Zunahmehäufigkeit durch CGH zu finden ist. Zuvor haben Kuhn et al. gezeigt, dass bei 18/53 klinisch lokalisierten Prostatakrebsfällen große Mengen dieses Gens ohne Anzeichen eines großen Ausmaßes an Genamplifikation exprimiert wurden (Kuhn et al., Journal of Urology (1993)). Es ist möglich, dass die moderate Zunahme der Kopienanzahl, die in den vorliegenden Analysen sichtbar ist, für eine solche erhöhte Genexpression verantwortlich ist.
Vom Androgen-Rezeptorgen, lokalisiert in Xq12, wurde bereits gezeigt, dass es Zunahmen mit einer relativ großen Häufigkeit (4/9) bei wiederauftretenden Prostatatu moren aufweist (Visakorpi et al., Cancer Res 55, 342-347 (1995)). In einem darauf folgenden Bericht zeigten Visakorpi et al., dass die Amplifikation von Xq12 mit dem Wiederauftreten des Tumors bei Individuen während der Androgendeprivationstherapie assoziiert ist (Visakorpi et al., Nature Genetics 9, 401-6 (1995)). Obwohl diese Region in nur 5/31 (16 %) der gesamten, hier untersuchten Tumorgruppe dazugewonnen wurde, wurde sie in 3/11 (27 %) der androgenunabhängigen Tumoren aus Gruppe II dazugewonnen. Die vorliegenden Studien sind daher allgemein in Einklang mit jenen von Visakorpi et al. und unterstützen ihren Vorschlag, dass Tumorzellen mit Androgen-Rezeptoramplifikation während der Androgendeprivationstherapie ausgewählt werden. Die Amplifikation dieser Region ist jedoch nicht auf jene Tumoren beschränkt, bei denen eine Hormontherapie nicht anschlägt.
Afroamerikaner
Die unten stehend präsentierten Resultate zeigen eine erhöhte Häufigkeit der Zunahme in der Region 4q25-q28 bei Afroamerikanern (p < 0,001). Ein Gen konnte auf 4q lokalisiert werden, das häufiger in seiner Aktivität erhöht ist und ein schnelleres klinisches Fortschreiten von Prostatakrebs bei Afroamerikanern induziert (Pienta et al., Urology 45, 93-101 (1993); Braven et al., Cancer 71, 2369-73 (1993)).
Detektion genetischer Veränderungen
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Resultate kann ein Fachmann Nucleinsäuresonden herstellen, die für bestimmte genomische Regionen mit genetischer Veränderung spezifisch sind, die mit Prostatakrebs assoziiert sind. Die Sonden können in einer Reihe an Nucleinsäure-Hybridisierungstests verwendet werden, um die Gegenwart (insbesondere eine erhöhte Kopienanzahl) oder das Fehlen der Regionen für die frühe Diagnose oder Prognose von Krebs zu detektieren. Wie oben stehend erwähnt, sind die Sonden primär für die Diagnose oder die Prognose von Prostatakrebs von Nutzen. Die Regionen können auch für eine große Anzahl anderer Krebsarten verwendet werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Brust-, Eierstock-, Blasen-, Kopf- und Hals- und Kolonkrebs.
Die genetischen Veränderungen werden durch die Hybridisierung einer Sonde dieser Erfindung an eine Nucleinsäureprobe detektiert, bei der ein Screening nach der Veränderung gewünscht ist. Geeignete Hybridisierungsformate sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Variationen von Southern-Blot-Verfahren, In-situ-Hybridisierung und quantitative Amplifikationsverfahren, wie z.B. quantitative PCR (siehe z.B. Sambrook, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), Kallioniemi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5321-5325 (1992), und Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y. (1990)).
In-situ-Hybridisierung
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin offenbarten Regionen unter Verwendung der In-situ-Hybridisierung identifiziert. Im Allgemeinen umfasst die In-situ-Hybridisierung die folgenden Hauptschritte: (1) Fixierung des Gewebes oder der biologischen Struktur, das/die analysiert werden soll; (2) Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen Struktur, um die Zugänglichkeit der Ziel-DNA zu erhöhen und um die nichtspezifische Bindung zu reduzieren; (3) Hybridisierung des Gemisches an Nucleinsäuren an die Nucleinsäure in der biologischen Struktur oder dem Gewebe; (4) Waschschritte nach der Hybridisierung, um bei der Hybridisierung nicht gebundene Nucleinsäurefragmente zu entfernen; und (5) Detektion der hybridisierten Nucleinsäurefragmente. Das in jedem dieser Schritte verwendete Reagens und ihre Verwendungsbedingungen variieren in Abhängigkeit von der spezifischen Anwendung.
In einigen Anwendungen ist es notwendig, die Hybridisierungsfähigkeit repetitiver Sequenzen zu blockieren. In diesem Fall wird menschliche genomische DNA als Agens verwendet, um diese Hybridisierung zu blockieren. Der bevorzugte Größenbereich liegt zwischen von etwa 200 bp bis etwa 1000 Basen, noch bevorzugter zwischen etwa 400 bis etwa 800 bp für doppelsträngige, nicktranslatierte Nucleinsäuren.
Hybridisierungsprotokolle für die spezifischen, hierin offenbarten Anwendungen werden in Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9138-9142 (1988), und in EPO-Veröffentlichung Nr. 430.402 beschrieben. Geeignete Hybridisierungsprotokolle sind auch in Methods o/in Molecular Biology, Band 33: In Situ Hybridization Protocols, K.H.A. Choo (Hrsg.), Humana Press, Totowa, New Jersey (1994), zu finden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Hybridisierungsprotokoll von Kallioniemi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5321-5325 (1992), verwendet.
Typischerweise ist es wünschenswert, eine Dual-Farb-FISH zu verwenden, in der zwei Sonden verwendet werden, wobei jede mit einem anderen fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Eine Testsonde, die an die Region von Interesse hybridisiert, wird mit einem Farbstoff markiert, und eine Kontrollsonde, die an eine andere Region hybridisiert, wird mit einem zweiten Farbstoff markiert. Eine Nucleinsäure, die an einen stabilen Abschnitt des Chromosoms von Interesse, wie z.B. die Centromer-Region, hybridisiert, ist oftmals besonders nützlich als Kontrollsonde. Auf diese Art und Weise können Unterschiede zwischen der Wirksamkeit der Hybridisierung von Probe zu Probe erklärt werden.
Die FISH-Verfahren zur Detektion chromosomaler Anomalien können auf Nanogramm-Mengen der Nucleinsäuren des Individuums durchgeführt werden. Paraffineingebettete Tumorschnitte können verwendet werden, wie auch frisches oder gefrorenes Material. Da die FISH auf das eingeschränkte Material angewandt werden kann, können auch Berührungspräparate verwendet werden, die aus nicht gezüchteten Primärtumoren hergestellt wurden (siehe z.B. A. Kallioniemi et al., Cytogenet. Cell Genet. 60, 190-193 (1992)). Beispielsweise können kleine Biopsie-Gewebeproben aus Tumoren für Berührungspräparate verwendet werden (siehe z.B. A. Kallioniemi et al., Cytogenet. Cell Genet. 60, 190-193 (1992)). Geringe Anzahlen an Zellen, die durch Aspirationsbiopsie erhalten wurden, oder Zellen in Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Urin, Sputum und dergleichen) können auch analysiert werden.
Southern-Blot-Verfahren
In einem Southern-Blot-Verfahren wird eine genomische oder cDNA (typischerweise fragmentiert und auf einem elektrophoretischen Gel getrennt) an eine Sonde hybridisiert, die für die Zielregion spezifisch ist. Der Vergleich der Intensität des Hybridisierungssignals der Sonde für die Zielregion mit dem Signal einer Sonde, die auf eine Kontrolle (nicht amplifiziert oder deletiert) gerichtet ist, wie z.B. centromere DNA, stellt eine Schätzung der relativen Kopienanzahl der Ziel-Nucleinsäure bereit. Verfahren zum Durchführen von Southern-Hybridisierungen sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe z.B. Sambrook et al., s.o.
