DE69823372T2

DE69823372T2 - Verfahren und reagentiensatz zur amplifizierung, sequenzierung und typisierung von hla i genen

Info

Publication number: DE69823372T2
Application number: DE69823372T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Caroline GAREY; James Leushner
Original assignee: Visible Genetics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1997-10-10
Filing date: 1998-10-09
Publication date: 2005-05-04
Also published as: CA2302810A1; AU9425798A; EP1021559A2; EP1021559B1; WO1999019509A3; WO1999019509A2; DE69823372T8; JP2001520020A; DE69823372D1; US5910413A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Testkit für die hoch auflösende, DNA-basierte Typisierung von drei klassischen Genen der MHC Klasse I, nämlich die Loci für HLA A, HLA B und HLA C in einer Probe eines Patienten.
Die Gene der MHC Klasse I umfassen die drei klassischen Gene, die die hauptsächlichen Transplantations-Antigene HLA A, HLA B und HLA C und sieben andere Gene der Klasse I kodieren, von welchen HLA E, HLA F und HLA G wahrscheinlich funktionale Gene sind und HLA H, HLA I, HLA K und HLA L Pseudogene sind. Alle klassischen Gene der Klasse I haben eine ähnliche Struktur: Exon 1 (73 bp) – Intron 1 (130 bp) – Exon 2 (270 bp) – Intron 2 (272 bp) – Exon 3 (276 bp) – Intron 3 (588 bp). Die klassischen Gene der Klasse I sind hoch polymorph. Seit 1996 sind wenigstens 82 Allele von HLA A, 186 von HLA B und 42 von HLA C identifiziert worden.
Verfahren zum Bestimmen der Allele von HLA A, HLA B und HLA C in einer Probe eines Patienten sind intensiv untersucht worden, aufgrund der funktionellen Bedeutung dieser Gene bei der Gewebsabstimmung für Transplantationen und Autoimmunkrankheiten. Serologische Tests einschließlich des Komplement abhängigen Tests der Zytotoxizität (siehe Terasaki und McClelland, Nature, 204: 998, (1964)), die eine Identifikation mit niedriger Auflösung der Typen von HLA Bereitstellen, waren die am häufigsten bis heute angewendeten. Unvorteilhafter Weise können solche Tests mit niedriger Auflösung nicht alle funktionell bedeutenden Transplantations-Antigene nachweisen und unterscheiden (Anasetti et al., Hum. Immunol., 29: 70 (1990)).
Tests mit hoher Auflösung sind wünschenswerter, da sie zu einer verbesserten Abstimmung von Gewebe und einer verminderten Abstoßung des Transplantats führen. Gegenwärtige Verfahren zum Typisieren mit hoher Auflösung schließen die Verwendung von Sequenz-spezifischen Oligonukleotid-Sonden (SSOP) ein. Das SSOP-Verfahren ist gut in US Patent 5 451 512, an Hoffmann LaRoche Inc. übertragen, erläutert. Unter Verwendung eines umgekehrten Dotblot-Formats werden HLA A Sonden auf einer Membran immobilisiert und die markierte Ziel-DNA (Probe eines Patienten) wird mit der an die Membran gebundenen Sonde hybridisiert, wie in Saiki et al., 1989, Proc. Acad. Natl. Sci. 86: 6230–6234 beschrieben ist. Die Stellen der Hybridisierung werden nachgewiesen und der Typ von HLA A kann abgeleitet werden. Dieses Verfahren betrifft keine direkte Sequenzierung von DNA.
Ein anderer Test mit hoher Auflösung ist das Amplification Refractory Mutation System (ARMS) (siehe „HLA Class I SSP ARMS-PCR typing kit", Reference Manual, Ausgabe Juni 1995, Imperial Cancer Research Fund). Weil Primer, die nicht zur Ziel-Nukleinsäure passen, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht amplifiziert werden, ermöglicht die Verwendung von Primern mit spezifisch ausgelegten 3'-Enden zur Amplifizierung, dass die allelische Zusammensetzung auf der Grundlage bestimmt wird, welche der ARMS-Primer dabei versagen zu amplifizieren und welche erfolgreich sind. Dieses Verfahren betrifft keine direkte Sequenzierung von DNA.
Ein direktes Sequenzierverfahren für DNA für die Typisierung von HLA Klasse I ist von Santamaria et al. vorgeschlagen worden („HLA Class I Sequence-Based Typing", Hum. Immunol. 37, 39–50 (1993); WO 9 219 771; US Patent 5 424 184). Dieses Verfahren hat Oligonukleotid-Primer für die Amplifizierung identifiziert und das Sequenzieren klassischer Gene der Klasse I. Dieses Verfahren ist nachteilig, weil es sich auf die Sequenzen von cDNA (Exon) fokussiert, welche aufgrund der Diversität von Sequenzen eine sehr geringe Auswahl konservierter Stellen zur Hybridisierung von Primern anbieten. Des Weiteren wurden die offenbarten Stellen vor der kürzlichen Entdeckung von Dutzenden weiterer Allele bestimmt, die nun beim Identifizieren des Typs von HLA in Betracht gezogen werden müssen. Weil die Sequenzierprimer von Santamaria mit einem Exon hybridisieren, liefern sie überdies keine Informationen über DNA-Sequenzen stromaufwärts des Primers, was möglicherweise für die Unterscheidung zwischen den Allelen entscheidend ist.
Die Sequenzen von Introns, wie sie in der vorliegenden Patentanmeldung offenbart werden, stellen die bevorzugten Hybridisierungsstellen für Amplifikations- und Sequenzierprimer für die Gene von HLA A, HLA B und HLA C bereit. Intron-Sequenzen für ein HLA Gen der Klasse I wurden mindestens so früh wie 1985 offenbart (Weiß et al., Immunobiol. 170: 367–380, (1985)). Aufgrund der wesentlichen Diversität und Schwierigkeiten beim Sequenzieren sind wenige Intron-Sequenzen in der Folge veröffentlicht worden. Ein Bericht von Blasczyk und Wehling (in Abstracts of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, 22nd Annual Meeting, October 11–15, 1996) behauptet, dass die Intron-Sequenzen in 48 gut definierten Zelllinien und 195 per PCR typisierten klinischen Proben bestimmt worden sind.
Cereb et al. (Tissue Antigens 1995: 45: 1–11) nahmen die Identifizierung der Intron-Sequenzen vor, die für Locus-spezifische Primersätze zur Amplifizierung von allen Genen der Klasse I geeignet sind. Amplifizierte Fragmente wurden durch SSOP charakterisiert und es wurde keine direkte Sequenzierung der amplifizierten Fragmente durchgeführt.
Blaszyk et al. haben Primer zur Verwendung in der Amplifizierung des Locus HLA A zur Vorbereitung der Sequenz-basierten Typisierung einer Probe veröffentlicht. Tissue Antigens 47: 102–110 (1996). Einundzwanzig verschiedene Mischungen von Primern, die unterschiedliche serologische Spezifitäten aufwiesen, wurden zur Amplifizierung des zweiten und dritten Exons des Gens HLA A identifiziert. Die sich ergebenden Amplifikationsprodukte wurde dann durch Sequenzieren analysiert.
