DE3904270A1 - Verfahren zur markierung bestimmter chromosomen unter verwendung repetetiver rekombinations dns - Google Patents
Verfahren zur markierung bestimmter chromosomen unter verwendung repetetiver rekombinations dnsInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die Chromosomenidentifikation
und insbesondere auf die Identifikation repetitiver DNS-Sequenzen,
die zur spezifischen Chromosomen hydridisieren.
Es ist bekannt, daß lebende Zellen Chromosomen aufweisen, deren
Strukturen DNS genetische Einheiten enthalten. Spezifische
Sätze von Chromosomen bestimmen die Eigenschaften des Lebens,
welches mit den DNS genetischen Einheiten assoziiert ist. So
enthalten menschliche Zellen 24 unterschiedliche Chromosomenarten
(22 Autosome, X und Y) und die Zahl und Anordnung der
Chromosomen innerhalb der Zelle bilden eine Anzeige für die
verschiedenen normalen und anormalen Entwicklungen. Beispielsweise
enthalten normale Zellen ein Paar jeden Autosomentyps
und das Vorhandensein von drei eines Chromosomentyps (Trisomie)
kann einen anormalen Zustand oder eine anormale Bedingung
andeuten. Die Trisomie 9 (d. h., drei Nummer 9 Chromosomen)
zeigt ein Syndrom an, welches innerhalb weniger Tage nach der
Geburt zum Tode führt. Die Trisomie 16 ist in einem Drittel
aller spontanen Abgänge vorhanden, die Chromosomentrisomien
enthalten. Die Trisomie 21 ist für das Down′sche Syndrom indikativ.
Repetitive DNS-Clone wurden beschrieben, welche zu Gruppen
menschlicher Chromosomen hybridisieren, oftmals mit einem
prominenten Hybridisationsplatz an nur einem der zwei Autosome.
Vergl. dazu beispielsweise A. R. Mitchell und andere,
"Molecular hybridization to meiotic chromosomes in man reveals
sequence arrangement on the No. 9 chromosome und provides
clues to the nature of 'parameres'." Cytogenet. Cell Genet.
41: 89-95 (1986), wo eine Probe Xbl gelehrt wird, welche
bevorzugt aber nicht ausschließlich mit Chromosomen 9 hybridisiert.
Es wurde vorgeschlagen, daß jedes menschliche Chromosom gekennzeichnet
werden kann durch einen oder mehrere distinkte
Untersätze aus alpha-Satellit DNS. Vergl. dazu beispielsweise
P. Devilee und andere, "Two Subsets of Human Alphoid
Repetitive DNA Show Distinct Preferential Localization in the
Pericentric Regions of Chromosomes 13, 18 and 21." Cytogenet.
Cell Genet. 41, 193-201 (1986); A. Lund Jorgensen und andere,
"Chromosome-Specific Subfamilies within Human Alphoid
Repetitive DNA," J. Mol Biol. 187, 185-196 (1986). In der
Tat wird die Anreicherung einer oder einiger weniger distinktiver
Subfamilien an individuellen Chromosomen berichtet. Es
wird jedoch kein Verfahren gelehrt, um systematisch Nucleotidsequenzen
zu bestimmen, welche chromosomenspezifische Proben
bilden. Ferner werden keine Proben gelehrt, die unter normalen
Striktheitserfordernissen chromosomenspezifisch sind für eine
positive Chromosomenidentifikation nach in situ-Hybridisierung
der Probe mit Chromosomen innerhalb einer Zelle.
Die Chromosomenspezifität von chromosomenpreferentiellen oder
bevorzugten DNS-Proben identifiziert im Stand der Technik kann
verbessert werden durch Erhöhung der Striktheit der Vorschriften
oder denen die Hybridisierung versucht wird. Die
Hybridisierung unter Bedingungen hoher Striktheit kann jedoch
den Erhalt nicht reproduzierbarer Ergebnisse zur Folge haben.
Wenn nur bestimmte oder spezifische Chromosomen markiert werden
können, kann nicht jedes solche Chromosom markiert werden,
was ganz klar eine nicht annehmbare Bedingung ist für
eine routinemäßige klinische Anwendung. Ferner reduzieren hohe
Striktheitsniveaus häufig die Größe und/oder Identität des Hybridisationsplatzes,
was erhöhte Verstärkung des Fluoreszenzsignals
erfordert oder eine längere Zeit an autoradiographischer
Aussetzung oder Belichtung. Diese Bedingungen erhöhen
die nicht-spezifischen Hintergrundfehler bei den Messungen.
Proben, die nach der Hybridisierung chromosomenspezifisch bei
normaler Striktheit sind, und ein einziger Verstärkungsschritt
oder eine kurze Aussetzung wären für die meisten Anwendungsfälle
brauchbar, insbesondere für die Identifikation und Quantifizierung
von Chromosomen in Interphasennuclei.