Herstellung von Sonden der Erfindung
Es kann eine Reihe an Verfahren verwendet werden, um Sonden zu identifizieren, die spezifisch an die hier identifizierten Regionen hybridisieren. Sonden können z.B. durch die zufällige Auswahl von Klonen aus einer chromosomenspezifischen Bibliothek erzeugt werden und anschließend mittels digitaler Bildgebungsmikroskopie an jedes Chromosom oder jede Region kartiert werden. Dieses Verfahren ist im US-Patent Nr. 5.472.842 beschrieben. Kurz gesagt, wird ein ausgewähltes Chromosom mittels Durchflusszytometrie entsprechend den Standardverfahren isoliert. Das Chromosom wird anschließend mit Restriktionsenzymen verdaut, die geeignet sind, um DNA-Sequenzen von zumindest etwa 20 kb und noch bevorzugter etwa 40kb zu erzeugen. Verfahren zum partiellen Sequenzverdau sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z.B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2. Auflage, Wiley, N.Y. (1988). Die daraus resultierenden Sequenzen werden mit einem Vektor ligiert und in den geeigneten Wirt eingeführt. Geeignete Vektoren, die für diesen Zweck geeignet sind, umfassen Cosmide, künstliche Hefechromosomen (YACs), künstliche Bakterienchromosomen (BACs) und P1-Phagen. Typischerweise werden Cosmid-Bibliotheken hergestellt. Verschiedene Bibliotheken, die gesamte Chromosomen umspannen, sind auch im Handel erhältlich (Clonetech, South San Francisco, CA) oder aber beim Los Alamos National Laboratory.
Ist einmal eine Sondenbibliothek konstruiert, wird eine Teilmenge der Sonden physisch auf dem ausgewählten Chromosom kartiert. FISH und Digitalbildanalyse können verwendet werden, um Klone entlang des gewünschten Chromosoms zu lokalisieren. Kurz gesagt, werden die Klone mittels FISH an Metaphasen-Ausbreitungen von normalen Zellen kartiert, und zwar unter Verwendung von z. B. FITC als Fluorophor. Die Chromosomen können mit einem Färbemittel gegengefärbt werden, welches die DNA unabhängig von der Basenzusammensetzung färbt (z.B. Propidiumiodid), um die Umrisse des Chromosoms zu definieren. Die gefärbten Metaphasen werden in einem Fluoreszenzmikroskop mit einem polychromatischen Strahlteiler dargestellt, um farbabhängige Bildverschiebungen zu vermeiden. Die verschiedenen Farbbilder werden mit einer CCD-Kamera aufgenommen, und die digitalisierten Bilder werden in einem Computer gespeichert. Ein Computerprogramm wird anschließend verwendet, um die Chromosomen-Achse zu berechnen, die beiden (für Einzelkopiesequenzen) FITC-Signale senkrecht auf diese Achse zu projizieren und um die durchschnittliche Bruchlänge von einer definierten Position zu berechnen, typischerweise dem p-Telomer.
Die Genauigkeit der kartierten Positionen der Sonden kann unter Verwendung der Interphasen-Kartierung erhöht werden. Kurz gesagt, wird der Abstand zwischen den beiden Sonden, von denen mittels Interphasen-Kartierung herausgefunden wurde, dass sie sehr eng aneinander liegen, in normalen Interphasen-Nuclei gemessen. Der genomische Abstand zwischen den beiden entspricht der Quadratzahl des physikalischen Abstands (Van den Engh et al., Science 257, 1410 (1992)). Ist die Anordnung unsicher, so werden die Sonden mit verschiedenen Farben markiert, und ihr relativer Abstand zu einer dritten (entfernten) Sonde kann erneut untersucht werden. Trask et al., Am. J. Hum. Genet. 48, 1 (1991).
Typischerweise besteht eine kartierte Bibliothek aus zwischen etwa 20 und etwa 125 Klonen, meist zwischen etwa 30 und etwa 50 Klonen. Idealerweise werden die Klone relativ einheitlich über die Region von Interesse, normalerweise einem ganzen Chromosom, verteilt.
Hier identifizierte Sequenzinformationen der Region ermöglichen das Design hochgradig spezifischer Hybridisierungssonden oder Amplifikationsprimer, die für die Detektion der Zielsequenzen geeignet sind. Dies ist für diagnostische Screening-Systeme sowie für Forschungszwecke von Nutzen. Mittel zur Detektion spezifischer DNA-Sequenzen sind dem Fachmann nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Es können z.B. Oligonucleotidsonden, die komplementär zu einer ausgewählten Subsequenz mit der Region sind, verwendet werden. Alternativ dazu können Sequenzen oder Subsequenzen durch eine Reihe an DNA-Amplifikationsverfahren (z.B. durch Polymerase-Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion, Transkriptionsamplifikation etc.) vor der Detektion unter Verwendung einer Sonde amplifiziert werden. Die Amplifikation der DNA erhöht die Empfindlichkeit des Tests durch die Bereitstellung von mehr Kopien möglicher Ziel-Subsequenzen. Zusätzlich können durch die Verwendung markierter Primer im Amplifikationsprozess die DNA-Sequenzen markiert werden, während sie amplifiziert werden.
Markierungssonden
Verfahren zur Markierung von Nucleinsäuren sind dem Fachmann wohlbekannt. Bevorzugte Markierungen sind jene, die für die Verwendung zur In-situ-Hybridisierung geeignet sind. Die Nucleinsäuresonden können vor der Hybridisierungsreaktion detektierbar markiert werden. Alternativ dazu kann eine detektierbare Markierung verwendet werden, die an das Hybridisierungsprodukt bindet. Solche detektierbaren Markierungen umfassen ein beliebiges Material mit einer detektierbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft und wurden auf dem Gebiet der Immuntests stark weiterentwickelt.
Wie hierin verwendet, ist eine „Markierung" eine beliebige Zusammensetzung, die mittels spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunchemischer oder chemischer Mittel detektierbar ist. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung umfassen radioaktive Markierungen (z.B. ³²P ¹²⁵, ¹⁴C, ³H und ³⁵S), fluoreszierende Farbstoffe (z.B. Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot etc.), elektronendichte Reagenzien (z.B. Gold), Enzyme (wie z.B. häufig in einer ELISA verwendet), colori metrische Markierungen (z.B. kolloidales Gold), magnetische Markierungen (z.B. Dynabeads^TM) und dergleichen. Beispiele von Markierungen, die nicht direkt detektiert werden, sondern die durch die Verwendung von direkt detektierbaren Markierungen detektiert werden, umfassen Biotin und Dioxigenin sowie Haptene und Proteine, für die markierte Antisera oder monoklonale Antikörper erhältlich sind.
Die spezifische Markierung, die verwendet wird, ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, solange sie nicht die In-situ-Hybridisierung des Färbemittels stört. Färbemittel, die jedoch direkt mit fluoreszierenden Markierungen markiert sind (z.B. Fluorescein-12-dUTP, Texas-Rot-5-dUTP etc.), werden für die Chromosomenhybridisierung bevorzugt.
Eine direkt markierte Sonde, wie sie hierin verwendet wird, ist eine Sonde, an die eine detektierbare Markierung angebracht ist. Da die direkte Markierung bereits an die Sonde angebracht ist, sind keine weiteren Schritte erforderlich, um die Sonde mit der detektierbaren Markierung zu assoziieren. Im Gegensatz dazu ist eine indirekt markierbare Sonde eine, die eine Gruppierung trägt, an die schließlich eine detektierbare Markierung gebunden wird, typischerweise, nachdem die Sonde mit der Ziel-Nucleinsäure hybridisiert wird.
Zusätzlich dazu muss die Markierung in einer so geringen Anzahl an Kopien wie möglich detektierbar sein, wodurch die Empfindlichkeit des Tests maximiert wird, und trotzdem muss sie über jeglichen Hintergrundsignalen detektierbar sein. Schließlich muss eine Markierung ausgewählt werden, die ein hochgradig lokalisiertes Signal bereitstellt, wodurch bei der physikalischen Kartierung des Färbemittels gegen das Chromosom ein hohes Ausmaß an räumlicher Auflösung bereitgestellt wird. Besonders bevorzugte fluoreszierende Markierungen umfassen Fluorescein-12-dUTP und Texas-Rot-5-dUTP.
