DE69637194T2 - In situ-hybridisation zum nachweis von spezifischen nukleinsäuresequenzen in eukaryontischen proben - Google Patents

In situ-hybridisation zum nachweis von spezifischen nukleinsäuresequenzen in eukaryontischen proben Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

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Description

  • Die Erfindung betrifft Methoden zum Bestimmen des Vorhandenseins von speziellen Nukleinsäuresequenzen in einer Probe von eukaryotischem Ursprung unter Anwendung der in situ-Hybridisation. Die Methode ist besonders geeignet für das Diagnostizieren von verschiedenen Erkrankungen, wie bakteriellen und viralen Infektionen, genetisch bedingten Erkrankungen und neoplastischen Erkrankungen. Unter einem anderen Aspekt der Erfindung werden diagnostische Kits bereitgestellt zur Verwendung beim Ausführen der erfindungsgemäßen Methode.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Hybridisation ist traditionell verwendet worden, um die generelle Technik zu beschreiben, durch welche komplementäre Stränge von Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekülen, Ribonukleinsäure (RNA)-Molekülen oder Kombinationen von DNA und RNA in einzelne Stränge getrennt werden und man sie dann renaturieren oder erneut hybridisieren und erneut basengepaarte Doppelhelices bilden lässt. Hybridisationstechniken werden allgemein in drei hauptsächliche Klassen klassifiziert: Lösungshybridisation, bei welcher die individuelle Zelle aufgebrochen und die interne Nukleinsäure vor einer Hybridisation in eine Lösung extrahiert wird; diese Technik umfasst unterschiedliche Ausmaße von Reinigung der Nukleinsäure vor der Hybridisation; Filter- oder Blot-Hybridisation, bei welcher DNA oder RNA an eine feste Matrix entweder direkt oder nach einer Auftrennung der individuellen Nukleinsäurefragmente auf z.B. einem Agarosegel oder einem Polyacrylamidgel gebunden wird und die nachfolgende Hybridisation mit einer markierten Sonde für den Nachweis von Hybriden ausgeführt wird; und in situ-Hybridisation (ISH), wodurch eine Methode für den Nachweis und die Lokalisierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen direkt in einer speziellen Struktur, z.B. innerhalb einer Zelle, eines Gewebes, eines Zellkerns oder eines Chromosoms, bereitgestellt wird. Obwohl diese Techniken auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem Ziel und einer Sonde, welche in der Lage ist, spezifisch an die nachzuweisende Sequenz zu binden, basieren, sind diese Techniken ziemlich unterschiedlich und voneinander unterscheidbar.
  • Eine in situ-Hybridisation erlaubt den Nachweis von spezifischen zellulären oder chromosomalen Nukleinsäuresequenzen in dem zellulären Material, wie in in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten, frischen oder gefrorenen Biopsien, Zellen oder Chromosomen. Traditionell sind Nukleinsäuresonden, welche eine Basensequenz aufweisen, die zu der nachzuweisenden Zielsequenz ausreichend komplementär ist, verwendet worden. Für diese Art des Nachweises sind weithin Nukleinsäuresonden, die mit anderen nachweisbaren Gruppen als radioaktiven Isotopen markiert waren, verwendet worden.
  • Der Bedarf an empfindlicheren Methoden nimmt zu. Möglichkeiten, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, bestehen darin, ein verstärkendes Nachweissystem zu verwenden und/oder die Anzahl von Sonden mit unterschiedlichen Sequenzen, die zielgerichtet die nachzuweisen den Nukleinsäuresequenzen ansteuern, zu erhöhen. Wenn eng verwandte Sequenzen unterschieden werden sollen, besteht oftmals eine Beschränkung, wie viele Sondenvariationen verwendet werden können, um ein gegebenes Ziel nachzuweisen.
  • Eine Erhöhung der Empfindlichkeit für eine in situ-Nukleinsäurehybridisation in Gewebeschnitten oder Zellausstrichen ist unter Anwendung der sogenannten „in situ-PCR" beschrieben worden. Das Prinzip der in situ-PCR besteht darin, die Techniken von PCR und ISH zu kombinieren durch die Amplifizierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen innerhalb der individuellen Zellen, was zu einer Erhöhung der Kopienzahlen bis zu Konzentrationen, die durch ISH nachweisbar sind, führt. Reproduzierbare Ergebnisse hängen von der Unversehrtheit der Probe ab. Während einer Vorbehandlung der Probe könnte die Zellmembran beschädigt werden, was zu einem Risiko von sogenannten „Diffusionsartefakten" führen könnte. PCR-Produkte können aus Zellen heraus lecken und als Matrize für eine extrazelluläre Amplifizierung dienen. Dies könnte falsche positive Signale erzeugen. Ein neuerer Bericht fasst die Hauptschwierigkeiten der „in situ-PCR" zusammen (Cell Vision. 3. 231-235 (1995)).
  • Gemäß der Erfindung, die durch die beigefügten Ansprüche definiert wird, werden Bindungspartner und Protokolle für in situ-Hybridisations-Verfahren für den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in einer Probe von eukaryotischem Ursprung bereitgestellt. In der Methode wird eine Hybridisation ausgeführt unter Verwendung eines Bindungspartners, der ein polymerer Strang von polymerisierten Komponenten mit einem nicht-cyclischen Rückgrat ist, wobei der polymere Strang in der Lage ist, mit der zu bestimmenden Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Beispiele von solchen polymeren Strängen sind in WO 92/20702 angegeben.
  • In WO 92/20702 wurde der Begriff Peptidnukleinsäure („Peptide Nucleic Acid"; PNA) eingeführt, um einige Verbindungen mit einem nicht-cyclischen Rückgrat und Nukleinsäurebindungseigenschaften zu beschreiben.
  • In WO 93/24652 ist postuliert worden, dass PNA-Sonden einsetzbar sind in einer in situ-Hybridisation, welche ohne Zugabe eines Denaturierungsmittels, wie Formamid, ausgeführt wird, und ferner mit einer Hybridisation, die bei niedriger Temperatur ausgeführt wird. Die postulierte Vereinfachung des in situ-Hybridisationsverfahrens basiert auf der früheren Annahme, dass PNA Dreifachstrang-Strukturen mit doppelsträngiger DNA bildet. In WO 93/24652 gibt es keine experimentellen Daten, um diese Vereinfachung zu stützen. Es ist jetzt gezeigt worden, dass die 1991 (Science 254, 1497-1500 (1991)) aufgestellte Hypothese der Dreifachstrangbildung nur zutrifft, wenn eine Homopyrimidin-PNA mit einer Homopurin-DNA zusammengegeben wird, wodurch (PNA)2/DNA-Dreifachstränge gebildet werden, wie (PNA(T))2(polydA) (TIBTECH, 11, 384-386 (1993)).
  • Egholm et al. (Nature 365, 566-568, 1993) offenbaren, dass eine Peptidnukleinsäure mit komplementären Oligonukleotiden unter Beachtung der Watson-Crick-Wasserstoffbindungsregeln hybridisiert.
  • WO-A-9 636 734 , die nur unter Art. 54(3) EPÜ relevant ist, offenbart in vitro-Hybridisationsassays unter Verwendung von PNAs.
  • Pluskal et al. (The FASER Journal, 1994, Poster 35) offenbaren die feste Bindung von Peptidnukleinsäure-Sonden an Nukleinsäuren, die auf synthetische Membranen elektrogeblottet worden sind. Vor dem Blotten werden die Nukleinsäuren unter denaturierenden Bedingungen isoliert und nach dem Blotten werden die Nukleinsäuren mit den Membranen UV-vernetzt. Die Struktur und die Umgebung der Nukleinsäuren, an welche eine Hybridisation in Pluskal et al. gezeigt wird, sind folglich sehr verschieden von der Struktur von Nukleinsäuren in biologischen Strukturen. Pluskal et al zeigen eine Hybridisation an eine künstlich erzeugte und weniger komplexe Struktur von Nukleinsäure als bei Nukleinsäure in biologischen Systemen, die von zellulären Strukturen, die Kreuzreaktionen hervorrufen können, umgeben ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Gemäß der Erfindung werden durch die Ansprüche 1-20 definierte Methoden bereitgestellt für das Bestimmen des Vorhandenseins von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Proben von eukaryotischem Ursprung unter Anwendung der in situ-Hybridisation.
  • Die Erfindung stellt dementsprechend eine Methode zum Nachweisen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe von menschlichem Ursprung unter Anwendung der in situ-Hybridisation bereit, welche die folgenden Schritte umfasst: (1) Fixieren der Probe, (2) Kontaktieren der Probe mit einer Hybridisationslösung, umfassend: einen Bindungspartner, der zum Hybridisieren an die nachzuweisende spezifische Nukleinsäuresequenz fähig ist, um ein Hybrid zu bilden, welcher Bindungspartner einen polymeren Strang umfasst, der polymerisierte Komponenten mit einem nicht-cyclischen Rückgrat enthält, und ein Hybrid-destabilisierendes Agens in einer Menge, die wirksam ist, die Schmelztemperatur der zwischen der Nukleinsäure und dem Bindungspartner gebildeten Hybride herabzusetzen, um das Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nicht-spezifischen Bindung zu erhöhen, (3) Entfernen jeglichen ungebundenen und jeglichen nicht-spezifsch gebundenen Bindungspartners und (4) Nachweisen des Vorhandenseins von gebundenem Bindungspartner in der Präparation, wobei die Konzentration des Hybrid-destabilisierenden Agens in der Hybridisationslösung über 10% beträgt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Methode bereitgestellt, wobei der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (I) umfasst
    Figure 00040001
    worin Y O oder S bezeichnet,
    jedes X unabhängig O oder S bezeichnet,
    jedes Q einen Liganden bezeichnet, der unabhängig eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, ein interkalator, eine Nukleobase-bindende Gruppe, eine Markierung oder H ist,
    u eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist,
    p und s unabhängig 0 oder 1 bezeichnen,
    q und r unabhängig 0 oder 1 bezeichnen,
    t 0 oder 1 bezeichnet,
    R1 und R10 unabhängig H oder C14-Alkyl bezeichnen,
    R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen.
  • Das Hybrid-destabilisierende Agens ist in einer Menge vorhanden, welche wirksam ist, die Schmelztemperatur von Hybriden, die zwischen der zu bestimmenden Nukleinsäure und dem Bindungspartner, welcher verwendet wird, um die Nukleinsäure nachzuweisen, gebildet werden, herabzusetzen, um das Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nichtspezifischen Bindung zu erhöhen. Insbesondere liegt die Konzentration des Hybrid-destabilisierenden Agens in der Hybridisationslösung über 10% v/v.
  • Beispiele von Hybrid-destabilisierenden Agentien sind Formamid, Ethylenglycol und Glycerol. Diese Agentien können vorzugsweise in einer Menge über 10% und weniger als 70% vorhanden sein. Formamid kann mehr bevorzugt in einer Menge von 20% bis 60%, am meisten bevorzugt von 30% bis 50% vorhanden sein. Ethylenglycol kann mehr bevorzugt in einer Menge von 30% bis 65%, am meisten bevorzugt von 50% bis 65% vorhanden sein.
  • Die Erfindung stellt eine Methode zum Bestimmen des Vorhandenseins von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Proben von menschlichem Ursprung bereit. Nicht-einschränkende Beispiele sind Gewebeschnitte, Zellausstriche, Suspensionen von Zellen oder Teilen davon und Chromosomenspreitungen (Chromosomenausbreitungen; Chromosomen-„Spreads").
  • Der Bindungspartner kann in geeigneter Weise markiert oder unmarkiert sein. Unter einem Aspekt trägt der Bindungspartner eine oder mehrere Markierungen für einen Nachweis von Hybriden, die während der Hybridisation gebildet werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung kann vorzugsweise ein Waschpuffer mit alkalischem pH in Schritt (3) verwendet werden. Die Verwendung eines Waschpuffers mit einem alkalischen pH kann in einigen Fällen ein erhöhtes Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nicht-spezifischen Bindung bewirken.
  • Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein diagnostischer Kit zur Verwendung bei einer Methode zum Nachweisen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe von menschlichem Ursprung durch in situ-Hybridisation bereitgestellt, wobei der Kit eine Hybridisationslösung, umfassend wenigstens einen Bindungspartner, der zum Hybridisieren an die spezifische Nukleinsäuresequenz fähig ist, um ein Hybrid zu bilden, welcher Bindungspartner einen polymeren Strang, der polymerisierte Komponenten mit einem nicht-cyclischen Rückgrat enthält, umfasst, und ein Hybrid-destabilisierendes Agens in einer Menge, die wirksam ist, die Schmelztemperatur von zwischen der Nukleinsäure und dem Bindungspartner gebildeten Hybriden herabzusetzen, um das Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nichtspezifischen Bindung zu erhöhen, wobei die Konzentration des Hybrid-destabilisierenden Agens in der Hybridisationslösung über 10% v/v beträgt.
  • Der diagnostische Kit kann des Weiteren Reagenzien umfassen, die für die Probenvorbereitung, Probenfixierung, Entfernung von ungebundenem oder nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner und für den Nachweis eines gebildeten Hybrids erforderlich sind.
  • SPEZIELLE BESCHREIBUNG
  • Die Methode zum Bestimmen des Vorhandenseins von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Proben von eukaryotischem Ursprung unter Anwendung von in situ-Hybridisation umfasst die folgenden vier Schritte: (1) Herstellen eines Präparats der Probe, (2) Hybridisation, (3) nach der Hybridisation erfolgendes Waschen (Posthybridisations-Waschen), um jeglichen ungebundenen und jeglichen nicht-spezifisch gebundenen Bindungspartner zu entfernen, und (4) Bestimmen des Vorhandenseins von gebundenem spezifischem Bindungspartner in dem Präparat. Ausführungsformen von diesen Schritten werden nachfolgend zusammen mit Beispielen von Ausgangsmaterial und den Bindungspartnern, die bei der Hybridisation verwendet werden sollen, beschrieben.
  • Ausgangsmaterial
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen in Proben von eukaryotischem Ursprung nachzuweisen. Es wird daran gedacht, dass die Erfindung ein wertvolles Hilfsmittel (Tool) bereitstellt für das Analysieren von solchen Proben auf das Vorhandensein von Nukleinsäuresequenzen, die beispielsweise für pathogene Bakterien oder Viren spezifisch sind, wodurch Informationen für das Stellen einer Diagnose bereitgestellt werden. In der humanen oder tierischen Pathologie kann der Nachweis von Chromosomenaberrationen klinisch wichtige Informationen für das Diagnostizieren von genetisch bedingten Störungen oder Erkrankungen bereitstellen. Im Rahmen der Pflanzenbiologie wird des Weiteren daran gedacht, dass die Erfindung ein wertvolles Hilfsmittel (Tool) sein kann für das Überwachen der Effizienz eines Transferierens von beispielsweise Herbizidresistenzgenen zu einer Pflanze oder, wie in menschlichen Geweben, um eine spezifische Synthese von Proteinen (durch Nachweis von mRNA) in einer gegebenen Zellstruktur nachzuweisen.
  • In dem vorliegenden Kontext ist der Begriff „Probe" beschränkt auf menschliche Gewebeschnitte, Zell- oder Gewebekulturen, Suspensionen von menschlichen Zellen oder isolierten Teilen davon, menschliche Biopsien, Blutproben, Speichel, Urin, Liquor cerebrospinalis, Milch, Exkretionen, Sekretionen, Abstriche, Fäkalproben und Aspirate.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass bei den zwischen den Bindungspartnern und den zu bestimmenden spezifischen Nukleinsäuren gebildeten Hybriden eine Hoogsteen- und/oder Watson-Crick-Basenpaarung zu der Bildung der Hybride beiträgt. In dem vorliegenden Kontext soll der Begriff „Hybride" Komplexe der Bindungspartner und der zu bestimmenden spezifischen Nukleinsäure, welche zwei oder mehrere Stränge umfassen, einschließen. Nichteinschränkende Beispiele sind Doppelstränge aus einem einzelnen Strang des Bindungspartners und einem einzelnen Strang der Nukleinsäure und Dreifachstränge aus z.B. zwei Strängen des Bindungspartners und einem Strang der Nukleinsäure.
