DE3786181T2

DE3786181T2 - Dns-probe, spezifisch fuer das maennliche genom der wiederkaeuer, ihre herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE3786181T2
Application number: DE19873786181
Authority: DE
Inventors: Colin Bishop; Corinne Cotinot; Marc Fellous; Marek Kirszenbaum; Marcel Vaiman
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1986-02-28
Filing date: 1987-02-27
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2007-02-28
Also published as: AU6920387A; FR2603701A2; EP0235046A1; DE3786181D1; IN167981B; FR2603701B2; CA1312565C; NZ219431A; AU596642B2; ES2042591T3; EP0235046B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Präparat mit molekularen DNA-Sonden, die spezifisch zur Bestimmung des Geschlechts - oder der Geschlechtsanlage - von Embryonen und Föten von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder und insbesondere der Gattung Bos, nützlich sind, welche für das männliche Geschlecht spezifische DNA-Sequenzen besitzen.
Die Geschlechtsanlage von Embryonen und Föten ist in mehrerlei Hinsicht mit einem großen Interesse verbunden. Die Bestimmung des Geschlechts von menschlichen Embryonen gestattet eine vorzeitige Feststellung bzw. Früherkennung von schweren genetischen Krankheiten, die mit dem Geschlecht des Embryos verbunden sind. Die Bestimmung des Geschlechts der Tierembryonen zur Aufzucht (oder der Geschlechtsanlage) ist, was sie betrifft, von großem wirtschaftlichem Interesse.
Das Geschlecht (männlich oder weiblich) wird wie man weiß durch die Geschlechtschromosomen bestimmt. Bei Säugetieren reicht das Vorliegen eines Y-Chromosoms aus, um einen männlichen Phänotyp zu erzeugen, und es scheint, daß die Gene, die das Geschlecht bestimmen und die auf dem Y- Chromosom vorhanden sind, sich wie ein dominantes genetisches Merkmal verhalten.
Der erste Schritt zur vorzeitigen Bestimmung des Geschlechts menschlicher Embryonen bestand somit aus einer Chromosomenanalyse von gezüchteten Zellen der Amnionflüssigkeit. Während dieser Analysentyp zwei bis drei Wochen dauert, erschien es notwendig, andere Verfahren zur vorzeitigen Bestimmung des Geschlechts von Embryonen bereitzustellen, die rascher Ergebnisse liefern können.
Es wurde festgestellt, daß die Gesamtheit des Y-Chromosoms nicht an der geschlechtlichen Differenzierung beteiligt ist. Es erschien somit als logisch, die Sequenzen, die auf dem Y-Chromosom vorhanden sind, zu analysieren, und der erste Schritt in dieser Hinsicht bestand aus der Isolierung und Clonierung der DNA des Y-Chromosoms.
Daher haben Kundel et al. (insbesondere in Biochem, Band 18, Nr. 15, S. 3343-3353, 1979) DNA-Fragmente von 3,4 Kilobasen (kb) von Männern durch Spaltung mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen, wie HaeIII, EcoRI oder EcoRII isoliert und haben gezeigt, daß die repetitive spezifische DNA des Chromosoms Y (Y-it-DNA) in diesen 3,4 kb Molekülen vorhanden ist. Während indes die Arbeiten von Kunkel et al. präzise Angaben über die Organisation der zwei Arten von repetitiven, jeweils spezifischen und nicht-spezifischen Sequenzen des Y-Chromosoms in jedem 3,4 kb Molekül angeben, sind sie nicht direkt für die Geschlechtsentwicklung nützlich.
Die Arbeiten von Bishop et al. (Nature, Band 303, 30. Juni 1983, S. 831-832) zeigten die Konstruktion einer Teilbank des Y-Chromosoms unter Verwendung eines Hybriden aus somatischen Zellen, die nur das menschliche Y-Chromosom enthalten, ausgehend von Mäusen, erhalten durch Fusion von menschlichen, männlichen Lymphocyten mit der Mauszell-Linie RAG und enthaltend eine mäßige Anzahl von vier menschlichen Y-Chromosomen pro Zelle. Sie haben DNA-Hybride mit einem erhöhten Molekulargewicht extrahiert und einen Teilabbau mit Hilfe des Restriktionsenzyms MboI durchgeführt und die 35-50 kb Fragmente in Escherichia coli-Bakterien unter Verwendung des Cosmids pJB8 cloniert. Um die Clone, die Insertionen aus menschlicher DNA (abgeleitet von Y) enthalten, von denen die, die Maus-DNA enthalten, zu unterscheiden, wurden die Kolonien bei geringer Dichte mit repetitiver mit ³²P-markierter menschlicher DNA getestet, mit dem Ziel, nur die repetitiven Sequenzen zu detektieren und die gewünschte Bank zu schaffen. Die Autoren haben unter den rekombinanten Clonen der von Y abgeleiteten, nicht-repetitiven DNA-Sequenzen selektioniert, um die Organisation des menschlichen Y-Chromosoms auf molekularer Ebene zu untersuchen. Diese Arbeiten, deren wissenschaftliches Interesse ausschlaggebend ist, sind auch nicht direkt für die Geschlechtsentwicklung von Embryonen von Säugetieren zur Aufzucht verwendbar.
Mehrere Methoden zur vorzeitigen Bestimmung des Geschlechts von menschlichen Embryonen wurden auf der Grundlage der Arbeiten von Kunkel et al. vorgeschlagen, d.h. unter Verwendung von für das Y-Chromosom spezifischen DNA-Sequenzen. Insbesondere schlugen Lau et al. (The Lancet, 7. Januar 1984, S. 14-16) einen Test zur Bestimmung des Geschlechts bei einem menschlichen Embryo mit Hilfe einer, ausgehend von der repetitiven menschlichen Sequenz von 3,4 kb, abgeleitet von dem Heterochromatin des Y-Chromosoms (Verfahren nach Kunkel et al.) zur Bestimmung des Geschlechts bei einem menschlichen Embryo vor. Diese Sonde wurde dann mit einer DNA isoliert aus einer kleinen Anzahl von Zellen aus 0,2 ml Amnionflüssigkeit hybridisiert. Der Hybridisierungsgrad ist 1000-fach größer bezüglich der DNA dea männlichen Genoms (isoliert aus Zelllen der Amnionflüssigkeit) als bezüglich der DNA des weiblichen Genoms. Das von Gosden et al. (The Lancet, 10. März 1984, S. 540-541) vorgeschlagene Verfahren, das das "DOT-BLOT"-Verfahren ist, verwendet eine für das Y-Chromosom spezifische Sonde mit der Bezeichnung pHY2,1, die zuvor von diesen Autoren beschrieben worden war. Diese Sonde hybridisiert mit DNA aus einer Biopsie der Choreonzotten eines männlichen, menschlichen Embryos.
Lamar und Palmer (Cell, Band 37, Mai 1984, S. 171-177) versuchten, ein allgemeines Verfahren zur Clonierung von DNA des Y-Chromosoms bei Mäusen zu entwickeln. Das von diesen Autoren vorgeschlagene Verfahren besteht darin, daß man DNA aus der Leber von weiblichen Mäusen durch Beschallung fragmentiert und die DNA von männlichen Mäusen vollständig durch MbOI abbaut. Eine Probe der fragmentierten, weiblichen DNA und der abgebauten männlichen DNA werden in einem Verhältnis von 100:1 vermischt. Das Gemisch wird denaturiert und mit einem Cot=1320 in einem geeigneten Puffer reassoziiert. Unter diesen Bedingungen liegen 95 % der DNA in Doppelstrangform vor. Diese bestehen aus homogener, weiblicher DNA, heterogenen Doppelsträngen aus männlich und weiblich entsprechend den beiden Geschlechtern gemeinsamen Sequenzen und schließlich aus spezifischen männlichen Duplices. Die Doppelstränge wurden chromatografisch über eine Hydroxylapatitsäule isoliert. Sie wurden in dem Plasmid pBR 322 rekombiniert. Die rekombinanten Plasmide wurden zur Transformation von kompetenten Escherichia coli-Bakterien HB 101 verwendet. Ungefähr 100.000 Clone (Ampr-Tets) wurden getestet, worunter 3000 die vermutlich für das Y-Chromosom spezifische DNA enthielten. Drei dieser Sonden erwiesen sich als spezifisch für die männliche Maus, was dem Nachweis einer Artspezifität der molekularen Sonden der männlichen DNA dienen könnte.
Unter anderem wurden mehrere Techniken zur Sortierung der Spermien angesichts ihrer Geschlechtsentwicklung vorgeschlagen:
- Sog. physikalische Verfahren zur Trennung von Spermien, die X- bzw. Y-Chromosomen tragen, durch Elektrophorese (Shishito et al., Int. J. Fertil, 20, 13-16, 1976), Gelfiltration, Passage durch einen Albumingradienten (Ericsson et al., Nature, Band 246, 421-424, 1973), Zentrifugation und insbesondere Zentrifugation in einem Dichtegradienten unter Verwendung von Percoll (Fertility and Sterility, Band 40, Nr. 5, Nov. 1983), Ultrazentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten etc.
- Verfahren zur Fraktionierung von Sperma in Fraktionen, die reich an Spermien, die das Y-Chromosom tragen, sind und/oder in Fraktionen, die reich an Spermien, die das X-Chromosom tragen, sind, indem man die Mobilitätsunterscheide der Spermien ausnutzt, die das Y-Chromosom tragen im Vergleich zu denen, die das X-Chromosom tragen, in unterschiedlichen Milieus (beispielsweise Albumingradienten) (US-PS 4 009 260) ebenso wie Verfahren zur Trennung von Spermien, die geeignet sind, eine Trennung als Funktion der Dichte zu erzeugen, indem man einen Vorteil aus der Tatsache zieht, daß die Dichte des Y- Chromosoms geringer als die des X-Chromosoms ist (US-PS 894 529), wobei diese Verfahren das Anbringen von hydrostatischen Kräften (US-PS 4 092 229 und US-PS 4 155 831), die Zentrifugation in einem Gradienten eines geeigneten Milieus, wie Percoll, beispielsweise umfassen. Man kann ebenso eine Spermienpopulation in unterschiedliche Fraktionen als Funktion der elektrischen Ladung, die mit den verschiedenen Geschlechtern verbunden ist, mit Hilfe eines Trägermaterials für eine elektrostatische Ladung auftrennen (US-PS 4 083 957). In die Zahl dieser Trennverfahren kann man ebenso Verfahren zur zellulären Sortierung mittels Durchflußcytometrie einreihen, d.h. durch Aussonderung und Trennung der durch ihre DNA- Menge identifizierten Zellen mittels eines elektrischen Feldes, gefolgt von einer Untersuchung der sortierten Zellen, beispielsweise durch Fixierung anderer Markerliganden, durch optische oder elektronische Mikroskopie, durch in vitro Funktionstest etc. (Application in Cell Biology, Kapitel 25, 471-482, 1980).