Die Markierungen können mit einer Reihe verschiedener Mittel an die Sonden gekoppelt werden, die dem Fachmann bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuresonden unter Verwendung einer Nick-Translation oder einer Zufalls-Primerextension markiert (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, 237 (1977), oder Sambrook et al.).
Ein Fachmann erkennt, dass die Sonden dieser Erfindung nicht absolut spezifisch für die Region des Genoms sein müssen, auf die abgezielt wird. Die Sonden sollen eher einen „Anfärbungs-Kontrast" erzeugen. „Kontrast" wird durch das Verhältnis der Sondenintensität der Zielregion des Genoms zu der der anderen Abschnitte des Genoms quantifiziert. So kann z.B. eine DNA-Bibliothek, die durch Klonieren eines besonderen Chromosoms (z.B. Chromosom 7) produziert wurde, als Färbemittel verwendet werden, das in der Lage ist, das gesamte Chromosom anzufärben. Die Bibliothek enthält beide Sequenzen, die nur in diesem Chromosom zu finden sind, sowie Sequenzen, die mit anderen Chromosomen geteilt werden. Ungefähr die Hälfte der chromosomalen DNA fällt in jede der Klassen. Falls es möglich wäre, durch die Hybridisierung der gesamten Bibliothek alle der Bindungsstellen auf dem Ziel-Chromosom zu sättigen, so wäre das Ziel-Chromosom zweimal so hell (Kontrastverhältnis von 2) wie die anderen Chromosomen, da es sowohl Signale der spezifischen als auch der geteilten Sequenzen im Stamm enthalten würde, wogegen die anderen Chromosomen nur durch die geteilten Sequenzen angefärbt würden. Daher würde nur eine bescheidene Verringerung der Hybridisierung der geteilten Sequenzen in dem Stamm zu einer wesentlichen Verstärkung des Kontrasts führen. Daher können kontaminierende Sequenzen, die nur an Sequenzen hybridisieren, auf die nicht abgezielt wird, z.B. Unreinheiten in einer Bibliothek, in dem Stamm in einem Ausmaß toleriert werden, in dem die Sequenzen den Anfärbungskontrast nicht unter nützliche Mengen reduzieren.
BEISPIELE
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Metastatisches oder Primärtumorgewebe wurde von zwei Patientengruppen mit metastatischem Prostatakrebs erhalten (siehe Tabelle 1). Gruppe I bestand aus 20 Patienten, die zuvor keiner Langzeit-Androgendeprivationstherapie oder anderen The rapien ausgesetzt waren. Gruppe II bestand aus 11 Patienten mit einer klinischen Krankheitsprogression trotz Langzeit-Androgendeprivationstherapie (androgenunabhängige Erkrankung).
Gruppe I: Gewebe von Metastasen. Von achtzehn dieser zwanzig Patienten wurde anfangs angenommen, dass sie unter Tumoren litten, die auf die Prostata begrenzt wären, es wurde jedoch später herausgefunden, dass sie zum Zeitpunkt der Durchführung einer Becken-Lymphadenektomie unter lymphatischen Becken-Metastasen litten. Teile des metastatischen Krebsgewebes, die bei der Lymphadenektomie erhalten wurden, wurden für diese Studie verwendet. Keiner dieser achtzehn Patienten hatte sich vor dieser Operation einer Androgendeprivationstherapie, einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie unterzogen. Die verbleibenden zwei Proben wurden von Patienten mit bis zum Knochen metastatisierendem Prostatakrebs erhalten. Einer dieser Patienten (Nr. 375) unterzog sich einen Monat vor der Knochenbiopsie einer Androgendeprivationstherapie. Der andere Patient (Nr. 391) erhielt vor der Knochenbiopsie keine Therapie.
Bei Untersuchung dieser 20 Patienten zusammen lag das Durchschnittsalter zum Zeitpunkt der Gewebeprobenentnahme bei 61 Jahren, mit einem Bereich von 44-72 Jahren. Fünf der Männer sind afroamerikanischer Herkunft, die anderen 15 sind weiß, wobei keine weiteren ethnischen Daten erhältlich sind. Für die 20 Männer lag der mittlere Serum-PSA (Hybritech) einen Tag bis 20 Wochen vor der Becken-Lymphknotendissektion oder der Knochenbiopsie bei 61 ng/ml, mit einem Bereich von 3,3-250 ng/ml. Der mittlere Prostatabiopsie-Gleason-Score (D.F. Gleason, Cancer Chemother. Rep. 50, 125-8 (1966)) für die 18 Männer, bei denen Beckenmetastasen festgestellt wurden, lag bei 7, mit einem Bereich von 4-9 (Tabelle 1). Bei 12/20 Patienten gab es eine Familiengeschichte bezüglich Prostatakrebs, die bei allen 12 negativ war.
Eine genaue histologische Kontrolle wurde für alle in dieser Gruppe untersuchten Gewebe unter Verwendung der folgenden Arbeitsvorschrift erreicht. Gewebe, die nicht für die histologische Diagnose benötigt wurden, wurden bei –80 °C innerhalb von 10-30 Minuten nach der operativen Entfernung schockgefroren. Es wurde eine serielle Kryostat-Sektion verwendet, um Abschnitte auf der Probe zu identifizieren, die einen niedrigeren Anteil an Tumorzellen enthielten. Diese Gebiete wurden aus dem Gewebeblock mittels Mikrodissektion alle 300 μM entfernt. Der Bereich des Gewebes, der nach der Mikrodissektion überblieb, variierte von etwa 2 × 5 mm bis 10 × 20 mm. Der geschätzte Tumorzellanteil (Fraktion der Probe, die aus Tumorzellen im Gegensatz zu Lymphozyten oder Stromazellen besteht) wurde mittels visueller Schätzung in 20 zufällig ausgewählten Feldern bestimmt, die bei einer totalen Vergrößerung von 100 × (Olympus Optical Co., Ltd., Japan) untersucht wurden und bei denen für alle histologischen Sektionen, die während der seriellen Sektion produziert wurden, der Durchschnitt ermittelt wurde (Tabelle 1). Die DNA wurde von zwischen 200 und 1000 6-μ-Sektionen pro Fall erhalten. Wenn geschätzt wird, dass eine Tumorzelle in jeder 1000-μ³-Gewebsvolumeneinheit enthalten ist, so bestanden die untersuchten Proben aus DNA, die von zwischen 10⁷ und 10⁹ metastatischen Prostatakrebszellen gepoolt wurde. Die DNA-Reinigung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Bova et al., Cancer Res. 53, 3869-73 (1993)). Aliquote Teile derselben DNA-Proben wurden sowohl für die Alleltypisierung als auch für die CGH verwendet. Sowohl für die Southern- als auch für die Mikrosatelliten-Analyse wurde nichtkanzeröse Vergleichs-DNA aus gepoolten Blutlymphozyten eines jeden Patienten hergestellt.
Gruppe II: Gewebe von androgenunabhängigen Fällen. Diese Patienten zeigten eine klinische Krankheitsprogression trotz einer Langzeit-Androgendeprivationstherapie. Vier Patienten wurden wegen eines lokalen Tumors im fortgeschrittenen Stadium, der die Blasenöffnung verstopfte, einer transurethralen Resektion unterzogen, bei 6 Patienten wurde nach einer radikalen Prostatektomie eine Core-Biopsie des wiederauftretenden Beckentumors durchgeführt, und ein Patient litt unter skrotalen Hautmetastasen. Daher wurde in 4 Fällen eine genetische Analyse des Primärtumors durchgeführt, in 6 Fällen des persistenten oder rekurrenten Primärtumors und in einem Fall des metastatischen Tumors.
Bei Untersuchung dieser 11 Patienten zusammen lag das Durchschnittsalter zum Zeitpunkt der Gewebeprobenentnahme bei 72 Jahren, mit einem Bereich von 43-96 Jahren. Alle dieser 11 Patienten sind weiß, wobei keine ausführlicheren ethnischen Daten vorhanden sind. Der mittlere Serum-PSA zum Zeitpunkt der Diagnose des metastatischen Postatakrebs lag bei 272 ng/ml, mit einem Bereich von 14,9-1632 ng/ml. Der mittlere Gleason-Score lag bei 7,6 mit einem Bereich von 6-10.