Johnston-Dow et al. (Poster-Präsentation: 1995, ASHI Meeting, Dallas, Texas) präsentierten ein System zur direkten Bestimmung der Sequenz von HLA A, bei dem degenerierte Primer auf Basis von Exons verwendet wurden, um Exons 1 bis 5 der genomischen DNA-Sequenz von HLA A zu amplifizieren. Das Sequenzieren der amplifizierten Fragmente wurde unter Verwendung degenerierter Primer erhalten, welche mit den Regionen der Introns hybridisieren, die die Exons 2 und 3 flankieren.
Das direkte Sequenzieren von Allelen von HLA B aus einem amplifizierten genomischen DNA-Fragment wurde von Petersdorf und Hansen durchgeführt (Tissue Antigens 1995, 46: 73–85). Insgesamt fünf Primer-Sätze (zehn verschiedene Primer) mit verschiedenen allelischen Spezifitäten wurden verwendet, um genomisches Material zu amplifizieren und die Amplifikationsprodukte wurden dann sequenziert.
Die WO 97/23645 offenbart die Identifizierung von Konsensus-Sequenzen von Introns (1, 2 und 3) aus der Mehrheit von Allotypen von HLA A, B und C und ihre Verwendung, um Primer zu entwickeln, die innerhalb der Introns (1 und 3) dieser Gene lokalisiert sind. Diese Primer sind für die Locus-spezifische Amplifizierung der Gesamtheit der Exons 2 und 3 geeignet, d. h. den Abschnitt dieser Gene, der zur Verwendung beim Typisieren von HLA A, B und C am geeignetesten ist. Diese Primer sind auch zur Verwendung als Sequenzierprimer geeignet, um die Allele von HLA im Sequenz-basierten Typisieren von HLA zu bestimmen.
Ungeachtet der verschiedenen Anstrengungen, die unternommen worden sind, um wirksame Verfahren zum Typisieren von HLA-Genen zu entwickeln, stellt keines der zuvor offenbarten Verfahren tatsächlich einen Test bereit, welcher eine schnelle Typisierung von HLA-Allelen unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Reagenzien auf eine Art und Weise ermöglichen wird, welche reproduzierbar ist und welche bei gewöhnlicher Verwendung tatsächlich die Typisierung aller allelischer Varianten erzielt. Daher mögen zum Beispiel bestimmte Primer theoretisch in der Lage sein, die Amplifizierung und nachfolgende Sequenzierung von allen allelischen Varianten von einem der klassischen HLA-Gene zu erzielen, jedoch wird in der Praxis für Reaktionen dieser Primer gefunden, dass sie unter Ausfällen leiden, die den spezifischen Nachweis einiger Allele ausschließen. Es verbleibt daher ein Bedarf nach einem Verfahren und einen Testkit, welche direkte Sequenz-Informationen mit hoher Auflösung für die Gene HLA A, HLA B und/oder HLA C unter Verwendung eines Minimums an Oligonukleotid-Primern für alle Allele des analysierten Gens erreichen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Testkit zur direkten Sequenzierung der Allele von HLA A, HLA B und/oder HLA C bereitzustellen, die eine minimale Anzahl von Oligonukleotiden umfassen, welche mit Intron- Regionen dieser Gene hybridisieren und welche zwischen sich alle Allele dieser Gene amplifizieren können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Testkit zum direkten Sequenzieren der Allele von HLA A, HLA B und, HLA C unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Oligonukleotiden bereitzustellen, welche mit Intron-Regionen dieser Gene hybridisieren und welche zwischen sich alle Allele dieser Gene sequenzieren können.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben nun bevorzugte Primerstellen für die Amplifikation und Sequenzierung identifiziert, welche die hoch robuste und konsistente Amplifikation und das Sequenz-basierte Typisieren der Exons 2 und 3 von jedem der klassischen HLA-Gene unter Verwendung einer Amplifizierungsreaktion und einer oder mehrerer 3'- und/oder einer oder mehrerer 5'-Sequenzierungsreaktionen pro Locus ermöglichen. Daher wird in Übereinstimmung mit der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des allelischen Typs eines Gens von HLA A, HLA B oder HLA C bereitgestellt, das in einer Probe vorliegt, das die Schritte umfasst von
Vereinigen der Probe mit einer Reaktionsmischung zur Amplifikation, die eine Mischung von Amplifikationsprimern umfasst, die unter den Primern ausgewählt sind, die die Sequenzen aufweisen, die durch die Sequenz ID Nrn. 1 und 2, Sequenz ID Nrn. 3, 4 und 5; oder Sequenz ID Nrn. 6 und 7 angegeben sind und Zyklusfahren der sich ergebenden Mischung, um ein Amplifikationsprodukt zu produzieren;
Vereinigen des Amplifikationsproduktes mit einer Reaktionsmischung zur Sequenzierung, die eine oder mehrere Oligonukleotid-Sequenzierprimer umfasst, welche mit konservierten Regionen des Amplifikationsproduktes hybridisieren, wobei die Oligonukleotid-Sequenzierprimer zwischen sich wirksam sind, um Sequenzierfragmente von allen bekannten Allelen von Exon 2 oder Exon 3 des Gens unter geeigneten Bedingungen, um Sequenzierfragmente zu erzeugen, produzieren;
Bewerten der Sequenzierfragmente, um die Sequenz von wenigstens einem Abschnitt von Exon 2 oder Exon 3 des Gens in der Probe zu bestimmen; und
Vergleichen der bestimmten Sequenz mit einer Standard-Sequenz für bekannte Allele, um den allelischen Typ des Gens in der Probe zu bestimmen. Das Sequenzieren wird vorzugsweise unter Verwendung von Sequenzierprimern ausgeführt, die die Sequenzen aufweisen, die durch die Sequenz ID Nrn. 8–21 angegeben sind. Die Amplifikations- und Sequenzierprimer können für den einfachen Verkauf und zum Testen der Leistung in ein Testkit verpackt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Verfahren der Erfindung schematisch.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Praktisch alle der Allele der klassischen Gene von HLA Klasse I (HLA A, HLA B und HLA C) können allein auf der Basis von Exon 2 und 3 unterschieden werden. Die vorliegende Erfindung nutzt diesen Vorteil und stellt ein Verfahren und ein Testkit zur Amplifizierung und Sequenzierung von DNA eines DNA-Fragments von annähernd 900 bp bereit, dass die Exons 2 und 3 von HLA A, HLA B und/oder HLA C enthält, durch Verwenden von Primern, die an Ziele in Introns hybridisieren, die diese Exons flankieren. Diese Ziele sind für den in Rede stehenden Locus hoch spezifisch und unter allen Allelen des Locus hoch konserviert. Diese Primer amplifizieren keine Pseudogene oder anderen Loci der Klasse I in signifikantem Ausmaß mit.
Während die in dieser Anmeldung verwendete Terminologie innerhalb des Fachgebiets üblich ist, werden die folgenden Definitionen bestimmter Ausdrücke bereitgestellt, um die Klarheit sicherzustellen.