Immunologische Verfahren, von denen einige selektiv mit den Spermien, die entweder das X-Chromosom oder das Y-Chromosom tragen, reagieren, die agglutiniert werden und inaktiviert werden und so eine Spermienfraktion freigesetzt wird, die homogen das Chromosom des Typs, der dem, der mit dem genannten Antikörper reagiert hat, entgegensetzt ist, trägt, wobei die durch den Antikörper fixierte Fraktion ebensfalls ggf. von dieser freigesetzt werden kann, insbesondere im Falle, in dem der Antikörper an eine feste Phase, die aus einem immunabsorbierenden Material besteht, fixiert ist (US- PSen 4 191749, 4 085 205 und 3 687 806).
In den folgenden Publikationen sind die vorstehend zitierten Verfahren ebensfalls beschrieben:
- SHILLING E. In : "Sex-ratio et birth prospects for Control." (C.A. KIDDY and H.D. HAFS. Eds) Am. Soc. Animal. Sci. S. 76-84 (1971)
- MEISTRICH M.L. J. Cell. Physiol., 299-312 (1972)
- RHODE W. et al., J. Repro. Fertil. 42, 587-591 (1975)
- STEENO O. et al., Andrologia, 7, 95-97 (1975)
- BHATTACHARYA B.C. et al., Ind. J. Exp. Biol., 14, 610-611 (1976)
- SHASTRY P.R. et al., Nature, 269, 58-60 (1977)
- SHILLING E., THORMAHLEN D. Zuchthyg, 11, 113-121 (1976)
- ADIMOELJA A. et al., Andrologia 9, 289-292 (1977)
- BHATTACHARYA B.C. et al., Int. J. Fertil., 22, 30-35 (1977)
- SCHILLING E., THORMAHLEN D. Andrologia, 9, 74-78 (1977)
- PERTOFT H. et al., Anal. Biochem. 88, 271-282 (1978)
- SCHILLING E. et al., Andrologia 10, 215-217 (1978)
- QUINLIVAN W.L.G., Fertil. Steril., 34, 307-308 (1980)
- QUINLIVAN W.L.G. et al., Fertil. Steril, 37, 104-107 (1982)
- CORSON S.L. et al., Fertil. Steril, 40, 384-385 (1983)
- KANEKO S. et al., Fertil. Steril 40, 661-665 (1983)
- BEAL W.E. et al., J. Anim. Sci., 58, 1432-1436 (1984)
- KANEKO S. et al., Biomed. Res., 5, 187-194 (1984)
- UEDA K. et al., Dev. Growth Differ. 28, Suppl. Abst. 79 (1986)
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- SHISHITO et al., Int. J. Fertil., 20, 13-16 (1975)
- BROER K.H. et al., Andrologia, 9, 74-78 (1977)
- DMOWSKI W.P. et al., Fert. and Seril., 31, 52-57 (1979)
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Die im Stand der Technik vorgeschlagenen Verfahren zur Trennung bzw. Sortierung bzw. Auslese der Spermien haben als gemeinsamen Nachteil, daß sie einen relativ hohen Unsicherheitsgrad besitzen, was ihre Zuverlässigkeit betrifft. In der Tat, die Trennverfahren ergeben keine zu 100 % an einem oder dem anderen Chromosom homogene Fraktionen, so daß die Qualität der Auftrennung in der Praxis nur durch künstliche Befruchtungen kontrolliert werden kann, welche das Endziel sind (die in vitro Befruchtungen ergeben unter diesen Umständen nur einen schwachen Ertrag). Andererseits muß man, um zu wissen, ob die Abweichung von dem "Geschlechtsverhältnis" einen signifikanten Wert im Zusammenhang mit einer nach irgendeiner der im Stand der Technik befürworteten Trennverfahren isolierten Spermien besitzt, eine wichtige statistisch signifikante Anzahl von Inseminationen durchführen, was sich als kostspielig und lang erweisen kann.
Es ist somit unverzichtbar, über ein geeignetes Mittel, das die unmittelbare Kontrolle der nach einer der im Stand der Technik vorgeschlagenen Trennverfahren erhaltenen Spermien gestattet, zu verfügen, um jedes Irrtumsrisiko bei der Durchführung der künstlichen Befruchtungen unter Verwendung der infragekommenden getrennten Fraktionen zu begrenzen oder sogar zu beseitigen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung von molekularen DNA-Sonden, die für das männliche Genom von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder und insbesondere der Gattung Bos, spezifisch sind, die für das männliche Geschlecht spezifische DNA- Sequenzen zeigen, ein Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts dieser Tiere mit Hilfe der genannten Sonden, die zufriedenstellend den Bedürfnissen der in Betracht gezogenen Technik entsprechen, nämlich daß sie die Bestimmung des Geschlechts von Embryonen bei diesen Wiederkäuern, ausgehend von einer kleinen Zahl an Embryozellen, die 500 bis 1000 nicht überschreiten, gestatten, die Bestimmung des Geschlechts der Embryonen in einem frühzeitigen Entwicklungsstadium mit einem Zuverlässigsgrad von 100 % gestatten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ebenso die Bereitstellung eines Verfahrens zur unmittelbaren Kontrolle des Teils der Spermien, die das Y-Chromosom tragen, in einer Fraktion einer Spermienpopulation, die durch ein geeignetes Trennverfahren abgetrennt wurde, unter Verwendung der erfindungsgemäßen molekularen Sonde.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine molekulare DNA-Sonde, die spezifisch für das männliche Genom von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder und insbesondere der Gattung Bos, ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie 49 Basenpaare umfaßt, deren 5'-3'- Sequenz, ausgedrückt als Nucleotide, die folgende ist:
ebenso wie die dazu komplementäre Sequenz oder ein Fragment der Sequenz, die mindestens 11 aufeinanderfolgende Nucleotide trägt oder jedes andere Fragment, das mindestens eine 70%ige Homologie mit der zuletzt genannten trägt, wobei die Sonde als b.c.1.2. bezeichnet wird und ein Hybridisierungsprofil, bestimmt mittels Hybridisierung der Sonde mit männlicher durch EcoRI abgebaute, genomische DNA zeigt, das zum Erscheinen einer Bande in der Größenordnung von 7 kb führt, die spezifisch für das männliche Genom der Gattung Bos ist.
Die erfindungsgemäße molekulare Sonde ist mindestens 2000-fach in dem männlichen Genom der Gattung Bos wiederholt.
Dessen Nucleotidsequenz wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren [Methods Enzymol., 65, 499 (1977)] bestimmt.
Die Hybridisierung der Sonde b.c.1.2. mit der männlichen durch EcoRI abgebauten, genomischen DNA zeigt das Vorliegen einer Bande von 7 Kilobasen (kb), die in der weiblichen genomischen DNA fehlt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Verfahren zur Herstellung einer molekularen DNA-Sonde, die für das männliche Genom von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, insbesondere der Gattung Bos, spezifisch ist.
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen molekularen Sonde, das die Reassoziation von einsträngig gemachten DNA-Sequenzen aus einem Gemisch von männlicher und weiblicher DNA, worin die weibliche DNA in großem Überschuß ist (in der Größenordnung von 100 Teilen auf 1 Teil männliche DNA) realisiert, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt: - Eine erste Stufe, im Verlauf derer die weibliche genomische DNA der Wiederkäuer durch Beschallung in Fragmente von 200 bis 550 Basenpaare (bp) gespalten wird, dann in einem Verhältnis in der Größenordnung von 100:1 mit der männlichen genomischen DNA der gleichen Wiederkäuer vermischt wird, dann durch die Endonuclease SAU 3A abgebaut wird, um die Restriktionsfragmente mit kohäsiven Enden freizusetzen, deren Größe zwischen 40 und 1650 bp liegt; - eine zweite Stufe, im Verlauf deren das DNA-Gemisch nach Extraktion in an sich bekannter Weise mit einem Gemisch aus Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol und Ethanolfällung bei 100ºC denaturiert wird und dann bei 68ºC 22 h lang in einem Puffer, der 2M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 50 mM Natriumphosphat (pH = 6,8) und 5 mM EDTA enthält, reassoziiert wird; - eine dritte Stufe, im Verlauf derer die reassoziierte doppelsträngige DNA mit einem Plasmid, wie dem Plasmid pUC9 (Ampr-Lac Z&spplus;), das zuvor durch die Endonuclease BamHI linearisiert und durch die alkalische Phosphatase dephosphoryliert worden ist, in Gegenwart der T&sub4;-Ligase vermischt wird, die die Insertion der DNA in das Plasmid durch 16-stündigen Kontakt bei 16ºC bewirkt; - eine vierte Stufe, im Verlauf derer die rekombinanten Plasmide, die während der vorstehenden Stufe erhalten worden sind, zur Transformation von Escherichia coli-Zellen, die stark kompetent gemacht worden sind, verwendet werden, wobei die rekombinanten Glone (Ampr-Lac Z&supmin;) in einem Verhältnis von etwa 200 Clonen auf 2 ml Bakterienzellsuspension erhalten werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen molekularen Sonde werden die Bakterienzellen von Escherichia coli stark kompetent gemacht, vor der Insertion von rekombinanten Plasmiden durch 10-minütige Behandlung bei 0ºC in einem Milieu aus 10 mM K-Mes (pH = 6,2), 100 mM RbCl&sub2;, 45 mM MnCl&sub2;, 3 mM [Co(NH&sub3;)&sub6;]Cl&sub3;.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die transformierten Bakterien auf ein Gelosemilieu, enthaltend Ampicillin und X-Gal (oder 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β- D-galacto-pyranosid) in schwacher Konzentration in Dimethylformamid aufgebracht, werden die isolierten bakteriellen Kolonien (Ampr-Lac Z&supmin;) einzeln aufgenommen, dann angesichts der Herstellung von Minilysaten amplifiziert, dann jedes isolierte Plasmid durch die Endonuclease PvuII, die mit einem oder mehreren Radioisotopen markiert ist, abgebaut und mit genomischer DNA von den Wiederkäuern hybridisiert, und die DNA dieser Tiere wird durch die Endonuclease EcoRI, die Restriktionsfragmente variabler Größe erzeugt, abgebaut.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform werden die Fragmente durch elektrophoretische Wanderung auf einem Agarosegel getrennt.