Die histologische Kontrolle war bei diesen Geweben weniger präzise, da die geschätzte Tumorzellenfraktion nicht direkt auf dem Gewebestück bestimmt wurde, aus dem die DNA isoliert wurde. Stattdessen wurde sie anhand einer histologischen Sektion eines nahegelegenen Gewebeteils geschätzt, das während derselben Operation entfernt wurde. Daher ist die in Tabelle 1 aufgelistete, geschätzte Tumorzellenfraktion weniger präzise als für Gruppe I. Die DNA wurde aus frischem Gewebe isoliert, das sofort mittels Proteinase-K-Dissektion und Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion aus dem Operationssaal oder der Klinik bereitgestellt wurde. Es wurde keine serielle Kryostat-Sektion verwendet.
Vergleichende genomische Hybridisierung. Die CGH wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Cher et al., Genes Chromosom Cancer 11, 153-162 (1994)), mit der Modifikation, dass die DNA mittels direkter Inkorporation von fluoreszenzfarbstoffgekoppelten Nucleotiden markiert war. Kurz gesagt, wurde Tumor-DNA (0,5-1 μg) mittels Nick-Translation in Gegenwart von 20 μM dATP, dCTP, dGTP und FITC-12-dUTP (NEN Research Products, Boston, MA) markiert. Normale DNA, aus den Lymphozyten eines Freiwilligen aus dem Labor isoliert, wurde auf identische Art und Weise unter Verwendung von Texas-Rot-5-dUTP (NEN Research Products) markiert. Die Hybridisierung mit 0,2-1,0 μg markierter Tumor- und normaler DNA sowie 10 μg Cot-1-DNA wurde auf Metaphasen-Ausbreitungen von Lymphozyten eines normalen Spenders für eine Zeitspanne von 2-3 Tagen durchgeführt, die Objektträger wurden gewaschen, in Ethanol dehydriert, und die Methaphasen-Ausbreitungen wurden mit 0,1 μM DAPI gegengefärbt.
Fünf bis 10 mikroskopische Fluoreszenz-Metaphasen-Bilder einer jeden Farbe wurden für jede Tumor-/normale Hybridisierung erworben; 4 bis 5 Bilder wurden für eine quantitative Analyse ausgewählt. Für jedes Metaphasenbild wurden, wie zuvor beschrieben, grüne (Tumor) und rote (normal) Fluoreszenz-Intensitätswerte berechnet (Cher et al., Genes Chromosom Cancer 11, 153-162 (1994); Kallioniemi et al., Genes Chromosom Cancer 10, 231-43 (1994)). Die grünen und roten Fluoreszenz-Intensitätswerte entlang eines jeden Chromosoms wurden anschließend den für ihre Position im Genom geeigneten Datenkanälen zugeordnet. Es gab 1247 Datenkanäle, die sich entlang der Länge des Genoms von 1pter bis Yqter erstreckten, wobei die Anzahl der Kanäle für jedes Chromosom einem festgelegten Wert zugeordnet ist, der auf den relativen Längen der Chromosomen basiert (N.E. Morton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7474-6 (1991); Lucas et al., Cytometry 8, 273-9 (1987)). Daher enthielten die Kanäle 1 bis 100 Fluoreszenzintensitäten, die für Chromosom 1 gemessen wurden, Kanäle 101-197 enthielten Fluoreszenzintensitäten für Chromosom 2 etc. Jedes Metaphasenbild ergab im Allgemeinen Intensitätswerte einer jeden Farbe für beide Mitglieder aller Autosomenpaare und einen Intensitätswert jeder Farbe für das Chromosom X und das Chromosom Y. Die Fluoreszenzintensität einer jeden Farbe wurde für eine bestimmte Metaphase normalisiert, und die Verhältnisse von grün/rot wurden für jeden Datenkanal eines jeden Chromosomenbilds berechnet. Die Verhältnis-Verteilungen der Grün-/Rot-Fluoreszenzintensität (Mittelwert und Standard-Abweichung) wurden anschließend für jeden Datenkanal berechnet, wobei dabei die Verhältnisse eines jeden Chromosomenbilds in jeder Metaphase, die analysiert wurde, berücksichtigt wurden. Im Allgemeinen wurden Durchschnittswerte von über 7 Bildern eines jeden Autosoms kombiniert (Bereich 4-10), um eine Profil-Verteilung des Fluoreszenzintensitäts-Verhältnisses entlang des Genoms für jeden Tumor zu erhalten.
Quantitative Analyse mittels CGH. Um die CGH-Daten quantitativ zu analysieren, verglichen die Erfinder Resultate aus Tumor-/normalen Hybridisierungen mit jenen aus normalen/normalen Kontrollen. Daher führten die Erfinder 5 Zweifarben-Hybridisierungen durch, die nur normale DNA involvierten, die sowohl grün als auch rot markiert wurde, um diese als Kontrollen zum Vergleich mit Tumor-/normalen Hybridisierungen zu verwenden. Es wurde eine CGH unter Verwendung derselben Methodik, wie jener, die für Tumor-DNA verwendet wurde, durchgeführt. Für jede dieser Kontrollhybridisierungen wurden 4 Metaphasen-Bilder analysiert, was zu bis zu 8 Bildern für jedes Autosom und 4 Bildern für jedes Geschlechtschromosom führte. Wie erwartet, waren die Grün/Rot-Verhältnisse bei jeder dieser Kontrollhybridisierungen zentral um 1,0 entlang der Länge des Genoms angeordnet. Eine genau Untersuchung der Verhältnisse zeigte jedoch, dass viele genomische Regionen durchwegs Grün/Rot-Verhältnisse aufwiesen, die sich ein bisschen von 1,0 unterschieden. Die Region, die dem Chromosom 1p32-Ipter entsprach, zeigte z.B. ein durchschnittliches Grün/Rot-Verhältnis von 1,07, die Region, die dem Chromosom 19 entsprach, zeigte ein durchschnittliches Verhältnis von 1,08, und die Region, die dem Chromosom 4q entsprach, zeigte ein durchschnittliches Verhältnis von 0,952. Der Grund für diese durchgängigen Abweichungen in den Grün/Rot-Verhältnissen in den Normal-/Normal-Kontrollhybridisierungen war unbekannt. Die Erfinder vermuten, dass die Hybridisierungseigenschaften durch die Inkorporation von konjugiertem Uridin in die Sonden-DNA leicht verändert werden, und diese Hybridisierungsunterschiede werden durch leichte Variationen in bestimmten Regionen der Metaphasen-Chromosome gezeigt, vielleicht aufgrund von Protein/DNA-Wechselwirkungen oder der chromosomalen Struktur. Zusätzlich dazu neigten die Standardabweichungen der Verhältnisse dazu, von Region zu Region zu variieren. Die Standardabweichungen neigten z.B. dazu, in der Nähe der chromosomalen Telomere und Centromere zuzunehmen. An den Centromeren kann dies durch die Tatsache erklärt werden, dass unmarkierte Cot-1-DNA hinzugefügt wurde, um eine nichtspezifische, repetitive DNA-Hybridisierung durch die markierten DNAs zu blockieren, und da große Mengen repetitiver DNA an den Centromeren vorhanden sind, war das Ergebnis eine verringerte Intensität von sowohl grüner als auch roter Fluoreszenz in diesen Regionen. Die verringerte Intensität beider Fluoreszenzfarben führte zu geringerer Präzision der Intensitätsmessungen und Verhältnisberechnungen. An den Telomeren scheint es eine leichte Unsicherheit bezüglich der Definition des exakten Terminus zu geben, wie durch den Bildanalyse-Algorithmus aufgrund der Tatsache bestimmt wurde, dass es einen großen Bereich mit lokalem Hintergrund gibt, der zu einer lokalen Verringerung in der chromosomalen Bildintensität für beide Farben führt. Wie bei den centromeren Regionen führte dies zu einer geringeren Präzision der Intensitätsmessungen an den Telomeren.