  • Herstellung eines Präparats der Probe
  • Die zu untersuchende Probe wird vor dem Hybridisationsschritt vorbehandelt, wodurch ein Präparat der Probe hergestellt wird. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht erkennen dass die geeignete Vorbehandlung von der Art der Probe, die untersucht werden soll, abhängen wird. Während der Vorbehandlung wird die Probe einer Fixierung unterworfen werden.
  • Dementsprechend wird in einer Ausführungsform der Methode die Probe auf einem festen Träger aufgebracht. Techniken zum Aufbringen einer Probe auf dem festen Träger werden von der Art der fraglichen Probe abhängen und können beispielsweise das Anfertigen von Schnitten von Geweben wie auch das Ausstreichen oder eine Zytozentrifugation von Zellsuspensionen umfassen. Es können viele Arten von festen Trägern eingesetzt werden, um die Methode in der Praxis auszuführen. Die Verwendung von solchen Trägern und die Vorgehensweisen, um Proben darauf aufzubringen, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Mikroskopobjektträger aus Glas sind besonders geeignet. Mikroskopobjektträger aus Glas können behandelt werden, um die Probe besser zurückzuhalten.
  • Vor der Hybridisation wird die Probe in geeigneter Weise mit verschiedenen Chemikalien vorbehandelt, um die nachfolgenden Reaktionen zu vereinfachen. Die aktuelle Vorbehandlung wird von der Art der zu analysierenden Probe und davon, ob DNA- oder RNA-Sequenzen nachgewiesen werden sollen, abhängen. Für das Lokalisieren von RNA, wie mRNA, ist es vorteilhaft, dass die Probe so bald wie möglich nach dem Sammeln der Probe behandelt wird, um den größten Teil der RNA intakt zu halten. Wenn DNA-Sequenzen nachgewiesen werden sollen, ist dieser Schritt weniger wichtig. Die bevorzugte Behandlung ist eine, die die morphologische Integrität der zellulären Matrix und der Nukleinsäuren innerhalb der Zelle fixiert und bewahrt wie auch das effizienteste Ausmaß an Eindringen der Sonde ermöglicht. Die Begriffe „Sonde" und „Bindungspartner" werden hier gegeneinander austauschbar verwendet und dementsprechend entspricht der Begriff „Bindungspartner" dem Begriff „Sonde", der im Rahmen der Nukleinsäure-Hybridisation traditionell verwendet wird.
  • Beim Herstellen eines Präparats einer Gewebeprobe können die morphologische Integrität eines Gewebes und die Integrität der Nukleinsäuren bewahrt werden, indem die Probe entweder mittels einer chemischen Fixierung oder mittels Einfrieren in einen fixierten Zustand gebracht wird. Wenn ein Einfrieren für das Aufbewahren von beispielsweise einer Biopsie verwendet wird, wird die Biopsie typischerweise in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach dem Einfrieren kann die Probe bei –80°C in geeigneter Weise aufbewahrt werden. Vor der Analyse der Nukleinsäure wird die gefrorene Probe in dünne Schnitte geschnitten und auf z.B. vorbehandelte Objektträger transferiert. Dies kann z.B. bei einer Temperatur von –20°C in einem Kryostaten ausgeführt werden. Die Biopsie- oder Gewebeschnitte können bis zur Verwendung in geeigneter Weise bei –80°C aufbewahrt werden. Vor der Hybridisation kann der Gewebeschnitt mit einem Fixiermittel, vorzugsweise einem ausfällenden Fixiermittel, wie Aceton, behandelt werden oder der Gewebeschnitt wird für eine kurze Zeitspanne in einer Lösung von gepuffertem Formaldehyd inkubiert. Alternativ kann die Biopsie oder der Gewebeschnitt in ein Fixiermittel, wie gepuffertes Formaldehyd, 12 bis 24 h transferiert werden. Nach der Fixierung kann das Gewebe in Paraffin eingebettet werden, wobei ein Block gebildet wird, ausgehend von welchem dünne Schnitte geschnitten werden können. Korrekt hergestellte, in Paraffin eingebettete Proben können bei Raumtemperatur jahrelang aufbewahrt werden.
  • Vor der Hybridisation wird der Gewebeschnitt unter Verwendung von Standardvorgehensweisen entwachst und rehydratisiert.
  • Es kann eine weitere Permeabilisierung erforderlich sein, um eine ausreichende Zugänglichkeit der Ziel-Nukleinsäuresequenzen für den Bindungspartner sicherzustellen. Die Art der Behandlung wird von mehreren Faktoren abhängen, beispielsweise von dem verwendeten Fixiermittel, dem Ausmaß von Fixierung, der Art und Größe der verwendeten Probe und der Länge des Bindungspartners. Die Behandlung kann eine Exposition gegenüber einer Protease, wie Proteinase K, Pronase oder Pepsin, verdünnten Säuren, Detergentien oder Alkoholen oder eine Wärmebehandlung umfassen.
  • In einigen Fällen kann ein Vorhybridisationsschritt unter Verwendung einer Vorhybridisationsmischung, die der Hybridisationslösung sehr ähnlich ist, aber ohne den Bindungspartner, nützlich sein, um die nicht-spezifische Bindung des Bindungspartners herabzusetzen. Die Komponenten der Vorhybridisationsmischung sollten so ausgewählt werden, dass eine effektive Sättigung von Stellen in dem Gewebe, die ansonsten den Bindungspartner nicht-spezifisch binden könnten, erzielt wird.
  • Für das Analysieren eines suspendierten Präparats, wie einer Suspension von Zellen, wird die Probe so behandelt, dass eine Permeabilisation des Materials und eine Bewahrung der Morphologie erzielt werden. Es kann eine Fixierung mit einem Fixiermittel, wie Formaldehyd, Aceton oder Ethanol, ausgeführt werden.
  • Unter einem anderen Aspekt erlaubt die Methode den Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einem Chromosom. Ein solcher Nachweis kann beispielsweise ausgeführt werden unter Verwendung von Spreitungen („Spreads") von Chromosomen in Metaphase, wobei die Zielsequenz in einer jeglichen Region der Chromosomen, z.B. der Centromeren Region oder der telomeren Region eines Chromosoms, lokalisiert sein kann. Eine Vorbehandlung kann in diesem Falle umfassen, ein Mittel, wie Colcemid, zuzugeben, um die Chromosomen von sich teilenden Zellen in der Metaphase der Mitose anzuhalten. Nachfolgend kann die Probe mit einem hypotonischen Puffer behandelt werden. Nach einer Zentrifugation werden die Chromosomen mit einem Fixiermittel behandelt und auf einem Objektträger gespreitet. Unmittelbar vor oder gleichzeitig mit dem Hybridisationsschritt kann das Präparat behandelt werden, um das doppelsträngige Ziel abzutrennen. Diese Trennung kann erzielt werden, in dem das Präparat in Gegenwart eines denaturierenden Mittels, wie Formamid, erwärmt wird. Der Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einem Chromosom kann auch ausgeführt werden unter Verwendung von Chromosomen in Interphase, z.B. in Gewebeschnitten oder in einer Suspension von Zellen. In solchen Fällen können die Proben behandelt werden, wie oben für Gewebeschnitte oder Suspensionen von Zellen beschrieben.
  • Für alle Probenpräparate werden die Nukleinsäuren in einer morphologischen Struktur, welche erlaubt, dass eine Hybridisation in situ ausgeführt werden kann, fixiert. Dementsprechend werden die Nukleinsäuren aus dem zellulären Material nicht extrahiert und die Hybridisation wird nicht in Lösung ausgeführt.
  • Wenn RNA-Sequenzen das Ziel für den Nachweis sind, ist es wichtig, einen Abbau der Ziel-Nukleinsäuren durch Ribonukleasen während der Vorhybridisationsschritte zu verhindern. Es ist folglich wichtig, dass alle Ausrüstungsgegenstände und Lösungen, die für die Vorbehandlung wie auch für die Hybridisation verwendet werden, in geeigneter Weise behandelt werden, um Nukleasen zu entfernen. Solche Inaktivierungstechniken sind in der Literatur wohlbekannt und können gemäß Standardprozeduren ausgeführt werden.
  • Bindungspartner zur Verwendung in der Methode
  • Der in der Methode verwendete Bindungspartner ist ein polymerer Strang von polymerisierten Komponenten mit einem nicht-cyclischen Rückgrat, wobei der polymere Strang zu einer Hybridisation mit der zu bestimmenden Nukleinsäuresequenz fähig ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (I)
    Figure 00090001
    worin Y O oder S bezeichnet,
    jedes X unabhängig O oder S bezeichnet,
    jedes Q einen Liganden bezeichnet, der unabhängig eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, ein Interkalator, eine Nukleobase-bindende Gruppe, eine Markierung oder H ist,
    u eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist,
    p und s unabhängig 0 oder 1 bezeichnen,
    q und r unabhängig 0 oder 1 bezeichnen,
    t 0 oder 1 bezeichnet,
    R1 und R10 unabhängig H oder C14-Alkyl bezeichnen,
    R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen.
  • Der Begriff „natürlich vorkommende Nukleobase" umfasst die vier hauptsächlichen DNA-Basen (d.h. Thymin (T), Cytosin (C), Adenin (A) und Guanin (G)) wie auch andere natürlich vorkommende Nukleobasen (z.B. Uracil (U) und Hypoxanthin).
  • Der Begriff „nicht-natürlich vorkommende Nukleobasen" umfasst z.B. natürlich vorkommende Nukleobasen, in welchen eine Markierung an die Base gegebenenfalls durch einen geeigneten Linker gebunden ist, und modifizierte natürlich vorkommende Nukleobasen, wie z.B. modifiziertes Uracil und Hypoxanthin. Andere Beispiele von nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen sind 2,6-Diaminopurin, Propinylcytosin (C-Propinyl), Isocytosin (iso-C), Isoguanosin, 5-Methylisocytosin (isoMeC) (siehe z.B. Tetrahedron Letters Band 36, Nr. 12, 2033-2036 (1995) oder Tetrahedron Letters Band 36, Nr. 21, 3601-3604 (1995)).
  • Beispiele von nützlichen Interkalatoren sind z.B. Acridin, Anthrachinon, Psoralen und Pyren.
  • Beispiele von nützlichen Nukleobase-bindenden Gruppen sind z.B. 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol.
  • Im vorliegenden Kontext soll „C1-4-Alkyl" verzweigte oder nicht-verzweigte Alkylgruppen, welche 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, bedeuten. Nicht-einschränkende Beispiele sind CH3, CH2CH3 und CH(CH3)2.
  • Innerhalb des vorliegenden Kontextes soll der Ausdruck „natürlich vorkommende Aminosäure" D- und L-Formen von Aminosäuren, die gewöhnlich in der Natur gefunden werden, umfassen, z.B. D- und L-Formen von Ala (Alanin), Arg (Arginin), Asn (Asparagin), Asp (Asparaginsäure), Cys (Cystein), Gin (Glutamin), Glu (Glutaminsäure), His (Histidin), Ile (Isoleucin), Leu (Leucin), Lys (Lysin), Met (Methionin), Phe (Phenylalanin), Pro (Prolin), Ser (Serin), Thr (Threonin), Trp (Tryptophan), Tyr (Tyrosin) und Val (Valin).
  • In dem vorliegenden Kontext soll der Ausdruck „nicht-natürlich vorkommende Aminosäure" D- und L-Formen von anderen Aminosäuren als jenen, die gewöhnlich in der Natur gefunden werden, wie auch von modifizierten natürlich vorkommenden Aminosäuren umfassen. Beispiele von nützlichen nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuren sind D- und L-Formen von Cha (Cyclohexylalanin), Cit (Citrullin), Hci (Homocitrullin), HomoCys (Homocystein), Hse (Homoserin), Nie (Norleucin), Nva (Norvalin), Orn (Ornithin), Sar (Sarcosin) und Thi (Thienylalanin).
  • Der in der vorliegenden Methode zu verwendende Bindungspartner sollte eine ausreichende Anzahl von Liganden umfassen, welche zur Wechselwirkung mit der zu bestimmenden Nukleotidsequenz fähig sind, um Hybride zu bilden, die unter der bei der Hybridisation und dem nach der Hybridisation erfolgenden Waschen (Schritte (2) und (3)) verwendeten Stringenz ausreichend stabil sind. Die Strategie zum Auswählen der Liganden des Bindungspartners, die gemäß der Methode verwendet werden sollen, kann auf verfügbaren Zielnukleotidsequenz-Informationen basieren.
  • Bei den oben angegebenen Bindungspartnern kann das Rückgrat der Komponenten vorzugsweise aus sechs Atomen bestehen. Es ist gezeigt worden, dass dies die gegenwärtig stärkste beobachtete Affinität für Nukleinsäuren ergibt. Es kann in einigen Fällen vorteilhaft sein, die Stärke der Bindung zwischen dem Bindungspartner und der Nukleinsäuresequenz zu verändern. Eine solche Veränderung der Affinität kann bewerkstelligt werden, indem die Liganden durch weniger oder durch mehr Atome als sechs Atome voneinander getrennt sind. Es wird auch daran gedacht, dass bevorzugte Bindungspartner, die in der Methode verwendet werden sollen, weniger als 25 Gew.-% (berechnet ausschließlich von X- und Q-Gruppen wie auch von jeglichen Linkern und/oder Markierungen) von Komponenten, welche mehr oder weniger als sechs Atome im Rückgrat aufweisen, umfassen.
  • Die Stärke der Bindung zwischen dem Bindungspartner und der Nukleinsäuresequenz wird durch den Liganden Q beeinflusst. Hoogsteen- und/oder Watson-Crick-Basenpaarung trägt zu der Bildung von Hybriden zwischen einer Nukleinsäure und einem Bindungspartner bei, wobei Q eine Nukleobase bezeichnet. Es wird auch daran gedacht, dass einer oder mehrere der Liganden eine Gruppe sein kann bzw. können, die wenig oder gar nicht zu der Bindung der Nukleinsäure beträgt, wie Wasserstoff. Es wird auch daran gedacht, dass Bindungspartner, die in der Methode verwendet werden sollen, weniger als 25 Gew.-% Komponenten, in welchen Q H bezeichnet, umfassen. Einer oder mehrere der Liganden Q kann bzw. können Gruppen sein, die die Nukleobasen-Stapelung stabilisieren, wie Interkalatoren.
  • Bei den oben angegebenen Bindungspartnern kann eine oder mehrere der Q-Gruppen eine Markierung bezeichnen. Beispiele von geeigneten Markierungen werden nachfolgend angegeben. Komponenten, in welchen Q eine Markierung bezeichnet, können bevorzugt in einer oder beiden der endständigen Gruppierungen bzw. Komponenten des polymeren Strangs lokalisiert sein. Komponenten, in welchen Q eine Markierung bezeichnet, können auch intern lokalisiert sein.
  • Geeignete Bindungspartner, die in der Methode verwendet werden sollen, sind Bindungspartner, umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (I), in welcher u, p, q, r, s Y, X und Q wie oben definiert sind, t 0 ist, R1 H oder CH3 bezeichnet, R3, R4, R6 und R9 H bezeichnen und R2, R5, R7 und R8 unabhängig H oder die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen.
  • Eine andere Ausführungsform betrifft eine Methode, in welcher der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (II) umfasst, welche Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, worin r 0 ist und q und s 1 sind,
    Figure 00110001
    worin Y, X, Q, p, t und u wie oben definiert sind,
    R2, R5 und R7 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen und R1 und R10 unabhängig H oder CH3 bezeichnen.