1. „Allel" bezieht sich auf eine spezifische Version einer Nukleotidsequenz in einem polymorphen genetischen Locus.
2. „Amplifikation" bezieht sich auf jede Form des bevorzugten Anwachsens der Menge einer Region eines Polynukleotids in einer Probe. Die Amplifikation wird vorzugsweise unter Verwendung der Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, wie in US Patent Nr. 4 436 202 beschrieben. Dieses Verfahren ist im Fachgebiet gut bekannt und wird nicht in allgemeinen Ausdrücken beschrieben werden, sondern nur durch das spezifische Beispiel.
3. „Gen" oder der „genetische Locus" bedeutet eine spezifische Nukleotidsequenz innerhalb eines gegebenen Genoms.
4. Die „Lokalisierung" oder „Position" eines Nukleotids in einem genetischen Locus bedeutet die Nummer, die dem Nukleotid in dem Gen zugeordnet ist, die allgemein aus der Sequenz der cDNA oder der genomischen Sequenz des Gens genommen ist.
5. „Oligonukleotid-Primer" sind kurze Polynukleotide, die im Allgemeinen eine Länge von 10 bis 40 Basen aufweisen, welche spezifisch mit einer definierten Stelle in einem Ziel-Polynukleotid hybridisieren.
6. „Polymorphie" bedeutet die Variabilität, die innerhalb einer Population an einen genetischen Locus gefunden wird.
7. „Polymorphe Stelle" bedeutet einen gegebenen Nukleotidort in einem genetischen Locus, welche innerhalb einer Population variabel ist.
8. „Sequenzieren" bezieht sich auf das Verfahren zum Bestimmen der Identität von Nukleotidbasen an jeder Position entlang der Länge einem Polynukleotids. Bevorzugte Sequenzierverfahren schließen die Technik des Kettenabbruchs ein, die zuerst von Sanger et al. beschrieben wurde und die Variationen davon, die nachfolgend entwickelt worden sind. Das „komplette Sequenzieren" bezieht sich auf die Bestimmung aller vier Basen für ein gegebenes Polynukleotid. Das „Sequenzieren von Einzelbasen" bezieht sich auf das Bestimmen der Orte oder Positionen eines Typs von Nukleotidbase innerhalb des Polynukleotids, wie in der US Patentanmeldung Nr. 08/577858, am 22. Dezember 1995 eingereicht, beschrieben wurde, die hier durch Bezugnahme enthalten ist.
9. Die Nukleotide Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin werden manchmal durch ihre Bezeichnungen A, C, G bzw. T dargestellt. Desoxynukleotid-Triphosphate werden in ihrer Gesamtheit als dNTPs in Bezug genommen und individuell als dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Didesoxynukleotid-Triphosphate zum Kettenabbruch werden in ihrer Gesamtheit als ddNTPs in Bezug genommen und individuell als ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP.

