DE19959751A1

DE19959751A1 - DNA-Marker für die Erstellung von digitalen DNA-Signaturen

Info

Publication number: DE19959751A1
Application number: DE19959751A
Authority: DE
Inventors: Hans Rudolf Fries; Gregor Durstewitz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-12-11
Filing date: 1999-12-11
Publication date: 2001-06-13

Description

EINLEITUNG

Die Erfindung betrifft DNA-Moleküle mit einer bestimmten Nukleotidsequenz und der Bezeichnung einer variablen Position innerhalb der Sequenz, an der alternativ zwei verschiedene Nukleotide vorkommen können. Durch die Abfrage der variablen Position innerhalb der Moleküle, die Gegenstand dieser Erfindung sind, wird eine individualspezifische Signatur erstellt, die für die Identifikation, die Abstammungskontrolle und den Herkunftsnachweis von tierischen Produkten herangezogen werden kann. Die Methode eignet sich auch für die Untersuchung der Assoziation von Merkmalen mit Genomregionen, aus denen die Moleküle isoliert wurden und für die Erstellung art-, populations- und rassespezifischer DNA-Signaturen.

Voraussetzung für eine erfolgreiche Tierzucht ist eine möglichst zuverlässige Schätzung des genetischen Wertes eines Tieres (Zuchtwertschätzung). Diese Schätzung wird oft durch die Untersuchung von Nachkommen eines Prüftieres bewerkstelligt. Für die Zuchtwertschätzung müssen die verwandtschaftlichen Beziehungen der involvierten Tiere gesichert sein. Herkömmliche Verfahren der Abstammungssicherung beruhen auf Blutgruppen- und DNA- Untersuchungen. Auf Blutgruppenuntersuchungen beruhende Verfahren lassen oft keine eindeutigen Schlüsse zu. Herkömmliche DNA-Verfahren lassen sich nur schwer oder überhaupt nicht standardisieren, da die Variabilität der diesen Untersuchungen zu Grunde liegenden DNA-Moleküle analog als Mobilitätsunterschiede in einem Gel gemessen werden. Die fehlende Standardisierungsmöglichkeit hat zur Folge, dass eine zuverlässige Aussage hinsichtlich der Identität und Abstammung nur möglich ist, wenn alle involvierten Tiere gleichzeitig untersucht werden. Die hier vorgestellte Erfindung nutzt die für eine Spezies eindeutige Sequenz, welche die variable Position umgibt, als inhärentes Standardisierungsmerkmal. Wenn eine durch die flankierende Sequenz eindeutig definierte Stelle auf das Vorkommen von zwei bestimmten Basen abgefragt wird, ist das (digitale) Resultat unabhängig von der angewandten Abfragemethode und ohne die Verwendung eines Standards entweder "1 0" (1 Nukleotid präsent), "0 1" (das andere Nukleotid ist präsent) oder "1 1" (beide Nukleotide sind präsent, heterozygot).

Normalerweise ist bekannt, welches die beiden alternative Basen sind, die an einer variablen Stelle vorkommen. Wenn das nicht der Fall ist, kann auch auf das Vorkommen aller vier Basen abgefragt werden.

Die Erfindung ist auch herkömmlichen Verfahren zur Herkunftskontrolle von Fleisch überlegen. Die Möglichkeit, die Abfrage der variablen Positionen bei hohem Durchsatz z. B. auf DNA-Chips vornehmen zu können, erlaubt die Typisierung ganzer Tierpopulationen. Die Resultate der Abfrage werden als Abfolge der Zahlenpaare "1" und "0" in einer Datenbank abgelegt. Für Routinekontrollen und in Streitfällen wird die angegebene Herkunft durch die Erstellung einer digitalen DNA-Signatur des Fleisches und den Vergleich mit der in der Datenbank abgelegten Signatur überprüft. Herkömmliche Methoden der DNA-Typisierung erfordern die gleichzeitige Untersuchung von Material des Tieres, von dem das Produkt stammt, und einer Probe des Produktes. Die herkömmliche Methode erfordert deshalb beträchtliche Lagerkapazität und birgt zudem die Gefahr, dass das gelagerte Material wegen Verderbnis nicht mehr typisiert werden kann.

Die Untersuchung von Assoziationen von variablen Genombereichen mit der Merkmalsausprägung erfordert die Untersuchung von mehreren Tausenden von Tieren. Unsere Erfindung schafft die Grundlage für die Typisierung der Chromosomenregionen, aus denen die präsentierten Moleküle stammen, bei einem für populationsweite Untersuchungen notwendigen hohen Durchsatz.

Es ist weiterhin von Vorteil, dass DNA-Variation, die auf Einzelnukleotidaustauschen beruht, um Größenordnungen stabiler vererbt werden als das bei herkömmlichen Markersystemen der Fall ist.