  • Noch eine andere Ausführungsform betrifft eine Methode, in welcher der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (III) umfasst, welche Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, worin p, r und t 0 sind und q und s 1 sind,
    Figure 00120001
    worin Y, X, Q und u wie oben definiert sind,
    R2, R5 und R7 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen.
  • Der polymere Strang umfasst polymerisierte Komponenten, wie oben definiert. Aufgrund der Formel versteht sich, dass der polymere Strang polymerisierte Komponenten umfassen kann, deren Struktur wechselseitig unterschiedlich oder identisch sein kann.
  • Das Rückgrat des polymeren Strangs kann in geeigneter Weise ein Polyamid, welches polymerisierte Komponenten umfasst, in denen alle X-Gruppen O sind, bilden, oder ein Polythioamid, welches polymerisierte Komponenten umfasst, in denen alle X-Gruppen S sind, bilden. Die Polyamid und Polythioamid bildenden Komponenten können verknüpft werden, um polymere Stränge zu bilden, welche sowohl Polyamid als auch Polythioamid bildende Komponenten umfassen, oder um polymere Stränge zu bilden, welche nur Polyamid bildende Komponenten oder Polythioamid bildende Komponenten umfassen. Polymere Stränge mit einem Polyamid-Rückgrat (alle X-Gruppen bezeichnen O) sind von besonderem Interesse.
  • Bindungspartner von großem Interesse sind jene, bei welchen der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formeln (IV)-(VI) umfasst, welche Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, in welcher p, r und t 0 sind und u, s und q 1 sind:
    Figure 00130001
    worin R2, R5 und R7 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen und jedes Q unabhängig eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, einen Interkalator oder eine Nukleobase-bindende Gruppe bezeichnet.
  • In den Formeln (IV)-(VI) können die Substituenten R2, R5 und R7 in geeigneter Weise so ausgewählt werden, dass sie H oder die Seitenkette von Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser oder Thr bezeichnen, und dass Q Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil oder Hypoxanthin bezeichnet.
  • Besonders interessante Bindungspartner sind jene, in denen der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (VII) umfasst, welche Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, worin p, r und t 0 sind und u, s und q 1 sind,
    Figure 00130002
    worin Q Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil oder Hypoxanthin bezeichnet.
  • Die bevorzugte Länge des Bindungspartners wird von dem Zielmaterial abhängen und davon, ob markierte Bindungspartner verwendet werden. Es wird auch daran gedacht, dass besonders interessante Bindungspartner 8 bis 30 polymerisierte Komponenten, wie oben definiert, umfassen. Bindungspartner, welche 12 bis 20 polymerisierte Komponenten umfassen, können von besonderem Interesse sein und Bindungspartner, welche 14 bis 20 Komponenten umfassen, sind von größtem Interesse.
  • Wie oben erwähnt, können die polymerisierten Komponenten des Bindungspartners wechselseitig verschieden oder identisch sein. In einigen Ausführungsformen bilden die polymerisierten Komponenten der Formeln (IV)-(VII) wenigstens 75 Gew.-% (berechnet, wie oben definiert), vorzugsweise wenigstens 80 Gew.-% und am meisten bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% des polymeren Strangs.
  • Die Enden an den Komponenten, welche den polymeren Strang beenden, können durch geeignete Substituenten substituiert sein. Die Substituenten können so ausgewählt werden, dass sie die freie oder acylierte Form der Endkomponente bilden. Die Substituenten können des Weiteren so ausgewählt werden, dass sie einen Ester, ein Amid oder ein Amin abhängig von der chemischen Natur der Endkomponente bilden. Ein terminierendes Ende kann des Weiteren durch eine oder mehrere Markierungen substituiert sein, welche Markierungen Ende an Ende eingebaut sein können, d.h. so, dass ein nicht-verzweigtes markiertes Ende gebildet wird, oder können so eingebaut sein, dass ein verzweigtes markiertes Ende („Zipper") gebildet wird. Ein terminierendes Ende kann des Weiteren durch eine oder mehrere Linkereinheiten substituiert sein. Solche Linkereinheiten können direkt an ein terminierendes Ende angeheftet sein, können an eine Markierung oder zwischen Markierungen an einem terminierenden Ende angeheftet sein oder an ein terminierendes Ende angeheftet werden, bevor eine Markierung an ein terminierendes Ende angeheftet wird. Es sollte sich verstehen, dass zwei terminierende Enden unterschiedliche oder identische Substituenten, Linkereinheiten und/oder Markierungen tragen können. Es sollte sich ferner verstehen, dass der Begriff „eine Markierung" eine oder mehrere Markierungen umfassen soll.
  • Der Ausdruck „Peptid-Markierung” soll eine Markierung bedeuten, welche 1 bis 20 natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 10 natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren, mehr bevorzugt 1 bis 8 natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren, am meisten bevorzugt 1 bis 4 natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren, die miteinander Ende an Ende in einer nicht-verzweigten oder verzweigten („Zipper”) Weise verknüpft sind, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein solches nicht-verzweigtes oder verzweigtes Ende eine oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 8 Markierungen, mehr bevorzugt 1 bis 4 weitere andere Markierungen als eine Peptid-Markierung. Solche weiteren Markierungen können ein nicht-verzweigtes Ende oder ein verzweigtes Ende in geeigneter Weise beenden. Eine oder mehrere Linkereinheiten können in geeigneter Weise an das terminierende Ende angeheftet werden, bevor eine Peptid-Markierung und/oder eine weitere Markierung angeheftet wird. Solche Linkereinheiten können auch zwischen einer Peptid-Markierung und einer weiteren Markierung angeheftet werden.
  • Der polymere Strang als solcher kann auch eine oder mehrere Markierungen, wie 1 bis 8 Markierungen, vorzugsweise 1 bis 4 Markierungen, und/oder eine oder mehrere Linkereinheiten, die intern, d.h. an das Rückgrat des polymeren Strangs, angeheftet sein können, umfassen. Die Linkereinheiten und Markierungen können wechselseitig angeheftet werden, wie oben beschrieben.
  • In dem vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff „Markierung" auf einen Substituenten, der zum Nachweis von Hybriden, die zwischen einem Bindungspartner und einer Nukleinsäure gebildet werden, nützlich ist. Gemäß der Erfindung umfassen geeignete Markierungen Fluorophore, Biotin, Dinitrobenzoesäure, Digoxigenin, Radioisotop-Markierungen, Peptid- oder Enzymmarkierungen, Chemolumineszenz-Markierungen, Hapten-, Antigen- oder Antikörper-Markierungen. Beispiele von besonders interessanten Markierungen sind Biotin, fluoreszierende Markierungen, wie Fluorescein-Markierungen, z.B. 5- (und 6-)-Carboxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxyfluorescein, 6-(Fluorescein)-5-(und 6-)-carboxamidohexansäure und Fluoresceinisothiocyanat, Peptid-Markierungen, Dinitrobenzoesäure, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Cyanin-Farbstoffe, wie Cy2, Cy3 und Cy5, Cumarin, R-Phycoerythrin, Allophycoerythrin, Texas Red und Princeston Red wie auch Konjugate von R-Phycoerythrin und z.B. Cy5 oder Texas Red.
  • Beispiele von bevorzugten Markierungen sind Biotin, fluoreszierende Markierungen, Peptid-Markierungen und Dinitrobenzoesäure. Peptid-Markierungen können vorzugsweise aus 1 bis 10, mehr bevorzugt aus 1 bis 8, am meisten bevorzugt aus 1 bis 4 natürlich vorkommenden oder nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen. Es kann besonders vorteilhaft sein, eine oder mehrere andere Markierungen wie auch eine Peptid-Markierung, wie beispielsweise 1 bis 8 oder 1 bis 4 andere Markierungen, einzubauen. Zwei von solchen anderen Markierungen können z.B. an jedem terminierenden Ende eingebaut werden.
  • Geeignete Peptid-Markierungen können vorzugsweise aus Cystein, Glycin, Lysin oder Ornithin bestehen.
  • Ein Linker kann aufgebaut sein aus Linkereinheiten, die aus Einheiten der Formeln -NH-(CH2CH2O)nCH2C(O)-, -NH-(CHOH)nC(O)-, -(O)C(CH2OCH2)nC(O)- und -NH(CH2)nC(O)-, worin n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 8, vorzugsweise von 1 bis 3 ist, ausgewählt werden. Eine Linkereinheit kann eine freie Aminogruppe oder eine freie Säuregruppe aufweisen, d.h. NH2(CH2CH2O)nCH2C(O)-, NH2(CHOH)nC(O)-, HO(O)C(CH2OCH2)nC(O)-, NH2(CH2)nC(O)-, -NH(CH2CH2O)nCH2C(O)OH, -NH(CHOH)nC(O)OH, -(O)C(CH2OCH2)nC(O)OH und -NH(CH2)nC(O)OH. Ein Linker kann aus bis zu 3 von solchen Linkereinheiten bestehen. Beispiele von sehr interessanten Linkereinheiten sind -NHCH2C(O)-, -NHCH2CH2C(O)-, -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)-, HO(O)CCH2C(O)(NH-(CH2CH2O)2CH2C(O))2-.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann der Ligand Q, wie oben definiert, markiert sein. Geeignete Markierungen sind, wie oben definiert. Zwischen einer solchen Markierung kann ein Linker, welcher aus C1-15-Alkyl, C1-15-Alkenyl und C1-15-Alkinyl ausgewählt wird, eingebaut werden. In dem vorliegenden Kontext sollen „C1-15-Alkyl, C1-15-Alkenyl und C1-15-Alkinyl" verzweigte oder nicht-verzweigte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen, welche 1 bis 15 Kohlenstoffatome enthalten, bedeuten. Es ist bevorzugt, dass solche markierten Liganden Q aus Thymin und Uracil, die an der 5-Position markiert sind, ausgewählt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die verwendeten polymeren Stränge Bindungspartner, welche polymerisierte N-(2-Aminoethyl)glycin-Komponenten der Formel (VII), in welchen das Glycin-Stickstoffatom mit natürlich vorkommenden Nukleobasen durch einen Methylencarbonyl-Linker verknüpft ist, umfassen. Die als Nachweissonden zu verwendenden Bindungspartner können in geeigneter Weise 8 bis 30 von solchen polymerisierten Komponenten umfassen, umfassen vorzugsweise 12 bis 20 Komponenten, am meisten bevorzugt 14 bis 20 Komponenten.
  • Herstellung von Ausführungsformen von Bindungspartnern für eine Hybridisation
  • In einer Ausführungsform ist der gegenwärtig am meisten bevorzugte Bindungspartner ein polymerer Strang, welcher polymerisierte Komponenten der Formel (VII) umfasst. Die Synthese von Verbindungen dieser Struktur wird in WO 92/20702 beschrieben und diese Verbindungen sind als PNA bezeichnet worden.
  • Die in den Beispielen verwendeten Bindungspartner wurden synthetisiert gemäß den Vorgehensweisen, die im „PNA Information Package", erhalten von der Millipore Corporation (Bedford, MA, USA), beschrieben worden sind, oder die Bindungspartner wurden von PerSeptive Biosystems (Framingham, MA, USA) erhalten.
  • Bei einer Anwendung der Fmoc-Strategie zur Verlängerung des Bindungspartners mit Linkern oder Aminosäuren war es möglich, Seitenketten-Aminogruppen mit säureempfindlichen Schutzgruppen, wie der Boc-Gruppe, schützen zu lessen. Diese Methode erlaubt die Einführung eines Linkers, welcher mehrere Boc-geschützte Aminogruppen enthält, die allesamt in ein und demselben Synthesezyklus abgespalten und markiert werden können.
  • Eine Weise zum Markieren des Bindungspartners besteht darin, eine fluoreszierende Markierung, wie 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxyfluorescein, 6-(Fluorescein)-5-(und 6-)carboxamidohexansäure oder Fluoresceinisothiocyanat, zu verwenden. Die Säuregruppe wird mit HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) oder HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) aktiviert und mit der N-terminalen Aminogruppe umgesetzt. Dieselbe Technik kann auf andere Markierungsgruppen, welche eine Säurefunktion enthalten, angewendet werden. Alternativ kann der Succinimidylester der oben erwähnten Markierungen direkt verwendet werden.
  • Nach der Synthese wurden die Bindungspartner von dem Harz unter Verwendung von Standardprozeduren, wie von Millipore Corporation oder PerSeptive Biosystems beschrieben, abgespalten. Die Bindungspartner wurden gereinigt und analysiert unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC-Techniken bei 50°C und wurden durch „matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry" (MALDI-TOFMS), Plasmadesorptionsmassenspektrometrie (PDMS) oder Elektrospray-Massenspektrometrie (ESMS) charakterisiert.
  • Allgemein können Bindungspartner, wie Bindungspartner, welche polymerisierte Komponenten der Formel (IV)-(VII) umfassen, auch hergestellt werden, wie z. B. in Tetrahedron Letters, Band 35, Nr. 29, 5173-5176 (1994) und Bioorganic & Medical Chemistry Letters, Band 4, Nr. 8, 1077-1080 (1994) beschrieben. Chemische Eigenschaften von einigen Bindungspartnern werden beispielsweise in Nature, 365, 566-568 (1993) beschrieben.
  • Hybridisation
  • Die Hybridisation kann ausgeführt werden unter Verwendung von fixierten, immobilisierten oder suspendierten Präparaten, die hergestellt werden, wie oben beschrieben. Wenn ein doppelsträngiges Ziel, wie chromosomale oder DNA-Sequenzen nachgewiesen werden sollen, kann eine Behandlung, um die beiden Stränge zu trennen, erforderlich sein. Diese Trennung der Stränge kann erzielt werden, indem die Probe in Gegenwart der Hybridisationsmischung auf eine ausreichend hohe Temperatur und für eine ausreichende lange Zeitspanne, um die Stränge zu dissoziieren, erwärmt wird. Typischerweise ist ein Erwärmen bei einer Temperatur von 90°C bis 95°C für eine Zeitspanne von 5 bis 15 min geeignet.
  • Der Hybridisationspuffer umfasst ein Hybrid-destabilisierendes Agens in einer Konzentration über 10% v/v in einer Menge, welche wirksam ist, die Schmelztemperatur der zwischen der zu bestimmenden Nukleinsäure und dem Bindungspartner gebildeten Hybride herabzusetzen, um das Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nicht-spezifischen Bindung zu erhöhen. Dieses Agens wird ermöglichen, dass die Hybridisation bei einer niedrigeren Temperatur als ohne das Agens stattfinden kann. Bei einer traditionellen Nukleinsäure-Hybridisation wird ein solches Agens als ein Denaturierungsmittel bezeichnet.
  • Hybridisation und Denaturierung können gleichzeitig unter Verwendung einer geeigneten Menge eines Hybrid-destabilisierenden Agens in Kombination mit einer geeigneten Temperatur für die Behandlung ausgeführt werden.
  • Die wirksame Menge des Hybrid-destabilisierenden Agens wird von der Art des verwendeten destabilisierenden Agens und darüber hinaus von dem Bindungspartner oder der Kombination von Bindungspartnern, der bzw. die verwendet wird, abhängen. Es ist festgestellt worden, dass bei Verwendung von Bindungspartnern der Formel (VII) durch Aufnahme eines Hybrid-destabilisierenden Agens besonders gute Ergebnisse erzielt worden sind, Beispiele von Hybrid-destabilisierenden Agentien sind Formamid, Ethylenglycol und Glycerol und diese Agentien werden in einer Konzentration über 10% und vorzugsweise unter 70% verwendet. Die Konzentration von Formamid kann mehr bevorzugt 20% bis 60%, am meisten bevorzugt 30% bis 50% betragen. Die Konzentration von Ethylenglycol kann mehr bevorzugt 30% bis 65%, am meisten bevorzugt 50% bis 65% betragen. Die Konzentration von Glycerol kann mehr bevorzugt 45% bis 60%, am meisten bevorzugt 50% betragen.
