DE3904270A1 - Verfahren zur markierung bestimmter chromosomen unter verwendung repetetiver rekombinations dns - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Chromosomenidentifikation und insbesondere auf die Identifikation repetitiver DNS-Sequenzen, die zur spezifischen Chromosomen hydridisieren.

Es ist bekannt, daß lebende Zellen Chromosomen aufweisen, deren Strukturen DNS genetische Einheiten enthalten. Spezifische Sätze von Chromosomen bestimmen die Eigenschaften des Lebens, welches mit den DNS genetischen Einheiten assoziiert ist. So enthalten menschliche Zellen 24 unterschiedliche Chromosomenarten (22 Autosome, X und Y) und die Zahl und Anordnung der Chromosomen innerhalb der Zelle bilden eine Anzeige für die verschiedenen normalen und anormalen Entwicklungen. Beispielsweise enthalten normale Zellen ein Paar jeden Autosomentyps und das Vorhandensein von drei eines Chromosomentyps (Trisomie) kann einen anormalen Zustand oder eine anormale Bedingung andeuten. Die Trisomie 9 (d. h., drei Nummer 9 Chromosomen) zeigt ein Syndrom an, welches innerhalb weniger Tage nach der Geburt zum Tode führt. Die Trisomie 16 ist in einem Drittel aller spontanen Abgänge vorhanden, die Chromosomentrisomien enthalten. Die Trisomie 21 ist für das Down′sche Syndrom indikativ.

Repetitive DNS-Clone wurden beschrieben, welche zu Gruppen menschlicher Chromosomen hybridisieren, oftmals mit einem prominenten Hybridisationsplatz an nur einem der zwei Autosome. Vergl. dazu beispielsweise A. R. Mitchell und andere, "Molecular hybridization to meiotic chromosomes in man reveals sequence arrangement on the No. 9 chromosome und provides clues to the nature of 'parameres'." Cytogenet. Cell Genet. 41: 89-95 (1986), wo eine Probe Xbl gelehrt wird, welche bevorzugt aber nicht ausschließlich mit Chromosomen 9 hybridisiert.

Es wurde vorgeschlagen, daß jedes menschliche Chromosom gekennzeichnet werden kann durch einen oder mehrere distinkte Untersätze aus alpha-Satellit DNS. Vergl. dazu beispielsweise P. Devilee und andere, "Two Subsets of Human Alphoid Repetitive DNA Show Distinct Preferential Localization in the Pericentric Regions of Chromosomes 13, 18 and 21." Cytogenet. Cell Genet. 41, 193-201 (1986); A. Lund Jorgensen und andere, "Chromosome-Specific Subfamilies within Human Alphoid Repetitive DNA," J. Mol Biol. 187, 185-196 (1986). In der Tat wird die Anreicherung einer oder einiger weniger distinktiver Subfamilien an individuellen Chromosomen berichtet. Es wird jedoch kein Verfahren gelehrt, um systematisch Nucleotidsequenzen zu bestimmen, welche chromosomenspezifische Proben bilden. Ferner werden keine Proben gelehrt, die unter normalen Striktheitserfordernissen chromosomenspezifisch sind für eine positive Chromosomenidentifikation nach in situ-Hybridisierung der Probe mit Chromosomen innerhalb einer Zelle.

Die Chromosomenspezifität von chromosomenpreferentiellen oder bevorzugten DNS-Proben identifiziert im Stand der Technik kann verbessert werden durch Erhöhung der Striktheit der Vorschriften oder denen die Hybridisierung versucht wird. Die Hybridisierung unter Bedingungen hoher Striktheit kann jedoch den Erhalt nicht reproduzierbarer Ergebnisse zur Folge haben. Wenn nur bestimmte oder spezifische Chromosomen markiert werden können, kann nicht jedes solche Chromosom markiert werden, was ganz klar eine nicht annehmbare Bedingung ist für eine routinemäßige klinische Anwendung. Ferner reduzieren hohe Striktheitsniveaus häufig die Größe und/oder Identität des Hybridisationsplatzes, was erhöhte Verstärkung des Fluoreszenzsignals erfordert oder eine längere Zeit an autoradiographischer Aussetzung oder Belichtung. Diese Bedingungen erhöhen die nicht-spezifischen Hintergrundfehler bei den Messungen. Proben, die nach der Hybridisierung chromosomenspezifisch bei normaler Striktheit sind, und ein einziger Verstärkungsschritt oder eine kurze Aussetzung wären für die meisten Anwendungsfälle brauchbar, insbesondere für die Identifikation und Quantifizierung von Chromosomen in Interphasennuclei.