Das grundlegende Format der Amplifikations- und Sequenzierschritte der Erfindung wird in 1 schematisch umrissen. 1 zeigt die Exons 2 und 3 des Gens HLA A, wie sie in genomischer DNA zusammen mit den Intron-Sequenzen vorliegen. Die Amplifikationsprimer 10 und 11 werden verwendet, um die Sequenz von etwa 900 bp zu amplifizieren. Die Sequenz von Exon 2 kann unter Verwendung von entweder einem oder beiden der Primer 12 (Sense-Strang) und 13 (Antisense-Strang) bestimmt werden. Die Sequenz von Exon 3 kann unter Verwendung von einem oder beiden der Primer 14 (Sense-Strang) und 15 (Antisense-Strang) bestimmt werden.
Der entscheidende Faktor für den Erfolg des Verfahrens der Erfindung ist die Auswahl von Primern zur Verwendung in dem Amplifikationsschritt. Als eine Sache des Grundprinzips könnten die Amplifikationsprimer vernünftigerweise ausgewählt werden, dass mit hoch konservierten Hybridisierungsstellen in den Introns 1 und 3 von jedem der klassischen Gene von HLA Klasse I hybridisieren, die identifiziert worden sind. Ausgewählte Primer sollten auch nicht mit anderen Stellen auf den klassischen Genen von HLA der Klasse I hybridisieren (was zu Amplifikationsprodukten verschiedener Längen führen könnte) und sollte keine der nicht klassischen Gene von HLA der Klasse I oder irgendein anderes Gen, das in den zu testenden Gewebsproben gefunden wird, amplifizieren. Das Testen, das während der Entwicklung der Primer der Erfindung durchgeführt wurde, hat jedoch ergeben, dass diese Kriterien nicht ausreichen, um ein erfolgreiches analytisches Ergebnis sicherzustellen. Insbesondere ist beobachtet worden, dass sehr kleine Unterschiede in den Primer-Sequenzen zu bedeutenden Unterschieden in der Leistung der Amplifizierungsreaktion führen können.
Zum Beispiel wurde für den Fall von HLA A gefunden, dass die Amplifikation mit einem Vorwärts-Primer, der mit Intron 1: 25–46 hybridisiert und einem Rückwärts- Primer, der mit Intron 3: 25–47 hybridisiert, einem allelischen Ausfall bei den Gruppen A 24, A 1 und A 11 unterlag, da die Primer Basen enthielten, die in diesen Gruppen nicht konserviert waren. Das Umschwenken zu einem unterschiedlichen Rückwärts-Primer (Seq.-ID Nr. 2) überwandt dieses Problem. Auf ähnliche Weise brachte im Falle von HLA B die Verwendung eines Vorwärts-Primers, der mit Intron 1: 36–57 hybridisierte, Schwierigkeiten beim Typisieren aufgrund von allelischen Ausfällen von vielen Gruppen hervor. Die Verwendung einer Kombination von zwei Vorwärts-Primern, die mit Intron 1: 57–76 und Intron 1: 59–76 (Seq.-ID Nrn. 3 und 4) hybridisieren, vermindert die Ausfallrate in bedeutender Weise. Weitere Verbesserungen wurde erhalten (Ausschließen des Ausfalls der Allele B 15 und B 60) durch Verschieben des Startpunkts des Rückwärts-Primers um fünf Basen (Seq.-ID Nr. 5).
Andere Probleme neben dem allelischen Ausfall können auch angetroffen werden, was die Auswahl anderer Primer erforderlich macht, selbst wenn der genaue Grund für dieses experimentelle Problem nicht offensichtlich sein kann. Dieses wurde beobachtet, wenn das Gen HLA C unter Verwendung eines für den Locus spezifischen Vorwärts-Primers amplifiziert wurde, der mit Intron 1: 42–61 hybridisierte. Dieser Primer ergab inkonsistente Ergebnisse der PCR, die oft trotz mehrerer Versuche zur Optimierung ausfiel. Das Verschieben des Primers um drei Basen (Seq.-ID Nr. 6) verbesserte die Robustheit der PCR-Reaktion wesentlich. Eine weitere Verbesserung wurde erhalten, wenn eine frühere Version des Primers, die mit Intron 3: 65–76 hybridisierte, um eine einzelne Base verschoben wurde (Seq.-ID Nr. 7), um den Ausfall der Allele 0702 auszuschließen.
Die Primer-Sätze zur Amplifikation für die Loci A, B und C können individuell verwendet werden, d. h., dass die Primer, welche für den Locus A spezifisch sind, in einer Reaktion verwendet werden können, während die Primer, die für die Loci B und C spezifisch sind, in zwei anderen, getrennten Reaktionen verwendet werden können. Auf eine andere Weise können alle der Primer in einer einzelnen Reaktion kombiniert werden, weil die Primer alle wirklich für den Locus spezifisch sind, um eine Mischung der Amplifikationsprodukte hervorzubringen, die die Amplifikate für HLA A, HLA B und HLA C enthält.