Die Fähigkeit spezifische menschliche autosomale Chromosomen
in Interphasennuclei zu markieren, würde Untersuchungen der
drei-dimensionalen Struktur des Nucleus gestatten und eine
Möglichkeit für die Chromosomenanalyse vorsehen, wo die Isolation
von Metaphasenchromosomen unbequem, schwierig oder unmöglich
ist. Jede Kreuzhybridisierung zwischen einer chromosomen
"spezifischen" Probensequenz und anderen Chromosomen
verdünnt die Brauchbarkeit der Probe insbesondere für Hybridisierung
zu Zwischen- oder Interphasennuclei. Die Erfindung
sieht ein Verfahren zur Identifizierung repetitiver Nucleotidsequenzen
vor, die in situ hybridisieren, und zwar zu spezifischen
Chromosomen unter normalen Striktheitsbedingungen, um
solche Untersuchungen und Analysen zuverlässig ausführen zu
können.
Es ist demgemäß ein Ziel der vorliegenden Erfindung, repetitive
oder sich wiederholende Nucleotidsequenzen zu identifizieren,
die unter Bedingungen normaler Striktheit chromosomenspezifisch
sind. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin,
die in situ Identifikation von Chromosomen in intakten
Zell-Nuclei zu ermöglichen. Weiterhin bezweckt die Erfindung
ein Verfahren anzugeben zur Bestimmung von Probensequenzen,
welche nur den Teil einer Wiederholungseinheit enthalten, der
angereichert ist mit oder einzigartig ist für das identifizierte
Chromosom. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht
darin, chromosomenspezifische Nucleotidsequenzen zu identifizieren,
die eine Länge besitzen, die synthetisiert werden
kann.
Zusammenfassung der Erfindung. Um die genannten sowie weiteren
Ziele zu erreichen wird gemäß der Erfindung ein Verfahren
zur Bestimmung einer repetitiven Nucleotidsequenz vorgesehen,
und zwar effektiv zur Identifikation eines bestimmten
oder spezifischen Chromosoms unter normalen Bedingungen der
Striktheit für Hybridisierung. Eine erste repetitive Nucleotidsequenz
wird aus einer Variantsequenz ausgewählt, und zwar
mit einer Sequenz einer bekannten repetitiven DNS-Familie. Die
erste repetitive Nucleotidsequenz wird sodann hybridisiert, um
die Sequenz als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt
(chromosomenpreferenziell) oder chromosomen-nicht-spezifisch
zu klassifizieren. Die klassifizierten Chromosomenvorzugssequenzen
werden sodann zur Bestimmung von Regionen untersucht,
die eine niedrige Homologie mit anderen Regionen der Chromosomenpreferenz
oder Vorzugssequenz besitzen, wobei die Regionen
niedriger Homologie effektiv sind, um mit einem spezifischen
Chromosom unter normalen Striktheitsbedingungen zu hybridisieren.
Gemäß einer weiteren Kennzeichnung der Erfindung wird ein Verfahren
vorgesehen zur Selektion von chromosomenspezifischen
repetitiven DNS-Sequenzen aus einer Bücherei von Rekombinanten
DNS-Clonen mit Familien aus repetitiven Sequenzen. Als erstes
werden die Clone aus der Bücherei ausgewählt, und zwar mit
einer niedrigen Homologie mit der Sequenz der repetitiven DNS-Familien,
zu denen die ersten Clone jeweils gehören. Die ausgewählten
ersten Clone werden zu totalem oder gesamtgenomischem
DNA oder DNS hybridisiert und Variantclone werden ausgewählt,
die ein Hybridisierungsmuster besitzen, welches zu
einem prädominanten Hybridisierungsmuster, gezeigt durch die
entsprechenden Familien unähnlich ist. Die varianten Clone
werden sodann mit Chromosomen hybridisiert und als chromosomenspezifisch,
chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch
klassifiziert. Die chromosomenbevorzugten Clone
werden weiterhin einer Sequenzbehandlung unterworfen, um
Regionen zu bestimmen, die eine Sequenz mit niedriger Homologie
besitzen, und zwar relativ zu bekannten Sequenzen anderer
Familienmitglieder und Konsensussequenzen der repetitiven
DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Clone. Diese Zonen
niedriger Homologie werden weiter hybridisiert, um chromosomenspezifische
Sequenzen zu bestimmen, die effektiv sind, um
in situ Chromosomenspezifität bei einem normalen Striktheitsniveau
vorzusehen.
Gemäß einer weiteren Kennzeichnung der vorliegenden Erfindung
werden Oligomere vorgesehen, die eine Nucleotidsequenz besitzen,
die entsprechend den oben genannten Verfahren bestimmt
wird. Die Oligomere sind in der Lage, eine Probe vorzusehen,
welche mit einem spezifischen Chromosom hybridisiert.
Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen erläutert.