Das Verfahren der digitalen Darstellung von DNA-Variation verlangt keine bestimmte Abfragemethode der variablen Position. Zur Zeit stehen die allelspezifische Hybridisierung, der "Oligonucleotide-Ligation-Assay" (siehe "Beispiel") und die allelspezifische Primerextension und ähnliche Verfahren zur Verfügung. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass in Zukunft noch effizientere Verfahren zur Verfügung stehen werden.

BEISPIEL

Im folgenden wird dargestellt, wie durch die Untersuchung der variablen Position in einem Subset der in Anspruch 1 aufgeführten Nukleotidsequenzen (TCRA, 431_A2, 420_21, 417_16, 423_24a) individualspezifische Signaturen erstellt werden können. Das angewandte Verfahren zur Darstellung der variablen Nukleotidpositionen basiert auf einer Publikation von Baron et al. (Oligonucleotide ligation assay (OLA) for the diagnosis of familial hypercholesterolemia, Nature Biotechnology 14: 1279-1282, 1996).

Multiplex PCR

Für jedes Tier (Tier 1, Tier 2, Tier 3)wurde in einem Biometra T Gradient Thermocycler eine 5x multiplex PCR durchgeführt in 20 µl Gesamtvolumen unter Einsatz von 75 ng genomischer DNA, bei 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 200 µM je dNTP, 2 mM MgCl₂, 0.5 µM je Primer und 0.5 units Ampli-Taq DNA Polymerase (PE Biosystems). Es wurden die folgenden PCR-Primer verwendet:

Die PCR Bedingungen waren: 3 Minuten Denaturierung bei 94°, gefolgt von 30 Zyklen mit 30 sec bei 95°, 1 min bei 60°, 1 min bei 72°, gefolgt von einer abschliessenden Extension von 10 min bei 72° und anschliessender Kühlung bei 4°C.

Design von OLA Primern

Für jeden polymorphen Locus wurden 2 allel-sensitive und 1 gemeinsamer 5'-phosphorylierter und 3'-fluoreszenzmarkierter Primer synthetisiert. Die beiden allel-sensitiven Primer verfügten am 5'-Ende über unterschiedlich lange, kovalent gekoppelte Pentaethylenoxid (PEO)-Schwänze. Dabei entsprach ein PEO-Monomer einem Mobilitätsäquivalent von 2.4 bp DNA. Die verwendenten Oligonukleotide sind unten aufgeführt:

Multiplex OLA

Ein 5x multiplex Oligo ligation assay (OLA) wurde durchgeführt in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 3 µl multiplex-PCR-Produkt bei 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 10 mM DTT, 1 mM NAD, 0.1% Triton X-100, 2.5-50 nM je OLA Primer und 4 units Taq Ligase (New England Biolabs). Die Ligation wurde durchgeführt mit 30 sec Denaturierung bei 94°, gefolgt von 20 Zyklen mit 30 sec bei 94° und 3 min bei 45°, einer abschließenden Denaturierung von 10 min bei 99° und schließlich Kühlung bei 4°C.

Elektrophorese auf ABI 377 Sequencer

1 µl OLA-Produkt wurden gemischt mit 2 µl entionisiertem Formamid und 0.3 µl ROX 500 als internem Größenstandard (PE Biosystems). Die Proben wurden 2 min denaturiert bei 95°, dann auf Eis gekühlt. 2 pl davon wurden dann auf ein 0.2 mm dickes denaturierendes 8% PA Gel in 1x TBE geladen (29 : 1 Acrylamid/Bisacrylamid, 5.8 M Harnstoff, 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA). Die Auftrennung der Proben erfolgte in einem ABI 377 Sequencer (PE Biosystems) auf einer Gellänge von 36 cm bei 3000 V für 3 h. Die Auswertung der Fluoreszenzscans erfolgte mit der GENESCAN/GENOTYPER Software (PE Biosystems).

Das Resultat des OLA für die drei Tiere sowie die digitalen Signaturen sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

Tabelle 1

Charakteristika der variablen Sequenzenpositionen

Nukleotid Sequenzen der in Tabelle 1 aufgeführten variablen DNA-Moleküle des Rindes

Claims

1. Eine Menge von DNA-Molekülen des Rindes charakterisiert durch ihre Nukleotidsequenz und aufgeführt in Tabelle 1 mit der Angabe von jeweils einer oder mehreren variablen Positionen und der Frequenz der alternativen Nukleotide bei 10 Tieren.

2. Eine Methode, die dadurch gekennzeichnet ist, dass mit ihr die in Anspruch 1 aufgeführten Sequenzen für die Erstellung von digitalen, standardisierbaren DNA-Signaturen eingesetzt werden.

3. Die Methode von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Abstammungskontrolle eingesetzt wird.

4. Die Methode von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Individualidentifikation eingesetzt wird.

5. Die Methode von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für genetische Assoziationsstudien eingesetzt wird.

6. Die Methode von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Erstellung von art-, populations- und rassespezifischen Signaturen eingesetzt wird.