Nachdem die Amplifikations-Reaktion abgeschlossen ist, wird das amplifizierte Produkt weiter durch Sequenzieren bewertet. Das Sequenzierverfahren kann ein herkömmliches Sequenzierverfahren der vier Basen sein, in welchem die Positionen von jeder der vier Basen ausdrücklich bestimmt wird. Auf eine andere Weise kann eine Sequenzierung der Einzelbasen verwendet werden, um die Positionen von einer Base oder von zwei Basen zu bestimmen, in dem sowohl eine vorwärtige als auch eine rückwärtige Sequenz gleichzeitig für einen einzelnen Basentyp durchgeführt wird, wobei die Positionen von einer oder zwei Basen ausreichend sind, um die Information zur Typisierung bereitzustellen. Der wichtigste Faktor für die erfolgreiche Bestimmung der Sequenz ist wiederum die Auswahl der Sequenzierprimer.
Die Amplifikationsprimer (Seq.-ID Nrn. 1–7) können als Sequenzierprimer verwendet werden, um das angrenzende Exon in einer Richtung zu sequenzieren. Die Verwendung dieser Primer sequenziert im Allgemeinen jedoch mehr Material, als für die Bestimmung des HLA-Typs des amplifizierten Produkts erforderlich ist. Des Weiteren können die Amplifikationsprimer nicht für die Sequenzierung beider Stränge verwendet werden. Daher ist es bevorzugt, Sequenzierprimer zu verwenden, welche Exon 2 oder Exon 3 dichter flankieren, welche jedoch noch mit hoch konservierten Regionen des Gens hybridisieren, so dass eine minimale Anzahl von Sequenzierprimern zur Bewertung aller Allele verwendet werden kann. Spezifisch bevorzugte Sequenzierprimer, welche diese Kriterien erfüllen, sind durch Seq.-ID Nrn. 8 und 9 angegeben, welche universelle Primer sind, welche für die Sequenzierung von HLA A, HLA B und HLA C verwendet werden können und die für den Locus spezifischen Sequenzierprimer 10 bis 21. Wie in dem Fall der Amplifikationsprimer können kleine Veränderungen in der Eigenschaft der Primer zu beträchtlichen Veränderungen der Effizienz der Sequenzierung führen.
Zum Beispiel führten beim 5'-Sequenzieren von Exon 2 der Amplifikate von HLA A anfängliche Anstrengungen unter Verwendung eines Amplifikationsprimers, der mit Intron 1: 79–96 hybridisierte, zu einem allelischen Ausfall in den Gruppen A 3, A 25, A 66, A 28 und A 26. Das Wechseln zu einem Primer, der gerade innerhalb von Exon 2 lokalisiert ist (Seq.-ID Nr. 10) eliminierte diese Ausfälle, ohne dass andere Probleme eingeführt würden. Auf ähnliche Weise ergab im Falle des 5'- Sequenzierens für Exon 2 des Locus von HLA B das Verlängern eines Primers, der Exon 2: 2–19 überspannte, um drei Basen und Erhöhen der Hybridisierungstemperatur auf 55°C wesentliche Verbesserungen bei der Beständigkeit des erzeugten Sequenzierfragments.
Der 3'-Sequenzierprimer für Exon 3 des Locus HLA B wurde auch von einem ursprünglich verwendeten Primer (Intron 3: 8–25) durch Verschieben des Primers um 6 Basen (Seq.-ID Nr. 17) verbessert. Diese Verschiebung eliminierte allelische Ausfälle in den Gruppen B 15, B 35, B 37, B 42, B 57, B 60 und B 61.
Die verbleibenden Primer-Sätze zum Sequenzieren, wie sie in dem Beispiel unten dargelegt sind, sind jeweils optimiert worden, um hoch robuste und beständige Sequenzierreaktionen unter Verwendung der spezifizierten Chemie bereitzustellen. Dieses Maß an Leistung ist erforderlich, falls das Sequenzieren als ein Routinewerkzeug zum Typisieren von HLA verwendet werden soll.
Die in der Erfindung verwendeten Sequenzierprimer sind vorzugsweise mit einer nachweisbaren Markierung markiert, so wie einer fluoreszierenden Markierung, um einen einfachen Nachweis der erzeugten Sequenzierfragmente zu ermöglichen. Falls die durchzuführende Analyse auf einem Instrument für mehrfache Farbstoffe durchgeführt werden soll, welches in der Lage ist, zwischen Primern zu unterscheiden, die mit verschiedenen Fluoreszenz-Markierungen markiert sind, können die 3'- und 5'-Sequenzierprimer unterschiedlich markiert sein, mit spektroskopisch zu unterscheidenden Markierungen, um das simultane Sequenzieren von beiden Strängen der DNA zu ermöglichen. Siehe Wiemann et al., „Simultaneous On-Line DNA Sequencing of both strands with Two Flourescent Dyes", Anal. Biochem. 224: 117–121 (1995), was hierin durch Bezugnahme enthalten ist.
Als eine Alternative zur Verwendung markierter Primer können mit Farbstoff markierte Kettenabbrecher verwendet werden, um nachweisbare Sequenzierprodukte hervorzubringen.