Daten von diesen 5 Kontroll-Normal-/Normal-Hybridisierungen, unter denselben experimentellen Bedingungen erhalten wie die Tumor-/Normal-Hybridisierungen, wurden kombiniert, um das Verhalten der Verhältnisse, als keine genetischen Veränderungen vorhanden waren, mit einem Modell nachzustellen. Daher wurde jedem der 1247 Datenkanäle entlang des Genoms in den Kontrollhybridisierungen eine spezifische Verhältnis-Verteilung der Grün/Rot-Fluoreszenzintensität zugeordnet. Die Erfinder verglichen anschließend die Grün/Rot-Verteilungen für jede Tumor-/Normal-Hybridisierung mit jenen des kombinierten Pools an Kontroll-Normal-/Normal-Hybridisierungen. Eine t-Statistik wurde unabhängig für jeden Kanal entlang des Genoms berechnet, um zu testen, ob das durchschnittliche Verhältnis einer Tumor-/Normal-Hybridisierung sich signifikant von dem durchschnittlichen Verhältnis für die Kontroll-Normal-/Normal-Hybridisierungen unterschied. An jedem der 1247 Datenkanäle zeigten größere absolute Werte von t ein höheres statistische Vertrauen, dass tatsächlich eine chromosomale Veränderung vorlag. Positive t-Werte zeigten eine Zunahme an genetischem Material in der Tumor-DNA an, während negative Werte von t einen Verlust an genetischem Material anzeigten. Schließlich wurden centromere und heterochromatische Regionen aus der Interpretation ausgeschlossen, da die Hybridisierung in diesen Regionen ungenau ist (Kallioniemi et al., Genes Chromosom Cancer 10, 231-43 (1994)).
In der quantitativen CGH-Analyse muss ein Schwellen-t-Wert ausgewählt werden, um die t-Statistik zu verwenden, um zu definieren, ob ein Verhältnis an einem beliebigen Punkt entlang des Genoms eine(n) signifikante(n) Zunahme oder Verlust an genetischem Material in einer beliebigen Tumor-DNA-Probe angibt. Der Schwellenwert beeinträchtigt direkt die Empfindlichkeit und die Spezifität der CGH-Analyse und sollte den Zielen der Studie gemäß festgelegt werden. Um diesen Schwellenwert für die Studie der Erfinder festzulegen, berechneten die Erfinder die Statistiken für jede der Normal-/Normal-Kontrollhybridisierungen durch Vergleichen einer jeden mit der vollständigen Gruppe an 5 Kontrollhybridisierungen. Während dieser Analyse fanden die Erfinder heraus, dass eine Glättung der Normal-/Normal-Verhältnisvarianzen durch Ermittlung des Durchschnitts über mehrere zusammenhängende Kanäle vor der Bildung der t-Statistik die Anzahl der falschen „Zunahmen" und „Verluste" in den Kontroll-Hybridisierungen stark reduzierte. Daher passten die Erfinder dieses Verfahren für alle t-statistischen Berechnungen an, und es wurde die Varianz in jedem Datenkanal für die Normal-/Normal-Elemente in der Analyse mit jenen der 5 zusammenhängenden Kanäle auf jeder Seite dieses Kanals gemittelt. Innerhalb von 5 Kanälen der chromosomalen Termini und Centromere wurde die Anzahl der zusammenhängenden Kanäle in dieser Durchschnittsberechnung systematisch verringert, und zwar durch eine Durchschnittsberechnung nur bis zum Terminus oder dem Centromer. Unter Verwendung dieses Verfahrens zur t-statistischen Evaluierung lagen die t-Werte für alle Kontrollhybridisierungen nahe Null, mit sehr wenigen erhöhten positiven oder negativen Werten (1). 99 % der t-Werte für die Kontrollhybridisierungen lagen z.B. zwischen –1,36 und 1,36. Für diese Studie wählten die Erfinder einen Schwellenwert von |t| > 1,6 für die Definition von Verlusten und Zunahmen. Bei einem solchen Ausmaß des Schwellenwerts lagen weniger als 0,3 % (17 von 6235) |t| – Werte aus den 5 Normal-/Normal-Kontrollhybridisierungen über dem Schwellenwert. Basierend auf der in 1 gezeigten Kurve würde eine Herabsetzung des t-Schwellenwerts zu einem rapiden Verlust der Spezifität (Erhöhung falsch-positiver Werte) führen; dieses Ausmaß des Schwellenwerts führte auch zu einer hohen Empfindlichkeit für die Detektion chromosomaler Veränderungen, basierend auf dem hohen Übereinstimmungsausmaß mit den unabhängig durchgeführten Alleltypisierungs-Experimenten (siehe Resultate).
Alleltypisierung. Für die 20 metastatischen Tumoren aus Gruppe I. Es wurde eine Southern-Analyse an 29 Loci auf 19 Chromosomen-Armen sowie eine Mikrosatelliten-Analyse an 24 Loci auf 7 Armen durchgeführt. Zahlreiche der Loci wurden ausgewählt, da sie in Regionen fielen, von denen zuvor bereits herausgefunden wurde, dass die für Prostatakrebs von Relevanz waren. insbesondere testeten die Erfinder multiple Loci auf den folgenden Chromosomen-Armen (Chromosom-Arm/Anzahl der verglichenen Loci): 2q/3; 8p/9; 10q/5; 13q/12; 16q/-5; 18q/3. Zusätzlich dazu wurden 12 andere Chromosomen-Arme mit je einem oder zwei Loci repräsentiert.
Die mittels Southern-Anlayse studierten Loci waren D1S57, D1S74, D2S44, D2S48, D2S50, D2S53, RAF1(3p), D4S125, D6S44, D7S150, KSR (8p), MSR (8p), D8S140, D8S220, D8S194, D8S39, IFNB1 (9p), D10S25, D10S28, D13S1, D13S2, D16S7, CEPT-A/B (16q), TAT (16q), D17S5, D17S34, D17S74, DCC (18q) und DYZ4 (Y). Die Southern-Analyse wurde durchgeführt, wie in Bova et al., Cancer Res. 53. 3869-73 (1993), beschrieben.
Die mittels Mikrosatelliten-Analyse studierten Loci waren D2S123, APC (5q), D8S201, LPL (8q), D8S261, D8S264, D10S190, D10S192, D10S201, D10S217, D13S115, D13S121, D13S134, D13S146, D13S147, D13S152, D13S170, D13S171, D13S175, D13S309, D16S26, D165402, D18S61 und D18S69 (Weissenbach et al., Nature 359, 794-801 (1992)). Die Mikrosatelliten-Analyse wurde durchgeführt, wie in Bova et al., s.o., beschrieben.
Der Allelverlust unter Verwendung der Southern- und der Mikrosatelliten-Analyse wurde definiert als das Fehlen eines Allels in prostatischer Tumor-DNA im Vergleich zu der nichtkanzerogenen, gepaarten Kontroll-DNA wie durch Inspektion der Autoradiographie definiert. In einigen Fällen, als es ein Rest-Signal aus kontaminierendem, normalem Gewebe gab, wurde eine Densitometrie für die Analyse verwendet. Eine Probe wurde als einen Allelverlust aufweisend eingestuft, wenn eine Reduktion von etwa 60 % im verringerten Allel vorhanden war, im Vergleich zu seinem normalisierten, beibehaltenen Gegenstück.
Nur eine Region (Chromosom 8q) zeigte eine Allel-Zunahme mittels Southern-Blotting-Test. Eine Allelzunahme unter Verwendung der Sonde MCT 128,2 (8q) wurde als eine Zunahme der Intensität von mehr als 100 % eines von zwei Allelen definiert, die in Tumorproben vorhanden sind, oder als Intensitätsunterschiede von mehr als 100 % zwischen Tumor- und normalen Allelen in homozygoten Fällen, wenn zuvor durchgeführtes Sondieren derselben Blots eine gleiche Ladung der DNA in Tu mor- und normalen Spuren zeigte. Alleltypisierungs-Messungen wurden durchgeführt und in Bezug auf die CGH-Resultate als Blind-Analyse analysiert.
