DE112018008028B4 - Verfahren zur mehrfachanalyse von amplikon unter verwendung der fluoreszenzbasierten mehrfachschmelzanalyse - Google Patents

Verfahren zur mehrfachanalyse von amplikon unter verwendung der fluoreszenzbasierten mehrfachschmelzanalyse Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung der Mehrfachschmelzanalyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:a) Herstellen von zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen, die jeweils eine FMMA-Sonde (eine Struktur von 5'-R-T-Q-C-3' aufweisend) und einen nicht-markierten Primer enthalten, wobei R ein Fluoreszenzfarbstoff ist, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Temperaturen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte ist, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird;b) Amplifikation mehrerer Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, durch eine Nukleinsäure-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im vorhergehenden Schritt erhaltenen, zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze; undc) Durchführen einer Schmelztemperaturanalyse der Amplifikationsprodukte.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung einer fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse und insbesondere ein Verfahren zur Multiplex-Analyse von Polymerase-Kettenreaktions-Produkten, das in der Lage ist, gleichzeitig mehrere Ziel-Nukleinsäuren unter Verwendung eines einzigen Fluoreszenzkanals durch eine fluoreszenzbasierte Schmelztemperaturanalyse zu analysieren.
  • Stand der Technik
  • Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) bzw. die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bzw. die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (Echtzeit-PCR) bzw. die real-time quantitative PCR ist eine molekularbiologisches Methode, bei dem ein spezifisches Genfragment eines Gens in voller Länge, das eine bekannte Nukleotidsequenz aufweist, durch eine DNA-Polymerase bzw. DNS-Polymerase amplifiziert und das Gen untersucht und isoliert wird. Die quantitative Echtzeit-PCR misst die Amplifikationsprodukte in Echtzeit, reduziert eine Kreuzkontamination und ermöglicht eine akkuratere quantitative Analyse. Diese quantitative Echtzeit-PCR ist zu einer der wesentlichen Methoden in der Forschung und der Prüfung in den Bereichen Biochemie, Molekularbiologie, Medizin und klinische Pathologie geworden.
  • Die quantitative Echtzeit-PCR basiert auf dem gleichen Prinzip wie die herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion, unterscheidet sich aber dadurch, dass sie die Produkte der Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit quantitativ überwachen kann. Die Echtzeit-PCR kann unterteilt werden in: ein Interkalations-Verfahren, bei dem ein Fluorophor in ein Amplifikationsprodukt eingefügt wird, um eine Fluoreszenz anzuzeigen (z. B. SYBR green); und ein Sonden-Verfahren, bei dem ein Fluorophor nur mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt reagiert, um Fluoreszenz anzuzeigen (z. B. TaqMan). Im ersten Fall kann ein unspezifisches Amplifikationsprodukt nicht unterschieden werden, daher wird als Hilfsverfahren ein Verfahren zur Analyse der Schmelztemperatur des Produkts, das heißt, eine Schmelztemperaturanalyse, verwendet. Das Sondenverfahren hat den Vorteil, dass es eine relativ hohe Genauigkeit hat, weil es selektiv ein Amplifikationsprodukt nachweist, und dass es gleichzeitig 4 bis 6 Ziel-Nukleinsäuren unter Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzarten nachweisen kann. Aufgrund dieser Vorteile ist das Sondenverfahren bei Diagnosverfahren im Bereich der klinischen Pathologie weit verbreitet.
  • Der Grund, warum das sondenbasierte Diagnoseverfahren, das zur Multiplex-Analyse fähig ist, hauptsächlich verwendet wird, ist, dass die Anzahl der Genotypen, die gleichzeitig analysiert werden müssen, in den letzten Jahren zugenommen hat. Das am häufigsten verwendete TaqMan-Verfahren verwendet eine Sonde, die mit einem Fluorophor und einem Quencher bzw. einer Löschungssubstanz an beiden Enden markiert ist, und ist ein Verfahren, das die Spaltung der Sonde durch eine 5'-3'-Nukleaseaktivität der DNA-Polymerase nutzt, und dieses Verfahren ist derzeit das am weitesten verbreitete (US-Patentnummer 5,210,015 ).
  • Zu den Verfahren, die markierte Primer verwenden, gehören außerdem ein auf Molecular Beacons bzw. molekularen Beacons basierendes Verfahren (Tyagi & Kramer, Nature Biotechnology, 1996), ein Sunrise-Primer-Verfahren (US-Patentnummer 6,117,635 ), ein Skorpion-Primer-Verfahren (US-Patentnummer 6,326,145 ) und dergleichen. Bei diesen Verfahren ändert sich bei der Amplifikation eines Ziels bzw. eines Targets unter Verwendung der Stem-Loop-Struktur des Primers die Struktur, und der Fluorophor und der Quencher werden voneinander getrennt, um Fluoreszenz zu emittieren.
  • Der Nachteil der derzeit verwendeten quantitativen Echtzeit-PCR ist die eingeschränkte Möglichkeit der Multiplex-Analyse. Die derzeitige quantitative Echtzeit-PCR-Technologie verwendet einen fluoreszierenden Farbstoff als Mittel zum Nachweisen einer Amplifikationsreaktion. Da die verwendbaren fluoreszierenden Farbstofftypen aufgrund überlappender Wellenlängen begrenzt sind, das heißt, nur eine Ziel-Nukleinsäure in einem Fluoreszenzkanal analysiert werden kann, ist die Anzahl der gleichzeitig analysierbaren Proben auf 4 bis 6 (6-Plex) begrenzt.
  • Die internationale Patentveröffentlichung mit der Nummer WO 2013 133 561 offenbart ein Verfahren der quantitativen Echtzeit-PCR, das gleichzeitig 2 bis 3 Ziel-Nukleinsäuren in einem einzigen Fluoreszenzkanal analysieren kann, unter Verwendung eines PTOCE-Verfahrens (Probing & Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension) (Sondierung & Markierung Oligonukleotidspaltung und Oligonukleotidverlängerung), bei dem eine Sonde, die selektiv an eine Ziel-Nukleinsäure-DNA bzw. Ziel-Nukleinsäure-DNS bindet, und ein Schmelzkurven-Analyseverfahren gleichzeitig angewendet werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass die Anzahl der analysierbaren Ziel-Nukleinsäuren im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren, bei der eine Ziel-Nukleinsäure mit einer Art von Fluoreszenz analysiert wird, deutlich erhöht wird. Dieses Verfahren birgt jedoch viele Schwierigkeiten bei der Gestaltung von Primern bzw. beim Design von Primern, da die Anzahl der Primer und Oligonukleotide, die bei der Analyse verwendet werden, mehrere Dutzend erreicht und Interferenzen zwischen ihnen minimiert werden sollten.
  • In den letzten Jahren gab es eine kontinuierliche Zunahme an Genotypen, die gleichzeitig analysiert werden müssen, um genotypspezifische Medikamente zu entwickeln, wie z. B. Begleitdiagnostik-Medikamente bzw. Medikamente mit therapiebegleitender Diagnostik, oder um das Vorhandensein oder Fehlen mehrerer allelischer Marker zu bestimmen. Darüber hinaus ist im Bereich der Diagnose von Infektionskrankheiten der Bedarf gestiegen, möglichst viele Erreger gleichzeitig zu diagnostizieren. Daher bestand die dringende Notwendigkeit, ein neues Verfahren für die Multiplex-Analyse von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten zu entwickeln, das in der Lage ist, eine größere Anzahl von DNAs bzw. DNS in einer einzigen Reaktion zu amplifizieren und nachzuweisen, und bei der das Primerdesign relativ einfach ist.