Gemäß einem anderen Aspekt des Verfahrens zur Herstellung einer molekularen DNA-Sonde, die für das männliche Genom von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, insbesondere der Gattung Bos, wird eine derartige Sonde durch Synthese erhalten, wobei das Syntheseverfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Nucleotidsequenz, die diese Sonde umfaßt, nach dem Phosphoramiditverfahren in fester Phase synthetisiert wird.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Syntheseverfahrens des Oligonucleotids, das Bestandteil in der Zusammensetzung der erfindungsgemäßen molekularen Sonde ist, folgt auf die geeignet durchgeführte Synthese ein Reinigungsschritt, der aus der Trennung des Oligonucleotids einer gegebenen, gesuchten Größe, das mit Oligonucleotiden mittlerer Größe assoziiert ist, durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel, anschließend die Gewinnung der reinen gesuchten Oligonucleotidbande mit Hilfe einer mit Silicagel, das bei 254 nm fluoresziert, bedeckten Aluminiumfolie, das Ausschneiden dieser Bande und die Elution der DNA in eine geeignete Lösung und die anschließende Gewinnung der reinen synthetisierten DNA umfaßt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Syntheseverfahrens der erfindungsgemäßen molekularen Sonde wird letztere mit einem oder mehreren Radioisotopen nach Reinigung des synthetisierten Oligonucleotids markiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von molekularen DNA-Sonden, die für das männliche Genom von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, insbesondere der Gattung Bos, spezifisch sind, zur Bestimmung des Geschlechts von Embryonen und Föten dieser Wiederkäuer, wobei das Bestimmungsverfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Sonde, die auf einem geeigneterweise in an sich bekannter Weise vorhybridisierten Filter hybridisiert ist, wenn sie mit der genomischen DNA dieser Wiederkäuer sowohl männlich als auch weiblich, die zuvor auf ein geeignetes Filter überführt worden war, reassoziiert ist, nach elektrophoretischer Isolierung auf einem Agarosegel, ausschließlich mit männlicher genomischer DNA hybridisiert und diese Hybridisierung autoradiografisch und/oder durch nicht-radioaktive Sonde durch das Vorliegen von Hybridisierungssignalen in Bandenform nachgewiesen wird [Southern (J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)].
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der Geschlechtsbestimmung ist die zu erkennende DNA in den Lymphocyten der genannten Wiederkäuer enthalten.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindunsgemäßen Verfahrens zur Geschlechtsbestimmung, das am Fötus angewandt wird, ist die zu erkennende DNA in Zellen aus der Amnionflüssigkeit der der Allantois oder dem Chorionzotten der genannten Wiederkäuer enthalten.
Erfindungsgemäß werden die Zellen oder Analogen davon der genannten Wiederkäuer auf einer Membran (Dot-Blot) oder auf einem geeigneten Filter in Form von Tropfen nach Beschallung aufgebracht.
Gemäß einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Geschlechtsbestimmung ist die zu erkennende DNA im Y-Ghromosom der Wiederkäuer enthalten, welches in der Metaphase beobachtet wird, wobei die Geschlechtsbestimmung durch in situ Hybridisierung durchgeführt wird.
Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Geschlechtsbestimmung ist die zu erkennende DNA im Interphasenkern der Zellen der Wiederkäuer vorhanden, wobei die Geschlechtsbestimmung durch in situ Hybrisierung durchgeführt wird.
Bei der erfindungsgemäßen in situ Hybridisierung wird eine Biopsie von 5 bis 20 Zellen aus einem Embryo der Wiederkäuer mit der erfindungsgemäßen molekularen Sonde in Kontakt gebracht, um die Markierung der Zellen durch Hybridisierung mit der durch ein oder mehrere Radioisotope markierten Sonde oder mit einer nicht-radioaktiven Sonde durchzuführen, und dann wird die Hybridisierung nach einer geeigneten cytoimmun-chemischen Technik nachgewiesen.
Ebenso ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur direkten und unmittelbaren Kontrolle des Anteils der Spermien, die das Y- Chromosom tragen, in einer Spermienpopulation von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, insbesondere der Gattung Bos, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Spermien der Population mit der erfindungsgemäßen molekularen Sonde in Kontakt gebracht werden, um die Markierung der Spermien durch Hybridisierung mit der in geeigneter Weise markierten Sonde zu bewirken, und anschließend werden die hybridisierten Spermien mittels eines geeigneten cytoimmun-chemischen Verfahrens nachgewiesen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kontrollverfahrens wird die Hybridisierung der Spermien mit der spezifischen molekularen DNA-Sonde in situ direkt mit den Spermien durchgeführt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kontrollverfahrens wird die Hybridisierung zwischen der spezifischen molekularen DNA-Sonde und der aus Spermien der Wiederkäuer der Gattung Bos isolierten DNA durchgeführt.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführung der Ausführungsform, bei der die Hybridisierung in situ durchgeführt wird, werden die Spermien zuerst einem Hybridisierungsschritt, einem chemischen Dekondensationsverfahren, das im wesentlichen die drei Stufen, nämlich einen hypotonen Schock, einen proteolytischen Abbau und eine Reduktion der Disulfidbrücken umfaßt, unterworfen.
Gemäß einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kontrollverfahrens ist die verwendete, spezifische, molekulare DNA-Sonde eine Sonde, die mit einem oder mehreren Radioisotopen markiert ist oder eine nicht-radioaktive Sonde.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Kontrolle des Anteils der Spermien, die das Y-Chromosom tragen in einer Spermienpopulation, gestattet die Messung des Anteils der Y-Chromosomen, die in dieser Population vorhanden sind.
Erfindungsgemäß wird ein Vorteil aus dieser Möglichkeit zur Bestimmung der Menge der spezifischen Y-DNA in den Spermien mit Hilfe der erfindungsgemäßen spezifischen DNA-Sonde gezogen, um ein Verfahren zur Trennung der X- und Y-Spermien nach ihrem DNA-Gehalt zu entwickeln, wobei die verschiedenen Trennstufen selbst mit Hilfe der für das Y-Chromosom von Wiederkäuern spezifischen, erfindungsgemäßen, molekularen Sonde kontrolliert werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich auch ein Verfahren zur Trennung der Spermien, die das X-Chromosom tragen, von den Spermien, die das Y-Chromosom tragen, in einer Spermienpopulation, das durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist: - 1) Markierung der DNA, die in den Spermien enthalten ist, durch einen spezifischen Vitalfarbstoff für die DNA (wie z.B. Ethidiumbromid, Acridin, der Farbstoff Hoechst 33342, DAPI); - 2) Cytofluorimetrische Trennung in zwei Fraktionen der X- und Y- Spermien als Funktion der in ihnen enthaltenen DNA-Menge; - 3) Kontrolle der Qualität der im Verlauf des zweiten Schritts des Verfahrens durchgeführten Trennung, indem das Verfahren zur Kontrolle des Anteils der Spermien, die das Y-Chromosom tragen, in einer durch Aussonderung abgetrennten Fraktion an Y-Spermien gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird; - 4) Immunisierung von nagenden Säugetieren (Mäuse oder Ratten) durch die kontrollierten Fraktionen, die ggf. einer neuen Trennung als Folge der Kontrolle unterworfen wurden, hinsichtlich der Erzeugung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern; - 5) Kontrolle der Spezifität dieser Antikörper durch Agglutinations-, Spermatotoxizitäts-, indirekte Immunfluoreszenz-, Durchflußcytometrietests, um spezifische immunologische Reagentien zu erhalten, die die antigenen Determinanten, die von dem gewünschten Geschlechtschromosom kontrolliert und an der Oberfläche der Spermien exprimiert werden, erkennen und die geeignet sind zur Trennung lebender Spermien, die das X- oder Y-Chromosom tragen, verwendet zu werden; - 6) Abtrennung der Spermienfraktionen, die das X-Chromosom bzw. das Y-Chromosom tragen, in einer Spermienpopulation mit Hilfe der immunologischen Reagentien.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trennverfahrens folgt auf die Immunisierung der nagenden Säugetiere, was der vierte Schritt des Trennverfahrens ist, die Gewinnung der polyclonalen Antikörper, die aus dieser Immunisierung folgen und ihre Absorption auf den Spermien des dazu entgegengesetzten Geschlechts, das der Immunisierung gedient hat, wobei die Spezifität dieser Antikörper auf den Spermien des gesuchten Geschlechts kontrolliert wird und die Antikörper anschließend ggf. gereinigt werden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trennverfahrens werden die durch Cytofluorometrie getrennten X- und Y-Spermien zur Herstellung von für die X- und Y-Chromosomen spezifischen monoclonalen Antikörper verwendet.
Des weiteren sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung spezifische immunologische Reagentien, die die antigenen Determinanten, die von dem X- oder Y-Chromosom, das zum Erhalt der Reagentien gedient hat, kontrolliert werden und auf der Oberfläche der Spermien exprimiert werden, erkennen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus Antikörpern bestehen, die durch Durchführung des vorstehenden Verfahrens erhalten worden sind, auf ihre Spezifität getestet worden sind und ggf. gereinigt worden sind.
Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.
Die Erfindung wird mit Hilfe der nachfolgenden Beschreibung besser verstanden, die sich auf erfindungsgemäße Ausführungsbeispiele bezieht.
Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.