RESULTATE
Hybridisierungsqualität. Die Erfinder fanden heraus, dass das direkte Markierungsverfahren der Inkorporation von fluoreszenzfarbstoffgekoppelten Nucleotiden in genomische DNA zu einer Hybridisierung mit höherer Qualität führte im Vergleich zu dem älteren Verfahren der Detektion unter Verwendung von fluoreszenzfarbstoffgekoppelten Sekundär-Reagenzien (Cher et al., Genes Chromosom Cancer 11, 153-162 (1994)). Mittels mikroskopischer Fluoreszenz-Untersuchung war diese Zunahme der Qualität in Form von weniger granulierten Bildern mit schärferen Übergängen der Farben an den Termini der Verluste und Zunahmen zu sehen. Zusätzlich waren die Bildanalyse-Spuren der Fluoreszenz-Verhältnisse glatter, so dass bei einer Kombination von Daten multipler Bilder die Standard-Abweichungen der Fluoreszenz-Verhältnisse reduziert wurden.
CGH unter Verwendung des t-Schwellenwerts 1,6. Wie in Materialien und Verfahren beschrieben, wurde eine quantitative CGH unter Verwendung von t-Schwellenwerten von +1,6 für Zunahmen und –1,6 für Verluste auf alle Tumor-DNA-Proben angewandt. Mit diesem analytischen Ansatz zeigten alle Tumoren in beiden Gruppen der Proben einige DNA-Veränderungen (Verluste oder Zunahmen hinsichtlich der durchschnittlichen DNA-Kopienanzahl). Das Verhältnis des Genoms mit entweder Verlusten oder Zunahmen wurde für jeden Tumor berechnet und ist in 2 dargestellt. Es ist klar, dass ein großer Abschnitt des Genoms in den meisten Proben verändert erscheint. Daher führte das hohe Ausmaß der Spezifität, das durch die Verwendung von |t| > 1,6 erhalten wurde, nicht zu einem Opfern der Empfindlichkeit, um Veränderungen zu detektieren. Es ist ebenfalls anzumerken, dass die drei Tumoren mit den am wenigsten veränderten Genomen zu Gruppe II gehören. Dies spiegelt mit großer Wahrscheinlichkeit einen geringeren Tumorzellenanteil in diesen Proben wider, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Die Proben wiesen zahlreiche verschiedene relative Verhältnisse an Zunahmen und Verlusten auf, wobei es kein spezifisches Muster unter den Proben jeder Gruppe gab. Im Allgemeinen handelte es sich um beinahe gleiche Anteile des Genoms, die in Zunahmen und in Verluste involviert waren: bei Gruppe I wurde ein Durchschnitt von 15 % zugenommenem Genom und 14 % verlorenem Genom berechnet; bei Gruppe II wurde ein Durchschnitt von 16 % Zunahme und 11 % Verlust berechnet.
Um die Reproduzierbarkeit dieses neuen CGH-Verfahrens zu testen, wurde eine Tumor-DNA-Probe eingereicht und zwei Mal in einem Blindtest analysiert. Unter Verwendung des t-statistischen Verfahrens wurden Regionen des Verlusts und der Zunahme unabhängig auf diesen zwei Proben bestimmt. Die DNA dieses bestimmten Tumors (Nr. 50) zeigte eine große Anzahl an Veränderungen, wobei 26 % des Genoms eine signifikante Zunahme und 21 % des Genoms einen signifikanten Verlust aufwiesen. Beim Vergleichen der Resultate der beiden unabhängigen Analysen wiesen 89 % der 1247 Datenkanäle identische Positionen für Zunahmen, Verluste oder keinerlei Veränderung auf. Die Hauptunterschiede in diesen beiden Datenreihen befinden sich an den Termini der Veränderungen, wo sich die t-Werte schnell mit der Kanalnummer verändern. Eine Veranschaulichung dieses Vergleichs ist in 3 gezeigt, wo die t-Werte in den Datenkanälen für Chromosom 10 für jeden der beiden Durchläufe skizziert sind und die t-Schwellenwerte angegeben sind. Diese Illustration zeigt sowohl die relativen Übereinstimmungen als auch die Unstimmigkeiten. Die beiden Datenreihen stimmen in 84 % der Datenkanäle (46/55) überein, wobei der Großteil der Unterschiede in kleinen Regionen auftritt (ein oder zwei zusammenhängende Kanäle). Diese Duplikat-Bestimmung veranschaulicht die Stärke von CGH, reproduzierbare Positionen von Zunahmen und Verlusten über das gesamte Genom hinweg darzustellen, und zeigt auch ihre Schwäche als das Fehlen einer hohen Auflösung bezüglich der Definition der Position von Veränderungen.
CGH-Übereinstimmung mit der Alleltypisierung. Um diesen quantitativen statistischen Ansatz zu der CGH-Analyse zu validieren, verglichen die Erfinder die CGH mit den Alleltypisierungs-Resultaten jeder der 20 Tumorproben aus Gruppe I. 4 zeigt ein Beispiel des Vergleichsverfahrens bei zwei Tumoren auf einem Chromosom.
Im Allgemeinen führten die Alleltypisierungsstudien zu 280 informativen Resultaten an 49 verschiedenen Loci. Eine Zusammenfassung der Vergleiche mit CGH wird in Tabelle 2 dargestellt. Von den 280 informativen Resultaten, die mit der Alleltypisierung erhalten wurden, konnten 44 Fälle aufgrund ungenauer physikalischer Kartierung der Southern-Sonden oder der Mikrosatelliten-Polymorphismen bezüglich der Termini der CGH-definierten Veränderungen nicht mit der CGH verglichen werden. Von jenen, die verglichen werden konnten, kam es in nur 18/236 Fällen zu nicht übereinstimmenden Resultaten, zwölf dieser 18 Unstimmigkeiten traten in Fällen auf, in denen die CGH einen Verlust angab, die Allele jedoch ausgewogen zu sein schienen. Das Ausmaß der Übereinstimmung unter Verwendung der K-Statistik (J. Cohen, Educat. Psychol. Meas. 20, 37-46 (1960)), das eine Übereinstimmung berücksichtigt, die durch Zufall alleine auftreten könnte, ist K = 0,83 (95 % Vertrauensintervall ergibt 0,70-0,95), wobei es keinen Unterschied bezüglich des Ausmaßes der Übereinstimmung der CGH mit der Southern- oder der Mikrosatelliten-Analyse gibt.
Häufigkeit regionaler Chromosomen-Veränderungen: Gruppe I. Um die allgemeinen Tendenzen von DNA-Veränderungen im Genom unbehandelter Tumor-Metastasen zu definieren, erstellten die Erfinder ein Punkt-für-Punkt-Histogramm entlang aller Chromosomen-Arme, das die regionspezifische Häufigkeit von Verlusten und Zunahmen in dieser Serie von 20 unbehandelten Prostata-Metastasen zeigt. 5 zeigt die Häufigkeit des Auftretens von |t| > 1,6 für jeden skizzierten Datenkanal in Bezug auf ein Ideogramm eines jeden Chromosoms. Es zeigt, dass die folgenden 9 Chromosomen-Arme einen Verlust (in zumindest einer Region eines jeden Arms) in mehr als 40 % der Fälle aufwiesen: 8p (80 %), 13q (75 %), 16q (55 %), 2q (50 %), 10q (50 %), 17p (50 %), 5q (45 %), 6q (45 %) und 15q (45 %), und die folgenden 7 Chromosomen-Arme zeigten eine Zunahme (in zumindest einer Region eines jeden Arms) in mehr als 40 % der Fälle: 8q (85 %), 1q (55 %), 11p (55 %), 2p (50 %), 3q (45 %), 7q (45 %) und 9q (45 %) (5).
Eine genaue Untersuchung der Häufigkeits-Histogramme in 5 zeigt, dass einige der häufig veränderten Regionen kleinere Sub-Regionen mit höheren Häufigkeiten einer Veränderung enthalten als angrenzende Regionen. Verluste auf Chromosom 13 nehmen z.B. an Häufigkeit kontinuierlich zu von 13q11 bis p21.1, bleiben bei etwa 70 % von 13q21.1-q22 und verlieren kontinuierlich an Häufigkeit von 13q22 bis q35. Die Region 13q21.1.q22 besitzt daher die größte Chance, ein bedeutendes Prostata-Tumor-Suppressionsgen zu enthalten. Eine detaillierte Analyse solcher Regionen mit einem Verfahren hoher Auflösung (wie z.B. PCR-Mikrosatelliten-Alleltypisierung) ist erforderlich, um die Region präziser zu definieren.