  • Offenbarung
  • Technisches Problem
  • Die vorliegende Erfindung wurde getätigt, um die oben beschriebenen technischen Anforderungen zu erfüllen, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse bereitzustellen, das in der Lage ist, mehrere Ziele gleichzeitig unter Verwendung eines einzigen Fluoreszenzkanals nachzuweisen, indem Primer, die komplementär zu Ziel-Nukleinsäuregenen sind, mit einem Fluorophor und einem Quencher markiert werden und eine Schmelztemperatur-Steuersequenz bzw. Schmelztemperatur-Kontrollsequenz zum Induzieren verschiedener Schmelztemperaturen eingeführt wird.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Primerdesign und ein Verfahren zur Schmelztemperaturanalyse bereitzustellen, die für die Multiplex-Analyse von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten erforderlich sind.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Kits bzw. einer Ausrüstung für die Multiplex-Analyse von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten, das in der Lage ist, mehrere Ziele gleichzeitig unter Verwendung eines einzigen Fluoreszenzkanals nachzuweisen.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es überdies, ein Verfahren zur Analyse von Genotypen unter Verwendung der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse bereitzustellen, das ein schnelles, einfaches und automatisiertes Verfahren zur Identifikation bietet, das in der Lage ist, Sorten gleichzeitig unter Verwendung einer Vielzahl von Markern zu analysieren.
  • Technische Lösung
  • In der vorliegenden Erfindung wurde eine fluoreszenzbasierte Mehrfachschmelzanalyse (FMMA-Verfahren) bzw. eine fluorescence-based multiple melting analysis (FMMA method) entwickelt, um die oben beschriebenen Aufgaben zu lösen. Das heißt, es wurde möglich gemacht, eine Anzahl von verschiedenen Schmelztemperaturen gleichzeitig in einem einzigen Fluoreszenzkanal zu analysieren. Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Erfindung eine neuartige „FMMA-Sonde“ entwickelt, die im Gegensatz zu herkömmlichen Sonden, die nicht an der Bildung von Amplifikationsprodukten beteiligt sind, so gestaltet wurde, dass sie direkt an der Nukleinsäure-Amplifikation beteiligt ist und auch zur Analyse der Schmelztemperaturen von Amplifikationsprodukten verwendet werden kann.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung einer fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Herstellen von zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen bzw. Sätzen aus FMMA-Sonde und Primer bzw. FMMA-Sonde/Primer-Sets, die jeweils eine FMMA-Sonde (eine Struktur von 5'-R-T-Q-C-3' aufweisend) und einen nicht-markierten Primer enthalten, wobei Rein Fluoreszenzfarbstoff ist, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Temperaturen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte ist, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer bzw. jede/jeder FMMA-Sonde/Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird;
    2. b) Amplifizieren mehrerer Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, durch eine Nukleinsäure-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im vorhergehenden Schritt erhaltenen zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen; und
    3. c) Durchführen einer Schmelztemperaturanalyse der Amplifikationsprodukte.
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Einstellung der Schmelztemperatur jeder FMMA-Sonde und jedes Primers in den zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen so gestaltet, dass der Schmelzpunkt des Amplifikationsprodukts durch die Steuerung der Länge und des GC-Gehalts des Amplifikationsprodukts und der Länge und des GC-Gehalts der Schmelztemperatur-Steuersequenz unterschieden wird.
  • In der vorliegenden Erfindung können die FMMA-Sonden/Primer so gestaltet sein, dass die benachbarten Schmelztemperaturen der Amplifikationsprodukte eine Differenz von 2 °C oder höher, vorzugsweise 4 °C oder höher, aufweisen.
  • In der vorliegenden Erfindung beträgt die Länge der Schmelztemperatur-Steuersequenz (T) 10 bis 30 bp und die Länge des Amplifikationsprodukts 50 bis 300 bp.
  • Der Schritt des Durchführens der Schmelztemperaturanalyse umfasst die folgenden Schritte: Erhalten einer Schmelzkurve durch Messen der Fluoreszenz, die durch Schmelzen des Amplifikationsproduktes erzeugt wird, während dessen Temperatur erhöht wird; und Erhalten einer Schmelzpeakkurve aus der Schmelzkurve.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Genotypisierung unter Verwendung der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen von allelspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen, die jeweils eine FMMA-Sonde (eine Struktur von 5'-R-T-Q-C-3' aufweisend) und einen nicht-markierten Primer enthalten, wobei R ein Fluoreszenzfarbstoff ist, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Temperaturen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte ist, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird;
    1. b) Amplifizieren mehrerer Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, durch eine Nukleinsäure-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im vorhergehenden Schritt erhaltenen allelspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen; und
    2. c) Nachweisen bzw. Ermitteln von Allelen in der Probe durch Durchführen einer Schmelztemperaturanalyse an Amplifikationsprodukten.
  • Vorteilhafte Effekte
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit des Multiplexings bzw. des Multiplexens, so dass eine Vielzahl von Ziel-Nukleinsäuren in einer einzigen Reaktion der quantitativen Echtzeit-PCR amplifiziert und in einem einzigen Fluoreszenzkanal analysiert werden kann, indem zielspezifische FMMA-Sonde/Primer-Sätze verwendet werden, die aus einer Vielzahl von FMMA-Sonden/Primern bestehen, die unterschiedliche Schmelztemperatur-Steuersequenzen enthalten.
  • Gemäß dem FMMA-Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, mehrere Ziel-Nukleinsäuren gleichzeitig zu analysieren, wodurch Zeit und Kosten für die Durchführung der quantitativen Echtzeit-PCR reduziert werden.
  • Das Verfahren zur Genotypisierung unter Verwendung der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine effizientere und wirtschaftlichere Prüfung, indem es den Zeit- und Arbeitsaufwand für die Prüfung durch Vereinfachung eines PCR-Vorgangs bzw. eines PCR-Schrittes bzw. eines PCR-Prozesses zum Identifizieren von Reissorten reduziert.
  • Beschreibung der Zeichnung
    • 1a und 1b sind schematische Ansichten, die das Prinzip der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse (FMMA) der vorliegenden Erfindung veranschaulichen;
    • 2 ist eine schematische Ansicht, die eine allelspezifische FMMA für die Identifikation von Reissorten zeigt, die in einem Beispiel durchgeführt wurde;
    • 3 zeigt die Ergebnisse eines Experiments zur Identifikation von Reissorten, das unter Verwendung einer allelspezifischen FMMA in einem Beispiel durchgeführt wurde;
    • 4 zeigt die Ergebnisse der Identifikation von Reissorten (Satz A), die unter Verwendung einer allelspezifischen FMMA in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
    • 5 zeigt die Ergebnisse der Identifikation von Reissorten (Satz B), die unter Verwendung einer allelspezifischen FMMA in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
    • 6 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Schmelztemperaturverteilung eines Amplifikationsprodukts in Abhängigkeit von dessen Länge in Beispiel 4; und
    • 7 zeigt grafisch die Korrelation zwischen dem GC-Gehalt einer Schmelztemperatur-Steuersequenz (T) und der Schmelztemperatur des gesamten PCR-Produkts.