Gemäß der Erfindung werden chromosomenspezifische Nucleotidsequenzen
bestimmt durch die Identifikation signifikanter örtlicher
Sequenzdivergenzen einer repetitiven DNS-Familie. Es wurde
festgestellt, daß bestimmte Regionen chromosomenbevorzugter
Wiederholeinheiten in erster Linie für die chromosomenspezifische
Hybridisierung verantwortlich sind. Wie hier erläutert,
können solche variante Sequenzen Proben ergeben, die
unter Striktheitsniveau von 80% oder weniger chromosomenspezifisch
sind. Eine effektive Probe enthält Tandemanordnungen
der ausgewählten Sequenz zur Hybridisierung mit einer Tandemanordnung
des spezifischen Chromosoms zum Vorsehen einer lokalisierten
Fluoreszenz für die positive Identifikation.
Die repetitive DND ist der Teil der gesamten oder totalen DNS
einer Spezies oder Art, dem Genom, repräsentiert durch Sequenzen,
die viele Male oftmals in Tandemanordnungen vorhanden
sind. Wenn genomische DNS in relativ kurze Fragmente zerschnitten
wird und die zwei Stränge der Doppelhelix getrennt
werden (denaturiert), so vereinigen sich die Sequenzen repetitiver
DNS erneut (sie reassoziieren sich) mit einer schnelleren
Geschwindigkeit als Sequenzen, die nur einmal oder einige
wenige Male innerhalb der Genome vorhanden sind, weil es
vielmehr Möglichkeiten für diese gibt, ihre komplementäre
Sequenz zu finden. Diese Charakteristik gestattet die Bildung
von Büchereien aus DNS-Fragmenten, die eine große Anzahl von
repetitiven Sequenzen enthalten.
Das menschliche Genom enthält mehrere Familien an repetitiven
DNS. Obwohl an vielen Plätzen innerhalb des Genoms vorhanden,
bilden Mischungen aus repetitiven Sequenzen große Blöcke am
Centromer jedes Chromosoms. Repetitive Sequenzen haben die
Kapazität für schnelle Evolution; in der Tat können selbst
Homologe unterschiedliche repetitive Sequenzen haben, und
zwar infolge von Substitution, Insertion oder Weglassung
individueller Basen innerhalb der Sequenzen. Somit sollten
tandemrepetitive Sequenzen verfügbar sein, um in einzigartiger
Weise jedes Chromosom zu identifizieren und spezifisch zu hybridisieren
mit einer Probe mit einer hinreichend homologen
Tandemanordnung.
Die Familien repetitiver DNS können durch die Anordnung der
DNS-Basen innerhalb der Wiederholeinheit identifiziert werden.
Beispielsweise sind Alpha-Satelliten DNS-Sequenzen Einheiten
mit variablen Anzahlen von Tandemsequenzen von ungefähr 170
Basenpaarenlänge und Satellit 2 DNA-Sequenzen mit Wiederholeinheiten
von ungefähr 26 Basenlängen. Die repetitivsten
DNS-Familien haben eine prädominate Form. Wenn die gesamte
Familie isoliert ist, sind eine große Anzahl der vorhandenen
Sequenzen sehr ähnlich (homolog).
Der Rest der Sequenzen bildet Subfamilien. Diese sind Gruppen
von Sequenzen, die die gleiche Anordnung wie die prädominante
Form haben können, aber Basensubstitutionen, Weglassungen
und/oder Insertionen oder Einsetzungen unterworfen waren. Diese
Änderungen schaffen Plätze innerhalb der in Beziehung stehenden
oder verwandten Sequenzen, an denen komplementäre
Stränge keine Basenpaarung mit anderen Sequenzen innerhalb der
Familie vornehmen können. Die Anzahl dieser Änderungen bestimmt
die Beziehung zwischen irgendwelchen zwei Sequenzen, d. h.
homolog (Gleichheit) oder divergent (Unterschied oder Differenz).
Einige Subfamilien sind als Varianten identifiziert, mit hinreichender
Divergenz gegenüber der prädominanten Form, die sie
nicht mehr reassoziieren oder mit der prädominanten Form hybridisieren
können, und zwar unter normalen Striktheitsbedingungen
der Temperatur, der Konzentrationen, und der Zeit. Die Fähigkeit
verwandter Sequenzen bei einer gegebenen Homologie zu
hybridisieren, kann durch die der Reassoziation auferlegten
Striktheitsbedingungen gesteuert werden. Je höher die Striktheitsbedingungen
sind, um so größer ist die Homologie, die
erforderlich ist, um jede Sequenz anzupassen oder zu treffen.
Unter normalen Bedingungen müssen mindestens 80% der Basen
innerhalb einer Sequenz für die zwei Stränge zur Reassoziation
passen. Der hier verwendete Ausdruck niedrige Homologie bedeutet
eine Homologie, die kleiner ist als die für die normale
Reassoziation erforderliche, d. h. kleiner als ungefähr 80%.