5 zeigt andere Chromosomen-Regionen, die in einem etwas geringeren Anteil von Tumoren der Gruppe I verändert sind. Die häufigsten dieser sind 3p-Zunahme (40 %), 4p-Zunahme (40 %) und 11p-Verlust (30 %). Interessanterweise gibt es 12 Chromosomen-Arme, in denen in zumindest 20 % der Fälle sowohl Verluste als auch Zunahmen detektiert wurden. In 7 dieser 12 Arme überlappen die Verlust- und die Zunahme-Regionen nicht, und es könnte sein, dass rezessive und dominante Onkogene über diese Regionen verteilt sind. Es ist erneut anzumerken, dass eine genauere Lokalisierung einer jeden Region diese Frage besser lösen würde.
Schließlich zeigt 5 eine bescheidene Häufigkeit an Veränderungen (5-20 %) in beinahe allen Gebieten des Genoms, was darauf hindeutet, dass einige klonale Chromosomen-Veränderungen zufällig entstehen und in proliferierenden Postatakrebszellen erhalten werden.
Häufigkeit von Chromosomen-Veränderungen: Gruppe II. Elf Proben von Patienten mit einer fortschreitenden Krankheit trotz Langzeit-Androgendeprivation wurden auch mittels CGH analysiert. Wie bei den Proben der Gruppe I, führten die Erfinder eine Punkt-für-Punkt-Histogramm-Analyse entlang aller Chromosomen-Arme durch, wodurch die regionspezifische Häufigkeit der Veränderungen gezeigt wird. Im Allgemeinen zeigten die Resultate ein sehr ähnliches Muster der chromosomalen Veränderungen, wie dies auch bei der aus den Geweben von Gruppe I isolierten DNA hervorging. Insbesondere waren die am häufigsten detektierten Veränderungen ein Verlust im Chromosom 8p, eine Zunahme im Chromosom 8q sowie ein Verlust im Chromosom 13q. Histogramme, die für diese Chromosomen aus Gruppe-II-Proben (6) erhalten wurden, scheinen jenen, die für Gruppe I erhalten wurden (5), recht ähnlich zu sein. Um auf Unterschiede bezüglich der Chromsomen-Veränderungen zwischen Proben der Gruppe I und der Gruppe II zu testen, erstellten die Erfinder 2 × 3-Kontingenztafeln an jedem der 1247 Datenkanäle entlang des Genoms. Jede Tafel enthielt die Anzahl der Proben jeder der beiden Gruppen, die entweder einen Verlust, eine Zunahme oder keinerlei Veränderung an jedem Datenkanal aufwies. Die Erfinder testeten anschließend, ob es einen Unterschied in der Häufigkeit der Zunahmen oder der Verluste für jede Tafel gab, und zwar unter Verwendung des exakten Fisher-Tests. Das Resultat dieser Analysen zeigte nicht mehr als die erwartete Anzahl an signifikanten Unterschieden (bei p < 0,05), basierend auf der Durchführung einer großen Anzahl (1247) an Tests.
7 zeigt eine Zusammenfassung der Häufigkeit der Zunahmen und Verluste in Regionen des Genoms, die in vielen der Proben Veränderungen aufweisen. Keiner der Unterschiede zwischen den beiden Gruppen ist statistisch signifikant (p > 0,1). Man kann aus diesen Daten schließen, dass die meisten Chromosomen-Veränderungen ohne Androgendeprivationstherapie auftreten.
Gruppe I und II kombiniert. Da die Datenreihen für die beiden Gruppen an Tumoren nicht signifikant unterschiedlich waren, kombinierten die Erfinder sie und berechneten die gesamt auftretende Häufigkeit an Zunahmen und Verlusten an jedem Kanal (7). Für andere Untergruppen-Vergleiche der Häufigkeit der chromosomalen Veränderung wurde die kombinierte Datenreihe in Gruppen geteilt, die auf jüngerem oder älterem Patientenalter, höherem oder niedrigerem Serum-PSA und ethnischer Gruppierung (afroamerikanisch vs. weiß) basierten. Ähnliche Kontingenztafel-Analysen wurden durchgeführt, wie oben beschrieben. Es wurden keine regionalen Unterschiede in der Häufigkeit der Zunahmen oder der Verluste unter den Gruppen detektiert, die durch Patientenalter oder Serum-PSA definiert wurden.
Im Gegensatz dazu fanden die Erfinder tatsächlich einen Hinweis einer erhöhten Häufigkeit an Zunahmen in der Region 4q25-q28 bei Afroamerikanern. Bei einem sorgfältigen Vergleich der Häufigkeits-Histogramme (wie z.B. jenen, die in 5 und 6 dargestellt sind) war diese Region die einzige, in der alle fünf Schwarze eine Ver änderung aufzeigten. Die Erfinder fanden heraus, dass die gesamte Bande 4q27 eine signifikante Zunahme in den Proben von 5/5 Afroamerikanern zeigte im Vergleich zu 3/26 Weißen. Zusätzlich dazu zeigte eine größere Region von 6 zusammenhängenden Datenkanälen in 4q27q28 eine Zunahme in zumindest 4/5 Proben von Afroamerikanern im Vergleich zu weniger als 4/26 Proben von Weißen (exakter Fisher-Test p < 0,01 für jeden Vergleich). Die Erfinder bestimmten die statistische Signifikanz dieses Resultats durch zufallsbestimmte Auswahl von Subreihen von 5 Tumoren aus einer Gesamtmenge von 31 und das Wiederholen der Kontingenztafelanalysen für das gesamte Genom, wobei jedes Mal die Subreihe der zufällig ausgewählten 5 mit den verbleibenden 26 verglichen wird. Die Erfinder fanden heraus, dass nur 5 % dieser Proben einen Abschnitt von 6 zusammenhängenden Datenkanälen enthielten, und zwar mit dem exakten Fisher-Test p < 0,01 (basierend auf 1000 zufällig gebildeten Subreihen). Die Erfinder fanden auch heraus, dass nur 0,5 % dieser zufällig generierten Subreihen „signifikante" Zunahmen auf Chromosom 4 aufwiesen. In dem Vergleich von Afroamerikanern mit Weißen unterschieden sich keine anderen Regionen im Genom signifikant, obwohl die statistische Aussagekraft aufgrund der niedrigen Anzahl an Schwarzen in dieser Studie gering ist. Tabelle 1 Klinische Daten von Patienten, denen Gewebe zur Analyse entnommen wurde. Abkürzungen: PSA: Prostataspezifisches Antigen; c: weiß; a: afroamerikanisch; IN: Becken-Lymphknoten; met: Metastase; bx: Biopsie; TURP: transurethrale Resektion der Prostata.

a – Der Patient erhielt einen Monat lang eine Androgendeprivationstherapie vor der Gewebsuntersuchung.
b – Die Tumoren der Gruppe II wiesen während der Androgendeprivationstherapie einen klinischen Fortschritt auf. Für diese Tumoren wurde eine histologische Analyse auf angrenzen Operationsproben durchgeführt.
c – Die Objektträger konnten nicht lokalisiert werden.

a – In 3 von 4 Fällen eines Allelungleichgewichts auf dem Chromosom 8q war man mit einer Southern-Analyse in der Lage, eine Zunahme und nicht einen Verlust zu detektieren; mittels CGH waren alle Veränderungen auf dem Chromosom 8q Zunahmen. Alle anderen Allelungleichgewichte waren nach CGH Verluste. Anwendung der K-Statistik (30); K = 0,83 (0,70-0,95 beträgt 95 % Vertrauensintervall).