  • Bester Modus
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf Beispiele näher beschrieben. Diese Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung, sollen aber den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Ziel-Nukleinsäure“ oder „Ziel-Nukleinsäuregen“ auf eine Nukleinsäuresequenz, die schließlich nachgewiesen werden soll. Das Ziel-Nukleinsäuregen kann ein Teil eines Gens, eine regulatorische Sequenz, genomische DNA bzw. DNS, cDNA bzw. cDNS, RNA bzw. RNS, einschließlich mRNA bzw. mRNS, microRNA bzw. mikroRNS und rRNA bzw. rRNS, oder etwas Anderes sein. Ein Nukleinsäuremolekül, das das Ziel-Nukleinsäuregen ist, kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Wenn die Nukleinsäure als ein Ausgangsmaterial doppelsträngig ist, ist es bevorzugt, die beiden Stränge in eine einzelsträngige oder teilweise einzelsträngige Form zu bringen. Wenn eine mRNA als ein Ausgangsmaterial verwendet wird, ist vor der Amplifikation ein Schritt der reversen Transkription erforderlich.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Primer“ auf ein Oligonukleotid, das als Initiationspunkt der DNA-Synthese unter Bedingungen fungieren kann, bei denen die Synthese eines zum Matrizen-Nukleinsäurestrang bzw. zum Template-Nukleinsäurestrang komplementären Primer-Verlängerungsprodukts induziert wird. Die Bedingungen umfassen die Anwesenheit von Nukleotiden und einem induzierenden Agens, wie etwa DNA-Polymerase, bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer ist vorzugsweise ein einzelsträngiges Oligodesoxyribonukleotid. Die Primer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können natürlich vorkommende dNMPs (das heißt, dAMP, dGMP, dCMP und dTMP), modifizierte Nukleotide oder nicht natürlich vorkommende Nukleotide enthalten. Die Primer können auch Ribonukleotide enthalten.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „FMMA-Sonde“ auf ein Oligonukleotid, seine Komplemente bzw. seine Gegenstücke oder Fragmente davon, das zum Nachweis identischer, allelischer oder verwandter Nukleinsäuresequenzen verwendet wird. FMMA-Sonden können Oligonukleotide umfassen, die an ein nachweisbares Markierungs- oder Fluoreszenzmolekül gebunden sind. FMMA-Sonden sind direkt an der Nukleinsäure-Amplifikation beteiligt und werden auch zur Analyse von Schmelztemperaturen verwendet, im Gegensatz zu herkömmlichen Sonden, die nicht an der Bildung von Amplifikationsprodukten beteiligt sind.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Schmelztemperatur“ definiert als die Temperatur, bei der 50 % der doppelsträngigen DNAs in einer Population in einzelsträngige DNAs dissoziiert sind. Die Schmelztemperatur hat verschiedene Werte, die vom GC-Gehalt und der Länge der DNA, thermodynamischen Faktoren, Salzkonzentrationen usw. abhängen, und wird durch Schmelzanalyse bestimmt.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Schmelzanalyse“ auf einen Vorgang des Analysierens der Änderung der Fluoreszenz, die bei der Erhöhung der Temperatur, ausgehend von einer niedrigen Temperatur, nach Abschluss der PCR-Reaktion auf tritt. Durch diesen Vorgang wird die Schmelztemperatur bestimmt.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Schmelzkurve“ oder „Schmelzpeakkurve“ bzw. „Schmelzsignalkurve“ auf ein Diagramm, das die Änderung der Fluoreszenz (RFU) in Abhängigkeit von der Temperatur (T) zeigt, die während der Schmelzanalyse erhalten wurde. Die Schmelzkurve oder die Schmelzpeakkurve wird mit der Temperatur auf der x-Achse und der Fluoreszenz auf der y-Achse aufgetragen. Die „Schmelzpeakkurve“ ist eine Kurve, die als negativer Wert (-d(RFU)/dT) ausgedrückt wird, der durch Ableitung erster Ordnung der erhaltenen Schmelzkurve erhalten wird, und die Temperatur am Peak ist die Schmelztemperatur.
  • Die vorliegenden Erfinder haben ein Verfahren zur Induktion verschiedener Schmelztemperaturen durch Einstellen des GC-Gehalts der Schmelztemperatur-Steuersequenz des Primers der quantitativen Echtzeit-PCR und der Länge des Amplifikationsprodukts entwickelt.
  • Um eine Vielzahl von Ziel-Nukleinsäuren gleichzeitig nachzuweisen, verwendet eine herkömmliche Amplifikationskurven-Analysemethode mit quantitativer Echtzeit-PCR im Allgemeinen Fluorophore, um die Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe nachzuweisen, und somit kann nur ein Fluorophor als Markierung für jede nachzuweisende Nukleinsäure verwendet werden. Darüber hinaus ist bei aktuellen Systemen zum Nachweis von Fluorophoren die Anzahl der Fluoreszenzkanäle, die gleichzeitig analysiert werden können, auf 4 bis 6 Typen begrenzt, und somit ist der Multiplex-Nachweis eingeschränkt. Das Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung ist jedoch dadurch gekennzeichnet, dass ein Primer, der komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, mit einem Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher markiert ist, und eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren verschiedener Schmelztemperaturen in den Primer eingeführt ist bzw. wird, wodurch mehrere Ziele unter Verwendung eines einzigen Fluoreszenzkanals nachgewiesen werden können. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um mehrere Nukleinsäuren, Allele oder das Vorhandensein oder Fehlen einer bestimmten Nukleotidsequenz in einer Probe zu analysieren.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung einer fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Herstellen von zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen, die jeweils eine FMMA-Sonde (mit einer Struktur von 5'-R-T-Q-C-3') und einen nicht-markierten Primer enthalten, wobei R ein Fluoreszenzfarbstoff ist, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Temperaturen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte ist, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird;
    2. b) Amplifizieren mehrerer Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, durch eine Nukleinsäure-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im vorhergehenden Schritt erhaltenen zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen; und
    3. c) Durchführen einer Schmelztemperaturanalyse der Amplifikationsprodukte.
  • Die 1a und 1b sind schematische Ansichten, die das Prinzip der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse (FMMA) der vorliegenden Erfindung veranschaulichen.
  • Die einzelnen Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die 1a und 1b näher beschrieben.
  • a) Schritt des Gestaltens von FMMA-Sonde/Primer-Sätzen, die verschiedene Schmelztemperaturen induzieren
  • Unter Bezugnahme auf 1a werden zur Durchführung der Multiplex-Analyse nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zunächst FMMA-Sonde/Primer-Sätze hergestellt, die jeweils eine FMMA-Sonde (mit einer Struktur von 5'-R-T-Q-C-3') und einen nicht-markierten Primer enthalten. In diesem Fall ist Rein Fluoreszenzfarbstoff, T ist eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Schmelztemperaturen verschiedener Amplifikationsprodukte, Q ist ein Quencher, C ist eine Sequenz, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer sind so gestaltet, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird.
  • Unter Bezugnahme auf 1b erzeugt der oben gestaltete FMMA-Sonden/Primer-Satz mit der Struktur 5'-R-T-Q-C-3' kein Fluoreszenzsignal in Abwesenheit einer Ziel-Nukleinsäure, sondern erzeugt eine Fluoreszenz wie in C von 1b gezeigt, wenn eine Amplifikation aufgrund der Anwesenheit der Ziel-Nukleinsäure in der Reaktionslösung stattfindet. Bei einem herkömmlichen Vorgang der quantitativen Echtzeit-PCR wird diese Amplifikationskurve durch ein einzelnes Ziel verursacht, aber bei der vorliegenden Erfindung erscheinen die Amplifikationskurven aller mit demselben Fluorophor markierten Ziele als eine einzige Amplifikationskurve.
  • Wenn die Schmelztemperaturanalyse durchgeführt wird, um festzustellen, ob eine Amplifikation solcher multipler Ziele stattgefunden hat oder nicht, ist es möglich, eine Vielzahl von Zielen mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen (Tm) zu analysieren, wie in D von 1b gezeigt. In diesem Fall hat die Schmelztemperatur des Amplifikationsprodukts verschiedene Werte in Abhängigkeit vom GC-Gehalt der Schmelztemperatur-Steuersequenz und der Länge des Amplifikationsprodukts.