Gemäß der Erfindung werden repetitive Nucleotidsequenzen ausgewählt
und mit DNS-Sequenzen der entsprechenden repetitiven
DNS-Familien verglichen. Das vorliegende Verfahren sucht DNS-Sequenzen,
die eine niedrige Homologie besitzen und eine entsprechend
niedrige Wahrscheinlichkeit der Hybridisierung mit
ihren Familienmitgliedern, die im allgemeinen in mehreren
Chromosomen in dem menschlichen Genom vorhanden sind. Solche
Nucleotidsequenzen haben eine relativ hohe Wahrscheinlichkeit
der Hybridisierung mit nur spezifischen Chromosomen, wenn sie
überhaupt hybridisieren. Je varianter die Sequenz ist, desto
spezifischer ist die Chromosomenhybridisierung. Somit können
DNS-Proben, die eine oder mehrere Kopien der die niedrige
Homologie besitzenden Sequenz aufweisen zur Identifikation
spezifischer Chromosome durch in situ-Hybridisierung mit
Zellchromosomen verwendet werden.
Eine Bücherei aus menschlichen repetitiven DNS-Sequenzen wurde
unter Verwendung konventioneller Verfahren aufgebaut. Gereinigtes
menschliches plazentales DNS wurde physikalisch in
Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 3000 bis 4000
Basispaaren zerschert. Das DNA war denaturiert und gestattete
die Reassoziation unter Bedinungen, die die Reassoziation repetitiver
DNS-Sequenzen förderte. Die sich ergebenden Fragmente
wurden durch Sl-Nuclease verdaut und verarbeitet zum Erhalt
doppelsträngiger repetitiver DNS. Die sich ergebende doppelsträngige
repetitive DNS wurde in den PstI Platz von Plasmid
pBR322 geclont, und zwar durch G : C-Behandlung mit terminaler
Transferase. Die sich ergebenden Plasmide wurden sodann in
einem Bakteriensystem zur Bildung eines Clons gewachsen, der
viele Plasmide enthielt, wobei jedes die gleiche repetitive
DNA- oder DNS-Sequenz enthielt. Die Bücherei-Clone wurden als
pHuR (Plasmid Human Repeat) Clone identifiziert und erhielten
eine Identifikations-Nummer zugewiesen. Alle diese pHuR Clone,
die hier identifiziert sind, sind von der pHuR Bücherei des
Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, USA,
erhältlich.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden
rekombinante DNS-Clone aus der Bücherei ausgewählt, und chromosomenspezifische
Sequenzen werden durch das folgende
Verfahren identifiziert:
- 1. Die repetitiven DNS-Einsätze werden aus dem Plasmid durch PstI Verdauung oder Digestion entfernt und in den M13-Vektor recloniert. In einer ersten Auswahl werden die Clone partiell einer Sequenzbehandlung unterworfen (sequenziert) unter Verwendung bekannter Verfahren zur Bestimmung der repetitiven DNS-Familie, repräsentiert durch ein Clon. Diese Clone, die Sequenzen mit einer niedrigen Homologie (d. h. weniger als ungefähr 80% Homologie) mit der Sequenz des prädominantesten Familiengliedes enthalten, werden für das weitere Studium ausgewählt.
- 2. Die ersten ausgewählten Clone werden sodann hybridisiert zu Gesamtgenom DNS auf "Southern blot gels". Das Muster der Hybridisierung wird mit dem der prädominanten Sequenz der entsprechenden Familie verglichen. Diejenigen Clone, die nicht das gleiche Muster wie die prädominante Sequenz zeigen, werden als Varianten angesehen und ausgewählt für das Chromosomen-Bestimmtheits- (Spezifizitäts-)Testen.
- 3. Die varianten Clone werden zu Chromosomen hybridisiert bei
nicht mehr als normalen Striktheitsbedingungen und sodann
klassifiziert als chromosomenspezifisch (hybridisiert nur in
ein Chromosom), chromosomenbevorzugt (hybridisiert zumeist in
ein Chromosom, aber einige in andere) oder chromosomen-nicht-spezifisch.
- a) Bei einem Charakterisationsverfahren wird ein "slot blot" Hybridisierungsverfahren verwendet. Individuelle menschliche Chromosome werden durch Strömungscytrometrie sortiert und in gesonderten Schlitzen auf einem Filter angeordnet. Radioaktive DNS aus dem Variantenclon (Probe) wird zum Filter "blot" hybridisiert, reassoziiert, aber nur mit denjenigen Chromosomen, die DNS-Sequenzen mit 70 bis 80% Homologie mit der Probe enthalten. Das überschüssige Probematerial wird weggewaschen und die verbleibende Radioaktivität kann an den Schlitzen derjenigen Chromosome detektiert werden, die Sequenzen enthalten, welche hinreichend homolog sind, um mit der Probe zu hybridisieren. slot blot = Schlitz-Fleck
- b) In einem weiteren Verfahren wird der repetitive DNS-Clon in situ zu Chromosomen hybridisiert. Der repetitive DNS-Clon wird mit Biotin markiert und zu menschlichen Metaphasechromosomen hybridisiert. Die Probe reassoziiert nur an denjenigen Stellen am Chromosom mit komplementären Sequenzen, üblicherweise an oder nahe dem Centromer. Die biotinylierte Probe, die mit den Chromosomen hybridisiert, wird durch Avidin-Moleküle mti einem an diese gebundenen Fluoreszenzfarbstoff detektiert. Die Hybridisierungsplätze können durch ein Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet werden.