Die Fähigkeit spezifische menschliche autosomale Chromosomen in Interphasennuclei zu markieren, würde Untersuchungen der drei-dimensionalen Struktur des Nucleus gestatten und eine Möglichkeit für die Chromosomenanalyse vorsehen, wo die Isolation von Metaphasenchromosomen unbequem, schwierig oder unmöglich ist. Jede Kreuzhybridisierung zwischen einer chromosomen "spezifischen" Probensequenz und anderen Chromosomen verdünnt die Brauchbarkeit der Probe insbesondere für Hybridisierung zu Zwischen- oder Interphasennuclei. Die Erfindung sieht ein Verfahren zur Identifizierung repetitiver Nucleotidsequenzen vor, die in situ hybridisieren, und zwar zu spezifischen Chromosomen unter normalen Striktheitsbedingungen, um solche Untersuchungen und Analysen zuverlässig ausführen zu können.

Es ist demgemäß ein Ziel der vorliegenden Erfindung, repetitive oder sich wiederholende Nucleotidsequenzen zu identifizieren, die unter Bedingungen normaler Striktheit chromosomenspezifisch sind. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, die in situ Identifikation von Chromosomen in intakten Zell-Nuclei zu ermöglichen. Weiterhin bezweckt die Erfindung ein Verfahren anzugeben zur Bestimmung von Probensequenzen, welche nur den Teil einer Wiederholungseinheit enthalten, der angereichert ist mit oder einzigartig ist für das identifizierte Chromosom. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, chromosomenspezifische Nucleotidsequenzen zu identifizieren, die eine Länge besitzen, die synthetisiert werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung. Um die genannten sowie weiteren Ziele zu erreichen wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer repetitiven Nucleotidsequenz vorgesehen, und zwar effektiv zur Identifikation eines bestimmten oder spezifischen Chromosoms unter normalen Bedingungen der Striktheit für Hybridisierung. Eine erste repetitive Nucleotidsequenz wird aus einer Variantsequenz ausgewählt, und zwar mit einer Sequenz einer bekannten repetitiven DNS-Familie. Die erste repetitive Nucleotidsequenz wird sodann hybridisiert, um die Sequenz als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt (chromosomenpreferenziell) oder chromosomen-nicht-spezifisch zu klassifizieren. Die klassifizierten Chromosomenvorzugssequenzen werden sodann zur Bestimmung von Regionen untersucht, die eine niedrige Homologie mit anderen Regionen der Chromosomenpreferenz oder Vorzugssequenz besitzen, wobei die Regionen niedriger Homologie effektiv sind, um mit einem spezifischen Chromosom unter normalen Striktheitsbedingungen zu hybridisieren.

Gemäß einer weiteren Kennzeichnung der Erfindung wird ein Verfahren vorgesehen zur Selektion von chromosomenspezifischen repetitiven DNS-Sequenzen aus einer Bücherei von Rekombinanten DNS-Clonen mit Familien aus repetitiven Sequenzen. Als erstes werden die Clone aus der Bücherei ausgewählt, und zwar mit einer niedrigen Homologie mit der Sequenz der repetitiven DNS-Familien, zu denen die ersten Clone jeweils gehören. Die ausgewählten ersten Clone werden zu totalem oder gesamtgenomischem DNA oder DNS hybridisiert und Variantclone werden ausgewählt, die ein Hybridisierungsmuster besitzen, welches zu einem prädominanten Hybridisierungsmuster, gezeigt durch die entsprechenden Familien unähnlich ist. Die varianten Clone werden sodann mit Chromosomen hybridisiert und als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch klassifiziert. Die chromosomenbevorzugten Clone werden weiterhin einer Sequenzbehandlung unterworfen, um Regionen zu bestimmen, die eine Sequenz mit niedriger Homologie besitzen, und zwar relativ zu bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder und Konsensussequenzen der repetitiven DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Clone. Diese Zonen niedriger Homologie werden weiter hybridisiert, um chromosomenspezifische Sequenzen zu bestimmen, die effektiv sind, um in situ Chromosomenspezifität bei einem normalen Striktheitsniveau vorzusehen.