  • Jede Schmelztemperatur-Steuersequenz (T) in den zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen ist so gestaltet, dass der Schmelzpunkt jedes Amplifikationsprodukts durch Einstellen der Länge und des GC-Gehalts des Amplifikationsprodukts und der Länge und des GC-Gehalts der Schmelztemperatur-Steuersequenz unterschieden wird. Die zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze sind vorzugsweise so konfiguriert, dass die Differenz zwischen benachbarten Schmelztemperaturen 2 °C oder höher, vorzugsweise 4 °C oder höher, beträgt, um zwischen Amplifikationsprodukten zu unterscheiden. Die zielspezifischen FMMA-Sonden/Primer mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoff können so konfiguriert sein, dass die Differenz zwischen benachbarten Temperaturen der Amplifikationsprodukte 2 °C oder höher, 3 °C oder höher, 4 °C oder höher, 5 °C oder höher, 6 °C oder höher, 7 °C oder höher, 8 °C oder höher, 9 °C oder höher oder 10 °C oder höher ist.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Schmelztemperatur-Steuersequenz (T) 10 bis 30 bp lang. Der GC-Gehalt des zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Satzes einschließlich der Schmelztemperatur-Steuersequenz beträgt 0 bis 100 %, vorzugsweise 20 bis 90 %.
  • In der vorliegenden Erfindung wird ein Fluoreszenzfarbstoff (R) als ein signalerzeugendes Mittel zur Erzeugung eines Signals verwendet, das das Vorhandensein einer Ziel-Nukleinsäure anzeigt. Ein Fluoreszenzfarbstoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus FAM, TET, JOE, VIC, HEX, ROX, TAMRA, CyDye™ (Cy2™, Cy3™, CY3.5, Cy5™ und CY5.5™), Oregon Green (Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 500, Oregon Green™ 514), CAL Red, Red 640 und Texas Red™ besteht, ist aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt.
  • Weitere, nicht beschränkende Beispiele des Fluoreszenzfarbstoffes umfassen in nicht beschränkter Art und Weise Quantenpunkte, Alexa Fluor™-Farbstoff, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY™ 650/665, BODIPY™-FL, BODIPY™-R6G, BODIPY™-TMR, BODIPY™-TRX, CascadeBlue™, Fluorescein, 6-JOE, Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 500, Oregon Green™ 514, Pacific Blue™, REG, Phycobiliprotein, Phycoerythrin, Allophycocyanin, Rhodamine Green™, Rhodamine Red™, ROX™, TAMRA™, TET™, und Tetramethylrhodamin. Fluorophore weisen je nach Typ unterschiedliche Anregungs- und Emissionswellenlängen auf, und auch ihre Verwendung ist unterschiedlich. Die Eigenschaften der Ziel-Fluorophore sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst. [Tabelle 1]
    Filter Anregungs-Wellenlänge Emissionswellenlänge Fluorophor
    1 490 520 FAM, SYBR Green
    2 520 550 JOE, VIC, HEX, TET
    3 550 580 NED, TAMRA, CY3
    4 580 610 Taxas Red, ROX, RED610
    5 640 670 CY5, RED670
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Quencher“ auf eine Substanz, die die Fluoreszenzintensität reduziert, indem sie das von dem Fluoreszenzfarbstoff erzeugte Licht absorbiert. Der Quencher, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann aus der Gruppe ausgewählt sein bzw. werden, die aus TAMRA, DABCYL, ECLIPSE, NFQ, Black Hole Quencher™ (BHQ), DDQ, QSY, Blackberry Quencher, Qxl, Iowa black FQ, Iowa black RQ und IRDye QC-1 besteht, ist aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt. Bei der Auswahl des Quenchers kann die Tatsache berücksichtigt werden, dass der Bereich, in dem die Fluoreszenzintensität durch den Quencher reduziert wird, je nach Art des Quenchers unterschiedlich ist. Geeignete Fluoreszenzfarbstoff-Quencher-Paare sind in verschiedenen Literaturen wie folgt offenbart: Pesce et al. (Herausgeber), Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, Herausgeber, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); U.S. Patentnummern 3,996,345 und 4,351,760 .
  • b) PCR-Amplifikation von mehreren Ziel-Nukleinsäuren
  • Mehrere Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, werden durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im vorhergehenden Schritt erhaltenen zielspezifischen FMMA-Sondc/Primcr-Sätzcn amplifiziert.
  • Bei der vorliegenden Erfindung kann die Amplifikationsreaktion des Ziel-Nukleinsäure/FMMA-Sondenkomplexes unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt werden, die für die Amplifikation erforderlich sind, z. B. geeignete Mengen an DNA-Polymerase, DNA-Polymerase-Cofaktor (Mg2+), Pufferlösung, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und Wasser (dH2O), zusätzlich zu dem Primer-Satz der vorliegenden Erfindung. Die Pufferlösung kann ferner geeignete Mengen an Triton X-100, Dimethylsulfoxid (DMSO), Tween20, Nonidet P40, PEG 6000, Formamid und Rinderserumalbumin (BSA) enthalten, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Bei der Durchführung der Polymerisationsreaktion werden vorzugsweise überschüssige Mengen der für die Reaktion notwendigen Komponenten einem Reaktor zugeführt. Die „Überschüssigen Mengen der für die Amplifikationsreaktion notwendigen Komponenten“ bedeuten solche Mengen, dass die Amplifikationsreaktion nicht wesentlich durch Konzentrationen der Komponenten beschränkt wird. Cofaktoren wie Mg2+, und dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden dem Reaktionsgemisch vorzugsweise so zugeführt, dass ein gewünschter Grad der Amplifikation erreicht werden kann.
  • Die Nukleinsäure-Polymerase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-Polymerase oder eine RNA-Polymerase sein.
  • Nicht beschränkende Beispiele für die Nukleinsäure-Polymerase umfassen Taq-Polymerase, Tth-Polymerase, Tli-Polymerase, VENT-Polymerase, Pfu-Polymerase, DEEPVENT-Polymerase, Pwo-Polymerase, Bst-Polymerase, Sac-Polymerase, Tac-Polymerase, Tfl/Tub-Polymerase, Tru-Polymerase, DYNAZYME-Polymerase, Tne-Polymerase, Tma-Polymerase, Tsp-Polymerase, Mth-Polymerase, Phi29-Polymerase, Klenow-Polymerase, T7-Polymerase oder KOD-DNA-Polymerase. Ein bevorzugtes Beispiel für die Nukleinsäure-Polymerase ist die Taq-Polymerase.
  • Eine PCR-Reaktion kann aus 10 bis 100 „Zyklen“ der Denaturierung und Synthese eines DNA-Moleküls bestehen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Temperatur, bei der die Denaturierung in einer thermozyklischen Amplifikationsreaktion durchgeführt wird, etwa 90 °C bis über 95 °C, vorzugsweise 92 °C bis 94 °C. Bevorzugte thermozyklische Amplifikationsverfahren umfassen Polymerase-Kettenreaktionen mit etwa 10 bis etwa 100 Zyklen, bevorzugter etwa 25 bis etwa 50 Zyklen, und Spitzentemperaturen bzw. Peaktemperaturen von etwa 90 °C bis mehr als 95 °C, bevorzugter 92 °C bis 94 °C.