- 4. Die chromosomenbevorzugten Clone werden einer weiteren
Analyse ausgesetzt, um festzustellen, ob Sequenzen innerhalb
eines Variantenclons enthalten sind, welche chromosomenmäßige
Spezifizität zeigen. Das Analysenverfahren hängt von der Verfügbarkeit
von Einschränkungs- oder Restriktionsplätzen ab,
und zwar innerhalb des Clons zur Verwendung beim Schneiden
natürlicher Fragmente.
- a) Wenn Restriktionsplätze verfügbar sind, werden die Sequenzen von Regionen zwischen Restriktionsplätzen bestimmt und mit den bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder verglichen und ferner mit der Konsensussequenz der repetitiven DNS-Familie. Eine Konsensus- oder Konsenssequenz wird bestimmt durch Vergleich aller der Basen in jeder Position der Wiederholeinheit für alle die bekannten Glieder der Familie oder Subfamilie und durch Aufzeichnung der am häufigsten vorhandenen Base an jeder Basisposition. Diese Restriktionsfragmente mit weniger als 75% Homologie zu den bekannten Familien und Konsensussequenzen werden aus dem Clon geschnitten, in Plasmide wieder eingesetzt und hybridisiert zu Metaphasechromosomen zur weiteren Auswertung der Spezifizität.
- b) Wenn Restriktionsplätze in unzureichendem Ausmaße verfügbar sind, so muß die gesamte Clonsequenz mit bekannten Familien und Konsensussequenzen verglichen werden. Eine kurze Region, beispielsweise 20 bis 50 Nucleotide, mit der geringsten Homologie wird sodann ausgewählt und die Sequenz wird unter Verwendung eines DNS-Synthetisierers synthetisiert zur Erzeugung der spezifischen Sequenz. Die synthetische DNS wird mit einer biotinylierten Base verbunden und zu Metaphasenchromosomen hybridisiert, um die chromosomale oder Chromosomenspezifizität auszuwerten. Unter Verwendung eines konventionellen Synthetisiermittels können Variationen bekannter Sequenzen oder Teile bekannter Sequenzen, für die kein natürliches DNS verfügbar ist, leicht synthetisiert und auf Chromosomenspezifizität getestet werden.
Zwei repetitive DNS-Clone, die chromosomenspezifisch sind,
wurden direkt aus der Bücherei identifiziert. pHuR 98 hybridisierte
spezifisch zur Chromosomenposition 9qh. Die pHuR 98
Wiederholsequenz besteht aus der 10 Nucleotidsequenz
CCAACCCGAGT, gefolgt von divergierten 5 Nucleotid GGAAT Wiederholungen.
Die vollständigen Wiederholabstände, die in diesem
Clon vorhanden sind, sind 54 und 45 Nucleotide in der Länge,
getrennt durch eine abgetrennte oder gekürzte Wiederholung
von 29 Nucleotiden. Die gesamte Sequenz von pHuR 98 ist in
Tabelle A angegeben.
Ein zweiter Rekombinations DNS Clon, pHuR 195, zeigte spezifische
Hybridisierung zur Chromosomposition 16qh nach in situ
Hybridisierung zu normalen menschlichen Metaphasenchromosomen.
pHuR 195 ist eine Variante des menschlichen DNS-Satelliten 2
und besitzt eine "Kern"-Sequenz einer konservierten Sechs-Nucleotid
CATCAT, gefolgt von vier divergenten GGAAT-Sequenzen.
Die Kern- oder Core-Sequenzen sind durch verschiedene Längen
von höher divergierten DNS-Sequenzen mit Abstand angeordnet,
und zwar variierend von 0 bis 49 Nucleotiden. Die Gesamtsequenz
von pHuR 195 ist in Tabelle B angegeben.
Die Fähigkeit von pHuR 98 und pHuR 195 zur Hybridisierung in
spezifische Chromosome zeigte, das Chromosome Tandemanordnungen
von varianten Sequenzen enthalten, die in einzigartiger
Weise das spezifische Chromosom identifizieren könnten. Eine
weitere chromosomenspezifische repetitive DNS-Sequenz wurde sodann
identifiziert und unter Verwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens synthetisiert. Alpha-Satellit DNS-Clone wurden zum
Gebrauch als Ausgangsmaterial ausgewählt, und zwar mit Alphoidclonen,
isoliert von der Plasmid-menschlichen Wiederhol-Bücherei.
Ein ersten Clon, pHuR 22, wurde sodann ausgewählt,
weil es keine Kreuzhybridisierung mit der prädominanten Dimer-Tetramer-Form
von Alphoid DNS bildete. Wenn hybridisiert
bei 70% Homologie Abtrennen zu einem Schlitzflecken (slot
blot) menschlicher Chromosomen sortiert durch Strömungscytometrie,
30 bis 35% der radiomarkierten Probe wurde mit dem
Chromosom 17 Schlitz gebunden. Ungefähr 2 bis 5% der Probe
verbanden sich ebenfalls mit jedem der mehreren anderen Chromosome,
aber die Clonsequenz wurde als ein chromosomenbevorzugtes
Verhalten identifiziert.