Beispiel 1

Herstellung der erfindungsgemäßen Sonden

Die verwendete Technik gestattet die Clonierung von DNA, die im männlichen Genom vorhanden und im weiblichen Genom abwesend ist und gestattet auch so die Konstruktion einer für das männliche Rind spezifischen DNA-Bank.

Konstruktion der für das männliche Tier spezifischen DNA-Bank

1 mg weibliche, genomische DNA aus den peripheren Lymphocyten wird durch Beschallung in Fragmente zu 200 bis 500 Basenpaaren (bp) gespalten. 10 ug männliche, genomische DNA aus peripheren Lymphocyten werden durch Endonuclease SAU 3A (Boehringer) abgebaut, wodurch Restriktionsfragmente mit kohäsiven Enden freigesetzt werden, deren Größe zwischen etwa 40 und 1650 bp liegt.
Diese beiden Fragmenttypen werden in dem folgenden Verhältnis vermischt: weibliche DNA : männlicher DNA = 100 : 1.
Nach Extraktion durch ein Phenol-Chloroform-Isoamylalkoholgemisch und Fällung mit absolutem Ethanol wird das Gemisch der zwei DNAs bei 100ºC 10 min lang denaturiert und dann bei 68ºC 22 h lang in einem Puffer, der 2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 50 mM Natriumphosphat (pH = 6,8) und 5 mM EDTA enthält, reassoziiert. Ein Aliquot (1 ug) doppelsträngiger, reassoziierter DNA wird mit 100 ng des Plasmids pUC9 (Ampr-Lac Z&spplus;), das zuvor durch die Endonuclease Bam HI (Boehringer) linearisiert worden war und durch die alkalische Phosphatase (CIP Boehringer) dephosphoryliert worden war, vermischt. Die Insertion der männlichen Rinder-DNA in das Plasmid wird mit T&sub4;-Ligase (Biolabs) bei 16ºC während 16 h durchgeführt.
Die rekombinanten Plasmide werden zur Transformation von 2 ml Escherichia coli-JM83-Bakterien, die Behandlung in einem Milieu aus 10 mM K-Mes (pH = 6,2), 100 mM RbCl&sub2;, 45 mM MnCl&sub2;, 3 mM [Co(NH&sub3;)&sub6;]Cl&sub3; während 10 min bei 0ºC stark kompetent gemacht worden sind, verwendet. Die so transformierten Bakterien werden auf ein LB-Agar-Milieu, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin und 2 ul/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) zu 2 % in Dimethylformamid ausgebracht. Etwa 200 Clone (Ampr- Lac Z&supmin;) wurden erhalten.

Beispiel 2

Analyse der Bank

Um das Vorliegen von männlichen Rinder-DNA-Insertionen zu untersuchen, wird jeder Clon individuell wiederaufgenommen, und die Plasmide werden von den Bakterien durch Minilysat isoliert. Jedes isolierte Plasmid wird durch die Endonuclease PvuII (Boehringer) abgebaut und durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel (30 V - 16 h) analysiert.
50 Clone unter den 200 analysierten enthalten Rinder-DNA (Insertion).
Die Spezifität der so erzeugten Insertionen wurde durch Hybridisieren mit männlicher und weiblicher, genomischer DNA (Lymphocyten), die durch die Endonuclease EcoRI (Boehringer) abgebaut worden war, und Überführung nach der Elektrophorese auf ein DBM-Papier oder Hybond-Membrane (Amersham) nach der Southern-Technik nachgewiesen.
Die Hybridisierung der Sonde b.c.1.2. mit männlicher, durch EcoRI abgebauter, genomischer DNA zeigt das Vorliegen einer Bande von 7,0 Kilobasen (kb), die in weiblicher, genomischer DNA fehlt. Dieses Ergebnis wurde durch Untersuchung von 12 männlichen und 13 weiblichen Tieren (p< 104) bestätigt.

Beispiel 3

Herstellung der genomischen Rinder-DNA

DNA von männlichen und weiblichen Rindern wurde, ausgehend von 5x10&sup7; peripheren Lymphocyten gereinigt. Die Zellen werden 18 h lang bei 42ºC unter langsamem Rühren in 10 ml Lyselösung [10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Ethylendiamintetraacetat-Na&sub2; (EDTA), 50 mM NaCl, 0,4 % Natriumdodecylsulfat plus 2 mg Proteinase K (Boehringer)] inkubiert. 1 mg Ribonuclease A (Boehringer) in 1 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA wird nach 1 h bei 37ºC zugesetzt, und dann schließt sich ein zweiter Abbau durch Proteinase K (1 mg, 1 h bei 42ºC) an. Die Lysate werden dreimal mit 15 ml eines Gemisches aus Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (3:1:0,01 Vol/Vol), gesättigt mit 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5, extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden dreimal mit einer Chloroform-Isoamylalkohollösung (1:0,04) gewaschen. Die DNA wird mit 2 Volumina absolutem Ethanol in Gegenwart von 150 mM NaCl gefällt und mit 80%igem Ethanol in Wasser gewaschen.

Abbau durch Restriktionsendonucleasen

Proben zu 15 ug Rinder-DNA werden bei 37ºC 18 h lang mit der Restriktionsendonuclease EcoRI (Boehringer) in Inkubationspuffer, der 100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, pH 7,5, enthält, abgebaut. Der vollständige Abbau wird mit insgesamt 6-10 Einheiten pro ug dreimal zugefügter DNA erhalten. Die abgebauten DNA-Fragmente werden einer elektrophoretischen Trennung auf einem 0,7%igen Agarosegel in einem Puffer aus 0,04 M Tris-CH&sub3;COOH, pH 8, und 0,002 M EDTA unterworfen. Die Kalibrierung des Gels wird unter Einschluß einer DNA-Probe des durch Hind III abgebauten Lambda-Phagen erhalten.

Überführung

Die in dem Gel enthaltenen DNA-Fragmente werden 15 min lang bei Umgebungstemperatur in 0,25 M HCl depuriniert, in 0,5 M NaOH + 1,5 M NaCl denaturiert und anschließend durch aufeinanderfolgende Passagen in 1,5 M Phosphatpuffer, pH 5,5 (3x15 min) und anschließend 0,15 M, pH 5,5 (2x15 min) neutralisiert. Eine Membran (Hybond-N-Amersham oder Pall-Biodyne-A- Flobio) aus "Nylon" wird anschließend auf das Gel aufgebracht, und durch die Kapillarwirkung werden die in dem Gel enthaltenen DNA-Fragmente auf die Membran überführt. Nach 16-stündigem Transfer in 20 x SSC wird die Membran mit 2 x SSC gewaschen, an der Luft getrocknet und anschließend 2 h lang in einen 80ºC heißen Ofen gegeben.

Markierung der Sonde mit ³²P

100 bis 200 ng der Sonde b.c.1.2. in einem Volumen von 1 bis 5 ul werden dem folgenden Reaktionsgemisch zugesetzt: 50 uM dATP (1 ul), 50 uM dTTP (1 ul), 50 uM dCTP (1 ul), 50 uCi α-³²P-dGTP (5 ul), 2 ul Reaktionspuffer, enthaltend 500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM HgCl&sub2;, 100 mM β-Mercaptoethanol. Die Reaktion wird bei 16ºC während 1 h 30 min durchgeführt, anschließend durch Zugabe von 200 ul einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80 mM EDTA, 0,5 % Natriumdodecylsulfat enthält, gestoppt.
Die radioaktiv markierte Sonde wird von den Nucleotiden durch Passage über eine Sephadex G100-Sonde (10 cm x 1 cm) (Pharmacia) getrennt und durch einen Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 1 mM EDTA eluiert. Die eluierten Fraktionen, die mehr Radioaktivität enthalten, werden anschließend vereinigt.

Vorhybridisierung und Hybridisierung

Die Filter (Blots) werden bei 42ºC 4-10 h mit einem Gemisch aus 50 % Vol/Vol an entionisiertem Formamid, 1 M NaCl, 0,2 % Denhart-Lösung, 2,5 % Dextransulfat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat und 0,5 mg/ml beschallte DNA aus Lachssperma vorhybridisiert.
Die Hybridisierung wird in dem gleichen Gemisch durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Dextransulfat in einer Konzentration von 5 % und NaCl in einer Konzentration von 0,5 M vorhanden ist. Die mit ³²P radioaktiv markierte und bei 100ºC 10 min lang denaturierte Sonde wird dem Hybridisierungsgemisch in einer Konzentration von 1 x 10&sup6; cpm/ml zugesetzt, was ungefähr 10 ng Sonde pro ml entspricht. Die Hybridisierung wird bei 42ºC mindestens 18 h lang durchgeführt. Nach Hybridisierung werden die Filter ein erstes Mal bei 65ºC 30 min lang in einem Puffer aus 2 x SSC (0,3 M NaCl und 0,03 M Natriumcitrat) + 0,1 % SDS gewaschen, dann nockmals 30 min lang in dem gleichen 10-fach verdünnten Puffer (0,2 x SSC) gewaschen. Die Filter werden dann auf eine Kassette gegeben, die mit Verstärkern "Cronex" (DuPont) ausgestattet ist und in Kontakt mit einem Kodak- XAR-5-Film zur Autoradiografie während 6 bis 24 h bei -70ºC gebracht.