  • Im Annealing-Schritt bzw. Anlagerungsschritt bzw. Hybridisierungsschritt des Vorgangs zur Amplifikation der Ziel-DNA unter Verwendung des zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Satzes wird der zielspezifische FMMA-Sonden/Primer-Satz an den komplementären Strang der Ziel-Nukleinsäure angelagert bzw. mit diesem hybridisiert, und wenn die Ziel-DNA während des Amplifikationsvorgangs amplifiziert wird, wird ein Amplifikationskurvensignal (Fluoreszenz) erzeugt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Sonden ist die FMMA-Sonde der vorliegenden Erfindung eine Sonde, die direkt an der Nukleinsäure-Amplifikation beteiligt ist, und daher unterscheidet sich ihr Wirkmechanismus von dem anderer Typen von Sonden, die Fluoreszenz durch Bindung an die Ziel-DNA zeigen. Das heißt, die FMMA-Sonde der vorliegenden Erfindung zeigt Fluoreszenz, indem sie einen Teil des Amplifikationsprodukts bildet. Wenn bei dem Vorgang der Schmelztemperaturanalyse die Doppelstränge in Einzelstränge aufgetrennt werden, nimmt die Fluoreszenz ab, wodurch die Schmelztemperaturanalyse möglich wird. Im Gegensatz zu einem herkömmlichen Verfahren, bei dem eine Sonde allein von einer Ziel-Nukleinsäure und deren Schmelztemperatur getrennt wird, bildet die FMMA-Sonde der vorliegenden Erfindung also einen Teil des Amplifikationsprodukts.
  • c) Analyse der Schmelztemperatur eines jeden Amplifikationsprodukts
  • Die Schmelztemperaturanalyse wird an den Amplifikationsprodukten durchgeführt. Der Schritt des Analysierens der Schmelztemperatur umfasst einen Schritt des Erhaltens einer Schmelzkurve durch Messen der Fluoreszenz, die durch das Schmelzen jedes Amplifikationsprodukts erzeugt wird, während die Temperatur davon erhöht wird, und dann des Erhaltens einer Schmelzpeakkurve aus der Schmelzkurve.
  • Jede zielspezifische FMMA-Sonde ist spezifisch für die Ziel-Nukleinsäuresequenz, und in jedem Satz sind zwei oder mehr Sonden mit der gleichen Markierung vorhanden. Die Amplifikationsprodukte der zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze mit der gleichen Markierung unterscheiden sich dadurch voneinander, dass sie eine Schmelztemperatur (Tm) aufweisen, die sich um eine Schmelztemperatur von 2 °C oder höher, vorzugsweise 4 °C oder höher, voneinander unterscheidet. Daher können durch die Schmelztemperaturanalyse Produkte, die durch verschiedene FMMA-Sonden/Primer mit der gleichen Markierung amplifiziert wurden, voneinander unterschieden werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zur Genotypisierung unter Verwendung einer fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse gerichtet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte: a) Herstellen einer Vielzahl von allelspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen, die jeweils eine Struktur von 5'-R-T-Q-C-3' aufweisen und jeweils eine FMMA-Sonde/Primer enthalten, wobei R ein Fluoreszenzfarbstoff ist, der in der Lage ist, nachzuweisen, ob das Allel amplifiziert wurde oder nicht, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz ist, um unterschiedliche Temperaturen von unterschiedlichen Amplifikationsprodukten zu induzieren, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird; und b) Amplifizieren mehrerer Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, durch eine Nukleinsäure-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des im vorhergehenden Schritt erhaltenen zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Satzes. Nach Abschluss der Amplifikation wird das Allel in der Probe durch Durchführung einer Schmelztemperaturanalyse an den Amplifikationsprodukten nachgewiesen.
  • In diesem Fall wird in einem System der quantitativen Echtzeit-PCR, wie dem Biorad CFX96, unter Verwendung der eingebauten Analysesoftware ein Graph aufgezeichnet, der die Temperatur auf der x-Achse und die Fluoreszenzsignalintensität auf der y-Achse zeigt. Danach differenziert die Analysesoftware die Fluoreszenzsignalintensität auf der y-Achse in Bezug auf die Temperatur, um die visuelle Identifikation zu unterstützen, und zeichnet dann einen Graphen mit negativen Werten auf der y-Achse, das heißt, einen Graphen mit der Temperatur auf der x-Achse und -d(RFU)/dT-Werten auf der y-Achse. Nachdem eine Ableitungskurve der Änderung des Fluoreszenzniveaus mit der Änderung der Schmelztemperatur (Tm) wie oben beschrieben erhalten wurde, wird die Genotypisierung entsprechend der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Peaks, der jeden Genotyp repräsentiert, durchgeführt.
  • 2 ist eine schematische Ansicht, die allelspezifische FMMA für die Identifikation von Reissorten zeigt. Bei der vorliegenden Erfindung wird ein allelspezifischer SNP-Marker bzw. SNP-Markierung bzw. Einzelnukleotid-Polymorphismus-Markierung verwendet, und der SNP-Marker ist ein Marker, dessen Nukleotide am 3'-Ende genau mit einem beliebigen Allel übereinstimmen, aber durch ein Nukleotid ersetzt sind, das mit anderen spezifischen Allelen nicht übereinstimmt. Um in der vorliegenden Erfindung mehrere zielallelspezifische SNP-Marker gleichzeitig mit einem einzigen Fluoreszenzfarbstoff analysieren zu können, werden die Amplifikationsproduktlänge und die Schmelztemperatur-Steuersequenz so gestaltet, dass die Amplifikationsprodukte zwei oder drei unterschiedliche Schmelztemperaturen aufweisen.
  • Bezugnehmend auf 2 stimmt der zielspezifische FMMA-Sonden/Primer-Satz gemäß einem Marker für die Identifikation von Reissorten nach der vorliegenden Erfindung mit einem spezifischen Allel überein, das einen SNP darstellt. Somit hybridisiert die FMMA-Sonde spezifisch mit der Template-DNA für die Allele, die komplementär übereinstimmen, aber die FMMA-Sonde hybridisiert nicht mit einem unspezifischen Allel. Da die FMMA-Sonde in diesem Fall mit einem nachweisbaren Mittel, wie z. B. einem Fluoreszenzfarbstoff, markiert ist, kann der SNP-Typ des durch die PCR amplifizierten Produkts identifiziert werden. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines Produkts, das durch PCR unter Verwendung des allelspezifischen Markers zur Identifikation von Reissorten amplifiziert wurde, kann mit Hilfe der Schmelzkurvenanalyse leicht analysiert werden.
  • Die gemessene Schmelztemperatur (Tm) auf der Schmelzkurve zeigt einen Schmelzpeak, wenn die FMMA-Sonde jedes der zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze mit dem Nukleotid an der SNP-Position des jeweiligen Zielgens übereinstimmt und somit eine Amplifikation stattfindet. Daher ermöglicht der Vergleich des Tm-Wertes den Nachweis einer Nukleotidvariation an der SNP-Position.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Nukleotidvariation“ auf verschiedene Allele, die im selben Gen auftreten. Mit anderen Worten, der Begriff „Nukleotidvariation“ umfasst sowohl Wildtypen als auch Mutanten. Daher kann der Nachweis einer Nukleotidvariation durch Genotypisierung oder den Nachweis eines Allels ausgedrückt werden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „genetische Variation“ auf ein Phänomen, das aufgrund eines Allels, eines Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), einer Mutation oder einer Kombination davon auftritt. In diesem Fall bezieht sich das Allel auf Gene, die unterschiedliche Merkmalsausprägungen bzw. Funktionen aufweisen, während sie am selben Locus auf einem Chromosom existieren, oder auf Gene mit unterschiedlichen Nukleotidsequenzen, die sich am selben Locus auf homologen Chromosomen befinden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit bzw. eine Ausrüstung für den Multiplex-Nachweis von Ziel-Nukleinsäuren unter Verwendung der fluoreszenzbasierten Mehrfachschmelzanalyse, wobei das Kit die zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze der vorliegenden Erfindung enthält.