Biotinyliertes pHuR 22 wurde sodann zu Metaphasenchromosomen
hybridisiert. Unter normalen Striktheitsbedingungen (50%
Formamid bei 37°C) gab es eine bevorzugte Stelle oder Lage
der Probe zu der centromeren Region von Chromosom 17, aber
kleinere oder mindere Plätze der Kreuzhybridisierung konnten
an den Centromeren der Chromosome 1. 9. 20. und X in vielen
der Metaphasen detektiert werden. Diese kleineren Plätze wurden
auch in den Interphasennuclei detektiert. Geringfügige
Änderungen der Probenkonzentration oder der Striktheitsbedingungen
erhöhten die Größe der Quer- oder Kreuzhybridisierung;
beispielsweise hybridisierte pHuR 22 mit im wesentlichen allen
Centromeren nach Hybridisierung unter niedrigen Striktheitsbedingungen
(30% Formamid bei 37°C).
Die prädominante Form von Alphoid DNS an Chromosom 17 ist eine
2,7 kb höhere Ordnung Wiederholeinheit, bestehend aus 16 Monomeren
von jeweils annähernd 170 bp. Wenn Clon pHuR 22 aus dem
Plasmidvektor durch PstI Digestion vor dem Sequenzieren entfernt
wurde, erzeugten zwei interne PstI-Plätze Fragmente von
2,7, 1,5 und 0,2 kb Längen. Der 2,7-kb-Einsatz war eine ganze
Wiederholung höherer Ordnung. Das 1,5-kb-Fragment war die
letzte Hälfte der Wiederholeinheit und das 0,2-kb-Fragment war
vorherrschend Monomer 1, d. h. pHuR 22-1.
Die in situ-Hybridisierung der Proben, aufgebaut aus diesen
Fragmenten zeigte, daß das 2,6-kb-Fragment wie pHuR 22 hybridisierte,
das 1,5-kb-Fragment war nicht spezifisch, während
das 0,2-kb-Fragment, pHuR 22-1, spezifisch zu Chromosom 17 hybridisierte,
und zwar unter mäßigen Striktheitsbedingungen
(40% Formamid bei 37°C). Die einzelnen Monomeren des ausgewählten
Alphoid DNS haben nur 65 bis 94% Homologie. Monomer 1
ist eines der divergierteren dieser Monomere. Es zeigt auch
eine niedrige Homologie, verglichen mit den Monomeren anderer
bekannter Alphoid DNS′s und ist weniger als 65% homolog mit
der Konsensus-Alphoid-Sequenz. Somit bestätigte die spezifische
Hybridisierung von Monomer 1 zu Chromosom 17 den vorläufigen
Selektions- oder Auswahlprozeß.
Es wurde sodann festgestellt, daß mindestens eine Region der
Monomer 1 Sequenz hinreichend einzigartig war, daß sie mit
anderen Alphas nicht kreuz- oder querhybridisieren würde. Die
Region von bp 141 bis 151 von pHuR 22-1 enthält ein Cluster
oder eine Zusammenballung von Basen, die von sowohl menschlichem
Alpha I und II Konsensussequenzen differieren. Ein 42-bp-Oligomer,
welches diese Region enthält, wurde synthetisiert,
und zwar Nucleotide 111-152 von pHuR 22-1 überspannend. Das
Oligonucleotid wurde biotinyliert durch terminale Transferase,
Verbindung mit bio-dCTP und hybridisiert in menschliche Metaphasechromosome
mit 30% Formamid bei 37°C, einem normalen
Striktheitsniveau. Die Probe verband sich spezifisch mit Chromosom
17. Die gesamte Sequenz von pHuR 22-1 mit der Chromosom
17 spezifischen Probe (unterstrichen) ist in der Tabelle C
dargestellt.
Die Synthese der chromosomenspezifischen Oligomere ist nicht
auf Sequenzen von divergierten Regionen nativer DNS-Proben
beschränkt. Eine Nucleotidsequenz kann aus veröffentlichten
Konsensussequenzen von Wiederholfamilien ausgewählt sein. Ein
Oligomer wird mit einer Wiederholsequenz aus einer hochdivergenten
Region der veröffentlichten Sequenz synthetisiert. Die
Chromosomenpreferenz des synthetisierten Oligomer wird sodann,
wie oben beschrieben, bestimmt. Die Chromosomenspezifizität kann
ferner durch Bestimmung von Regionen verbessert werden, und
zwar innerhalb der ausgewählten Sequenz mit einer niedrigen
Homologie mit anderen Regionen der ausgewählten Sequenz.