Deshybridisierung

Diese wird durch Waschen der Filter bei 37ºC während 30 min mit 0,4 M NaOH und anschließend in einer Lösung, die 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % (Vol/Vol) Natriumdodecylsulfat, 0,1 x SSC, enthält, durchgeführt.

Herstellung der Dot-Blots

1) Genomische DNA-Dot-Blot

Die genomische DNA männlicher und weiblicher Rinder wurde 5 min lang beschallt (Branson Sonifier BIS), anschließend mit DNA von beschalltem Lachssperma in den Anteilen, daß die Menge der Gesamt-DNA des Niederschlags 2 ug beträgt, verdünnt. Der Bereich der Konzentration an Rinder-DNA betrug 1 ug, 0,5 ug, 0,25 ug, 0,1 ug und 0,05 ug für einen Niederschlag von 1 ul.
Nach dem Aufbringen der DNA auf den Pall-Biodyne A-Membranen wurden diese mit 0,5 N NaOH + 1,5 N NaCl 5 min lang behandelt, dann mit 1,5 M Phosphatpuffer, pH 5,5, 2 x 5 min lang neutralisiert und dann noch mit 0,3 M Phosphatpuffer, pH 5,5, während 5 min. Die Membranen werden anschließend auf Whatman 3 MM getrocknet, und dann wird die DNA bei 80ºC 2 h lang fixiert. Die verwendungsbereiten Filter werden in einer Lösung zur Vorhybridisierung bei 4ºC aufbewahrt.

2) Dot-Blot der Rinderzellen

Die peripheren Lymphocyten des männlichen und weiblichen Rinds werden 6 min lang beschallt, dann mit Proteinase K (Boehringer) 1 h bei 42ºC behandelt. Der Bereich der Verdünnung entspricht 1x10&sup6;, 5x10&sup5;, 1x10&sup5;, 5x10&sup4;, 1x10&sup4; und 5x10³ Zellen in 2 ul. Die DNA von beschalltem Lachssperma wird zugesetzt, um auf 2 ug Gesamt-DNA zu ergänzen.
Nach Aufbringen der DNA auf Pall-Biodyne A-Membranen ist die Behandlung derjenigen des Dot-Blots der genomischen DNA identisch.
Hybridisationen der Dot-Blots und Sichtbarmachung der Signale sind die gleichen wie für die Blots allgemein.

Beispiel 4

Synthese und Reinigung des Syntheseoligonucleotids

Die chemische Synthese des Oligonucleotids entsprechend der zuvor bestimmten Sequenz wurde mit Hilfe eines automatischen Synthesegeräts von "Applied Biosystems" nach der Phosphoramidittechnik an fester Phase durchgeführt.
Obwohl die Reaktion zu 95-97 % in jedem Stadium erfolgreich war, ist es trotzdem notwendig, das Endprodukt der intermediären Nucleotide (Sonde b.c.1.2. - 49 mer) zu reinigen. Ungefähr 7 mg eines Oligonucleotidgemisches in 60 ul H&sub2;O werden elektrophoretisch in einem Gel aus 20 % Polyacrylamid + 8 M Harnstoff bei 700 V, 38 mA während 3 h getrennt. Die Bande entsprechend dem 49 meren wird mit Hilfe einer mit einem Silicagel bedeckten Aluminiumfolie, die bei 254 nm (Merck) fluoresziert, isoliert. Dieser Teil des Gels wird ausgeschnitten, und anschließend wird die DNA in 1,5 ml einer Lösung aus 0,5 M CH&sub3;COONH&sub4; + 5 mM EDTA unter Rühren bei 37ºC während 16 h lang eluiert.
Der Überstand wird auf ungefähr 300 ul eingeengt, und der Harnstoff wird durch Chromatografie über eine Säule aus 10 cm x 1 cm Sephadex G-50 (Pharmacia) equilibriert, mit einem Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 + 1 mM EDTA eliminiert. Die so isolierte DNA wird lyophilisiert und bei -20ºC aufbewahrt.

Radioaktive Markierung (³²P) der synthetisierten Sonde b.c.1.2. (einsträngig)

10 bis 20 pM der Sonde b.c.1.2. in einem Volumen von 3 ul werden zu 23 ul des Reaktionsgemisches aus 100 mM Dithiothreit (2,5 ul), 10 mM Spermidin (2,5 ul), Inkubationspuffer aus 500 mM Tris-HCl, pH 7,5 + 100 mM MgCl&sub2; (2,5 ul), 100 uCi (γ-³²P) Adenosintriphosphat-ATP, 3000 Ci/mMol (Amersham) und 20 U T4 Polynucleotidkinase (Boehringer) gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wird die Reaktion mit 2 ul 400 mM EDTA gestoppt, und das markierte Oligonucleotid wird von dem ATP durch Chromatografie über eine Sephadex G-50-Säule abgetrennt.

Beispiel 5

Sequenzierung

-Herstellung des Plasmids b.c.1.2. hinsichtlich der Sequenzierung seiner beiden Stränge

a) Unterer Strang (Richtung 3' T 5')

30 ug des Plamids b.c.1.2. werden durch die Endonuclease Hind III 3 h lang bei 37ºC abgebaut. Das Enzym wird durch Extraktion mit einem Gemisch aus Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (3:1:0,01, Vol/Vol) abgetrennt. Die DNA wird anschließend in 1 Volumen Isopropanol in Gegenwart von 0,3 M CH&sub3;COONa ausgefällt, anschließend in 80%igem Ethanol in Wasser gewaschen.
Die DNA des linearisierten Plasmids wird 3' durch die Enzym-terminale Transferase mit Didesoxyadenosintriphophat ³²P (AS = 3000 Ci/mM) gemäß der Technik des Kits Nr. N4020 von Amersham markiert.
DNA des Plamids 40 ul
ddATP (125 uCi) 13 ul
Amersham-Puffer x 10 10 ul
Destilliertes Wasser 95 ul
Enzymlösung von Amersham 5 ul
Inkubation: 1 h bei 37ºC.
Das markierte Plasmid wird anschließend von dem Nucleotid durch Passage über Sephadex G75 abgetrennt und anschließend durch die Endonuclease EcoRI, die 2 Fragmente mit einer Größe von 2,6 bzw. 0,1 kb ergibt, abgebaut. Das 0,1 kb Fragment, das die Insertion b.c.1.2. enthält, wird durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel isoliert. Es wird anschließend durch Passage über Glaswolle und Extraktion mit dem Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch gereinigt.
Das gereinigte Fragment wird nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren mit einer Modifikation nach der Société N.E.N. sequenziert.
Die Analyse der zu sequenzierenden Fragmente wird durch Elektrophorese auf einem 0,2 mm Gel zu 5 %, 8 % und 12 % Polyacrylamid in einem Makrophor LKB-Behälter [Garoff und Ansorge, Analytical Biochemistry 115 (450-457) 1980] durchgeführt. Gemäß den Konzentrationen betragen die Wanderungszeiten 6 h bis 7 h und 2 h.
Die Gele werden anschließend mit Hilfe von 10%iger Essigsäure während 10 min fixiert, in Wasser gewaschen und anschließend bei Umgebungstemperatur getrocknet.
Die Autoradiografie des Gels wird auf einem URNO HS 90-Film während Expositionszeiten von 24, 48 und 72 h durchgeführt.

b) Oberer Strang (Richtung 5' T3')

Es werden die gleichen Techniken verwendet, ausgenommen, daß das erste Abbauenzym EcoRI und das zweite PVUII ist.
Die Bestimmung der Nucleotidsequenz der Sonde b.c.1.2., erhalten ausgehend von peripheren Lymphocyten von Säugetieren der Gattung Bos, die aus den 49 folgenden Basenpaaren
besteht, gestattete die Synthese der erfindungsgemäßen Sonde, wie im vorstehenden Beispiel 4 beschrieben.
Die erfindungsgemäße Sonde b.c.1.2. besitzt eine große Empfindlichkeit, da Tests, die auf einer Pall-Biodyne-Membran durchgeführt wurden, zeigten, daß 5 ng Rinder-DNA eine ausreichende Menge sind, um ein positives Signal zu erhalten.