  • Es ist oftmals vorteilhaft, Makromoleküle oder Polymere, wie Dextransulfat, Polyvinylpyrrolidon und/oder Ficoll, zuzusetzen. In Gegenwart von solchen Makromolekülen oder Polymeren wird angenommen, dass die effektive Konzentration des Bindungspartners an dem Ziel heraufgesetzt wird. Dextransulfat kann in einer Konzentration von bis zu 15% zugesetzt werden. Konzentrationen von Dextransulfat von 2,5% bis 12,5% sind oftmals vorteilhaft.
  • In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, ein Detergens, wie Natriumdodecylsulfat, Tween 20® oder Triton X-100®, zuzusetzen.
  • Während der Hybridisation sind andere wichtige Parameter Hybridisationstemperatur, Konzentration des Bindungspartners und Hybridisationsdauer. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht erkennen, dass optimale Bedingungen für verschiedene Ausgangsmaterialien für jeden der oben erwähnten Parameter bestimmt werden müssen.
  • Die Hybridisation zwischen Bindungspartnern, welche polymerisierte Komponenten der Formeln (IV)-(VII) umfassen, und einer Ziel-Nukleinsäuresequenz scheint gegenüber Schwankungen beim pH und hinsichtlich der NaCl-Konzentration unempfindlich zu sein.
  • Nach der Hybridisation erfolgendes Waschen (Posthybridisations-Waschen)
  • Nach der Hybridisation wird das Präparat gewaschen, um jegliche ungebundene und jegliche nicht-spezifisch gebundene Bindungspartner zu entfernen. Die nachfolgend beschriebenen Bedingungen sind lediglich beispielhaft und können von der Art des zu analysierenden Präparats abhängen. Während des Posthybridisationsschritts sollten geeignete Stringenzbedingungen verwendet werden, um jeglichen nicht-spezifisch gebundenen Bindungspartner zu entfernen. Stringenz bezieht sich auf das Ausmaß, bis zu welchem Reaktionsbedingungen die Dissoziation der gebildeten Hybride begünstigen, und diese kann erhöht werden, beispielsweise indem die Waschtemperatur und die Inkubationsdauer erhöht werden. Für eine herkömmliche Hybridisation mit Nukleinsäuresonden wird oftmals die Salzkonzentration als ein zusätzlicher Faktor für das Regulieren der Stringenz verwendet. Dies trifft nicht auf Bindungspartner zu, welche polymerisierte Komponenten der Formel (IV)-(VII) umfassen, da die Bindung von dieser Art von Sonden sich als praktisch unabhängig von der Salzkonzentration erwiesen hat (Nature, 365, 566-568 (1993)).
  • Beispiele von nützlichen Puffersystemen sind Tris-Buffered-Saline (TBS; Tris-gepufferte Kochsalzlösung), Standard-Citratpuffer (SSC) oder Phosphatpuffer. Ein geeigneter TBS-Puffer ist 0,05 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,6. Der SSC-Puffer umfasst 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Trinatriumcitrat, pH 7,0.
  • Typischerweise können Waschdauern von 25 bis 30 min geeignet sein. Waschzeiträume von zweimal 10 min oder dreimal 5 min in einem geeigneten Puffer können ebenfalls gute Ergebnisse liefern.
  • In einigen Fällen, insbesondere wenn Bindungspartner verwendet werden, die wenigstens eine Fluorescein-Markierung tragen, ist gezeigt worden, dass es vorteilhaft ist, den pH des Waschpuffers zu erhöhen. Eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist bei Verwendung eines Waschpuffers mit einem alkalischen pH beobachtet worden. Dies ist offensichtlich auf eine signifikante Verringerung der nicht-spezifischen Bedingung zurückzuführen. In solchen Fällen ist es bevorzugt, dass die Waschlösung in Schritt (3) einen pH-Wert von 8 bis 10,5, vorzugsweise von 9 bis 10 aufweist.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • In Fällen, wo das Präparat auf Objektträger aufgebracht wird, können die Hybridisationsergebnisse sichtbar gemacht werden unter Verwendung von wohlbekannten immunhistochemischen Färbemethoden, um die Markierung an dem Bindungspartner nachzuweisen. Wenn fluoreszierend markierte Bindungspartner verwendet werden, können die Hybride nachgewiesen werden unter Verwendung eines Antikörpers gegen die fluoreszierende Markierung, welcher Antikörper mit einem Enzym konjugiert sein kann. Die fluoreszierende Markierung kann alternativ direkt unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen werden oder die Ergebnisse können automatisch mittels eines auf Fluoreszenz basierenden Bildanalysesystems analysiert werden.
  • Wenn mit Biotin markierte Bindungspartner verwendet werden, können die Hybride nachgewiesen werden unter Verwendung eines Antikörpers gegen die Biotin-Markierung, welcher Antikörper mit einem Enzym konjugiert sein kann. Sofern erforderlich, kann eine Verstärkung des Signals erzeugt werden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Amplifizierungssystemen, wie des katalysierten Signalamplifizierungssystems für biotinylierte Sonden (DAKO K 1500).
  • In dem Falle einer suspendierten Probe, wie einer Zellsuspension, können quantitative Ergebnisse erhalten werden unter Verwendung von Bindungspartnern, welche eine fluoreszierende Markierung umfassen, und eines Durchflusszytometers, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle aufzuzeichnen.
  • Bindungspartner, die im Rahmen von einigen Aspekten der Methode verwendet werden, können Nukleinsäure/Bindungspartner-Hybride bilden, die durch einen in WO 95/17430 beschriebenen Antikörper erkannt werden können. Zwischen dem Bindungspartner, Nukleinsäure und dem Antikörper gebildete Hybride können im Rahmen einer direkten immunhistochemischen Färbemethode nachgewiesen werden beispielsweise unter Verwendung einer Enzym konjugierten Form des Antikörpers, gefolgt von einem Nachweis der Enzymaktivität, oder durch die Anwendung von wohlbekannten indirekten immunhistochemischen Färbetechniken.
  • ILLUSTRATIVE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Um die Methode vollständiger zu veranschaulichen, werden die grundlegenden Aspekte einer an Gewebeschnitten (A), an Zellen in Suspension (B) oder an Chromosomenspreitungen (C) ausgeführten in situ-Hybridisation beschrieben. Obwohl die beschriebenen Vorgehensweisen für einen bestimmten Test ausgelegt sind, wird der Fachmann auf diesem Gebiet verstehen, dass die prinzipiellen Testprozeduren leicht ausgeführt werden können unter Verwendung der geeigneten Bindungspartner für den Nachweis von vielen anderen spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Proben von menschlichem Ursprung.
  • A: Vorgehensweise zum Ausführen einer in situ-Hybridisation an Gewebeschnitten für den Nachweis von humanem Papillomavirus (HPV)
  • Eine Infektion mit Papillomavirus ist traditionell unter Verwendung einer histologischen Färbung, von Elektronenmikroskopie oder von Immunhistochemie, welche für den Nachweis von viralen Antigenen ausgelegt war, diagnostiziert worden. Jedoch sind diese Methoden allesamt relativ unempfindlich. Es sind mehrere unterschiedliche HPV-Typen bekannt, z.B. die HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 35, 45, 51 und 52. Ausgehend von diesen können spezifische Sequenzen als das Ziel eines Nachweises ausgewählt werden. Beispielsweise wird ein in situ-Hybridisationsprotokoll für den Nachweis von mit HPV 16 infiziertem Zervixgewebe unter Verwendung von typspezifischen Bindungspartnern beschrieben.
  • Schritt (1): Vorbereitung der Probe
  • Eine Plattenepithelzellen von Uteruszervixgewebe enthaltende Biopsie wird so behandelt, dass die morphologische Unversehrtheit der zellulären Matrix und der Nukleinsäure innerhalb der Zelle aufrechterhalten bleibt. Die Biopsie wird so bald wie möglich in einen fixierten Zustand entweder mittels einer chemischen Fixierung oder durch Einfrieren gebracht. Eine bevorzugte Behandlung besteht darin, ein Fixiermittel, wie Formaldehyd, vorzugsweise als eine 4%-ige (v/v) Lösung in Puffer bei neutralem pH, zu verwenden. Nach einer Fixierung für typischerweise 12 bis 14 h wird die Biopsie in Paraffin eingebettet. Die in Paraffin eingebettete Biopsie kann unverzüglich verwendet werden oder kann bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von Jahren aufbewahrt werden. Aus der in Paraffin eingebetteten Biopsie werden dünne Schnitte mit einer Dicke von typischerweise 3-6 μm geschnitten und auf silanisierte oder ansonsten mittels eines Haftmittels behandelte Mikroskop-Objektträger transferiert.
  • Der Objektträger wird dann getrocknet, beispielsweise durch Inkubieren des Objektträgers für 30 min bei 60°C in einem Ofen.
  • Die Objektträger werden von Wachs befreit, beispielsweise durch Eintauchen in eine Wachsentfernungslösung, wie Xylol, und rehydratisiert, z.B. durch Eintauchen in 99% Ethanol, 95% Ethanol, Lufttrocknen und Eintauchen in beispielsweise Milli Q-Wasser. Um die Zugänglichkeit der Zielsequenzen für den Bindungspartner zu erhöhen, kann der Gewebeschnitt mit einem proteolytischen Agens, wie Proteinase K, behandelt werden. Die Objektträger werden in einem geeigneten Puffer, wie einem TBS-Puffer, gespült.
  • Schritt (2) Hybridisation
  • Für das Nachweisen von HPV 16 können Bindungspartner, welche polymerisierte Komponenten der Formel (I)-(VII) umfassen, verwendet werden. Die Auswahl von Nukleobasen, die für den Nachweis des HPV 16 spezifisch sein werden, basiert auf öffentlich verfügbaren Sequenzinformationen, die von verschiedenen Datenbanken gewonnen werden. Eine der zwischen den verschiedenen HPV-Subtypen am stärksten variierenden Regionen ist das offene Leseraster E6/E7, das zwei Proteine (E6 und E7), die an der Transformation von infizierten Zellen beteiligt sind, kodiert. Geeignete Bindungspartner, welche zur Bildung von ausreichend stabilen Hybriden mit mRNA, welche diese Proteine kodiert, fähig sind, werden ausgewählt und synthetisiert.
  • Eine geeignete Menge von unmarkiertem oder markiertem Bindungspartner wird zusammen mit einer geeigneten Hybridisationsmischung, welche ein Hybrid-destabilisierendes Agens umfasst, mit dem Gewebeschnitt in Kontakt gebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Hybridisationsmischung 30% bis 50% Formamid. Der Gewebeschnitt auf dem Objektträger wird bei einer geeigneten Temperatur für eine geeignete Zeitspanne inkubiert. Typischerweise werden eine Bindungspartnerkonzentration von 20 bis 100 nM, Inkubationstemperaturen von 40°C bis 60°C und Hybridisationsdauern von 10 bis 20 min verwendet.
  • Schritt (3): Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger werden gewaschen, um jeglichen ungebundenen und jeglichen nichtspezifisch gebundenen Bindungspartner zu entfernen. Die Objektträger werden typischerweise in einem TBS-Puffer bei einer Temperatur von 40°C bis 65°C 15 bis 45 min gewaschen. Die nicht-spezifische Bindung kann bei Verwendung eines alkalischen Waschpuffers signifikant verringert werden. Es kann ein Waschpuffer mit einem pH-Wert von 8 bis 10,5 eingesetzt werden, vorzugsweise von 9 bis 10.
  • Schritt (4): Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Die Hybridisationsergebnisse können sichtbar gemacht werden unter Verwendung von wohlbekannten immunhistochemischen Färbemethoden, um die Markierung an dem Bindungspartner nachzuweisen. Wenn fluoreszierend markierte Bindungspartner verwendet werden, können die Hybride unter Verwendung eines Antikörpers gegen die fluoreszierende Markierung, welcher Antikörper mit einem Enzym konjugiert sein kann, nachgewiesen werden. Die fluoreszierende Markierung kann alternativ direkt unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen werden oder die Ergebnisse können automatisch mittels eines auf Fluoreszenz basierenden Bildanalysesystems analysiert werden.
  • Wenn mit Biotin markierte Bindungspartner verwendet werden, können die Hybride nachgewiesen werden unter Verwendung eines Antikörpers gegen die Biotin-Markierung, welcher Antikörper mit einem Enzym konjugiert sein kann. Sofern erforderlich, kann eine Verstärkung des Signals erzeugt werden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Amplifizierungssystemen, wie des katalysierten Signalamplifizierungssystems für biotinylierte Sonden (DAKO K 1500).
  • Bindungspartner, die im Rahmen von einigen Aspekten der Methode verwendet werden, können Nukleinsäure/Bindungspartner-Hybride bilden, die durch einen in WO 95/17430 beschriebenen Antikörper erkannt werden können. Zwischen dem Bindungspartner, Nukleinsäure und dem Antikörper gebildete Hybride können im Rahmen einer direkten immunhistochemischen Färbemethode nachgewiesen werden beispielsweise unter Verwendung einer Enzymkonjugierten Form des Antikörpers, gefolgt von einem Nachweis der Enzymaktivität, oder durch die Anwendung von wohlbekannten indirekten immunhistochemischen Färbetechniken.
  • B: In situ-Hybridisation in suspendierten Präparaten zur Bestimmung von mRNA, welche die konstante Region der leichten Kette von Immunglobulin Kappa kodiert.
  • Schritt (1): Vorbereitung der Probe
  • Venöses Blut wird in ein Teströhrchen, welches ein gerinnungshemmendes Mittel (z.B. EDTA, Citrat oder Heparin) enthält, gesammelt. Die mononuklearen Zellen werden durch Zentrifugation auf einem Trennmedium isoliert oder alternativ werden die roten Blutkörperchen lysiert. Die mononuklearen Zellen werden zweimal mit einem synthetischen Kulturmedium, RPMI 1640 (Life Technologies), oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Ein geeigneter PBS-Puffer ist 0,01 M Phosphat, 0,14 M NaCl, pH 7,2. Die Zellen werden in einem Fixiermittel, wie 70% Ethanol (v/v), 15 min bei 4°C fixiert. Eine geeignete Konzentration von Zellen ist 107 Zellen pro ml des Fixiermittels.
  • Schritt (2): Hybridisation
  • Eine Suspension von Zellen (105-106 Zellen) wird zu 50 μl vorgewärmtem Hybridisationspuffer, wie Tris/HCl, pH 7,2, umfassend geeignete Mengen von Natriumchlorid, Natriumdodecylsulfat (SDS), einem Hybrid-destabilisierenden Agens, zusammen mit einer geeigneten Menge eines geeigneten Bindungspartners, z.B. eines mit einer Fluorescein-Markierung markierten Bindungspartners, z.B. in einer Konzentration von 20 bis 100 nM zugesetzt. Beispiele von geeigneten Bindungspartnern werden in Beispiel 1 beschrieben. Das Teströhrchen wird bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, z.B. bei einer Temperatur von 40°C bis 60°C. Nach 10-30 min wird die Hybridisation gestoppt, indem die Zellen durch Zentrifugation, z.B. bei 8000 g für 2 min, pelletiert werden.
  • Schritt (3): Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Zellen werden gewaschen, z.B. dreimal für 10 min jedes Mal bei einer Temperatur von 40°C bis 65°C in einem geeigneten Puffer, wie PBS, und nachfolgend in einer PBS-Lösung (z.B. 500 μl, pH 8,4) resuspendiert. Die Zellen werden gekühlt, z.B. bei 4°C, im Dunkeln bis zur Analyse aufbewahrt.