Chromosomenspezifische repetitive DNS-Markierungen sehen ein
leistungsfähiges Werkzeug für die Identifizierung von menschlichen
Chromosomen vor, aber die Spezifizität der repetitiven
DNS-Proben hängt von dem Ausmaß der Homologie der Probensequenz
ab mit den Komplexsequenzen der verschiedenen DNS-Subfamilien,
die in menschlichen Chromosomen vorhanden sind. Die
Anreicherung einer bestimmten Subfamilie an einem individuellen
Chromosom kann für sich allein keine Chromosomenspezifizität
bewirken. Das Vorhandensein der gleichen oder eng verwandter
Subfamilien an anderen Chromosomen kann zur Kreuzhybridisierung
unter normalen Striktheitsbedingungen führen und die
Brauchbarkeit der Probe verdünnen, insbesondere für die Hybridisierung
zu Interphasennuclei. Proben, die gemäß der Erfindung
identifiziert sind, enthalten nur den Teil der Tandemwiederholung,
der für das identifizierte Chromosom einzigartig
ist. Die Sequenzanalyse kann dazu verwendet werden, um zu bestimmen,
welche Segmente der Wiederholfrequenz am divergentesten
sind und die Probe kann durch Restriktion oder Synthese
gekürzt werden zur spezifischeren Hybridisierung zum Target-
oder Zielchromosom unter Verwendung normaler Striktheitsbedingungen.
Die oben genannten Beispiele veranschaulichen, daß chromosomenspezifische
Proben unter Verwendung des oben genannten
Identifikationsverfahrens formuliert werden können. Obwohl
chromosomenspezifische Sequenzen nicht für jedes Chromosom identifiziert
wurden, so ist das oben genannte Verfahren von Natur
aus in der Lage, die Identifikationen auszuführen. Die Erfindung
umfaßt somit die Oligomere, identifiziert durch das obige
Verfahren, aus denen chromosomenspezifische Proben synthetisiert
werden können.
Die Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsbeispiele
beschränkt.
Zusammenfassend sieht die Erfindung folgendes vor:
Es ist ein Verfahren vorgesehen zur Bestimmung spezifischer
Nucleotidsequenzen, die brauchbar sind bei der Bildung einer
Probe, die verwendet werden kann zur Identifikation spezifischer
Chromosome, vorzugsweise durch in situ Hybridisierung
mit der Zelle selbst. Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden
chromosomenbevorzugte Nucleotidsequenzen zuerst aus einer
Bücherei aus Rekombinations DNS-Clonen bestimmt mit Familien
repetitiver Sequenzen. Bücherei-Clonen werden identifiziert
mit einer niedrigen Homologie mit einer Sequenz von repetitiven
DNS-Familien, zu denen die ersten Clone jeweils gehören
und Variantensequenzen werden sodann durch Auswahl der Clone
identifiziert mit einem Muster der Hybridisierung mit genomischem
DNS unähnlich dem Hybridisiermuster, welches durch die
entsprechenden Familien gezeigt wird. Bei dem anderen Ausführungsbeispiel
werden die Variantensequenzen aus einer Sequenz
einer bekannten repetitiven DNS-Familie ausgewählt. Die ausgewählte
Variantensequenz wird als chromosomspezifisch, chromosombevorzugt
oder chromosom-nicht-spezifisch klassifiziert.
Sequenzen, die als chromosomenbevorzugt klassifiziert sind,
werden weiter sequenziert und Regionen werden identifiziert,
die eine niedrige Homologie mit anderen Regionen der chromosombevorzugten
Sequenz besitzen oder mit bekannten Sequenzen
anderer Familienmitglieder und Konsensussequenzen der repetitiven
DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Sequenzen.
Die ausgewählten eine niedrige Homologie besitzenden Regionen
werden sodann hybridisiert mit Chromosomen zur Bestimmung derjenigen
niedrigen Homologieregionen, hybridisiert mit einem
spezifischen Chromosom unter normalen Striktheitsbedingungen.
Gemäß der Erfindung werden Oligomere vorgesehen, die bei der
Bildung einer Probe brauchbar sind für die spezifische Chromosomidentifikation
unter normalen Striktheitsbedingungen.
Claims (13)
1. Verfahren zur Auswahl chromosomenspezifischer repetitiver
DNS-Sequenzen aus einer Bücherei von Rekombinations DNS-Clonen
mit Familien repetitiver Sequenzen, wobei die folgenden
Schritte vorgesehen sind:
Auswahl erster Clone aus der Bücherei mit einer niedrigen Homologie mit der Sequenz repetitiver DNS-Familien, zu denen die ersten Clone in entsprechender Weise gehören;
Hybridisierung der ausgewählten ersten Clone zu totalem genomischen DNA;
Auswahl varianter Clone mit einem Muster für die erwähnte Hybridisierung unähnlich einem prädominanten Hybridisationsmuster, gezeigt durch die entsprechenden Familien;
Klassifikation der varianten Clone als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch;
Feststellung der Regionen der Chromosomen bevorzugten Clone mit einer Sequenz mit niedriger Homologie relativ zu den bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder und Konsenssequenzen der repetitiven DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Clone; und
Hybridisieren der eine niedrige Homologie besitzenden Regionen mit Chromosomen zur Auswahl einer Nucleotidsequenz effektiv zum in-situ-Vorsehen von Chromosomenspezifizität bei normalem Striktheitsniveau.