  • Das Kit der vorliegenden Erfindung umfasst a) zielspezifische FMMA-Sonde/Primer-Sätze, die jeweils eine FMMA-Sonde (mit einer Struktur von 5'-R-T-Q-C-3') und einen nicht-markierten Primer umfassen, wobei Rein Fluoreszenzfarbstoff ist, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Temperaturen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte ist, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Kit optional Reagenzien enthalten, die für die Nukleinsäure-Amplifikation erforderlich sind, z. B. ein Puffer, DNA-Polymerase (z. B. thermostabile DNA-Polymerase, isoliert aus Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus oder Thermococcus literalis), einen DNA-Polymerase-Cofaktor und dNTPs.
  • Das Kit der vorliegenden Erfindung kann aus einer Reihe von separaten Konfigurationen bestehen, die die oben beschriebenen Reagenzkomponenten enthalten. Zusätzlich kann das Kit der vorliegenden Erfindung eine Gebrauchsanweisung enthalten, die die Bedingungen beschreibt, unter denen die optimale Reaktion durchgeführt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zur Identifikation von allelspezifischen Reissorten zur Verfügung, wobei das Kit die allelspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben enthält. Das Kit zur Identifikation von allelspezifischen Reissorten gemäß der vorliegenden Erfindung kann Reissorten unter Verwendung der allelspezifischen Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion identifizieren.
  • Das Kit zur Identifikation allelspezifischer Reissorten gemäß der vorliegenden Erfindung etabliert ein Verfahren der quantitativen Echtzeit-PCR, das mindestens 15 Markersätze gleichzeitig zur Identifikation von Reissorten einsetzt, und ist insofern sehr vorteilhaft, als er durch eine deutliche Vereinfachung des PCR-Vorgangs die notwendige Testzeit und den Arbeitsaufwand minimieren kann.
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele näher beschrieben. Die folgenden Beispiele dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, und der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
  • Beispiel 1. Identifikation von Reissorten mittels allelspezifischer FMMA
  • 1-1. Primerdesign für FMMA
  • Für die Mehrfachzielanalyse, die ein Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist, wurden SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) bzw. Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) auf mehreren Allelen für die Identifikation der zu analysierenden Reissorten eingesetzt. Für die Identifikation von Reissorten wurde das Vorhandensein oder Fehlen von etwa 20 SNP-Markern untersucht und die Sorten wurden entsprechend der Muster davon bestimmt.
  • Wie in 2 gezeigt, wurde ein FMMA-Primer, der spezifisch für die SNP-Stelle jedes Markergen-Typs ist, so gestaltet, dass er einen Schmelzpeak bei einer bestimmten Temperatur zeigt, wenn das Amplifikationsprodukt den gewünschten Genotyp hat.
  • Die für die Reissortenanalyse verwendeten Primer wurden auf der Grundlage der Informationen über genetische Marker zur Identifikation von Reissorten und deren Nukleotidsequenzen gestaltet, die vom National Agricultural Products Quality Management Service bereitgestellt wurden. Das heißt, die Primer wurden so gestaltet, dass das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des SNP, der jedem genetischen Marker entspricht, anhand des Auftretens der Amplifikation bestimmt werden kann. Die Primer wurden so gestaltet, dass sich die Länge jedes Amplifikationsprodukts und die Schmelztemperatur-Steuersequenz änderten, so dass die Amplifikationsprodukte zwei oder drei verschiedene Schmelztemperaturen aufwiesen, so dass es möglich war, mehrere Marker mit einem einzigen Fluoreszenzfarbstoff zu analysieren. Die Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten Primer sowie die Größen, GC-Gehalte und Schmelztemperaturen der Amplifikationsprodukte sind in Tabelle 2 unten dargestellt. [Tabelle 2]
    Fluoreszenzfarbstoff Allele Name Nukleotidsequenz PCR-Produkt Größe (bp) PCR-Produkt GC-Gehalt (%) PCR-Produkt Tm (◦C)
    FAM BR09 BRa09-F3(T-In)-3 [FAM] [FAM]TAGCGTAAAATAG AGGAGG[BHQ 1 ]ACATGAt AAG 52 36,5 72,5
    BR09-(T)R2 GAGGAAAAAACATAGCA TGTTTC
    FAM BR06 BR06-F(FAM) [FAM]GCGCTGGATACCC TGGACGAG[BHQ1]ATCTT ACATTTGGTTTCACTGTT A 239 33,5 80,0
    BRq06-R CAGTATGCTAATAACTC ACTAATT
    FAM BR01 BR01-F(FAM) [FAM]CGCGCCGCGCCCC GGCCGCGC[BHQ1]AAGC AGCCTCATGGAGGTAG 308 42,2 87,0
    BRq01-R CAACTTGATTTCCTGCTG CTAT
    HEX BR02 BRc02-F GTAGTTATAATTATTGGG TTCACC 134 31,3 78,5
    BRa02-RL 1 (HEX) [HEX]CGTCAGGTAAGCG TGACGACT[BHQ1]CACTC CTAAGATGCCACATAtCG
    HEX BR04 BRq04-F GAACTCTCACATTAGCTA GAAAT 305 32,5 84,0
    BRa04-R(HEX) [HEX]CGCCCGGCGGGCG CGGCGCAG[BHQ1]TGTTG GTTGTGAGTTGATACTG
    BRa07-R3 (Cy5) [Cy5]CCGCGGGGCCCGCC CGGCGAC[BHQ2]AGCCG ATCAGATAGATCCCT
  • 1-2. Reaktion der quantitativen Echtzeit-PCR
  • Unter Verwendung der gestalteten Primer wurde eine Reaktion der quantitativen Echtzeit-PCR mit der genomischen DNA jeder Reissorte als eine Matrize bzw. Template bzw. Vorlage durchgeführt.
  • Jedes genomische Fragment, das einen zu identifizierenden Ziel-Nukleinsäure-SNP enthält, wurde einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von 10 bis 50 ng genomischer DNA als Matrize unterzogen. Eine Reaktionsmischung mit einem Gesamtvolumen von 15 µl wurde hergestellt, einschließlich 7,5 µl 2x PCR für die Identifikation von Reissorten, 1 µl Matrizen-DNA bzw. Template-DNA (5 bis 10 ng/ µl), 1 µl FMMA-Sonde (0,1 bis 1,0 pmol/µl) für die Identifikation von Reissorten, 1 µl Primer (0,5 - 4,0 pmol/µl) und 4 µl steriles Wasser.
  • Die Reaktionsmischung wurde bei 95 °C für 15 Minuten aktiviert und dann 5 Zyklen unterzogen, die jeweils aus 95 °C für 20 Sekunden, 65 °C für 10 Sekunden und 61 °C für 30 Sekunden bestanden, gefolgt von 30 Zyklen, die jeweils aus 95 °C für 20 Sekunden und 63 °C für 30 Sekunden bestanden.
  • Als Systeme der quantitativen Echtzeit-PCR wurden CFX96 (Biorad) und ein MIC qPCR Cycler (Bio Molecular System) verwendet. Die Fluoreszenz wurde in Echtzeit gemessen. Die Schmelzkurvenanalyse wurde durch Messen der Fluoreszenz während der Durchführung der PCR unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 20 Sekunden und dann Hybridisierung bei 45 °C für 30 Sekunden, gefolgt von einer Erwärmung von 65 °C auf 99 °C mit einer Rate von 0,4 °C/sec.
  • 1-3. Analyse des Produkts der PCR mittels quantitativer Echtzeit-PCR und endgültige Bestimmung
  • Als ein Ergebnis der Durchführung von allelspezifischer FMMA an Reissorten wie Gan-Cheok, Nam-Gang, Dae-Ya und Shin-Woong-Bong wurde das Vorhandensein von fünf genetischen Markern (BR01, BR02, BR04, BR06 und BR09) durch eine einzige Reaktion unter Verwendung von zwei Fluoreszenzfarbstoffen (FAM und HEX) identifiziert. Als ein Ergebnis konnte, wie in 3 gezeigt, ein Genotypisierungsergebnis erhalten werden, das jeder Reissorte entspricht. Es wurde bestätigt, dass es möglich ist, mehrere Allele in einer einzigen Reaktion zu analysieren, indem zwei oder drei verschiedene Amplifikationsprodukt-Schmelztemperaturen für jeden Fluoreszenzkanal verwendet werden.