  • Schritt (4): Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Durchflusszytometrie: Wenn ein mit Fluorescein markierter Bindungspartner verwendet wird, können die Zellen mittels eines Durchflusszytometers (z.B. einem Becton Dickinson-FACScan-Durchflusszytometer), welches mit einer Ionenlaservorrichtung (z.B. einem Argonionenlaser) ausgerüstet ist, überwacht werden. Die Laser-Anregungswellenlänge des Becton Dickinson-FACScan-Durchflusszytometers ist 488 nm bei 15 mW. Die Lymphozyten werden identifiziert und eingegrenzt (gegated) durch Messen des Vorwärtsstreulichts und des 90°-Streulichts. Die grüne Fluoreszenz von Fluorescein wird durch einen 530 nm-Bandpassfilter erfasst. Diese Parameter werden als Pulshöhensignale (vier Dekaden in einer logarithmischen Skala) im List-Mode für 10000 Ereignisse mit einer Rate von ungefähr 200 Zellen pro Sekunde erfasst. Die Daten werden unter Verwendung der LYSYS II-Software analysiert.
  • Fluoreszenzmikroskopie: Abscheidungen einer geeigneten Anzahl von Zellen werden auf Glasobjektträger aufgetragen und diese werden mit Nagellack versiegelt und die Objektträger werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Positive Reaktionen werden als ein fluoreszierendes Präzipitat festgestellt.
  • C: In situ-Hybridisation für den Nachweis von Centromersequenzen in Chromosomen
  • Schritt (1): Vorbereitung der Probe
  • Metaphasen-Chromosomenspreitungen können ausgehend von peripherem Blut, Knochenmark, Amnion, Chorionzottenproben oder Tumorzellen hergestellt werden. Sofern sie ausgehend von peripherem Blut hergestellt werden, wird eine Probe von Vollblut, welche in ein Glasröhrchen, welches Heparin oder ein anderes gerinnungshemmendes Mittel enthält, gesammelt worden ist, mit einem geeigneten Kultivierungsmedium gemischt. Als ein Beispiel kann 1 ml Vollblut zu 8 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 20% (v/v) fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 E Penicillin/Streptomycin, 2% Phytohämagglutinin und 5 E/ml Heparin, zugegeben werden. Die Probe wird in einem CO2-Inkubator, z.B. bei 37°C 72 h, inkubiert. Die Chromo somen werden in der Metaphase der Mitose angehalten, z.B. durch Zugeben von Colcemid (0,1 μg/ml) zu der Kultur ungefähr 30 min vor dem Ernten der Zellen.
  • Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und in einem hypotonischen Puffer, z.B. 60 mM KCl, bei Raumtemperatur etwa 30 min resuspendiert. Die Probe wird mit einem geeigneten Fixiermittel, wie Methanol:Essigsäure 3:1, behandelt. Die Behandlung mit Fixiermittel kann mehrere Male wiederholt werden. Die Behandlung kann bei Gefriertemperaturen, wie bei –20°C, bis zu 20 min ausgeführt werden. Chromosomenspreitungen werden hergestellt, indem eine geeignete Menge der Suspension auf einen sauberen und kühlen Objektträger getüpfelt wird und der Objektträger luftgetrocknet wird.
  • Schritt (2): Hybridisation
  • Die Bindungspartner für das Nachweisen von Centromersequenzen können Bindungspartner sein, welche polymerisierte Komponenten der Formel (I)-(VII) umfassen. Die Auswahl von Nukleobasen, welche für Centromersequenzen der Chromosomen spezifisch sind, basiert auf öffentlich erhältlichen Sequenzinformationen.
  • Vor der Hybridisation wird die chromosomale DNA denaturiert. Eine solche Denaturierung kann ausgeführt werden, indem der Objektträger in eine Lösung von 2 × SSC und 70% Formamid bei etwa 70°C für eine kurze Zeitspanne, wie 2 min, gelegt wird.
  • Die Hybridisation kann ausgeführt werden, wie oben für Gewebeschnitte beschrieben (siehe Schritt (2) der Beschreibung von Ausführungsform A). Während der Hybridisation kann Dextransulfat in Konzentrationen bis zu 15% vorhanden sein, dies ist aber nicht erforderlich.
  • Alternativ können das Denaturieren und die Hybridisation gleichzeitig ausgeführt werden. Wenn sie gleichzeitig ausgeführt werden, ist es vorteilhaft, Formamid in einer Konzentration von etwa 60% zu verwenden.
  • Schritt (3): Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Der Objektträger kann in TBS, pH 7,4, typischerweise bei 40°C bis 65°C für 15 bis 45 min eingetaucht werden. Alternativ kann der Objektträger in einen SSC-Puffer, pH 7,0, enthaltend Triton X-100®, wie 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und 0,1% Triton X-100®, typischerweise bei 40°C bis 65°C für 5 bis 15 min eingetaucht werden.
  • Schritt (4): Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Der Nachweis von gebildeten Hybriden kann ausgeführt werden, wie oben für den Nachweis von HPV in Gewebeschnitten beschrieben (siehe Schritt (4) der Beschreibung von Ausführungsform A).
  • In den folgenden Beispielen werden spezielle Ausführungsformen der Erfindung aufgeführt.
  • BEISPIEL 1
  • Vergleich zwischen einer mit Bindungspartnern der Formel (VII) bzw. DNA-Sonden ausgeführten in situ-Hybridisation zur Bestimmung von mRNA, welche die konstante Region der leichten Kette von Immunglobulin Kappa kodiert
  • Die Bestimmung der Expression der leichten Kappa-Kette kann verwendet werden, um Klonalität von lymphoproliferativen Läsionen nachzuweisen, beispielsweise um Patienten mit multiplen Myelomen oder B-Zelllymphom zu klassifizieren.
  • Um die Verwendung von Bindungspartnern der Formel (VII) als Hybridisationssonden mit der Verwendung von äquivalenten, aber längeren DNA-Sonden zu vergleichen, wurde das folgende Experiment ausgeführt.
  • Vorbereitung von Proben
  • Proben von normalen, menschlichen Tonsillen wurden 24 h in 4% v/v pH-neutral gepuffertem Formaldehyd fixiert. Die fixierten Proben wurden in Paraffin eingebettet unter Bildung eines Blocks, ausgehend von welchem Schnitte mit einer Dicke von 4 bis 5 μm geschnitten und auf vorbeschichtete Objektträger (SuperFrost Plus, Menzel-Gläser, Deutschland, 041300) gelegt wurden. Die Objektträger wurden 60 min bei 65°C inkubiert.
  • Es wurde eine Vorbehandlung ausgeführt, um Gewebe-mRNA-Zielsequenzen zu entmaskieren und die Gewebeschnitte für Bindungspartner und Nachweisreagenzien zu permeabilisieren. Die Schnitte wurden von Wachs befreit und dehydratisiert (rehydratisiert) durch eine Reihe von Behandlungen mit Xylol, 99% Ethanol, 95% Ethanol bzw. Diethylpyrocarbonatbehandeltem, ultrareinem Wasser (DEPC-Wasser). Die Gewebeschnitte wurden mit Proteinase K (DAKO, Dänemark, S 3020, 1:10 in TBS) in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur 30 min verdaut. Nach dem Verdau wurden die Objektträger zweimal in DEPC-Wasser bei Raumtemperatur jeweils 5 min gewaschen, in 96% v/v Ethanol 10 s eingetaucht und luftgetrocknet.
  • Hybridisation
  • Bindungspartner, umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurden synthetisiert, wie oben beschrieben. Für den Nachweis der mRNA, welche die konstante Region der leichten Kappa-Kette kodiert, wurden drei Bindungspartner (Formeln (VIIa, VIIb, VIIc)), welche jeweils 15 Nukleobasen komplementär zu Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette umfassten, verwendet. An jeden Bindungspartner wurde eine Fluorescein-Markierung über Linkereinheiten L, wie unten gezeigt, angeheftet. Die Bindungspartner werden vom N- zum C-Terminus unter Verwendung von normalen Peptid-Konventionen geschrieben, d.h. H bezeichnet eine freie terminale Aminogruppe und -NH2 bezeichnet eine terminale Carboxamidgruppe. Die Sequenzen der synthetisierten Bindungspartner waren, wie folgt: Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIa) Flu-L-L-ACT-TTG-GCC-TCT-CTG-NH2 (VIIb) Flu-L-L-GAC-AGA-TGG-TGC-AGC-NH2 (VIIc)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(H2CH2O)2CH2C(O)- bezeichnet.
  • Für die Hybridisation wurden die Bindungspartner entweder getrennt oder in Kombination verwendet. In einem jeglichen Fall betrug die Konzentration von jedem der Bindungspartner 20 nM (0,1 ng/μl).
  • DNA-Sonden: DNA-Oligonukleotide, umfassend 25 bis 30 Nukleotide, wurden so ausgewählt, dass sie mit den gleichen Regionen der mRNA für die konstante Region der leichten Kappa-Kette wie die oben gezeigten Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) hybridisierten. DNA-Oligonukleotide wurden synthetisiert unter Verwendung eines ABI-Synthetisiergeräts, wurden gereinigt und markiert. Ein Einbau von Flu-12-dUTP über das Enzym terminale Desoxyribonukleotidtransferase (TdT, Boehringer Mannheim) führte zu einer durchschnittlichen Markierung von drei Fluorescein-Markierungen pro Sonde. In dem Hybridisationsschritt wurden die DNA-Sonden getrennt oder in Kombination verwendet, in einem jeden Falle in einer Konzentration von 12 nM (0,1 ng/μl).
  • Die luftgetrockneten Gewebeschnitte auf den Objektträgern wurden jeweils mit 15 μl Hybridisationslösung bedeckt. Die Hybridisationslösung bestand aus 10 mM NaCl (0,6 M NaCl für die DNA-Sonden) (Merck, Deutschland, 6404.5000), 10% Dextransulfat w/v (Gew./Vol.) (Sigma USA, D-8906), 30% Formamid v/v (Life Technologies, USA, 551508), 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,2% Polyvinylpyrrolidon (MG 40000), 0,2% Ficoll (MG 400000), 5 mM Na2EDTA, 0,05 M Tris/HCl, pH 7,5, und den jeweiligen Bindungspartnern in den oben angegebenen Konzentrationen. Die Schnitte wurden mit Deckgläschen bedeckt, um eine gleichmäßige Verteilung der Hybridisationslösung sicherzustellen, und sie wurden im Dunkeln in einer feuchten Kammer bei 37°C 1,5 h inkubiert.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Nach der Hybridisation wurden das Deckgläschen und die Hybridisationslösung entfernt und die Objektträger wurden in ein Gefäß, enthaltend TBS mit pH 7,6, transferiert und bei Raumtemperatur gehalten. Die Objektträger wurden 3 × 3 min gewaschen und der Puffer wurde zwischen jedem Waschvorgang erneuert.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Nach dem nach der Hybridisation erfolgenden Waschen wurden die Objektträger in TBS bei Raumtemperatur eingetaucht. Ein gebrauchsfertiges Kaninchen (Fab)-anti-FITC/AP-Konjugat (DAKO K0076) wurde verwendet, um die gebildeten Hybride nachzuweisen. Die Objektträger wurden 30 min mit dem Antikörper in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation ließ man den Antikörper durch leichtes Klopfen ablaufen und die Objektträger wurden zweimal in TBS, jedes Mal für 3 min, gewaschen, gefolgt von zwei Wäschen in Milli-Q-Wasser, jedes Mal für 1 min. Die über den Antikörper gebundene alkalische Phosphatase wurde durch Zugabe von BCIP/NBT-Substrat 1:50 bei pH 9,0 (DAKO K0046) überwacht und die Objektträger wurden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur 1 h inkubiert (BCIP ist 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und NBT ist Nitroblautetrazolium). Schließlich wurden die Objektträger in Leitungswasser gewaschen und unter Verwendung von Glycergel (DAKO, C 0563) eingedeckt.
  • Abschließende Bemerkungen
  • Eine Hybridisation, d.h. positive Färbungen, wurde unter dem Mikroskop als eine dunkelblaue/schwarze Färbung erkannt. Es zeigte sich, dass das mit den separaten oder kombinierten Bindungspartnern (VIIa)-(VIIc) erhaltene Signal stärker war als das Signal, das mit den äquivalenten separaten oder kombinierten DNA-Sonden erhalten wurde, sogar obwohl an den Bindungspartnern (VIIa)-(VIIc) weniger Nachweismoleküle zur Verfügung standen (nur eine Markierung an jedem der Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) verglichen mit durchschnittlich drei Markierungen an jeder der DNA-Sonden). Es wurde eine nicht-spezifische Bindung beobachtet, wenn die Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) verwendet wurden, insbesondere wenn die drei Bindungspartner in Kombination verwendet wurden.
  • Im Gegensatz zu einer Hybridisation zwischen zwei Nukleinsäuresträngen scheint die Hybridisation zwischen Bindungspartnern, welche polymerisierte Komponenten der Formel (VII) umfassen, und einer Zielnukleinsäure gegenüber der Salzkonzentration unempfindlich zu sein. Es wurde kein Unterschied beim Verhältnis zwischen spezifischer und nicht-spezifischer Bindung in einem Experiment unter Verwendung von 0,01 M, 0,1 M oder 0,6 M NaCl in den Hybridisationslösungen beobachtet. Darüber hinaus wurde kein Unterschied festgestellt, wenn der pH-Wert der Hybridisationslösung von 7,6 auf 9,0 oder 10,0 geändert wurde.
  • BEISPIEL 2
  • Auswirkung einer Variation der Konzentration von Bindungspartner, der Hybridisation- und Waschtemperaturen und -dauern auf die Hybridisation beim Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Die drei in Beispiel 1 erwähnten Bindungspartner wurden getrennt oder in Kombination verwendet. Die Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) wurden in einer Hybridisationslösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet mit der Ausnahme, dass die Konzentration von jedem Bindungspartner 20, 50 bzw. 100 nM betrug. Inkubationen erfolgten für 1½ h bei 37°C, 45°C, 50°C, 55°C bzw. 60°C.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Nach der Hybridisation erfolgende Wäschen (Posthybridisations-Wäschen) erfolgten in TBS, pH 7,6, für 25 min bei der gleichen Temperatur wie für die Hybridisation, nämlich bei 37°C, 45°C, 50°C, 55°C bzw. 60°C.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Abschließende Bemerkungen
  • Die Ergebnisse zeigten an, dass keine Verbesserung hinsichtlich des Signal-Rausch-Verhältnisses erhalten wurde, wenn Konzentrationen von Bindungspartnern (VIIa)-(VIIc) höher als 20 nM verwendet wurden. Dies war auf eine gleichzeitige Zunahme der nicht-spezifischen Bindung zurückzuführen. Eine erhöhte Temperatur während der Hybridisation und dem nach der Hybridisation erfolgenden Waschen verringerte die nicht-spezifische Bindung, ohne die spezifische Bindung zu verringern. Die Abnahme der nicht-spezifischen Bindung wurde am deutlichsten beobachtet, wenn die Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) in Kombination verwendet wurden. Das höchste Signal-Rausch-Verhältnis wurde erhalten bei Verwendung von jedem der drei Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) getrennt in einer Konzentration von 20 nM und Ausführung von Hybridisation und Waschen bei einer Temperatur von 55°C. Für die individuellen Bindungspartner wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet.