Gemäß einer weiteren Kennzeichnung der vorliegenden Erfindung werden Oligomere vorgesehen, die eine Nucleotidsequenz besitzen, die entsprechend den oben genannten Verfahren bestimmt wird. Die Oligomere sind in der Lage, eine Probe vorzusehen, welche mit einem spezifischen Chromosom hybridisiert.

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen erläutert.

Gemäß der Erfindung werden chromosomenspezifische Nucleotidsequenzen bestimmt durch die Identifikation signifikanter örtlicher Sequenzdivergenzen einer repetitiven DNS-Familie. Es wurde festgestellt, daß bestimmte Regionen chromosomenbevorzugter Wiederholeinheiten in erster Linie für die chromosomenspezifische Hybridisierung verantwortlich sind. Wie hier erläutert, können solche variante Sequenzen Proben ergeben, die unter Striktheitsniveau von 80% oder weniger chromosomenspezifisch sind. Eine effektive Probe enthält Tandemanordnungen der ausgewählten Sequenz zur Hybridisierung mit einer Tandemanordnung des spezifischen Chromosoms zum Vorsehen einer lokalisierten Fluoreszenz für die positive Identifikation.

Die repetitive DND ist der Teil der gesamten oder totalen DNS einer Spezies oder Art, dem Genom, repräsentiert durch Sequenzen, die viele Male oftmals in Tandemanordnungen vorhanden sind. Wenn genomische DNS in relativ kurze Fragmente zerschnitten wird und die zwei Stränge der Doppelhelix getrennt werden (denaturiert), so vereinigen sich die Sequenzen repetitiver DNS erneut (sie reassoziieren sich) mit einer schnelleren Geschwindigkeit als Sequenzen, die nur einmal oder einige wenige Male innerhalb der Genome vorhanden sind, weil es vielmehr Möglichkeiten für diese gibt, ihre komplementäre Sequenz zu finden. Diese Charakteristik gestattet die Bildung von Büchereien aus DNS-Fragmenten, die eine große Anzahl von repetitiven Sequenzen enthalten.

Das menschliche Genom enthält mehrere Familien an repetitiven DNS. Obwohl an vielen Plätzen innerhalb des Genoms vorhanden, bilden Mischungen aus repetitiven Sequenzen große Blöcke am Centromer jedes Chromosoms. Repetitive Sequenzen haben die Kapazität für schnelle Evolution; in der Tat können selbst Homologe unterschiedliche repetitive Sequenzen haben, und zwar infolge von Substitution, Insertion oder Weglassung individueller Basen innerhalb der Sequenzen. Somit sollten tandemrepetitive Sequenzen verfügbar sein, um in einzigartiger Weise jedes Chromosom zu identifizieren und spezifisch zu hybridisieren mit einer Probe mit einer hinreichend homologen Tandemanordnung.

Die Familien repetitiver DNS können durch die Anordnung der DNS-Basen innerhalb der Wiederholeinheit identifiziert werden. Beispielsweise sind Alpha-Satelliten DNS-Sequenzen Einheiten mit variablen Anzahlen von Tandemsequenzen von ungefähr 170 Basenpaarenlänge und Satellit 2 DNA-Sequenzen mit Wiederholeinheiten von ungefähr 26 Basenlängen. Die repetitivsten DNS-Familien haben eine prädominate Form. Wenn die gesamte Familie isoliert ist, sind eine große Anzahl der vorhandenen Sequenzen sehr ähnlich (homolog).

Der Rest der Sequenzen bildet Subfamilien. Diese sind Gruppen von Sequenzen, die die gleiche Anordnung wie die prädominante Form haben können, aber Basensubstitutionen, Weglassungen und/oder Insertionen oder Einsetzungen unterworfen waren. Diese Änderungen schaffen Plätze innerhalb der in Beziehung stehenden oder verwandten Sequenzen, an denen komplementäre Stränge keine Basenpaarung mit anderen Sequenzen innerhalb der Familie vornehmen können. Die Anzahl dieser Änderungen bestimmt die Beziehung zwischen irgendwelchen zwei Sequenzen, d. h. homolog (Gleichheit) oder divergent (Unterschied oder Differenz).