Die Spezifität der Amplifikationsprimer und der Sequenzierprimer (außer den universalen Primern) macht es möglich, die Anzahl von Gefäßen, die für die Ty pisierung klassischer Gene von HLA der Klasse I erforderlich sind, in beträchtlichem Maße zu reduzieren und den Durchsatz des Instruments zu erhöhen. Insbesondere, wie oben angemerkt, können alle drei der klassischen Loci in einer einzelnen Reaktionsmischung amplifiziert werden, unter Verwendung der für den Locus spezifischen Amplifikationsprimer. Dieses gemischte Amplifikationsprodukt kann dann mit einer Reaktionsmischung zur Sequenzierung vereinigt werden, die unverwechselbare, für den Locus spezifische Sequenzierprimer enthält.
Die bei der Ausführung des Verfahrens der Erfindung bevorzugten Primer sind geeignet in Form eines Testkits verpackt, um den Verkauf und die Durchführung des Tests zu erleichtern. Ein solches Testkit ist ein Testkit zur Amplifizierung der hoch polymorphen Abschnitte von Exon 2 und 3 eines klassischen Gens von HLA der Klasse I, das in verpackter Zusammenstellung wenigstens einen Satz von Amplifikationsprimern umfaßt, der unter den folgenden Primersätzen ausgewählt ist:
Seq.-ID Nrn. 1 und 2;
Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5; und
Seq.-ID Nrn. 6 und 7. Das Testkit kann Primer für gerade einen der HLA-Loci oder für eine Kombination von zwei Loci oder für alle drei Loci enthalten. Die Primer für jeden einzelnen Locus können einzeln verpackt sein (z. B. ein Behälter mit Seq.-ID Nr. 1 und ein anderer Behälter mit Seq.-ID Nr. 2) oder als eine Mischung (Seq.-ID Nrn. 1 und 2 in dem gleichen Behälter). Die Primer für die mehreren Loci können auch alle in einer Mischung bereitgestellt werden.
Ein zweiter Typ des Testkits in Übereinstimmung mit Erfindung ist ein Testkit zur Sequenzierung eines hoch polymorphen Abschnitts von Exon 2 oder 3 eines klassischen Gens von HLA der Klasse I, der in verpackter Zusammenstellung wenigstens einen Satz von Amplifizierungsprimern zum Erzeugen eines Amplifikationsproduktes von einem klassischen Gen von HLA der Klasse I umfasst, wobei der Satz unter den folgenden der Primersätze ausgewählt ist:
Seq.-ID Nrn. 1 und 2;
Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5; und
Seq.-ID Nrn. 7 und 6, und
wenigstens einem Sequenzierprimer, der eine Sequenz aufweist, die mit dem Amplifikationsprodukt unter geeigneten Bedingungen hybridisiert, um Sequenzierfragmente zu erzeugen. Bevorzugte Sequenzierprimer sind diejenigen, die die Sequenzen aufweisen, die von Seq.-ID Nrn. 8–21 angegeben sind. Wie oben angemerkt, sind die Sequenzierprimer vorzugsweise mit einer nachweisbaren Markierung, so wie mit einer fluoreszierenden Markierung markiert.
Jede Art von Testkit kann auch zusätzliche Reagenzien enthalten, die für das Durchführen der Amplifikations- und/oder Sequenzierreaktion erforderlich sind, einschließlich Polymerase-Enzymen, dNTPs, ddNTPs und geeigneter Puffer. Diese zusätzlichen Reagenzien sind getrennt oder in Kombination abgepackt, wie es für die durchzuführende Reaktion angemessen ist.
Ein spezifisches, hoch robustes Verfahren für die Typisierung von HLA A, HLA B und HLA C mit hoher Auflösung ist in Beispiel 1 unten im Detail angegeben, welches dargelegt ist, um das Verfahren der Erfindung beispielhaft darzustellen, und nicht, um ihren Umfang zu begrenzen.
Beispiel 1
Die Bestimmung der klassischen Gene von HLA der Klasse I (die die Loci HLA A, HLA B und HLA C umfassen) in einer Probe eines Patienten kann wie folgt erzielt werden.
Genomische DNA wird aus der Probe eines Patienten gemäß Standard-Verfahren unter Verwendung eines Detergenzes und Proteinase K (Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel, F. M. et al., (John Wiley & Sons, 1995)) vorbereitet. Ein alternatives Verfahren zum Extrahieren von DNA aus Blut durch Ausfällen mit Salz wird in dem Testkit zur Isolation von DNA, Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis) bereitgestellt.
Ein DNA-Fragment, das die Exons 2 und 3 von jedem Locus enthält, wird zuerst in einer Standard-PCR-Reaktion amplifiziert. Wie in den 1, 2 und 3 angedeutet, werden die Amplifikationsprimer ausgewählt, um mit den Intron-Regionen zu hybridisieren, die die Exons 2 und 3 flankieren, und die unter allen Allelen des Locus konserviert sind.
Die Reaktionsmischung für die PCR besteht aus