Beispiel 6

Bestimmung der spezifischen DNA-Bande des Y-Chromosoms in einer gegebenen Spermienpopulation

A. Herstellung der DNA aus Rindersperma

Jede Anhäufung von etwa 15 bis 10 x 10&sup6; gefrorener Spermien wird sofort in ein 37ºC warmes Wasserbad während etwa 30 s eingetaucht. Der Inhalt jeder Anhäufung wird sofort in 1 bis 2 ml sterilisiertem PBS verdünnt. Jedes Röhrchen wird bei 500 G 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird beseitigt, und der Rückstand in 1 bis 2 ml sterilem PBS aufgenommen. Diese Waschung wird viermal wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wird der Spermienniederschlag in Suspension in 10 ml Lysepuffer, enthaltend 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 M NaCl; 0,01 M EDTA; 1 % SDS; 2 % β-Mercaptoethanol, aufgenommen. Dieser Puffer wird bei 50ºC vorerhitzt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 50ºC werden 2 mg Proteinase K (Endkonzentration 200 ug/ml) jedem Röhrchen zugesetzt, und die Inkubation wird 2 h lang unter leichtem Rühren bei 50ºC fortgesetzt.
Das Gemisch wird anschließend 15 min lang bei Umgebungstemperatur mit 15 ml einer Lösung aus 50 % gesättigtem Phenol in 0,2 M Tris, pH 7,5, und 50 % Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die untere organische Phase wird verworfen, und die Extraktion wird noch weitere zweimal wiederholt.
Die wäßrige Phase wird dann zwei- bis dreimal 15 min lang bei Umgebungstemperatur mit einem Chloroform : Isoamylalkoholgemisch (24:1) extrahiert. Nach der letzten Extraktion wird die wäßrige Phase bei 2000 G 30 min lang zentrifugiert, um das gesamte Chloroform und die präzipitierten Proteine zu entfernen. Der geklärte Überstand wird dann mit 2 1/2 Volumina absolutem, zuvor gekühltem Ethanol während 15 min bei -20ºC geklärt. Die ausgefällte DNA wird mit Hilfe einer sterilen Pipette aufgenommen und 5 min lang in 70%igem Ethanol gewaschen. Der überschüssige Alkohol wird abgedampft, und die DNA wird in einem sterilen Puffer aus 0,001 M Tris-HCl, pH 8,0, und 0,0001 M EDTA aufgelöst.

B. Abbau durch Restriktionsendonucleasen

Proben zu 15 ug Rindersperma-DNA werden bei 37ºC 18 h lang mit der Restriktionsendonuclease EcoRI (Boehringer) in einem Inkubationspuffer, enthaltend 100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, pH 7,5, abgebaut. Der vollständige Abbau wird mit insgesamt 6-10 Einheiten pro ug DNA, zugesetzt in drei Anteilen, erhalten. Die abgebauten DNA-Fragmente werden einer elektrophoretischen Trennung auf einem 0,7%igen Agarosegel in einem Puffer aus 0,04 M Tris-CH&sub3;COOH, pH 8, 0,002 M EDTA, unterworfen. Die Kalibrierung des Gels wird durch Einschluß einer DNA-Probe des Lambda-Phagen, welche durch Hind III abgebaut wurde, erhalten.

Überführung

Die in dem Gel enthaltenen DNA-Fragmente werden 15 min lang bei Umgebungstemperatur in 0,25 M HCl depuriniert, in 0,5 M NaOH + 1,5 M NaCl denaturiert, anschließend durch aufeinanderfolgende Passagen in einem 1,5 M Phosphatpuffer mit pH 5,5 (3 x 15 min) und anschließend mit 0,15 M, pH 5,5, (2 x 15 min) neutralisiert. Eine Nylon-Membran (Hybond-N Amersham oder Pall-Biodyne-A Flobio) wird anschließend auf das Gel gelegt, und durch die Kapillarwirkung werden die in dem Gel enthaltenen DNA-Fragmente auf die Membran überführt. Nach 16-stündigem Transfer in 20 x SSC wird die Membran in 2 x SSC gewaschen, an Luft getrocknet und anschließend für 2 h in einen 80ºC heißen Ofen gegeben.

Markierung der Sonde mit ³²P

100 bis 200 ng der Sonde b.c.1.2. in einem Volumen von 1 bis 5 ul werden dem folgenden Reaktionsgemisch zugesetzt: 50 uM dATP (1 ul), 50 uM dTTP (1 ul), 50 uM dCTP (1 ul), 50 uCi α-³²P-dGTP (5 ul), 2 ul Reaktionspuffer, enthaltend 500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM MgCl&sub2;, 100 mM β-Mercaptoethanol. Die Reaktion wird bei 16ºC während 1 h 30 min durchgeführt, anschließend durch Zugabe von 200 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris- HCl, pH 7,5, 80 mM EDTA, 0,5 % Natriumdodecylsulfat, gestoppt.
Die radioaktiv markierte Sonde wird von den Nucleotiden durch Passage über eine Sephadex G100-Säule (Pharmacia) (10 cm x 1 cm) abgetrennt und mit einem Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 mM EDTA eluiert. Die eluierten Fraktionen, die die meiste Radioaktivität enthalten, werden anschließend vereinigt.

C. Prähybridisierung und Hybridisierung

Die Filter (Blots) werden bei 42ºC 4 bis 10 h lang mit einem Gemisch aus 50 % (Vol/Vol) entionisiertem Formamid, 1 M NaCl, 0,2 % Denhart-Lösung, 2,5 % Dextransulfat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat und 0,5 mg/ml DNA von beschalltem Lachssperma vorhybridisiert.
Die Hybridisierung wird in dem gleichen Gemisch durchgeführt, ausgenommen, daß die Konzentration an Dextransulfat 5 % und an NaCl 0,5 M beträgt. Die mit ³²P radioaktiv markierte Sonde, die 10 min bei 100ºC denaturiert worden war, wird dem Hybridisierungsgemisch in einer Konzentration von 1 x 10&sup6; cpm/ml zugesetzt, was etwa 10 ug Sonde pro ml ausmacht. Die Hybridisierung wird bei 42ºC mindestens 18 h lang durchgeführt. Nach Hybridisierung werden die Filter ein erstes Mal bei 65ºC während 30 min in einem Puffer aus 2 x SSC (0,3 M NaCl und 0,03 M Natriumcitrat) + 0,1 % SDS und anschließend 30 min in dem gleichen, 10-fach verdünnten Puffer (0,2 x SSC) gewaschen. Die Filter werden dann in eine Kassette mit Verstärkern "Cronex" (DuPont) gegeben, mit einem Kodak XAR-5- Film zur Autoradiografie während 6 bis 24 h bei -70ºC in Kontakt gebracht.

D. Ergebnisse

Die durch das Restriktionsenzym EcoRI abgebaute und dann mit der radioaktiv markierten Sonde b.c.1.2. hybridisierte DNA von Rindersperma zeigt ein Hybridisierungsprofil, das dem analog ist, das mit anderen Zelltypen von Rindern, die von den Erfindern getestet wurden, analog ist.

Beispiel 7

Bestimmung des Geschlechts der Rinderembryonen durch in situ Hybridisierung mit einer biotinylierten DNA-Sonde (nicht-radioaktiv)

A. Herstellung der Zellen

Die verwendeten Zellen stammen von Rinderembryonen im Alter von 7 bis 8 Tagen Trächtigkeit. Nach Sektion werden die Zellen auf einer Platte abgelegt und 10 bis 15 min in einer Fixierlösung, wie einem Alkohol- Essigsäure-Gemisch ( 3:1 Vol/Vol)) inkubiert und dann an der Luft getrocknet. Die Plättchen werden sofort verwendet oder im Falle von unterschiedlichem Geschlecht bei 4ºC unter Ausschluß von Staub aufbewahrt.

B. Biotinylierung der Sonde

Es wird ein Fragment des Plasmids pUC9, das die Insertion b.c.1.2. enthält, verwendet, wobei das Ganze 350 bp ausmacht. Das 350 bp-Fragment wird durch Abbau mit dem Restriktionsenzym PvuII erhalten, elektrophoretisch auf einem Agarosegel gereinigt und von dem Gel mittels Absorption auf eine DEAE NA45-Membran (Schleicher und Schuell) übertragen.
Die Biotinylierung der Sonde wird durch Nick-Translation unter Verwendung der folgenden Bestandteile in einem Endvolumen von 0,050 ml durchgeführt.
dATP dGTP dCTP je 0,2 mM
BRL DNA-Polymerase I 0,4 Einheiten/ul
DNase I 40 pg/ul
zu markierende DNA 1 ug
biotinyliertes d UTP 0,4 mM
Man inkubiert 90 min bei 15ºC und stoppt dann die Reaktion mit 300 mM Na&sub2; EDTA + 5 % SDS (Prokokoll BRL).
Nach Markierung wird die Sonde durch Gelfiltration über eine Sephadex G-100-Säule gereinigt. Die unterschiedlichen gewonnenen Fraktionen. werden separat mit Hilfe des Systems Streptavidin-alkalische Phosphatase (DNA-Detektionssystem BRL Ref. B239 SA) analysiert.
Die positiven Fraktionen werden vermischt, und die Aktivität des Gemisches wird durch Vergleich mit einer bekannten Menge biotinylierter DNA gemessen.

C. Hybridisierungstechnik auf Platten

Die Platten werden mit 90 bis 100 ul Hybridisierungsflüssigkeit inkubiert und mit einem Plastikfilm (um die Verdampfung zu vermeiden) überzogen.
Nach 10-minütiger Denaturierung in einem 100ºC heißen Ofen werden die Platten in eine Feuchtkammer gegeben und 16 h bei 42ºC inkubiert.
Die Endzusammensetzung der Hybridisierungsflüssigkeit beträgt:
4 x SSC
1 mM EDTA
25 mM Tris-HCl, pH 7,3
1 x Denhart
10 % Dextran
50 % entionisiertes Formamid
Sonde: 80 ng/ml Hybridisierungsmilieu
(1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat)
(1 x Denhard = 0,02 % BSA oder 0,02 % Magermilch in Pulverform;
0,02 % Polyvinylpyrrolidon
0,02 % Ficoll).
Nach Abziehen des Plastikfilms werden die Platten sukzessive in einer Lösung aus 2 x SSC (30 min bei Umgebungstemperatur) und dann in 0,1 x SSC (30 min bei 42ºC), 2 x SSC (15 min bei Umgebungstemperatur) und schließlich in PBS, pH 7,4, unter Zusatz von 0,1 % Vol/Vol Triton X - 100 und 0,5 % (Gewicht/Vol) Magermilchpulver (Regilait) gewaschen.