Einige Subfamilien sind als Varianten identifiziert, mit hinreichender Divergenz gegenüber der prädominanten Form, die sie nicht mehr reassoziieren oder mit der prädominanten Form hybridisieren können, und zwar unter normalen Striktheitsbedingungen der Temperatur, der Konzentrationen, und der Zeit. Die Fähigkeit verwandter Sequenzen bei einer gegebenen Homologie zu hybridisieren, kann durch die der Reassoziation auferlegten Striktheitsbedingungen gesteuert werden. Je höher die Striktheitsbedingungen sind, um so größer ist die Homologie, die erforderlich ist, um jede Sequenz anzupassen oder zu treffen. Unter normalen Bedingungen müssen mindestens 80% der Basen innerhalb einer Sequenz für die zwei Stränge zur Reassoziation passen. Der hier verwendete Ausdruck niedrige Homologie bedeutet eine Homologie, die kleiner ist als die für die normale Reassoziation erforderliche, d. h. kleiner als ungefähr 80%.

Gemäß der Erfindung werden repetitive Nucleotidsequenzen ausgewählt und mit DNS-Sequenzen der entsprechenden repetitiven DNS-Familien verglichen. Das vorliegende Verfahren sucht DNS-Sequenzen, die eine niedrige Homologie besitzen und eine entsprechend niedrige Wahrscheinlichkeit der Hybridisierung mit ihren Familienmitgliedern, die im allgemeinen in mehreren Chromosomen in dem menschlichen Genom vorhanden sind. Solche Nucleotidsequenzen haben eine relativ hohe Wahrscheinlichkeit der Hybridisierung mit nur spezifischen Chromosomen, wenn sie überhaupt hybridisieren. Je varianter die Sequenz ist, desto spezifischer ist die Chromosomenhybridisierung. Somit können DNS-Proben, die eine oder mehrere Kopien der die niedrige Homologie besitzenden Sequenz aufweisen zur Identifikation spezifischer Chromosome durch in situ-Hybridisierung mit Zellchromosomen verwendet werden.

Eine Bücherei aus menschlichen repetitiven DNS-Sequenzen wurde unter Verwendung konventioneller Verfahren aufgebaut. Gereinigtes menschliches plazentales DNS wurde physikalisch in Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 3000 bis 4000 Basispaaren zerschert. Das DNA war denaturiert und gestattete die Reassoziation unter Bedinungen, die die Reassoziation repetitiver DNS-Sequenzen förderte. Die sich ergebenden Fragmente wurden durch Sl-Nuclease verdaut und verarbeitet zum Erhalt doppelsträngiger repetitiver DNS. Die sich ergebende doppelsträngige repetitive DNS wurde in den PstI Platz von Plasmid pBR322 geclont, und zwar durch G : C-Behandlung mit terminaler Transferase. Die sich ergebenden Plasmide wurden sodann in einem Bakteriensystem zur Bildung eines Clons gewachsen, der viele Plasmide enthielt, wobei jedes die gleiche repetitive DNA- oder DNS-Sequenz enthielt. Die Bücherei-Clone wurden als pHuR (Plasmid Human Repeat) Clone identifiziert und erhielten eine Identifikations-Nummer zugewiesen. Alle diese pHuR Clone, die hier identifiziert sind, sind von der pHuR Bücherei des Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, USA, erhältlich.

In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden rekombinante DNS-Clone aus der Bücherei ausgewählt, und chromosomenspezifische Sequenzen werden durch das folgende Verfahren identifiziert:

• 1. Die repetitiven DNS-Einsätze werden aus dem Plasmid durch PstI Verdauung oder Digestion entfernt und in den M13-Vektor recloniert. In einer ersten Auswahl werden die Clone partiell einer Sequenzbehandlung unterworfen (sequenziert) unter Verwendung bekannter Verfahren zur Bestimmung der repetitiven DNS-Familie, repräsentiert durch ein Clon. Diese Clone, die Sequenzen mit einer niedrigen Homologie (d. h. weniger als ungefähr 80% Homologie) mit der Sequenz des prädominantesten Familiengliedes enthalten, werden für das weitere Studium ausgewählt.
• 2. Die ersten ausgewählten Clone werden sodann hybridisiert zu Gesamtgenom DNS auf "Southern blot gels". Das Muster der Hybridisierung wird mit dem der prädominanten Sequenz der entsprechenden Familie verglichen. Diejenigen Clone, die nicht das gleiche Muster wie die prädominante Sequenz zeigen, werden als Varianten angesehen und ausgewählt für das Chromosomen-Bestimmtheits- (Spezifizitäts-)Testen.
• 3. Die varianten Clone werden zu Chromosomen hybridisiert bei nicht mehr als normalen Striktheitsbedingungen und sodann klassifiziert als chromosomenspezifisch (hybridisiert nur in ein Chromosom), chromosomenbevorzugt (hybridisiert zumeist in ein Chromosom, aber einige in andere) oder chromosomen-nicht-spezifisch.
  • a) Bei einem Charakterisationsverfahren wird ein "slot blot" Hybridisierungsverfahren verwendet. Individuelle menschliche Chromosome werden durch Strömungscytrometrie sortiert und in gesonderten Schlitzen auf einem Filter angeordnet. Radioaktive DNS aus dem Variantenclon (Probe) wird zum Filter "blot" hybridisiert, reassoziiert, aber nur mit denjenigen Chromosomen, die DNS-Sequenzen mit 70 bis 80% Homologie mit der Probe enthalten. Das überschüssige Probematerial wird weggewaschen und die verbleibende Radioaktivität kann an den Schlitzen derjenigen Chromosome detektiert werden, die Sequenzen enthalten, welche hinreichend homolog sind, um mit der Probe zu hybridisieren. slot blot = Schlitz-Fleck
  • b) In einem weiteren Verfahren wird der repetitive DNS-Clon in situ zu Chromosomen hybridisiert. Der repetitive DNS-Clon wird mit Biotin markiert und zu menschlichen Metaphasechromosomen hybridisiert. Die Probe reassoziiert nur an denjenigen Stellen am Chromosom mit komplementären Sequenzen, üblicherweise an oder nahe dem Centromer. Die biotinylierte Probe, die mit den Chromosomen hybridisiert, wird durch Avidin-Moleküle mti einem an diese gebundenen Fluoreszenzfarbstoff detektiert. Die Hybridisierungsplätze können durch ein Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet werden.
• 4. Die chromosomenbevorzugten Clone werden einer weiteren Analyse ausgesetzt, um festzustellen, ob Sequenzen innerhalb eines Variantenclons enthalten sind, welche chromosomenmäßige Spezifizität zeigen. Das Analysenverfahren hängt von der Verfügbarkeit von Einschränkungs- oder Restriktionsplätzen ab, und zwar innerhalb des Clons zur Verwendung beim Schneiden natürlicher Fragmente.
  • a) Wenn Restriktionsplätze verfügbar sind, werden die Sequenzen von Regionen zwischen Restriktionsplätzen bestimmt und mit den bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder verglichen und ferner mit der Konsensussequenz der repetitiven DNS-Familie. Eine Konsensus- oder Konsenssequenz wird bestimmt durch Vergleich aller der Basen in jeder Position der Wiederholeinheit für alle die bekannten Glieder der Familie oder Subfamilie und durch Aufzeichnung der am häufigsten vorhandenen Base an jeder Basisposition. Diese Restriktionsfragmente mit weniger als 75% Homologie zu den bekannten Familien und Konsensussequenzen werden aus dem Clon geschnitten, in Plasmide wieder eingesetzt und hybridisiert zu Metaphasechromosomen zur weiteren Auswertung der Spezifizität.
  • b) Wenn Restriktionsplätze in unzureichendem Ausmaße verfügbar sind, so muß die gesamte Clonsequenz mit bekannten Familien und Konsensussequenzen verglichen werden. Eine kurze Region, beispielsweise 20 bis 50 Nucleotide, mit der geringsten Homologie wird sodann ausgewählt und die Sequenz wird unter Verwendung eines DNS-Synthetisierers synthetisiert zur Erzeugung der spezifischen Sequenz. Die synthetische DNS wird mit einer biotinylierten Base verbunden und zu Metaphasenchromosomen hybridisiert, um die chromosomale oder Chromosomenspezifizität auszuwerten. Unter Verwendung eines konventionellen Synthetisiermittels können Variationen bekannter Sequenzen oder Teile bekannter Sequenzen, für die kein natürliches DNS verfügbar ist, leicht synthetisiert und auf Chromosomenspezifizität getestet werden.

Zwei repetitive DNS-Clone, die chromosomenspezifisch sind, wurden direkt aus der Bücherei identifiziert. pHuR 98 hybridisierte spezifisch zur Chromosomenposition 9qh. Die pHuR 98 Wiederholsequenz besteht aus der 10 Nucleotidsequenz CCAACCCGAGT, gefolgt von divergierten 5 Nucleotid GGAAT Wiederholungen. Die vollständigen Wiederholabstände, die in diesem Clon vorhanden sind, sind 54 und 45 Nucleotide in der Länge, getrennt durch eine abgetrennte oder gekürzte Wiederholung von 29 Nucleotiden. Die gesamte Sequenz von pHuR 98 ist in Tabelle A angegeben.