μL

MgCl₂, 2,5 mM 1.5

deaza-dNTPs, 2,5 mM 2,0

DMSO, 100% 2,5

10 × PCR-Puffer 2,5

(NH₄)₂SO₄ 2,5

H₂O 7,75
Die PCR-Reaktionsmischung wird in drei Röhrchen aliquotiert (eines für jeden Locus). Eine Mischung der für den Locus spezifischen Amplifikationsprimer wird jedem Röhrchen zugegeben (1 μL von 10 μM Primermischung, die äquimolare Mengen Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthält). Die für den Locus spezifischen Mischungen haben die folgenden Zusammensetzungen:
Für den Locus HLA A spezifische Amplifikationsprimer
Für den Locus HLA B spezifische Amplifikationsprimer
Die zwei Vorwärts-Primer werden als eine äquimolare Mischung verwendet oder können in zwei getrennten Reaktionen zur Amplifikation verwendet werden, jede mit einem Vorwärts-Primer und dem Rückwärts-Primer. Für den Locus HLA C spezifische Amplifikationsprimer

Position

Vorwärts

AGGAGCGAGGKGCCCGCC Intron 1: 42–59 [Seq. ID Nr. 6]

Rückwärts

GCTGATCCCATTTTCCTCCCCTC Intron 3: 88–66 [Seq. ID Nr. 7]
100–500 ng einer DNA-Probe eines Patienten wird jedem Röhrchen zugegeben, zusammen mit 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Amersham International PLC). Die Proben werden gut gemischt und thermisch in einem Robocycler 9600 (Perkin Elmer, Inc.) gemäß dem folgenden Plan im Zyklus gefahren:
94°C für 5 min,
dann 35 Zyklen mit
94°C für 30 s,
63°C für 30 s,
72°C für 60 s,
gefolgt von
72°C für 5 min.
Das Reaktionsröhrchen wird dann auf Eis gekühlt, bis es für die Sequenzierreaktionen benötigt wird. Falls erwünscht, kann ein Aliquot des amplifizierten Fragments auf einem Agarosegel mit Färbung durch Ethidiumbromid beobachtet werden. Jedes Fragment sollte als eine Bande von annähernd 900 bp erscheinen.
Die Abfolge der Sequenzierreaktionen kann von dem Bediener ausgewählt werden. Jedes Exon von jedem Locus kann auf dem Sense-Strang oder dem Antisense-Strang sequenziert werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist es, die Sequenz von dem Sense-Strang (5'-Primer) von jedem Exon zu erhalten. Falls die Ergebnisse Zweideutigkeiten enthalten, dann wird das Amplifikat erneut unter Verwendung des Antisense-Strangs (3'-Primer) für das selbe Exon sequenziert. Die Verfügbarkeit der beiden Sequenzierprimer stellt eine Redundanz bereit, um verlässliche Ergebnisse sicherzustellen.
Die Reaktionsmischung zur Sequenzierung wird wie folgt hergestellt:
Der verwendete Sequenzierpuffer ist mit dem verwendeten Enzym verträglich. Zum Beispiel ist, wenn Thermosequenase^TM als die Polymerase zum Sequenzieren verwendet wird, der 10 × Thermosequenase^TM-Puffer geeignet, der aus 260 mM Tris-HCl (pH 9,5), 65 mM MgCl₂ besteht. Andere Polymerase-Enzyme zur Sequenzierung, so wie Taq FS können mit ihrem eigenen bevorzugten Puffer verwendet werden.
Die ausgewählten Sequenzierprimer können eine einzelne Spezies eines Oligonukleotids sein, oder im Falle von Exon 3 von HLA C kann es eine äquimolare Mischung von zwei oder mehreren Spezies von Oligonukleotiden sein. Mischungen von Oligonukleotiden werden so ausgewählt, dass sie zwischen sich wirksam die Sequenzierreaktionen für alle Allele des Locus an derselben Stelle starten werden. Geeignete Sequenzierprimer sind wie folgt:
Universelle Primer für HLA A, HLA B und HLA C
Für den Locus spezifische Primer-Sätze Sequenzierprimer für HLA A
Sequenzierprimer für HLA B
Sequenzierprimer für HLA C
Die Sequenzierprimer werden an ihrem 5'-Ende mit einer nachweisbaren Markierung unter Verwendung der Techniken mit Phosphoramiditit oder NHS/Farbstoff-Ester, die im Fachgebiet gut bekannt sind, markiert. Die ausgewählte Markierung hängt von dem verwendeten Instrument zum Nachweis ab. Die Markierung zur Verwendung mit einem System OPENGENE^TM (Visible Genetics Inc., Toronto, Ontario) ist das Fluorophor CY 5.0 oder 5.5 (Amersham Life Sciences, Cleveland Ohio). Fluoreszein-Isothiocyanat kann zum Nachweis mit dem ALF Automated Sequencer (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) verwendet werden. Mehrere Markierungen können in Kombination verwendet werden, falls ein Instrument für mehrere Farbstoffe verwendet wird.
5 μL der Primermischung zur Sequenzierung wird zu jedem der vier Röhrchen hinzugegeben, die 3 μL 750 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 7,5 μM von einem ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP) enthalten. Die Reaktionsmischung zur Sequenzierung wird in einem Robocycler 9600 (Perkin Elmer Inc.) wie folgt thermisch im Zyklus gefahren:
94°C für 30 s,
dann 35 Zyklen von
94°C für 30 s,
55°C für 30 s,
70°C für 60 s.
Ein alternatives Profil für den Thermozykler ist
94°C für 2 min,
dann 25 Zyklen von
94°C für 20 s,
55°C für 45 s,
68°C für 1 min,
gefolgt von 15 Zyklen von
94°C für 25 s,
68°C für 1 min.
Bei Beendigung werden die Proben bei 4°C gelagert, bis sie zum Laden auf ein Elektrophoresegel für die Sequenzanalyse bereit sind.
Zum Nachweis der Reaktionsprodukte wird die Probe mit einem gleichen Volumen Ladepuffer (5% Ficoll plus einen farbigen Farbstoff) gemischt. 1,5 μL dieser Proben werden pro Spur auf eine MICROCEL^TM Elektrophorese-Kassette geladen, die in ein automatisiertes DNA-Sequenziergerät MICROGENE BLASTER^TM (Visible Genetics Inc., Toronto) geladen ist. Die Probe wird elektrophoretisch getrennt und die aufgetrennten DNA-Banden werden nachgewiesen.
Die Ergebnisse werden in geeigneter Weise analysiert und mit dem Programm GENEOBJECTS^TM (Visible Genetics Inc., Toronto) dargestellt. Die Sequenz der Basen wird bestimmt und das Allel von HLA, welchem die Sequenz entspricht, wird identifiziert. Dieser Prozess wird für jeden Locus (HLA A, HLA B, HLA C) durchgeführt und die Ergebnisse werden der Akte des Patienten mitgeteilt.
In seltenen Fällen sind die Patienten für ein Allel an jedem Locus homozygot. Diese Fälle sind verhältnismäßig einfach zu bestimmen, selbst ohne Software. Zum Beispiel kann eine homozygote Sequenz von HLA A nur eine von 58 bekannten Allelen von A sein.
In dem üblicheren Fall ist die Probe des Patienten heterozygot. Die als üblich angesehene Probe erscheint als eine normale Abfolge von Basen, mit sporadisch zwei Basen an einer Stelle, jede mit der halben Höhe des Spitzenwerts. (Dieses Ergebnis ergibt sich aus dem hohen Grad der Ähnlichkeit, die von allen Allelen jedes Gens von HLA geteilt wird. Die Heterozygotie der Sequenz ergibt sich auf den Substitutionen von Basen). Bei 58 Allelen können mehr als 1.700 heterozygote Paare zusammengestellt werden. Die arbeitsaufwändige Bestimmung, welche Allele in der Test-Sequenz vorliegen, kann durch Verwendung einer Analyse per Rechner vereinfacht werden. Ein Programm, das GENELIBRARIAN^TM genannt wird, von Visible Genetics Inc. entwickelt, vergleicht die Test-Sequenzen schnell mit einer Datenbank, welche alle möglichen homozygoten und heterozygoten Zusammenstellungen der Allele enthält. Das Programm identifiziert diejenigen gespeicherten Sequenzen, die am engsten mit der Test-Sequenz überein stimmen. Der Bediener kann dann bestimmen, welches allelische Paar in der Test-Probe vorliegt. Falls kein allelisches Paar eine genaue Übereinstimmung zeigt, ermöglicht es das Programm dem Bediener, die Test-Sequenz durchzusehen, um zu bestimmen, ob Fehler beim Abrufen von Basen oder andere Artefakte die Analyse gestört haben.
Auflistung der Sequenzen