  • Beispiel 2. Identifikation von Reissorten mittels allelspezifischer FMMA
  • Allelspezifische FMMA für 20 Genmarker, die für die Identifikation von Reissorten verwendet werden, wurden gestaltet und Identifikationsstests für vier Reissorten wurden durchgeführt. Vier Fluoreszenzkanäle (FAM, HEX, Texas Red und Cy5) wurden verwendet, um die Analyse von 10 Markern pro Testsatz zu ermöglichen, und die Schmelztemperatur wurde so verteilt, dass die Analyse von zwei oder drei Markern für jeden Fluoreszenzkanal möglich war. 20 genetische Marker wurden mit zwei Sätzen analysiert, die jeweils zehn genetische Marker analysieren können, und die Ergebnisse sind in 4 und 5 dargestellt.
  • Wie aus den Ergebnissen in 4 und 5 ersichtlich ist, wurde bestätigt, dass die aus dem Probenreis extrahierte DNA spezifisch im Markerset für die Identifikation von Reissorten amplifiziert wurde, was darauf hindeutet, dass der Probenreis korrekt identifiziert wurde, um die Anforderungen der Sortenidentifikation zu erfüllen. Anhand dieses Ergebnisses wurde bestätigt, dass mehrere Allele in einer einzigen Reaktion analysiert werden können, indem zwei oder drei verschiedene Amplifikationsprodukt-Schmelztemperaturen für jeden Fluoreszenzkanal verwendet werden.
  • Zusammenfassend wurde bestätigt, dass die Anwendung des FMMA-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zehn oder mehr Proben gleichzeitig in einer einzigen Reaktion analysieren kann. Dieses Verfahren kann nicht nur für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von allelischen Markern, wie im obigen Beispiel durchgeführt, sondern auch für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von mehreren Ziel-Nukleinsäuregenen angewendet werden, und es gibt keine signifikante Differenz zwischen den Verfahren zur Bestimmung. Somit kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf Multiplex-Nachweisverfahren, wie z. B. die gleichzeitige Diagnose einer Infektion mit verschiedenen Krankheitserregern, angewendet werden.
  • Beispiel 3. Analyse der Schmelztemperaturverteilung in Abhängigkeit von der Länge des Nukleinsäure-Amplifikationsprodukts
  • Um mehrere Marker in einem einzigen Fluoreszenzkanal wie in Beispiel 1 zu analysieren, ist es erforderlich, die Schmelztemperatur angemessen auf die Marker zu verteilen. Um Faktoren zu verstehen, die die Bestimmung der Schmelztemperatur beeinflussen, wurde die Korrelation zwischen der Länge des Amplifikationsprodukts und dessen Schmelztemperatur untersucht. Der fluoreszenzmarkierte Primer wurde festgelegt bzw. fixiert, und die Länge des Produkts wurde durch Veränderung der Position des Reverseprimers bzw. Rückwärtsprimers eingestellt, und die Schmelztemperatur wurde analysiert. Das heißt, als fluoreszierender Primer am 5'-Ende wurde derselbe Primer verwendet, und als Primer am 3'-Ende wurde ein Primer mit einer eingestellten bzw. angepassten Länge verwendet, so dass die Länge des Amplifikationsprodukts zwischen 50 bp und 350 bp variieren würde. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 3 unten aufgeführt. [Tabelle 3]
    Name Nukleotidsequenz PCR-Produkt Größe (bp) PCR-Produkt Tm (°C)
    BR05 BRq05-F2 CAATGTGGATTGTGAAGGTGA 102 79
    BRq05-Fl GTTCAAGAATTTGGAGAATCAAT 121 79,5
    BRq05-F GCAACATCGGACTGAAAGGT 170 81
    BRm05-F(200) CTGTAAAGATTGAACTGCCAAAT 220 77/82
    BRc05-F GGAACCACCACCGTTTAAATAA 278 82
    BRm05-F(341) TGGTATGTCACATTCTGTACGA 362 82
    BRa05-R(Cy5) [Cy5]GGAGACATCAGATACAGAGTG[ BHQ2]TCGGTTATTGCAGGTGATaTTT
    BR13 BRa13-F(Texas red) [TexasRed]CCGTACCTTAGAGACAGC GTG[BHQ2]GATGCTTGCAAGAGGGG ATaTT
    BRm13-R(70) TCTTGATATGGCACCCATCCA 91 83,5
    BRm13-R(122) CAGTCATTGGGGTCAATGCCA 143 85
    BRq13-R GCAAGAACCAGGACCATGTGCT 208 85,5
    BRm13-R(247) TGTCAGTCATGATAATCCAAGG 268 85,5
    BRm13-R(309) CATGTTTAGAAACTGCAATGGC 330 85,5
    BR15 BRa15-F2-1 (HEX) [HEX]CGTCAGGTAAGCGTGACGACT[ BHQ1]GACGTCATAGCAACAACtaCG
    BRm15-R(51) CACCAACTCATCTTACCTTTAAC 72 80,5
    BRm15-R(102) CAGAAGGTGCCCATCCATGTT 123 84,5
    BRm15-R(151) CTACACCTACTTTCTTCGTCAA 172 84
    BRm15-R(204) TAAGGGACATGACGGGTCAG 225 85,5
    BRq15-R TGTCTGCACTGACTTCTTCATC 275 85,5
    BRm15-R(302) ATCCATCATCCGAAGGATGTG 324 85,5
    BR20 BRa20-F (Cy5) [Cy5]GGAGACATCAGATACAGAGTG[ BHQ2]ACTAGAATATGGAACCCTaGA G
    BRm20-R(52) TGCTAGTACAGATGAGGAGGT 73 77,5
    BRq20-R1 TTCAACATGCATGATGCAAAGC 144 80
    BRm20-R(183) CGACATTCTTGTTTGATATTTCTT 204 80,5
    BRq20-R GATGAAGGATCTTGGTGTTGCT 260 81
    BRm20-R(313) GATGATATGCTGATTGCTGCC 334 81
  • Für vier genetische Marker von Reissorten (BR05, BR13, BR15 und BR20) wurden Änderungen der Schmelztemperaturen von Amplifikationsprodukten in Abhängigkeit von deren Längen getestet, und die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Bezugnehmend auf 6 wurde beobachtet, dass die Schmelztemperatur des PCR-Amplifikationsprodukts mit zunehmender Länge des PCR-Amplifikationsprodukts anstieg. Es war jedoch zu sehen, dass, wenn die Länge des Amplifikationsprodukts 200 oder 250 bp überstieg, der Effekt auf den Anstieg der Schmelztemperatur vernachlässigbar war. Zusammenfassend wurde bestätigt, dass die Änderung der Schmelztemperatur des Amplifikationsprodukts durch die Steuerung der Länge des Amplifikationsprodukts zwischen 50 bp und 250 bp induziert werden kann.
  • Beispiel 4. Analyse der Schmelztemperaturverteilung auf die Länge des Nukleinsäure-Amplifikationsprodukts und des GC-Gehalts
  • Unter den Faktoren, die die Schmelztemperatur beeinflussen, wurde die Korrelation zwischen dem GC-Gehalt der verwendeten Schmelztemperatur-Steuersequenz und der Schmelztemperatur des gesamten Amplifikationsprodukts analysiert.