D. Detektion

Die noch feuchten Platten werden nach Entfernent überschüssiger Flüssigkeit dann 1 h bei 37ºC mit einem Antibiotin-Schaf-Antikörper oder einem Antibiotin-Kaninchen-Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper wird durch Affinitätschromatografie gereinigt, im Handel vertrieben (Vector Laboratories Ref. SP-3000) und wird in unseren Tests verdünnt in einem Verhältnis von 1:350 in PBS, pH 7,4 + 0,1 % (Vol/Vol) Triton X - 100 + 0,5 % (Gewicht/Vol) Magermilchpulver verwendet.
Nach 15-minütigem Waschen bei Umgebungstemperatur in PBS, pH 7,4, + 0,1 % (Vol/Vol) Triton X - 100 + 0,5 % (Gewicht/Vol) Magermilchpulver werden die Platten dann 1 h bei 37ºC mit einem herkömmlichen Kaninchen- Antiziege-Antikörper oder einem Ziege-Antikaninchen-Antikörper, der mit Peroxidase gekoppelt ist (Biosys Ref. BI 2403), verdünnt 1:40 in PBS, pH 7,4, + Triton 0,1 % + 0,5 % Magermilchpulver inkubiert.
Die Platten werden dann zweimal 15 min in PBS, pH 7,4, enthaltend diesmal 0,1 % (Vol/Vol) Tween 20 und schließlich in PBS, pH 7,4, 5 min lang gewaschen.
Die Inkubation wird 5 bis 8 min bei Umgebungstemperatur mit einer Diaminobenzidinlösung (DAB Sigma Ref. D 8001) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS, pH 7,4, enthaltend 0,01 % H&sub2;O&sub2; fortgesetzt.
Das unter Wirkung der Peroxidase auf das DAB gebildete Präzipitat wird durch anschließende Präzipitation von Goldsalzen und Silbersalzen nach dem von Burns et al. beschriebenen Verfahren verstärkt (Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092).
Zuerst werden 50 bis 100 ul pro Platte einer Lösung aus 2,5 mM Natriumchloraurat (NaAuCl&sub4; BDH Ref. 30125 2R) aufgebracht und bei Umgebungstemperatur 5 min lang inkubiert. Nach 5-minütigem Waschen in destilliertem Wasser werden die Platten 5 min bei Umgebungstemperatur mit 50 bis 100 ul einer Lösung aus 0,1 M Natriumsulfit (Na&sub2;S, Sigma Ref. S 2006) inkubiert, 5 min mit destilliertem Wasser gespült und 4 bis 8 min mit 100 bis 300 ul Silberreagens inkubiert.
Die Zusammensetzung des Silberreagens ist wie folgt:
A Natriumcarbonat 0,24 M (Sigma Ref. S 4132)
B1 Ammoniumnitrat 13 mM (Sigma Ref. A 9642)
B2 Silbernitrat 6 mM (BDH Ref. 303873N)
B3 Dodecawolframkieselsäure 1,5 mM (BDH Ref. 305453R)
B4 Formaldehyd 37%ig 0,6 ul/ml (Sigma Ref. F 1635)
Das Silberreagens wird durch sukzessives Vermischen unter Rühren der Lösungen B1 - B2 - B3 - B4 hergestellt. Das erhaltene Gemisch wird 1:1 mit einer Lösung A versetzt und das so hergestellte Reagens sofort verwendet.
Nach Behandlung mit dem Silberreagens werden die Platten mit destilliertem H&sub2;O 15 min lang gewaschen, anschließend in 1%iger Essigsäure (Vol/Vol) zweimal 15 min und schließlich 1 min in 1%igem Pyronin Y (Sigma Ref. P 7017) in H&sub2;O gewaschen, einige Sekunden mit destilliertem Wasser gespült, an heißer Luft getrocknet und auf DPX gegeben.

E. Ergebnisse der Spermien

Nach in situ Hybridisierung ist das Vorliegen eines spezifischen Markers auf den Spermien nachweisbar. Das Untergrundrauschen ist vernachlässigbar. Die Volumenerhöhung des Kopfes der Spermien bezeugt ihre Dekondensation.
Nach Hybridisierung in situ wird das Vorliegen eines Markers mit Hilfe eines optischen Mikroskops beobachtet.
Die spezifische Markierung ist auf etwa 80 bis 100 % der männlichen Zellen nachweisbar und fehlt bei den weiblichen Zellen völlig. Sie liegt in Form eines schwarzbraunen Präzipitats auf Kernhöhe der männlichen Zellen vor.

Beispiel 8

Kontrolle der Qualität einer Rinderspermienpopulation mit einer DNA-Sonde, die für das männliche Geschlecht spezifisch ist

A. Herstellung der Zellen

Die verwendeten Zellen sind in flüssigem Stickstoff stockgefrorene Stierspermien. Ein Anteil von etwa 13.000.000 lebenden Spermien wird aufgetaut. Dieser Anteil wird 30 s auf 37ºC erhitzt, und dann wird das Sperma in 1 ml sterilem PBS verdünnt.
Es wird eine Reihe von Zentrifugationen durchgeführt, mit dem Ziel, das meiste des Gefriermilieus zu entfernen. Die Spermiensuspension in PBS wird zuerst 10 min bei 500 g zentrifugiert, dann wird der Überstand angesaugt und die Spermien in 1 ml 0,11 M Natriumcitrat aufgenommen. Es wird 10 min bei 500 G zentrifugiert. Man saugt den Überstand an, nimmt in 1 ml 0,11 M Natriumcitrat + 5 % DMSO auf, zentrifugiert 10 min bei 500 G. Der Überstand wird abgesaugt, und dann wird in 1 ml 0,11 M Natriumcitrat + 15 % DMSO resuspendiert. Man zentrifugiert 10 min bei 500 G. Man saugt den Überstand an, resuspendiert ihn in 1 ml 0,11 M Natriumcitrat + 50 % DMSO. Es wird 10 min bei 500 G zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt. Es wird in 1 ml 0,11 M Natriumcitrat in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, aufgenommen. Es wird 10 min bei 500 G zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und der Rest in 250 ul des gleichen Puffers resuspendiert.
In diesem Stadium werden die Zellen entweder auf einer Platte (30 bis 40 ul Spermiensuspension pro Platte) niedergeschlagen und durch in situ Hybridisierung mit einer biotinylierten Sonde behandelt oder auf einem Filter niedergeschlagen und nach der Dot-Blot-Technik mit einer mit Hilfe von radioaktiven Nucleotiden markierten Sonde hybridisiert.

B. Vorbehandlung der Platten zur in situ Hybridisierung

Nach Aufbringen der Spermien werden die Platten an Luft getrocknet, und die Dekondensation der Zellen wird wie folgt durchgeführt:
1) Man gibt einen hypotonen Schock mit Hilfe einer 0,08 M Kaliumchloridlösung während 5 min bei Umgebungstemperatur. Die Spermien werden dann in einem Gemisch aus Methanol : Essigsäure (3:1) während 30 min fixiert. Um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu eliminieren, werden die Platten mit Methanol + 3,3 % H&sub2;O&sub2; während 30 min behandelt, dann 10 min in absolutem Ethanol, 10 min in Xylol, 10 min in absolutem Ethanol gespült.
2) Nach Trocknen in Luft wird eine Lösung aus 40 U Papain (aktiviert mit 2 mM Natriumsulfit in 0,1 M Tris, pH 8,6) (oder Proteinase K oder Trypsin) auf jede Platte aufgebracht.
3) Nach 15-minütiger Inkubation bei 37ºC werden die Platten kurz in PBS gespült, dann 15 min bei Umgebungstemperatur in einer Lösung aus 0,1 M Tris, pH 8,6, enthaltend 1 % DMSO oder SDS und 40 mM eines Reduktionsmittels für die Disulfidbrücken, wie Dithiothreit, β-Mercaptoethanol oder analoge Verbindungen inkubiert. Die Platten werden dann dreimal 5 min in PBS gewaschen und dann an Luft getrocknet.
In diesem Stadium sind die Platten bereit für die Denaturierung und die in situ Hybridisierung.

C. Hybridisierungstechnik auf Platten

Die Platten werden mit 90 bis 100 ul Hybridisierungsflüssigkeit inkubiert und mit einem Plastikfilm (um die Verdampfung zu verhindern).
Nach 10-minütiger Denaturierung in einem 100ºC heißen Ofen werden die Platten in eine Feuchtkammer gegeben und 16 h bei 42ºC inkubiert.
Die Endzusammensetzung der Hybridisierungsflüssigkeit ist die folgende:
4 x SSC
1 mM EDTA
25 mM Tris-HCl, pH 7,3
1 x Denhart
10 % Dextran
50 % entionisiertes Formamid
Sonde: 80 ng/ml Hybridisierungsmilieu
(1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat)
(1 x Denhard = 0,02 % BSA oder 0,02 % Magermilch
0,02 % Polyvinylpyrrolidon
0,02 % Ficoll).
Nach Abziehen des Plastikfilms werden die Platten sukzessive in einer Lösung aus 2 x SSC (30 min bei Umgebungstemperatur) und dann in einer Lösung 0,1 x SSC (30 min bei 42ºC), dann in einer Lösung aus 2 x SSC (15 min bei Umgebungstemperatur) und schließlich in einer Lösung aus PBS, pH 7,4, unter Zusatz von 0,1 % Vol/Vol Triton X - 100 und 0,5 % (Gewicht/Vol) Magermilchpulver (Regilait) gewaschen.