  • BEISPIEL 3
  • Auswirkung von Variationen der Posthybridisations-Waschlösung auf die Bindung von Bindungspartnern bei dem Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Um die Natur der Bindung der drei Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) weiter zu untersuchen, wurden verschiedene Posthybridisations-Waschlösungen hergestellt.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Die Hybridisationsbedingungen waren identisch zu den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen mit der Ausnahme, dass die Hybridisationstemperatur 55°C betrug. Es wurde eine Kombination der drei in Beispiel 1 beschriebenen Bindungspartner verwendet, jeweils in einer Konzentration von 20 nM.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde ausgeführt unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten Lösungen. Das Waschen wurde für 25 min bei 55°C unter sanftem Schütteln ausgeführt.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
    Posthybridisations-Lösung Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    0,05 M TBS, pH 7,6 +++(+) ++
    0,05 M TBS, pH 9,1 +++(+) +
    0,05 M TBS, pH 9,5 +++(+) (+)
    0,05 M TBS, pH 10,0 +++ –
    0,05 M TBS, pH 10,5 (+) –
    0,05 M TBS, pH 11,0 – –
  • In Bezug auf die spezifische Bindung (spezifische Färbung) war das für die Auswertung verwendete Bewertungssystem, wie folgt: ++++; +++(+), +++; ++(+); ++; +(+); + und (+), wobei ++++ bis (+) eine Bewertung ausgehend von intensiven, spezifisch gefärbten Zellen bis zu schwachen oder wenigen spezifisch gefärbten Zellen bezeichnen. Eine als – angegebene Bewertung bezeichnet keine Färbung.
  • In Hinblick auf die nicht-spezifische Bindung (Hintergrundfärbung) war das für die Auswertung verwendete Bewertungssystem, wie folgt: ++; +(+); + und (+), wobei ++ bis (+) eine Bewertung ausgehend von einer homogenen Färbung von Zellen und interzellulärer Matrix, die die Auswertung von schwach positiven Zellen schwierig macht, bis zu einer schwachen homo genen Färbung von Zellen und interzellulärer Matrix bezeichnen. Eine als – angegebene Bewertung bezeichnet keine Hintergrundfärbung (keine nicht-spezifische Bindung).
  • Abschließende Bemerkungen
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von TBS enthaltenden Posthybridisations-Waschlösungen mit einem pH von etwa 9 bis 10 zu einer signifikanten Verringerung der nichtspezifischen Bindung führt, ohne dass die Intensität der spezifischen Bindung signifikant beeinträchtigt wird. Sogar bei einer Verwendung einer hohen Konzentration von Bindungspartner, z.B. 50 nM, nimmt die in Beispiel 1 beschriebene nicht-spezifische Bindung signifikant ab, wenn ein alkalischer Waschpuffer verwendet wird (siehe Beispiel 6).
  • BEISPIEL 4
  • Einfluss von unterschiedlichen Hybrid-destabilisierenden Agentien auf die Hybridisation beim Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Hybridisationsbedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Hybrid-destabilisierende Agens variiert wurde. Es wurden drei unterschiedliche Hybrid-destabilisierende Agentien verwendet, nämlich Formamid, Ethylenglycol und Glycerol. Es wurde eine Kombination der drei Bindungspartner (VIIa)-(VIIc) aus Beispiel 1 verwendet und die Hybridisation wurde für 60 min bei 55°C ausgeführt. Die Konzentration von jedem der Bindungspartner betrug 20 nM.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger wurden bei 55°C in TBS-Puffer mit pH 10 gewaschen. Die Waschdauer betrug 25 min.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Das Bewertungssystem ist, wie in Beispiel 3 beschrieben; nb bezeichnet nicht bestimmt. In allen Experimenten wurde nur eine vernachlässigbare nicht-spezifische Bindung beobachtet. TABELLE 2
    % Hybrid-destabilisierendes Agens Spezifische Bindung Formamid Spezifische Bindung Ethylenglycol Spezifische Bindung Glycerol
    10 nb. nb. –
    20 ++ (+) nb.
    25 nb. nb. –
    30 +++ (+) nb.
    40 ++++ + nb.
    50 +++ +++ ++(+)
    60 +++ +++ nb.
    64 8 nb. ++++ nb.
  • BEISPIEL 5
  • Variation von sowohl Hybrid-destabilisierendem Agens als auch Hybridisationsdauer bei dem Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Hybridisationsbedingungen, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die folgenden Konzentrationen des Hybrid-destabilisierenden Agens verwendet wurden: Formamid, 30%, Ethylenglycol, 65% und Glycerol, 50%. Hybridisationsdauern 15, 30 bzw. 60 min.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger wurden bei 55°C in TBS-Puffer mit pH 10 gewaschen und die Waschdauer betrug 25 min.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Die Definition des Bewertungssystems ist in Beispiel 3 angegeben. In allen Experimenten wurde nur eine vernachlässigbare nicht-spezifische Bindung beobachtet. TABELLE 3
    Hybridisationsdauer (Minuten) Spezifische Bindung Formamid Spezifische Bindung Ethylenglycol Spezifische Bindung Glycerol
    15 +++ – –
    30 +++ +(+) +
    60 +++ ++(+) ++
  • Abschließende Bemerkungen
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass längere Hybridisationsdauern erforderlich sind, wenn Ethylenglycol oder Glycerol als Hybrid-destabilisierendes Agens verwendet werden, verglichen mit jenen von Formamid.
  • BEISPIEL 6
  • Auswirkung einer Variation des pH einer TBS-Posthybridisations-Waschlösung auf die Hybridisation von Bindungspartnern an Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Bindungspartner der Formeln (VIIa)-(VIIf), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurden synthetisiert, wie oben beschrieben. Die Bindungspartner umfassten 15 Nukleobasen komplementär zu Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Die Sequenzen der synthetisierten Bindungspartner waren, wie folgt: Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIa) Flu-L-L-ACT-TTG-GCC-TCT-CTG-NH2 (VIIb) Flu-L-L-GAC-AGA-TGG-TGC-AGC-NH2 (VIIc) Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-L-Flu (VIId) Flu-Lys(Flu)-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIe) Flu-Lys(Flu)-L-GAC-AGA-TGG-TGC-AGC-NH2 (VIIf)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet, Lys eine Lysin-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)- bezeichnet.
  • Hybridisationsbedingungen waren, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisationstemperatur 55°C betrug. Bindungspartner (VIIa), (VIIc), (VIId), (VIIe) und (VIIf) wurden getrennt verwendet oder Bindungspartner (VIIa), (VIIb) und (VIIc) wurden in Kom bination verwendet. Die Konzentration von jedem Bindungspartner betrug 20 nM (Tabelle 4A) bzw. 50 nM (Tabelle 4B).
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde in einem TBS-Puffer mit pH 7,6, 9,0 oder 10,0 für 25 min bei 55°C ausgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4A und 4B angegeben. Das verwendete Bewertungssystem wird in Beispiel 3 beschrieben. TABELLE 4A
    pH des Waschpuffers 7,6 9,0 10,0
    Bindungspartner (20 nM von jedem) Spezifische Bindung Nichtspezifische Bindung Spezifische Bindung Nichtspezifische Bindung Spezifische Bindung Nichtspezifische Bindung
    Kombination von (VIIa), (VIIb) und (VIIc) +++(+) ++ +++(+) + +++ –
    (VIIa) ++(+) + ++ (+) ++ –
    (VIId) +++ (+) +++ (+) ++(+) –
    (VIIe) +++ (+) +++ – ++(+) –
    (VIIc) ++ + ++ – ++(+) –
    (VIIf) +++ +(+) +++ + ++(+) (+)
    TABELLE 4B
    pH des Wasch-Puffers 7,6 9,0 10,0
    Bindungspartner (50 nM von jedem) Spezifische Bindung Nichtspezifische Bindung Spezifische Bindung Nichtspezifische Bindung Spezifische Bindung Nichtspezifische Bindung
    Kombination von (VIIa), (VIIb) und (VIIc) +++ ++ +++ + +++ (+)
    (VIIa) ++(+) +(+) ++(+) + ++ –
    (VIId) +++ +(+) +++ (+) ++(+) (+)
    (VIIe) +++ +(+) +++ (+) ++(+) –
    (VIIc) ++(+) +(+) ++ + ++ –
    (VIIf) +++(+) ++ +++ +(+) +++ (+)
  • Abschließende Bemerkungen:
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass die nicht-spezifische Bindung beseitigt werden kann, indem eine Waschlösung mit einem erhöhten pH verglichen mit einem pH von 7,6 verwendet wird, ohne die spezifische Bindung signifikant zu verringern.
  • BEISPIEL 7
  • Auswirkung einer Variation der Formamid-Konzentration auf die Hybridisationsleistungseigenschaften beim Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Es wurden die folgenden Bindungspartner, umfassend Komponenten der Formel (VII), verwendet: Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIa) oder Bio-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIg), wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet, Bio eine Biotin-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)- bezeichnet.
  • Die Hybridisationslösung war identisch mit der in Beispiel 1 beschriebenen Lösung mit der Ausnahme, dass die Formamidkonzentration von 0 bis 60% variiert wurde und dass die Konzentration des Bindungspartners (VIIa) oder (VIIg) 50 nM betrug. Die Objektträger wurden in einer feuchten Kammer im Dunkeln bei 55°C 1,5 h inkubiert.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde ausgeführt in einer TBS-Lösung mit pH 10 für 25 min bei 55°C unter sanftem Schütteln.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Der Nachweis von mit dem Fluorescein-markierten Bindungspartner (VIIa) gebildeten Hybriden wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Nachweis von mit dem Biotin-markierten Bindungspartner (VIIg) gebildeten Hybriden wurde ausgeführt unter Verwendung von Streptavidin/alkalischer Phosphatase (DAKO D396 1:100). Nach einer Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur wurden die Objektträger gespült und die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde durch Zugabe von BCIP/NBT-Substrat überwacht, wie in Beispiel 1 be schrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Definition des Bewertungssystems wird in Beispiel 3 angegeben. TABELLE 5
    Formamid-Konzentration (%) Flu-markierter Bindungspartner (VIIa) Bio-markierter Bindungspartner (VIIg)
    Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    05 – – – +
    – – (+) +
    11 (+) – (+) +
    15 (+) (+) (+) +
    20 + (+) ++ +
    30 ++(+) (+) +++ +
    40 +++ (+) ++(+) +
    50 60 +++ (+) + +
    +(+) (+) (+) +
  • Abschließende Bemerkungen
  • Aus den Ergebnissen kann geschlossen werden, dass für die in diesem Experiment verwendeten Bindungspartner und bei den angewendeten Hybridisations- und Posthybridisations-Waschbedingungen eine Konzentration von wenigstens 10-15% Formamid notwendig zu sein scheint, um eine spezifische Bindung zu erhalten. In diesem Experiment schien eine Konzentration von 30-50% Formamid das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu ergeben.
  • Bei Verwendung von anderen Bindungspartnern, welche polymerisierte Komponenten der Formel (VII) umfassen, z.B. von Bindungspartnern, die gegen die durch das EBV kodierten nuklearen EBER-RNAs gerichtet sind, sind annehmbare Ergebnisse erzielt worden ohne jegliches Formamid in der Hybridisationslösung, aber die besten Ergebnisse wurden nach wie vor mit 30-40% Formamid in dem Hybridisationspuffer erzielt (Ergebnisse nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 8
  • Variation der Hybridisationsdauer und der Konzentration von Bindungspartner bei alkalischem Wasch-pH und einer Temperatur von 55°C beim Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Die Hybridisation wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisationsdauer von 5 bis 90 min variiert wurde und dass die Hybridisationstemperatur bei 55°C gehalten wurde. Es wurde eine Kombination der drei Bindungspartner (VIIa)-(VIIc), die in Beispiel 1 beschrieben worden sind, verwendet. Die Konzentration von jedem der Bindungspartner betrug 6, 12, 25 oder 50 nM.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger wurden 25 min in einem TBS-Puffer mit pH 10 gewaschen. Die Waschtemperatur betrug 55°C.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6A und 6B angegeben. Die Definition des Bewertungssystems wird in Beispiel 3 angegeben. TABELLE 6
    Bindungspartner-Konzentration 50 nM (von jedem) 25 nM (von jedem)
    Hybridisationsdauer (min) Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    5 ++++ – +++(+) –
    15 ++++ – +++(+) –
    30 +++ – +(+) –
    45 ++++ (+) ++++ (+)
    60 ++++ (+) +++(+) (+)
    90 ++++ + +++(+) +
    TABELLE 6B
    Bindungspartner-Konzentration 12 nM (von jedem) 6 nM (von jedem)
    Hybridisationsdauer (min) Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    5 +++ – ++(+) –
    15 +++ – ++(+) –
    30 +++(+) – +++ –
    45 +++(+) (+) +++ –
    60 +++(+) (+) +++(+) (+)
    90 +++(+) + +++ (+)
  • Abschließende Bemerkungen
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass, wenn eine Hybridisation für eine Zeitspanne von 5 min bis 30 min ausgeführt wurde, keine nicht-spezifische Bindung beobachtet wurde. Es ist sehr bemerkenswert, dass sogar bei der sehr kurzen Hybridisationsdauer von 5 min eine sehr hohe Bewertung für die spezifische Bindung erhalten wurde. Es scheint, dass diese Bewertung nur geringfügig verringert wurde, wenn die Konzentration des Bindungspartners von 50 auf 6 nM verringert wurde. Jedoch wird eine schwache homogene nicht-spezifische Bindung an Zellen und interzelluläre Matrix (Bewertung (+)) bei längeren Hybridisationszeiten als 45 min erhalten.
  • Die in den Tabellen 6A und 6B gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass die Methode sehr flexibel in Hinblick auf mehrere Parameter ist, was die Methode tatsächlich sehr geeignet macht für sowohl ein schnelles Screening wie auch für eine Teilnahme an umfänglicheren Test-Konfigurationen, wo längere Hybridisationszeiten möglicherweise besser geeignet sind.
  • BEISPIEL 9
  • Kurze Hybridisationsdauer und Variation der Waschdauern beim Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette.
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Die Hybridisationbedingungen waren, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisationsdauer 15 min betrug und die Hybridisationstemperatur 55°C betrug. Die drei Bindungspartner, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind, (VIIa)-(VIIc) wurden in Kombination verwendet. Die Konzentration von jedem der Bindungspartner betrug 50 nM.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger wurden in einem TBS-Puffer mit pH 10 bei 55°C gewaschen und das Waschen wurde auf die folgenden drei Weisen ausgeführt: 1 × 25 min, 2 × 10 min bzw. 3 × 5 min.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Das Bewertungssystem ist, wie in Beispiel 3 definiert. TABELLE 7
    Waschdauern (Minuten) Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    25 ++++ –
    2 × 10 ++++ –
    3 × 5 ++++ –
  • BEISPIEL 10
  • Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette unter Verwendung von variablen Mengen von Dextransulfat
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Bindungspartner der Formeln (VIIa), (VIIb), (VIIc) oder (VIIm), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurden synthetisiert, wie oben beschrieben. Die verwendeten Bindungspartner umfassten 15 Nukleobasen komplementär zu Sequenzen in der leichten Kappa-Kette. Die Sequenzen der Bindungspartner waren, wie folgt: Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIa) Flu-L-L-ACT-TTG-GCC-TCT-CTG-NH2 (VIIb) Flu-L-L-GAC-AGA-TGG-TGC-AGC-NH2 and (VIIc) Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-L-L-Flu (VIIm)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2(O)- bezeichnet.