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Alleltyps eines klassischen Gens des MHC Klasse I, das in einer Probe vorliegt, das die Schritte umfasst von Vereinigen der Probe mit einer Reaktionsmischung zur Amplifikation, die einen Satz von Amplifizierungsprimern umfasst, der unter den folgenden Primersätzen ausgewählt ist: Seq.-ID Nrn. 1 und 2, Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5 sowie Seq.-ID Nrn. 6 und 7, und Zyklusfahren der erhaltenen Mischung, um ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen, Vereinigen des Amplifikationsproduktes mit einer Reaktionsmischung zur Sequenzierung, die eine oder mehrere Oligonukleotid-Sequenzierprimer umfasst, die unter geeigneten Bedingungen mit konservierten Regionen des Amplifizierungsproduktes hybridisieren, um Sequenzierfragmente zu erzeugen, Bewerten der Sequenzierfragmente, um die Sequenz von wenigstens einem Abschnitt von Exon 2 oder Exon 3 des Gens in der Probe zu bestimmen, und Vergleichen der bestimmten Sequenz mit einer Standard-Sequenz für bekannte Allele, um den Alleltyp des Genes in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Sequenzierprimer unter den Primern ausgewählt sind, die die Sequenzen aufweisen, die von den Seq.-ID Nrn. 8–21 angegeben sind.
Verfahren zum Amplifizieren einer hochgradig polymorphen Region der Exons 2 und 3 eines klassischen Gens des MHC Klasse I, das in einer Probe vorliegt, das die Schritte umfasst von Vereinigen der Probe mit einer Reaktionsmischung zur Amplifikation, die einen Satz Amplifizierungsprimer umfasst, der unter den folgenden Primersätzen ausgewählt ist: Seq.-ID Nrn. 1 und 2, Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5 sowie Seq.-ID Nrn. 6 und 7, und Zyklusfahren der erhaltenen Mischung, um ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen.
Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines Abschnittes von Exon 2 oder Exon 3 eines klassischen Gens des MHC Klasse I, das in einer Probe vorliegt, das die Schritte umfasst von Vereinigen der Probe mit einer Reaktionsmischung zur Amplifikation, die einen Satz Amplifizierungsprimer umfasst, der unter den folgenden Primersätzen ausgewählt ist: Seq.-ID Nrn. 1 und 2, Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5 sowie Seq.-ID Nrn. 6 und 7, und Zyklusfahren der erhaltenen Mischung, um ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen, Vereinigen des Amplifikationsproduktes mit einer Reaktionsmischung zur Sequenzierung, die eine oder mehrere Oligonukleotid-Sequenzierprimer umfasst, die unter geeigneten Bedingungen an konservierte Regionen des Amplifikationsproduktes hybridisieren, um Sequenzierfragmente zu erzeugen und Bewerten der Sequenzierfragmente, um die Sequenz von wenigstens einem Abschnitt von Exon 2 oder Exon 3 des klassischen Gens des MHC Klasse I in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Sequenzierprimer unter den Primern ausgewählt sind, die die Sequenzen aufweisen, die von Seq.-ID Nrn. 8–21 angegeben sind.
Testkit zur Amplifikation eines hochgradig polymorphen Abschnittes von Exon 2 und 3 eines klassischen Gens des MHC Klasse I, das in gepackter Zusammenstellung wenigstens einen Satz von Amplifizierungsprimern umfasst, der unter den folgenden Primersätzen ausgewählt ist: Seq.-ID Nrn. 1 und 2, Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5 und Seq.-ID Nrn. 6 und 7.
Testkit zum Sequenzieren eines hochgradig polymorphen Abschnittes von Exon 2 oder 3 eines klassischen Gens des MHC Klasse I, das in gepackter Zusammenstellung wenigstens einen Satz Amplifizierungsprimer zum Erzeugen eines Amplifikationsproduktes von einem klassischen Gen des MHC Klasse I umfasst, bei dem der Satz unter den folgenden Primersätzen ausgewählt ist: Seq.-ID Nrn. 1 und 2, Seq.-ID Nrn. 3, 4 und 5 sowie Seq.-ID Nrn. 6 und 7, und wenigstens einen Sequenzierprimer, der eine Sequenz aufweist, die unter geeigneten Bedingungen mit dem Amplifikationsprodukt hybridisiert, um Sequenzierfragmente zu erzeugen.
Testkit nach Anspruch 7, bei dem der Sequenzierprimer unter den Primern ausgewählt ist, die die Sequenzen aufweisen, die von den Seq.-ID Nrn. 8–21 angegeben sind.
Testkit nach Anspruch 8, bei dem der Sequenzierprimer mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.