DISKUSSION
Das Ziel dieser Studie war es, einen pangenomischen Überblick über die Positionen und die Häufigkeiten der regionalen Chromosomen-Veränderungen bei Prostatakrebs zu erhalten. Genetische Vorkommnisse, die zum Ausbruch von Prostatakrebs führen, sind von offensichtlicher Bedeutung, da es jedoch beim Großteil der Prostatakrebs-Fälle nie zu einer Metastasierung kommt (G. Dhom, J. Cancer Res. Clin. Onc. 106, 210-18 (1983)), müssen zusätzliche genetische Vorfälle in das Fortschreiten bis zu letalem metastatischem Prostatakrebs involviert sein. Durch ihre nachgewiesene Fähigkeit, zu metastasieren, und durch ihre relative Reinheit boten die hier untersuchten Tumoren ausgezeichnetes Material, um genetische Veränderungen zu definieren, die potentiell sowohl in den Ausbruch als auch in das Fortschreiten von Prostatakrebs involviert sein könnten. Die Anwendung eines neuen Verfahrens zur Interpretation der Fluoreszenzintensitätswerte führte zu einer standardisierten CGH-Analyse, wodurch die Detektion und Kartierung dieser genetischen Veränderungen, basierend auf statistischen Vergleichen der Intensitäts-Verhältnisse in Bezug auf Kontrollexperimente, ermöglicht wurden.
In 20 der 31 untersuchten Fälle wurde die CGH-Analyse mit einer parallel durchgeführten Southern- und Mikrosatelliten-Analyse bezüglich des Allelungleichgewichts auf derselben DNA bestätigt. Die gute Übereinstimmung zwischen diesen beiden analytischen Verfahren (K = 0,83) ergibt eine Absicherung der Tatsache, dass die neue, standardisierte CGH-Analyse eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität aufweist.
Gesamtgenomische Überlegungen. Die Häufigkeit der Kopieanzahl-Veränderungen, die in den hier untersuchten DNA-Proben von Prostatakrebsgewebe gefunden wurden, erscheint recht groß zu sein, wenn sie in Anbetracht der Durchflusszytometrie und anderer Ploidie-Studien gesehen wird, die bei metastatischen Prostatakrebsarten eine Diploidie in beinahe 50 % der Fälle gezeigt haben (Stephenson et al., Cancer Res. 47, 2504-7 (1987)). Die hier dargestellten Daten deuten jedoch darauf hin, dass gleiche Teile relativ kleiner Regionen des Genoms oftmals in vielen Tumoren verloren gehen oder hinzukommen, was zu einem Gesamtgleichgewicht an genetischem Material und normaler Ploidie-Bestimmung führt. Zusätzlich sind, wenn die Tumoren tetraploid sind, Veränderungen der Kopienanzahl unter den verschiedenen Regionen des Genoms gering in Bezug auf den zellulären Gesamt-DNA-Gehalt. Tumor 399 z.B. wurde auf einer Feulgen-Färbung und Bildanalyse (Daten nicht dargestellt) als tetraploid bestimmt. Die durch die CGH detektierten Verluste und Zunahmen müssen daher von einer Basislinie von 4 Allelkopien interpretiert werden. Die Verluste und die Zunahmen wurden in etwa 5 % bzw. 18 % der 1247 über das Genom verteilten Datenkanäle detektiert. Obwohl die Erfinder nicht in der Lage waren, die genaue Anzahl der verlorenen oder hinzugekommenen Kopien für jede der einzelnen Veränderungen zu bestimmen, so unterstützen die Daten jedoch die Ansicht, dass metastatische Prostatakrebsarten kritische DNA-Veränderungen enthalten, die bei einer Messung des Gesamt-DNA-Gehalts nicht detektierbar sein könnten. Da die Ploidie in den Berichten einiger Prostatakrebs-Studien als von unabhängigem prognostischem Wert bezeichnet wurde (Shankey et al., Cytometry 14, 497-500 (1993)), schlagen die Erfinder Ploidie-Messungen plus CGH oder Alleltypisierungs-Analyse zur Bereitstellung einer verbesserten, tumorspezifischen prognostischen Information vor.
Die hierin bereitgestellten Resultate zeigen an, dass die meisten Regionen des Genoms in zumindest 5 % der Fälle mit fortgeschrittenem Prostatakrebs verändert sind. Diese zufällig erscheinenden Veränderungen wären nicht detektiert worden, wären sie nicht klonal in einer signifikanten Anzahl an Zellen in den Geweben, aus denen die DNA extrahiert worden war, vorhanden gewesen. Die Erfinder gehen davon aus, dass Chromosomen-Regionen mit einer geringen Veränderungshäufigkeit als Resultat von zufällig auftretender genetischer Instabilität von fortgeschrittenem Krebs auftreten und dass sie wahrscheinlich keine Gene enthalten, die für den aggressiven Phänotypen von Bedeutung sind.
In der vorliegenden Studie waren Zunahmen so oft vorhanden wie Verluste. Die hier detektierten Zunahmen besaßen jedoch ein relativ geringes Ausmaß des Rot/Grün-Fluoreszenzverhältnisses und umfassten im Allgemeinen große Regionen oder ganze Chromosomen-Arme. Es wurden keine kurzen, hochgradigen Amplifikationen gefunden, die auf eine einzelne Onkogen-Amplifikation hindeuteten, wie z.B. jene, die bei Brustkrebs beschrieben wurden (Kallioniemi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2156-60 (1994)). Die Resultate der Erfinder deuten auf eine subtilere Verschiebung der Genkopieanzahlen hin, die mit früheren Berichten über relativ geringe Ausmaße der Amplifikation bei Prostatakrebs korreliert (Visakorpi et al., Nature Genetics 9, 401-6 (1995); Bova et al., Cancer Res. 53, 3869-73 (1993); Van den Berg et al., Clin. Ca. Res. 1, 11-18 (1993); Brothman et al., Cancer Res. 50, 3795-803 (1990)).

Claims

Verfahren zum Screening auf die Gegenwart von Prostatakrebszellen in einer Probe, worin das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren einer Nucleinsäureprobe eines menschlichen Patienten mit einer Sonde, die selektiv an eine Targetpolynucleotidsequenz in einer Chromosomenregion bindet, die in Prostatkrebzellen deletiert ist und aus der aus 2 cen bis 2q31, von 4q13 bis 4q31,1 und von 15 cen bis 15q24 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder eine Chromosomenregion, worin die Kopienzahl in Prostatakrebszellen erhöht ist und aus der aus 1q21.3 bis 1q42.3, 2p12 bis 2p23, 3p14.1 bis 3p22, 6p22 bis 6 cen und 17q21 bis 17qter bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die Sonde mit der Probe unter Bedingungen kontaktiert wird, unter welchen die Sonde sich selektiv mit der Targetpolynucleotidsequenz bindet, um einen stabilen Hybridisierungskomplex zu bilden; und Detektion der Bildung eines Hybridisierungskomplexes.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäureprobe aus einer Prostatabiopsieprobe des Patienten stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend das Kontaktieren der Probe mit einer Referenzsonde, die selektiv an eine Centromer-DNA bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt der Detektion des Hybridisierungskomplexes die Bestimmung der Kopienzahl der Targetsequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sonde mit Digoxigenin oder Biotin markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt der Detektion des Hybridisierungskomplexes durch die Detektion einer Fluoreszenzmarkierung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Fluoreszenzmarkierung FITC ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe eine Metaphasenzelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die deletierte Chromosomenregion von 2 cen bis 2q31 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die deletierte Chromosomenregion von 4q13 bis 4q31.1 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die deletierte Chromosomenregion von 15 cen bis 15q24 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion, in welcher die Kopienzahl erhöht ist, von 6p22 bis 6 cen reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion, in welcher die Kopienzahl erhöht ist, von 17q21 bis 17qter reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion, in welcher die Kopienzahl erhöht ist, von 1q21.3 bis 1q42.3 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion, in welcher die Kopienzahl erhöht ist, von 2p12 bis 2p23 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion, in welcher die Kopienzahl erhöht ist, von 3p14.1 bis 3p22 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion, in welcher die Kopienzahl erhöht ist, von 17q21 bis 17qter reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Chromosomenregion bei 17q12 liegt und das Onkogen erb B-2 umfasst.