Auswahl erster Clone aus der Bücherei mit einer niedrigen Homologie mit der Sequenz repetitiver DNS-Familien, zu denen die ersten Clone in entsprechender Weise gehören;
Hybridisierung der ausgewählten ersten Clone zu totalem genomischen DNA;
Auswahl varianter Clone mit einem Muster für die erwähnte Hybridisierung unähnlich einem prädominanten Hybridisationsmuster, gezeigt durch die entsprechenden Familien;
Klassifikation der varianten Clone als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch;
Feststellung der Regionen der Chromosomen bevorzugten Clone mit einer Sequenz mit niedriger Homologie relativ zu den bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder und Konsenssequenzen der repetitiven DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Clone; und
Hybridisieren der eine niedrige Homologie besitzenden Regionen mit Chromosomen zur Auswahl einer Nucleotidsequenz effektiv zum in-situ-Vorsehen von Chromosomenspezifizität bei normalem Striktheitsniveau.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Klassifikation
der varianten Clone den Schlitz der "blot"
Hybridisierung umfaßt zur Detektion des Vorhandenseins
jeder der Variantenclone hybridisiert zu spezifischen
Chromosomen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Klassifikation
der Variantenclone die in-situ-Hybridisierung jedes
des Variantenclones in menschliche Chromosome umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Bestimmung
der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Bestimmung
der Sequenz von Regionen zwischen Restriktionsenzymplätzen
auf den chromosomenbevorzugten Clonen umfaßt
für den Vergleich mit den Familienglied bekannten Sequenzen
und der erwähnten Konsensussequenz der Familie.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Bestimmung
der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Auswahl
einer Basispaarregion umfaßt mit einer relativ kleinen
Anzahl von Basen und mit einer geringsten Homologie
mit den bekannten Familien- und Konsensussequenzen.
6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt der Bestimmung
der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Bestimmung
der Sequenz von Regionen zwischen Restriktionsenzymplätzen
auf den chromosomenbevorzugten Clonen umfaßt
für den Vergleich mit den Familienglied bekannten Sequenzen
und der erwähnten Konsensussequenz der Familie.
7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt der Bestimmung
der Regionen niedriger Homologie den Schritt der
Auswahl einer Basispaarregion umfaßt mit einer relativ
kleinen Anzahl von Basen und mit einer Mindesthomologie
mit den bekannten Familien- und Konsensussequenzen.
8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Bestimmung
der Regionen niedriger Homologie den Schritt der
Bestimmung der Sequenz der Regionen umfaßt, und zwar zwischen
den Einschränkungs- oder Restriktionsenzymplätzen
auf den Chromosomenpreferenzclonen für Vergleich mit den
Familienglied bekannten Sequenzen und der Konsensussequenz
der Familie.
9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Bestimmung
der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Auswahl
einer Basispaarregion umfaßt mit einer relativ kleinen
Anzahl von Basen und mit der Mindesthomologie mit den
bekannten Familien- und Konsensussequenzen.
10. Verfahren zur Bestimmung einer repetitiven Nucleotidsequenz
effektiv zur Identifikation eines bestimmten Chromosoms
unter normalen Bedingungen der Striktheit für die
Hybridisierung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen
sind:
Auswahl einer ersten repetitiven Nucleotidsequenz aus einer Variantensequenz innerhalb einer Sequenz einer bekannten repetitiven DNS-Familie;
Klassifikation der ersten repetitiven Nucleotidsequenz als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch; und
Bestimmung von Zonen einer klassifizierten Chromosomenpreferenzsequenz mit einer niedrigen Homologie mit anderen Regionen der erwähnten Chromosomenpreferenzsequenz, während Effektivität vorliegt zur Hybridisierung mit einem spezifischen Chromosom unter den normalen Striktheitsbedingungen.
Auswahl einer ersten repetitiven Nucleotidsequenz aus einer Variantensequenz innerhalb einer Sequenz einer bekannten repetitiven DNS-Familie;
Klassifikation der ersten repetitiven Nucleotidsequenz als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch; und
Bestimmung von Zonen einer klassifizierten Chromosomenpreferenzsequenz mit einer niedrigen Homologie mit anderen Regionen der erwähnten Chromosomenpreferenzsequenz, während Effektivität vorliegt zur Hybridisierung mit einem spezifischen Chromosom unter den normalen Striktheitsbedingungen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet
durch den Schritt der Synthetisierung eines Oligomers,
welches die bestimmte niedrig-homologe Sequenz enthält.
12. Oligomer effektiv zur Bildung einer Probe, die mit einem
bestimmten Chromosom hybridisiert, wobei eine Nucleotidsequenz
bestimmt gemäß Anspruch 1 vorgesehen ist.
13. Ein Oligomer effektiv zur Bildung einer Probe, die mit
einem bestimmten Chromosom hybridisiert, und zwar unter
einer normalen Striktheitsbedingung und wobei eine Nucleotidsequenz
bestimmt gemäß Anspruch 10 vorgesehen ist.
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