  • Die Bindungspartner (VIIa), (VIIb) und (VIIc) wurden in Kombination verwendet und der Bindungspartner (VIIm) wurde separat verwendet. Die Konzentration von jedem Bindungspartner betrug 50 nM bzw. 20 nM. Die verwendete Hybridisationslösung war, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass sie entweder 0% oder 10% Dextransulfat enthielt. Die Hybridisation wurde bei 55°C für 90 min ausgeführt.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde in einem TBS-Puffer mit pH 10,0 für 25 min ausgeführt.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Der Nachweis von gebildeten Hybriden wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind nachfolgend in den Tabellen 8A (mit einer Kombination der Bindungspartner (VIIa), (VIIb) und (VIIc) erhaltene Ergebnisse) und 8B (mit dem Bindungspartner (VIIm) erhaltene Ergebnisse) nachfolgend gezeigt. Die Definition des Bewertungssystems wird in Beispiel 3 angegeben. TABELLE 8A
    Konzentration von Bindungspartner Spezifische Bindung (10% Dextransulfat) Spezifische Bindung (0% Dextransulfat)
    Kombination von (VIIa), (VIIb) und (VIIc), 20 nM ++(+) –
    Kombination von (VIIa), (VIIb) und (VIIc), 50 nM +++ (+)
    TABELLE 8B
    Konzentration von Bindungspartner Spezifische Bindung (10% Dextransulfat) Spezifische Bindung (0% Dextransulfat)
    (VIIm), 20 nM ++ –
    (VIIm), 50 nM +++ –
  • BEISPIEL 11
  • Nachweis von Sequenzen in der konstanten Region der leichten Kappa-Kette unter Verwendung von variablen Mengen von Dextransulfat
  • Vorbereitung der Proben
  • Es wurden Schnitte von normalen menschlichen Tonsillen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Bindungspartner der Formeln (VIIa), (VIIb) und (VIIm), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurden synthetisiert, wie oben beschrieben. Die verwendeten Bindungspartner umfassten 15 Nukleobasen komplementär zu Sequenzen in der leichten Kappa-Kette. Die Sequenzen der Bindungspartner waren, wie folgt: Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH2 (VIIa) Flu-L-L-ACT-TTG-GCC-TCT-CTG-NH2 and (VIIb) Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-L-L-Flu (VIIm)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2(O)- bezeichnet.
  • Die Bindungspartner wurden in Kombination verwendet und die Konzentration von jedem Bindungspartner betrug 20 nM. Die verwendete Hybridisationslösung war, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisationslösung entweder kein Dextransulfat oder 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5% bzw. 15% Dextransulfat enthielt.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde in einem TBS-Puffer mit pH 7,6 oder mit pH 10,0 für 25 min ausgeführt.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Der Nachweis von gebildeten Hybriden wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind nachfolgend in den Tabellen 9A (bei Verwendung eines TBS-Puffers mit pH 7,6 als Posthybridisations-Waschpuffer erhaltene Ergebnisse) und 9B (bei Verwendung eines TBS-Puffers mit pH 10 als Posthybridisations-Waschpuffer erhaltene Ergebnisse) nachfolgend gezeigt. Die Definition des Bewertungssystems wird in Beispiel 3 angegeben. TABELLE 9A
    Konzentration von Dextransulfat (TBS, pH 7,6) Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    0% (+) –
    2,5% +++(+) ++(+)
    5% +++(+) ++(+)
    7,5% +++ +
    10% +++(+) ++
    12,5% +++(+) ++
    15% +++(+) ++(+)
    TABELLE 9B
    Konzentration von Dextransulfat (TBS, pH 10) Spezifische Bindung Nicht-spezifische Bindung
    0% (+) –
    2,5% +++ –
    5% +++ –
    7,5% ++ –
    10% +++(+) –
    12,5% +++(+) –
    15% +++(+) –
  • ReferenzBEISPIEL 12
  • Nachweis von Chlamydia trachomatis unter Verwendung einer in situ-Hybridisation
  • Klinische Proben von eukaryotischem Ursprung sind oftmals mit unterschiedlichen Bakterien oder Viren infiziert. Beispielsweise können Proben aus der Harnröhre oder dem Zervix mit C. trachomatis oder Neisseria gonorrhoea infiziert sein. Es wurden gegen die ribosomale 16S- und 23S-RNA von C. trachomatis gerichtete Bindungspartner ausgewählt und synthetisiert. Die Bindungspartner wurden mit einer Fluorescein-Markierung markiert.
  • Vorbereitung der Proben
  • Eine Infektion der Maus-Zelllinie 1929 mit dem L1-Stamm von C. trachomatis wurde durch Standardtechniken ausgeführt. Zellen, welche „Ganzzell-Einschlüsse" enthielten, wurden auf Glas-Mikroskopobjektträger ausgestrichen. Das Probenpräparat wurde 10 min in Aceton fixiert, luftgetrocknet und für eine nachfolgende in situ-Hybridisation verwendet. Auf eine ähnliche Weise hergestellte Objektträger, die aber Ausstriche von mit C. pneumoniae infizierten Zellen enthielten, wurden verwendet, um die Spezifität der Bindungspartner zu testen.
  • Hybridisation
  • Es wurden Bindungspartner synthetisiert, von denen einer gegen die ribosomale 16S-RNA von C. trachomatis gerichtet war (VIIh) und drei gegen die ribosomale 23S-RNA gerichtet waren ((VIIi), (VIIj) und (VIIk)). Die Bindungspartner waren allesamt mit einer Fluorescein-Markierung markiert, wie nachfolgend gezeigt. Die Sequenzen sind nachfolgend angegeben: Flu-L-AAC-GTT-ACT-CGG-ATG-NH2 (VIIh) Flu-L-GTC-TTT-GCT-TAT-CAC-NH2 (VIIi) Flu-L-L-TGT-CGC-TTT-GCA-TAC-NH2 (VIIj) Flu-L-L-CCT-TTA-TCC-TCA-ATC-NH2 (VIIk)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)- bezeichnet.
  • Die Bindungspartner wurden getrennt oder in Kombination verwendet. Die verwendete Hybridisationslösung wird in Beispiel 1 beschrieben mit der Ausnahme, dass 0,1% Triton X-100® zugesetzt worden war und dass die Konzentration von jedem der Bindungspartner 100 oder 500 nM betrug. Die Hybridisation wurde bei 55°C für 90 min ausgeführt.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger wurden in TBS-Puffer mit pH 7,6 bei 55°C 25 min gewaschen.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Die Objektträger wurden unter Verwendung eines Eindeckmediums, welches für einen Fluoreszenznachweis geeignet ist, eingedeckt und wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. Die Definition des Bewertungssystems ist in Beispiel 3 angegeben. TABELLE 10
    Bewertung der C. trachomatis-Fluoreszenz Bewertung der C. pneumoniae-Fluoreszenz
    Bindungspartner 100 nM 500 nM 100 nM 500 nM
    (VIIh) ++(+) +(+) – –
    (VIIi) + ++ – –
    (VIIj) +(+) ++(+) – –
    (VIIk) +(+) ++ – –
    Kombination von (VIIh), (VIIi), (VIIj) und (VIIk) +++ +++(+) – –
  • Abschließende Bemerkungen
  • Wie aus den Ergebnissen ersehen werden kann, hybridisierten die Bindungspartner mit C. trachomatis, nicht aber mit C. pneumoniae. Es kann auch ersehen werden, dass die spezifische Bindung verstärkt wird, wenn die Bindungspartner in Kombination (VIIh)-(VIIk) verwendet werden. Darüber hinaus wurde keine nicht-spezifische Bindung beobachtet.
  • ReferenzBEISPIEL 13
  • Nachweis von Chlamydia trachomatis unter Verwendung einer variablen Menge von Dextransulfat
  • Vorbereitung der Proben
  • Ausstriche von „Ganzzell-Einschlüsse" von C. trachomatis enthaltenden Zellen wurden hergestellt, wie in Beispiel 12 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Die vier Bindungspartner (VIIh)-(VIIk), wie in Beispiel 12 beschrieben, wurden in Kombination verwendet.
  • Die verwendete Hybridisationslösung war, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass sie des Weiteren 0,1% Triton X-100® enthielt. Darüber hinaus enthielt die Hybridisationslösung entweder 0% oder 10% Dextransulfat. Die Konzentration von jedem der Bindungspartner betrug 100 bzw. 500 nM. Die Hybridisation wurde bei 55°C für 90 min ausgeführt.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Die Objektträger wurden in TBS-Puffer mit pH 7,6 bei 55°C 25 min gewaschen.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Die Objektträger wurden unter Verwendung eines Eindeckmediums, welches für einen Fluoreszenznachweis geeignet ist, eingedeckt und wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 unten angegeben. TABELLE 11
    Konzentration von Bindungspartner Spezifische Bindung (10% Dextransulfat) Spezifische Bindung (0% Dextransulfat)
    Kombination von (VIIh), (VIIi), (VIIj) und (VIIk), 100 nM +(+)
    Kombination von (VIIh), (VIIi), (VIIj) und (VIIk), 500 nM ++(+)
  • BEISPIEL 14
  • Nachweis von Neisseria gonorrhoea in klinischen Proben
  • Vorbereitung der Proben
  • Abstriche wurden von der Harnröhre oder dem Zervix von acht Patienten, welche unter einer N. gonorrhoea-Infektion litten, genommen. Die Proben wurden auf der Grundlage einer Methylenblau- und/oder Gram-Färbung als positiv ausgewertet.
  • Ausstriche der Proben wurden auf Glas-Mikroskopobjektträgern hergestellt und nachfolgend durch Flammenfixierung fixiert.
  • Hybridisation
  • Bindungspartner der Formeln (VIIn) und (VIIp), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurden synthetisiert, wie oben beschrieben. Die Bindungspartner umfassten 15 Nukleobasen komplementär zu der ribosomalen 16S-RNA von Neisseria gonorrhoea und waren, wie folgt: Flu-L-L-CCC-CGC-TAC-CCG-GTA-NH2 (VIIn) Flu-L-L-CGC-ACA-TGT-CAA-AAC-NH2 (VIIp)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet und jedes L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)- bezeichnet.
  • Die Bindungspartner wurden in Kombination verwendet. Die Konzentration von jedem Bindungspartner betrug 500 nM. Die verwendete Hybridisationslösung war, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Lösung des Weiteren 0,1% Triton X-100® enthielt. Die Hybridisation wurde bei 55°C für 90 min ausgeführt.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde in einem TBS-Puffer mit pH 7,6 für 25 min ausgeführt.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Die Objektträger wurden unter Verwendung eines Eindeckmediums, welches für einen Fluoreszenznachweis geeignet ist, eingedeckt und wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
  • Abschließende Bemerkungen
  • Sieben der acht Proben waren eindeutig positiv, indem Zellen von N. gonorrhoea leicht identifiziert werden konnten. Darüber hinaus wurden bei sechs von diesen sieben Proben deutlich typische Diplokokken intrazellulär in den Granulozyten beobachtet. Eine Probe war negativ, als sie durch diese Methode getestet wurde.
  • BEISPIEL 15
  • Nachweis von Neisseria gonorrhoea unter Verwendung von variablen Mengen von Dextransulfat
  • Vorbereitung der Proben
  • Ausstriche von Proben wurden hergestellt, wie in Beispiel 14 beschrieben.
  • Hybridisation
  • Bindungspartner der Formeln (VIIn), (VIIo) und (VIIp), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurden synthetisiert, wie oben beschrieben. Die Bindungspartner umfassten 15 Nukleobasen in einer Sequenz komplementär zu der ribosomalen 16S-RNA von N. gonorrhoea. Die Sequenzen der Bindungspartner waren, wie folgt: Flu-L-L-CCC-CGC-TAC-CCG-GTA-NH2 (VIIn) Flu-L-L-CCC-CGC-CAA-CCA-GCT-NH2 (VIIo) Flu-L-L-CGC-ACA-TGT-CAA-AAC-NH2 (VIIp)wobei Flu eine 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet und L eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)- bezeichnet.
  • Die Bindungspartner wurden in Kombination verwendet und die Konzentration von jedem Bindungspartner betrug 100 nM. Die verwendete Hybridisationslösung war, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass zu der Lösung 0,1% Triton X-100® zugesetzt wurde und dass der Gehalt an Dextransulfat entweder 0% oder 10% betrug. Die Hybridisation wurde bei 55°C für 90 min ausgeführt.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Das nach der Hybridisation erfolgende Waschen wurde in einem TBS-Puffer mit pH 7,6 für 25 min ausgeführt.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Die Objektträger wurden unter Verwendung eines Eindeckmediums, welches für einen Fluoreszenznachweis geeignet ist, eingedeckt und wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 12 unten gezeigt. TABELLE 12
    Konzentration von Bindungspartner Spezifische Bindung (10% Dextransulfat) Spezifische Bindung (0% Dextransulfat)
    Kombination von (VIIn), (VIIo), und (VIIp), 100 nM ++(+) +(+)
  • BEISPIEL 16
  • Durchflusszytometrischer Nachweis von EBV in einem suspendierten Präparat unter Anwendung von in situ-Hybridisation
  • Herstellung der Proben
  • Frisch geerntete EBV-infizierte HS-Sultan-Zellen (5 × 107 Zellen/ml) oder nicht-infizierte CEM T-Zellen (Negativkontrolle; 5 × 10 Zellen/ml) wurden in 1% Paraformaldehyd 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixiert. Die Zellsuspension wurde bei 340 × g 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und, um endogene RNAse-Aktivität zu blockieren, wurde das Zellpellet in 2,5 ml 70% Ethanol, zu welchen 10 μl 10% Diethylpyrocarbonat (DEPC) zugesetzt worden waren (10% DEPC war in 70% Ethanol hergestellt worden), resuspendiert. Die Zellsuspension wurde bei RT 15 min inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 340 × g für 5 min. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet wurde in 70% Ethanol/DEPC resuspendiert. Das suspendierte Präparat wurde bei –20°C aufbewahrt, wenn es nicht unverzüglich für eine in situ-Hybridisation verwendet wurde.
  • Für eine in situ-Hybridisation wurden 100 μl des suspendierten Präparats mit 1 ml TBS gemischt. Die Suspension wurde bei 340 × g 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 0,5 ml TBS, enthaltend 5 μl Proteinase K (DAKO, S3020), resuspendiert. Die Suspension wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Zu der Zellsuspension wurde 1 ml TBS zugesetzt und die Suspension wurde bei 340 × g 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet wurde in 1 ml TBS resuspendiert. Nach einer Zentrifugation bei 340 × g für 5 min wurde der Überstand entfernt und das Zellpellet wurde in 100 μl TBS resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde einer Vorhybridisationsbehandlung mit der Hybridisationslösung, aber ohne Bindungspartner, unterworfen (100 μl Suspension wurden mit 0,5 ml Hybridisationslösung, enthaltend 30% Formamid, 1 × TEST, 5% Dextransulfat (TEST ist TBS, enthaltend 0,1% Triton X-100) gemischt.) Der Überstand wurde nach Zentrifugation bei 700 × g für 5 min entfernt und das Pellet wurde für eine Hybridisation verwendet.
  • Hybridisation
  • Für die Hybridisation wurde ein Bindungspartner der Formel (VIIs), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), verwendet. Der Bindungspartner umfasste 15 Nukleobasen komplementär zu einer Sequenz in durch EBV kodierter nuklearer EBER-RNA. Die Sequenz des Bindungspartners war, wie folgt: Bio-L-L-CCT-CTA-GGG-CAG-CGT-L-Lys-Bio (VIIs)worin Bio eine Biotin-Markierung bezeichnet. Lys bezeichnet eine Lysin-Peptid-Markierung und jedes L bezeichnet eine Linkereinheit der Formel -NH(CH2CH2O)2CH2C(O)-.
  • Die Hybridisation wurde ausgeführt, indem das oben erhaltene Pellet in 65 μl einer Mischung von 30% Formamid, 1 × TEST, 5% Dextransulfat und 500 nM Bindungspartner (VIIs) resuspendiert wurde. Die Probe wurde 1,5 h bei 55°C (Wasserbad) inkubiert.