  • Für drei genetische Marker von Reissorten (BR12, BR16 und BR20) wurden die Positionen der 5'- und 3'-Endprimer auf dem Ziel-Nukleinsäuregen festgelegt und der GC-Gehalt der Schmelztemperatur-Steuersequenz des 5'-Endprimers wurde auf zwei Typen (hoher und niedriger GC%) eingestellt. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 4 unten aufgeführt. Unter diesen Bedingungen wurde die Analyse durchgeführt, und die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. [Tabelle 4]
    Marker Primer Nukleotidsequenz GC% der Tm Steuersequenz
    BR12 BRa12-F2_Hi(Texasred) [TexasRed]GCGGGCCGCGGGCGCCGCCAC[B HQ2]TCGACGGCGACCTGACtTGT 95,238
    BRa12-F2_Lo(Texasred) [TexasRed]GGAGACATCAGATACAGAGTG[B HQ2]TCGACGGCGACCTGACtTGT 47,619
    BR12-R GCATTGGAGACGAACTGACG
    BR16 BR16-F TGGCGGGCGGGAGACGTTC
    BRa16-R3_Lo [HEX] [HEX]GGAGACATTAGATATAGAGTG[BHQ1] ACTGGCTTGCTGCCGTAtCCA 38,095
    BRa16-R3_Hi [HEX] [HEX]CGCCCGGCGGGCGCGGCGCAG[BHQ1] ACTGGCTTGCTGCCGTAtCCA 92,238
    BR20 BRa20-F_Hi (Cy5) [Cy5]GCGGGCCGCGGGCGCCGCCAC[BHQ2] ACTAGAATATGGAACCCTaGAG 47,619
    BRa20-F_Lo (Cy5) [Cy5]GGAGACATCAGATACAGAGTG[BHQ2] ACTAGAATATGGAACCCTaGAG 95,238
    BRm20-R TGCTAGTACAGATGAGGAGGT
  • Bezugnehmend auf 7 wurde bestätigt, dass bei einem hohen GC-Gehalt der Schmelztemperatur-Steuersequenz die Schmelztemperatur (Tm) des Amplifikationsprodukts im Vergleich zu einem niedrigen GC-Gehalt der Schmelztemperatur-Steuersequenz anstieg, auch wenn der gleiche Primer verwendet wurde. Das heißt, es konnte bestätigt werden, dass mit steigendem GC-Gehalt der Schmelztemperatur-Steuersequenz die Schmelztemperatur des gesamten Amplifikationsprodukts anstieg.
  • Nimmt man die Ergebnisse der Beispiele 3 und 4 zusammen, so wurde bestätigt, dass die Schmelztemperatur des gesamten Amplifikationsprodukts durch eine Kombination aus der Länge des Amplifikationsprodukts und dem GC-Gehalt der verwendeten Schmelztemperatur-Steuersequenz beeinflusst wird.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Verwendung des FMMA-Verfahrens der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, mehrere Ziele gleichzeitig in einer einzigen Reaktion nachzuweisen. Daher kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Begleitdiagnostik, in der mehrere Ziel-Nukleinsäuregene analysiert werden müssen, in der Landwirtschaft und Viehzucht, in denen mehrere Allele analysiert werden müssen, und in der klinischen Pathologie, in der mehrere Infektionserreger gleichzeitig analysiert werden müssen, vielseitig verwendet werden.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf Ausführungsformen beschrieben wurde, dienen diese Ausführungsformen nur zur Veranschaulichung und der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nicht auf diese Ausführungsformen beschränkt. Der Fachmann wird verstehen, dass verschiedene Modifikationen und Änderungen möglich sind, ohne vom Gedanken und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, und solche Modifikationen und Änderungen fallen ebenfalls in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung. Daher sollte der wahre Umfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert werden.

Claims (14)

  1. Verfahren zur Multiplex-Analyse von Amplifikationsprodukten unter Verwendung der Mehrfachschmelzanalyse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen von zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen, die jeweils eine FMMA-Sonde (eine Struktur von 5'-R-T-Q-C-3' aufweisend) und einen nicht-markierten Primer enthalten, wobei R ein Fluoreszenzfarbstoff ist, T eine Schmelztemperatur-Steuersequenz zum Induzieren unterschiedlicher Temperaturen unterschiedlicher Amplifikationsprodukte ist, Q ein Quencher ist, C eine Sequenz ist, die komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, und jede FMMA-Sonde und jeder Primer so gestaltet sind, dass jedes Amplifikationsprodukt mit einer unterschiedlichen Schmelztemperatur erzeugt wird; b) Amplifikation mehrerer Ziel-Nukleinsäuren in einer Probe, die eine oder mehrere Ziel-Nukleinsäuren enthält, durch eine Nukleinsäure-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im vorhergehenden Schritt erhaltenen, zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze; und c) Durchführen einer Schmelztemperaturanalyse der Amplifikationsprodukte.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Einstellung der Schmelztemperatur einer jeden FMMA-Sonde und eines jeden Primers in den zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätzen so gestaltet ist, dass der Schmelzpunkt des Amplifikationsprodukts durch Einstellen der Länge und des GC-Gehalts des Amplifikationsprodukts und der Länge und des GC-Gehalts der Schmelztemperatur-Steuersequenz unterschieden wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die FMMA-Sonden/Primer so konfiguriert sind, dass benachbarte Schmelztemperaturen der Amplifikationsprodukte eine Differenz von 2 °C oder mehr aufweisen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die FMMA-Sonden/Primer so konfiguriert sind, dass die benachbarten Schmelztemperaturen der Amplifikationsprodukte eine Differenz von 4 °C oder mehr aufweisen.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schmelztemperatur-Steuersequenz (T) 10 bis 30 bp lang ist und das Amplifikationsprodukt 50 bis 300 bp lang ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus FAM, TET, JOE, VIC, HEX, ROX, TAMRA, CY3, CY3.5, CY5, CY5.5, Oregon Green, CAL Red, Red 640 und Texas Red.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA, DABCYL, ECLIPSE, NFQ, Black Hole Quencher™ (BHQ), DDQ, QSY, Blackberry Quencher, Qxl, Iowa black FQ, Iowa black RQ und IRDye QC-1.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Durchführens der Schmelztemperaturanalyse die folgenden Schritte aufweist: Erhalten einer Schmelzkurve durch Messen einer Fluoreszenz, die durch Schmelzen des Amplifikationsprodukts unter Erhöhung seiner Temperatur erzeugt wird; und Gewinnen einer Schmelzpeakkurve aus der Schmelzkurve.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure-Polymerase eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, eine DNA-Polymerase oder eine RNA-Polymerase ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die DNA-Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Taq-Polymerase, Tth-Polymerase, Tli-Polymerase, VENT-Polymerase, Pfu-Polymerase, DEEPVENT-Polymerase, Pwo-Polymerase, Bst-Polymerase, Sac-Polymerase, Tac-Polymerase, Tfl/Tub-Polymerase, Tru-Polymerase, DYNAZYME-Polymerase, Tne-Polymerase, Tma-Polymerase, Tsp-Polymerase, Mth-Polymerase, Phi29-Polymerase, Klenow-Polymerase, T7-Polymerase, und KOD-DNA-Polymerase.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsprodukte eine Schmelztemperatur von 50 °C bis 100 °C aufweisen.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Amplifikationsprodukte eine Schmelztemperatur von 60 °C bis 95 °C aufweisen.
  13. Kit für einen Multiplex-Nachweis von Ziel-Nukleinsäuren, wobei das Kit auf dem Verfahren nach Anspruch 1 basiert und die zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze nach Anspruch 1 aufweist.
  14. Kit zur Identifikation allelspezifischer Reissorten, wobei das Kit auf dem Verfahren nach Anspruch 1 basiert und die zielspezifischen FMMA-Sonde/Primer-Sätze nach Anspruch 1 aufweist.
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