D. Detektion

Die noch feuchten Platten werden nach Entfernen überschüssiger Flüssigkeit dann 1 h bei 37ºC mit einem Antibiotin-Ziegen-Antikörper oder einem Antibiotin-Kaninchen-Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper wird durch Affinitätschromatografie gereinigt, im Handel vertrieben (Vector Laboratories Ref. SP-3000) und wird in unseren Tests in einer Verdünnung von 1:350 PBS, pH 7,4 + 0,1 % (Vol/Vol) Triton X - 100 + 0,5 % (Gewicht/Vol) Magermilchpulver verwendet.
Nach 15-minütigem Waschen bei Umgebungstemperatur in PBS, pH 7,4, + 0,1 % (Vol/Vol) Triton X - 100 + 0,5 % (Gewicht/Vol) Magermilchpulver werden die Platten dann 1 h bei 37ºC mit einem herkömmlichen Kaninchen- Antiziege-Antikörper oder einem Ziege-Antikaninchen-Antikörper, gekoppelt an der Oxidase (Biosys Ref. BI 2403), verdünnt 1:40 in PBS, pH 7,4, + 0,1 % Triton + 0,5 % Magermilchpulver inkubiert.
Die Platten werden dann zweimal 15 min in PBS, pH 7,4, enthaltend diesmal 0,1 % (Vol/Vol) Tween 20 und schließlich in PBS, pH 7,4, 5 min lang gewaschen.
Es wird 5 bis 8 min bei Umgebungstemperatur mit einer Diaminobenzidinlösung (DAB Sigma Ref. D 8001) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS, pH 7,4, enthaltend 0,01 % H&sub2;O&sub2; inkubiert.
Das unter Wirkung der Peroxidase auf DAB gebildete Präzipitat wird durch anschließende Präzipitation von Gold- und Silbersalzen nach dem von Burns et al. (Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092) beschriebenen Verfahren verstärkt.
Zuerst werden 50 bis 100 ul pro Platte einer Lösung aus 2,5 mM Natriumchloraurat (NaAuCl&sub4; BDH Ref. 30125 2R) aufgebracht und 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach 5-minütigem Waschen in destilliertem Wasser werden die Platten 5 min bei Umgebungstemperatur mit 50 bis 100 ul einer Lösung aus 0,1 M Natriumsulfit (Na&sub2;S, Sigma Ref. S 2006) inkubiert, 5 min mit destilliertem Wasser gespült und 4 bis 8 min mit 100 bis 300 ul Silberreagens inkubiert.
Die Zusammensetzung des Silberreagenses lautet wie folgt:
A Natriumcarbonat 0,24 M (Sigma Ref. S 4132)
B1 Ammoniumnitrat 13 mM (Sigma Ref. A 9642)
B2 Silbernitrat 6 mM (BDH Ref. 303873N)
B3 Dodecawolframkieselsäure 1,5 mM (BDH Ref. 305453R)
B4 Formaldehyd 37 %ig 0,6 ul/ml (Sigma Ref. F 1635)
Das Silberreagens wird durch sukzessives Vermischen unter Rühren der Lösungen B1 - B2 - B3 - B4 hergestellt. Das erhaltene Gemisch wird im Verhältnis 1:1 zu einer Lösung A gegeben, und das so hergestellte Reagens wird sofort verwendet.
Nach Behandlung mit dem Silberreagens werden die Platten mit destilliertem H&sub2;O 15 min lang gewaschen, dann in 1%iger Essigsäure (Vol/Vol) zweimal 15 min lang und schließlich 1 min in 1% Pyronin Y (Sigma Ref. P 7017) in H&sub2;O angefärbt, einige Sekunden mit destilliertem Wasser gespült, an heißer Luft getrocknet und auf DPX aufgebracht.
Obwohl die vorausgehende Beschreibung im wesentlichen sich auf die Rolle der Sonde b.c.1.2. zur Bestimmung des Geschlechts der Rinderembryonen die Kontrolle des Vorliegens des Chromosoms Y in einer Spermienpopulation und Trennung der letzteren in zwei Gruppen, umfassend das Y-Chromosom bzw. das X-Chromosom, hinsichtlich ihrer Verwendung zur künstlichen Befruchtung bezogen hat, ist leicht einzusehen, daß diese Rolle sich auch auf andere Tiere in dem Maße, in dem die letzteren für das männliche Geschlecht spezifische DNA-Sequenzen zeigen, ähnlich denen der Rinderembryonen, erstrecken kann. Ebenso ist die Rolle der Sonde b.c.1.2., wie vorstehend beschrieben, nur als nicht beschränkendes Beispiel angegeben und kann sich auf die Suche nach anderen, für das männliche Geschlecht spezifischen Sequenzen erstrecken.

Claims

1. Molekulare DNA-Sonde, spezifisch für das männliche Genom von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, und insbesondere der Gattung Bos, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde ein Nukleinsäuresegment, ausgewählt aus der Gruppe:

(a) Nukleinsäurefragment aus 49 Basenpaaren, deren 5'-3'-Sequenz wie folgt lautet:

(b) Nukleinsäurefragment, umfassend mindestens 11 aufeinanderfolgende Nukleotide dieser Sequenz,

(c) Nukleinsäurefragment, dessen Sequenz mindestens 70 % Homologie mit der der obigen Segmente (a) und (b) zeigt,

(d) Nukleinsäurefragment, dessen Sequenz der eines der obigen Segmente (a), (b) oder (c) komplementär ist, umfaßt, mit der Maßgabe, daß das Nukleinsäurefragment ein für die männliche genomische DNA von Wiederkäuern, die durch EcoRI, das zum Erscheinen einer Bande in der Größenordnung von 7 kb führt, abgebaut wurde, spezifisches Hybridisierungsprofil zeigt.

2. Molekulare Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem oder mehreren Radioisotopen markiert ist.

3. Molekulare Sonde nach Anspruch 1, dadurch gegekennzeichnet, daß sie mit einem nicht-radioaktiven Marker markiert ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer molekularen DNA- Sonde, die für das männliche Genom von Wiederkäuern spezifisch ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Stufe umfaßt, im Verlauf derer man ein Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 synthetisiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurefragment nach dem Phosphoramiditverfahren an fester Phase synthetisiert wird.

6. Diagnostische Reagenzien zur Detektion von Sequenzen, die für das Y-Chromosom des Rinds spezifisch sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.

7. Verwendung der diagnostischen Reagenzien nach Anspruch 6 zur in-vitro-Bestimmung des Geschlechts eines Embryos oder Fötus von Wiederkäuern.

8. Verwendung der diagnostischen Reagenzien nach Anspruch 6 zur Detektion der Spermien, die das Y-Chromosom tragen.

9. Verfahren zur direkten und unmittelbaren Kontrolle des Anteils der Spermien, die das Y-Chromosom tragen, in einer Spermienpopulation von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, insbesondere der Gattung Bos, dadurch gekennzeichnet, daß die Spermien dieser Population mit einer DNA-Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die geeigneterweise markiert ist, in Kontakt gebracht werden, um die Spermien durch Hybridisierung mit der Sonde zu markieren, und danach die hybridisierten Spermien nach einem geeigneten Verfahren detektiert werden.

10. Verfahren zur Kontrolle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung der Sonde direkt in situ ohne vorherige Extraktion der DNA der Spermien durchgeführt wird.

11. Verfahren zur Kontrolle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA ausgehend von zuvor mit der Sonde hybridisierten Spermien isoliert wird.

12. Verfahren zur Kontrolle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Spermien bei dem Hybridisierungsschritt zuerst einem chemischen Dekondensationsverfahren unterworfen werden, das im wesentlichen drei schritte umfaßt, nämlich einen hypotonen Schock, einen proteolytischen Abbau und eine Reduktion der Disulfidbrücken.

13. Verfahren zur Aussonderung von Spermien, die daß X- Chromosom tragen, und von Spermien, die das Y-Chromosom tragen, in einer Spermienpopulation von Wiederkäuern, insbesondere der Unterfamilie der Rinder, insbesondere der Gattung Bos, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

(a) Markierung der bekannten DNA in den Spermien durch einen spezifischen Vitalfarbstoff für DNA;

(b) cytofluorometrische Auftrennung in zwei Spermienfraktionen X und Y als Funktion der DNA-Menge, die sie enthalten;

(c) Kontrolle der Qualität der im Verlauf der obigen zweiten Stufe durchgeführten Auftrennung, dadurch, daß man das Kontrollverfahren des Teils der Spermien, die das Y- Chromosom tragen, nach einem der Ansprüche 9 bis 12 durchführt;

(d) Immunisierung von Nagetieren [Saugetieren (Mäuse oder Ratten)] durch die kontrollierten Fraktionen, die gegebenenfalls einer erneuten Auftrennung als Folge der Kontrolle unterworfen worden sind, um monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erzeugen;

(e) Kontrolle der Spezifität der Antikörper durch Agglutinationstests, Tests auf Spermatotoxizität, Tests auf indirekte Immunfluoreszenz, Durchflußcytometrie, um spezifische immunologische Reagenzien zu erhalten, die die antigenen Determinanten, die von den Chromosomen X oder Y kontrolliert werden und an der Oberfläche der Spermien exprimiert werden, zu erhalten, welche zur Verwendung zur Trennung von lebenden Spermien, die das Chromosom X oder das Chromosom Y tragen, geeignet sind;

(f) Abtrennung der Spermienfraktionen, die jeweils das Chromosom X bzw. das Chromosom Y tragen, aus einer Spermienpopulation mit Hilfe der immunchemischen Reagenzien.

14. Verfahren zur Aussonderung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Immunisierung der Nagetiere, welche die vierte Stufe des Aussonderungsverfahrens darstellt, die Gewinnung der polyklonalen Antikörper, die sich aus der Immunisierung ergeben, und ihre Absorption auf den Spermien des Geschlechts, das dem, das zur Immunisierung gedient hat, entgegengesetzt ist, anschließt, wobei die Spezifität dieser Antikörper auf den Spermien des gesuchten Geschlechts kontrolliert wird und die Antikörper anschließend gegebenenfalls gereinigt werden.

15. Verfahren zur Aussonderung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die X- und Y-Spermien, die durch Cytofluorometrie getrennt worden sind, zur Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper der Chromosomen X und Y verwendet werden.