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Nach der Hybridisation wurde 1 ml auf 55°C erwärmtes TEST zugesetzt und die Probe wurde bei 700 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet wurde in 1 ml auf 55°C erwärmtem TEST resuspendiert und die Probe wurde 45 min bei 55°C inkubiert. Die Probe wurde bei 700 × g 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in dem Nachweisschritt verwendet.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Das oben erhaltene Pellet wurde in 100 μl Streptavidin/FITC (DAKO, F0422), 1:50 in 1% BSA (Rinderserumalbumin) in TEST verdünnt, resuspendiert. Die Probe wurde im Dunkeln 30 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden 2 ml TEST zugegeben und die Probe wurde bei 700 × g 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 0,5 ml TEST resuspendiert und an einem Becton Dickinson-FACSort-Instrument analysiert.
  • Abschließende Bemerkungen
  • Mittels der oben beschriebenen Vorgehensweise wurde ein FITC-Fluoreszenzverhältnis von 5,79 an einer logarithmischen 4 Dekaden-Skala zwischen den EBV-positiven Zellen und den EBV-negativen CEM-Zellen beobachtet.
  • BEISPIEL 17
  • In situ-Hybridisation für den Nachweis von X-Chromosom-spezifischen Sequenzen in Chromosomen-Metaphasenspreitungen
  • Ein Nachweis von Centromer-spezifischen Sequenzen kann verwendet werden, um numerische Aberrationen von Chromosomen, z.B. bei einer pränatalen Diagnose oder einer Tumordiagnose, zu bestimmen.
  • Vorbereitung der Proben
  • Metaphasen-Chromosomenspreitungen wurden ausgehend von peripherem Blut hergestellt. 1 ml von weiblichem Vollblut wurde zu 8 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 20% (v/v) fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 E Penicillin/Streptomycin, 2% Phytohämagglutinin und 5 E/ml Heparin, in einem Glasröhrchen zugegeben. Die Probe wurde in einem CO2-Inkubator bei 37°C 72 h inkubiert. Die Chromosomen wurden in der Metaphase der Mitose durch Zugeben von Colcemid (0,1 μg/ml) zu der Kultur ungefähr 30 min vor dem Ernten der Zellen angehalten.
  • Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in einem hypotonischen Puffer (60 mM KCl) bei Raumtemperatur ungefähr 30 min resuspendiert. Die Probe wurde dreimal mit einer Fixiermittelmischung aus Methanol:Essigsäure 3:1 bei Raumtemperatur gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurde die Probe in dem Fixiermittel bei –20°C 20 min fixiert. Chromosomenspreitungen wurden hergestellt, indem eine geeignete Menge der Suspension auf einen sauberen und kühlen Objektträger getüpfelt wurde und der Objektträger luftgetrocknet wurde.
  • Denaturierung und Hybridisation
  • Ein Bindungspartner der Formel (VIIq), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), wurde synthetisiert, wie oben beschrieben. Der Bindungspartner (VIIq) umfasste 17 Nukleobasen komplementär zu einer Sequenz aus der Centromerregion HSSATX (erhalten aus der Datenbank Genebank) des X-Chromosoms. Die Sequenz des Bindungspartners war, wie folgt: Bio-L-L-AAC-TGA-ACG-GAA-AGC-AA-NH2 (VIIq)wobei Bio eine Biotin-Markierung bezeichnet und jedes L ein -NH(CH2CH2O)2-CH2(O)- bezeichnet. Die Konzentration des Bindungspartners betrug 100 nM.
  • Die luftgetrockneten Chromosomenspreitungen (hergestellt, wie oben beschrieben) wurden jeweils mit 15 μl Hybridisationslösung bedeckt. Die Hybridisationslösung enthielt 0,3 × SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 60% Formamid v/v (Life Technologies, USA, 551506), 0,1% Triton X-100® und den jeweiligen Bindungspartner. Die Probe wurde mit einem Deckgläschen abgedeckt, um ein Verdampfen und Austrocknen während der Inkubation zu vermeiden. Die Objektträger wurden auf eine auf 60°C äquilibrierte Heizplatte (Pactronic, Buch & Holm A/S, Dänemark) gelegt und 5 min inkubiert (Denaturierung und Hybridisation wurden gleichzeitig ausgeführt).
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Nach Denaturierung und Hybridisation wurden die Deckgläschen entfernt und die Objektträger wurden in ein Gefäß mit Waschpuffer aus 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und 0,1% Triton X-100® transferiert und 5 min bei 50°C in einem Wasserbad unter sanftem Schütteln gewaschen.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Nach dem nach der Hybridisation erfolgenden Waschen wurden die gebildeten Hybride durch Inkubation mit Fluorescein-markiertem Streptavidin (DAKO F0422, 1:50 in TBS-Puffer, pH 7,6, verdünnt) für 10 min in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur nachgewiesen. Nach der Inkubation wurde überschüssiges Konjugat durch sanftes Klopfen ablaufen gelassen und die Objektträger wurden kurz in entionisiertem Wasser für 1 min bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden unter Verwendung von Vectashield Mounting Medium (Vektor H-1000), enthaltend 0,5 μg/ml Propidiumiodid (Sigma), eingedeckt. Die Objektträger wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (Leica DM RB) inspiziert.
  • Abschließende Bemerkungen
  • Auf jeder Chromosomenspreitung in der Probe, welche den beiden X-Chromosomen entsprach (Chromosome werden leicht anhand der roten Fluoreszenz identifiziert), wurden zwei starke grün/gelb fluoreszierende Flecken beobachtet, was eine starke spezifische Bindung anzeigte. Es wurde keine nicht-spezifische Bindung beobachtet.
  • BEISPIEL 18
  • In situ-Hybridisation für den Nachweis von X-Chromosom-spezifischen Sequenzen in Chromosomen-Metaphasenspreitungen
  • Vorbereitung der Proben
  • Metaphasen-Chromosomenspreitungen wurden hergestellt, wie in Beispiel 17 beschrieben.
  • Denaturierung und Hybridisation
  • Es wurde ein Bindungspartner der Formel (VIIr), umfassend polymerisierte Komponenten der Formel (VII), synthetisiert, wie oben beschrieben. Der Bindungspartner (VIIr) umfasste 17 Nukleobasen komplementär zu einer Sequenz aus der Centromerregion HSSATX (erhalten aus der Datenbank Genebank) des X-Chromosoms. Die Sequenz des Bindungspartners war, wie folgt: Flu-βAla-Lys-(Flu-βAla)-AAC-TGA-ACG-GAA-AGC-AA-NH2 (VIIr)wobei jedes Flu eine 5- (und 6-)-Carboxyfluorescein- oder Fluoresceinisothiocyanat-Markierung bezeichnet. Der Bindungspartner der Formel (VIIr) endet in einem verzweigten markierten Ende („Zipper"), wobei die Markierung aus einer Peptid-Markierung (Ala und Lys) und einer Fluorescein-Markierung, nämlich Flu-βAla-Lys-(Flu-βAla)-, besteht.
  • Die Konzentration des Bindungspartners betrug 100 nM.
  • Die luftgetrockneten Chromosomenspreitungen (hergestellt, wie oben beschrieben) wurden jeweils mit 15 μl Hybridisationslösung bedeckt. Die Hybridisationslösung bestand aus 10 mM NaCl (Merck, Deutschland, 6404.5000), 10% Dextransulfat w/v (Gew./Vol.) (Sigma USA, D-8906), 60% Formamid v/v (Life Technologies, USA, 551506), 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,2% Polyvinylpyrrolidon (MG 40000), 0,2% Ficoll (MG 400000), 5 mM Na2EDTA, 0,05 M Tris/HCl, pH 7,5, und dem oben angegebenen Bindungspartner.
  • Die Probe wurde mit einem Deckgläschen abgedeckt, um Verdampfen und Austrocknen während der Inkubation zu vermeiden. Die Objektträger wurden auf eine auf 60°C äquilibrierte Heizplatte (Pactronic, Buch & Holm A/S, Dänemark) gelegt und 5 min inkubiert (Denaturierung und Hybridisation wurden somit gleichzeitig ausgeführt).
  • Entfernung von jeglichem ungebundenem und jeglichem nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner
  • Nach der Denaturierung und Hybridisation wurden die Deckgläschen entfernt und die Objektträger wurden in ein Gefäß mit Waschpuffer, 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und 0,1% Triton X-100®, transferiert und 5 min bei 50°C in einem Wasserbad unter sanftem Schütteln gewaschen.
  • Nachweis von gebildeten Hybriden
  • Nach dem nach der Hybridisation erfolgenden Waschen wurden die Objektträger 2 min in TBS-Puffer, pH 7,6, bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem kurzen Waschen in entionisiertem Wasser für 1 min bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden unter Verwendung von Vectashield Mounting Medium (Vektor H-1000), enthaltend 0,5 μg/ml Propidiumiodid (Sigma), eingedeckt. Die Objektträger wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (Leica DM RB) inspiziert.
  • Abschließende Bemerkungen
  • Auf jeder Chromosomenspreitung in der Probe, welche den beiden X-Chromosomen entsprach (Chromosome werden leicht anhand der roten Fluoreszenz identifiziert), wurden zwei starke grün/gelb fluoreszierende Flecken beobachtet, was eine starke spezifische Bindung anzeigte. Es wurde keine nicht-spezifische Bindung beobachtet.

Claims (22)

  1. Methode zum Nachweisen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe von menschlichem Ursprung unter Anwendung der in situ-Hybridisation, welche die folgenden Schritte umfasst: (a) Fixieren der Probe, (b) Kontaktieren der Probe mit einer Hybridisationslösung, umfassend: einen Bindungspartner, der zum Hybridisieren an die nachzuweisende spezifische Nukleinsäuresequenz fähig ist, um ein Hybrid zu bilden, welcher Bindungspartner einen polymeren Strang umfasst, der polymerisierte Komponenten mit einem nicht-cyclischen Rückgrat enthält, und ein Hybrid-destabilisierendes Agens in einer Menge, die darin wirksam ist, die Schmelztemperatur der zwischen der Nukleinsäure und dem Bindungspartner gebildeten Hybride herabzusetzen, um das Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nicht-spezifischen Bindung zu erhöhen, (c) Entfernen jeglichen ungebundenen und jeglichen nicht-spezifisch gebundenen Bindungspartners, und (d) Nachweisen des Vorhandenseins von gebundenem Bindungspartner in der Probe, wobei die Konzentration des Hybrid-destabilisierenden Agens in der Hybridisati onslösung über 10% v/v beträgt.
  2. Methode nach Anspruch 1, wobei der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (I) umfasst
    Figure 00520001
    worin Y O oder S bezeichnet, jedes X unabhängig O oder S bezeichnet, jedes Q einen Liganden bezeichnet, der unabhängig eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, einen Interkalator, eine Nukleobase-bindende Gruppe, eine Markierung oder H ist, u eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, p und s unabhängig 0 oder 1 bezeichnen, q und r unabhängig 0 oder 1 bezeichnen, t 0 oder 1 bezeichnet, R1 und R10, unabhängig H oder C1-4-Alkyl bezeichnen, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen.
  3. Methode nach Anspruch 2, wobei u, p, q, r, s, Y, X und Q wie in Anspruch 2 definiert sind, t 0 ist, R1 H oder CH3 bezeichnet, R3, R4, R6 und R9 H bezeichnen, und R2, R5, R7 und R8 unabhängig H oder die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen.
  4. Methode nach Anspruch 2, wobei der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (II) umfasst, welches Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, worin r 0 ist und q und s 1 sind,
    Figure 00530001
    worin Y, X, Q, p, t und u wie in Anspruch 2 definiert sind, R2, R5 und R7 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen, und R1 und R10 unabhängig H oder CH3 bezeichnen.
  5. Methode nach Anspruch 2, wobei der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (III) umfasst, welches Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, worin p, r und t 0 sind und q und s 1 sind,
    Figure 00530002
    worin Y, X, Q und u wie in Anspruch 2 definiert sind, R2, R5 und R7 unabhängig H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen
  6. Methode nach Anspruch 2, wobei der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (IV)-(VI) umfasst, welches Komponenten der allgemeinen Formel (I) sind, worin p, r und t 0 sind und u, s und q 1 sind,
    Figure 00540001
    worin R2, R5 und R7 H, die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder die Seitenkette einer nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure bezeichnen, und jedes Q unabhängig eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, einen Interkalator oder eine Nu kleobase-bindende Gruppe bezeichnet.
  7. Methode nach Anspruch 6, worin R2, R5 und R7 H oder die Seitenkette von Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser oder Thr bezeichnen, und Q Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil oder Hypoxanthin bezeichnet.
  8. Methode nach Anspruch 2, wobei der polymere Strang polymerisierte Komponenten der Formel (VII) umfasst, welches Komponenten der Formel (I) sind, worin p, r und t 0 sind und u, s und q 1 sind:
    Figure 00550001
    worin Q Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil oder Hypoxanthin bezeichnet.
  9. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der polymere Strang 8 bis 30 polymerisierte Komponenten enthält.
  10. Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin die polymerisierten. Komponenten der Formeln (IV)-(VII) wenigstens 75 Gew.-% des polymeren Strangs ausmachen.
  11. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Hybrid-destabilisierende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Formamid, Ethylenglykol und Glycerol.
  12. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Hybrid-destabilisierende Agens Formamid bei einer Konzentration von 30% bis 50% ist.
  13. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Hybrid-destabilisierende Agens Ethylenglykol bei einer Konzentration von 50% bis 65% ist.
  14. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe von menschlichem Ursprung eine Gewebesektion, ein Zellabstrich, eine Suspension von Zellen oder Teilen davon oder eine Chromosomenausbreitung ist.
  15. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die nachzuweisende Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure-(RNA)-Sequenz, vorzugsweise Messenger-RNA (mRNA), umfasst.
  16. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Bindungspartner außerdem ein oder mehrere Markierungen umfasst, die zueinander identisch oder verschieden sein können.
  17. Methode nach Anspruch 16, worin die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus fluoreszenten Markierungen, Biotin, Digoxigenin, Dinitrobenzoesäure, Peptidmarkierungen, Rhodamin, R-Phycoerythrin und Cyanin-Farbstoffen.
  18. Methode nach Anspruch 16 oder 17, wobei wenigstens eine Markierung eine fluoreszente Markierung ist.
  19. Methode nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (c) das Entfernen von ungebundenem oder nicht-spezifisch gebundenem Bindungspartner mit einem Waschpuffer bei alkalischem pH umfasst.
  20. Methode nach Anspruch 19, wobei der Waschpuffer einen pH-Wert von 8 bis 10,5 aufweist.
  21. Diagnostischer Kit zur Verwendung bei einer Methode zum Nachweisen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Probe von menschlichem Ursprung durch in situ-Hybridisation, welcher Kit umfasst eine Hybridisationslösung, umfassend wenigstens einen Bindungspartner, der zum Hybridisieren an eine nachzuweisende spezifische Nukleinsäuresequenz fähig ist, um Hybride zu bilden, ein Hybrid-destabilisierendes Agens in einer Menge, die darin wirksam ist, die Schmelztemperatur der zwischen der Nukleinsäure und dem Bindungspartner gebildeten Hybride herabzusetzen, um das Verhältnis zwischen der spezifischen Bindung und der nicht-spezifischen Bindung zu erhöhen, welcher Bindungspartner ein polymerer Strang ist, der polymerisierte Komponenten mit einem nicht-cyclischen Rückgrat enthält, wobei der polymere Strang zum Hybridisieren an die zu bestimmende Nukleinsäuresequenz fähig ist, wobei die Konzentration des Hybrid-destabilisierenden Agens in der Hybridisationslösung über 10% v/v beträgt.
  22. Diagnostischer Kit nach Anspruch 21, außerdem umfassend eines oder mehrere der folgenden: ein Reagenz für die Probenpräparation, ein Reagenz für die Probenfxierung, ein Reagenz für die Entfernung von ungebundenem oder nichtspezifisch gebundenem Bindungspartner und ein Reagenz für den Nachweis eines gebildeten Hybrids.
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