Ein zweiter Rekombinations DNS Clon, pHuR 195, zeigte spezifische Hybridisierung zur Chromosomposition 16qh nach in situ Hybridisierung zu normalen menschlichen Metaphasenchromosomen. pHuR 195 ist eine Variante des menschlichen DNS-Satelliten 2 und besitzt eine "Kern"-Sequenz einer konservierten Sechs-Nucleotid CATCAT, gefolgt von vier divergenten GGAAT-Sequenzen. Die Kern- oder Core-Sequenzen sind durch verschiedene Längen von höher divergierten DNS-Sequenzen mit Abstand angeordnet, und zwar variierend von 0 bis 49 Nucleotiden. Die Gesamtsequenz von pHuR 195 ist in Tabelle B angegeben.

Die Fähigkeit von pHuR 98 und pHuR 195 zur Hybridisierung in spezifische Chromosome zeigte, das Chromosome Tandemanordnungen von varianten Sequenzen enthalten, die in einzigartiger Weise das spezifische Chromosom identifizieren könnten. Eine weitere chromosomenspezifische repetitive DNS-Sequenz wurde sodann identifiziert und unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens synthetisiert. Alpha-Satellit DNS-Clone wurden zum Gebrauch als Ausgangsmaterial ausgewählt, und zwar mit Alphoidclonen, isoliert von der Plasmid-menschlichen Wiederhol-Bücherei. Ein ersten Clon, pHuR 22, wurde sodann ausgewählt, weil es keine Kreuzhybridisierung mit der prädominanten Dimer-Tetramer-Form von Alphoid DNS bildete. Wenn hybridisiert bei 70% Homologie Abtrennen zu einem Schlitzflecken (slot blot) menschlicher Chromosomen sortiert durch Strömungscytometrie, 30 bis 35% der radiomarkierten Probe wurde mit dem Chromosom 17 Schlitz gebunden. Ungefähr 2 bis 5% der Probe verbanden sich ebenfalls mit jedem der mehreren anderen Chromosome, aber die Clonsequenz wurde als ein chromosomenbevorzugtes Verhalten identifiziert.

Biotinyliertes pHuR 22 wurde sodann zu Metaphasenchromosomen hybridisiert. Unter normalen Striktheitsbedingungen (50% Formamid bei 37°C) gab es eine bevorzugte Stelle oder Lage der Probe zu der centromeren Region von Chromosom 17, aber kleinere oder mindere Plätze der Kreuzhybridisierung konnten an den Centromeren der Chromosome 1. 9. 20. und X in vielen der Metaphasen detektiert werden. Diese kleineren Plätze wurden auch in den Interphasennuclei detektiert. Geringfügige Änderungen der Probenkonzentration oder der Striktheitsbedingungen erhöhten die Größe der Quer- oder Kreuzhybridisierung; beispielsweise hybridisierte pHuR 22 mit im wesentlichen allen Centromeren nach Hybridisierung unter niedrigen Striktheitsbedingungen (30% Formamid bei 37°C).

Die prädominante Form von Alphoid DNS an Chromosom 17 ist eine 2,7 kb höhere Ordnung Wiederholeinheit, bestehend aus 16 Monomeren von jeweils annähernd 170 bp. Wenn Clon pHuR 22 aus dem Plasmidvektor durch PstI Digestion vor dem Sequenzieren entfernt wurde, erzeugten zwei interne PstI-Plätze Fragmente von 2,7, 1,5 und 0,2 kb Längen. Der 2,7-kb-Einsatz war eine ganze Wiederholung höherer Ordnung. Das 1,5-kb-Fragment war die letzte Hälfte der Wiederholeinheit und das 0,2-kb-Fragment war vorherrschend Monomer 1, d. h. pHuR 22-1.

Die in situ-Hybridisierung der Proben, aufgebaut aus diesen Fragmenten zeigte, daß das 2,6-kb-Fragment wie pHuR 22 hybridisierte, das 1,5-kb-Fragment war nicht spezifisch, während das 0,2-kb-Fragment, pHuR 22-1, spezifisch zu Chromosom 17 hybridisierte, und zwar unter mäßigen Striktheitsbedingungen (40% Formamid bei 37°C). Die einzelnen Monomeren des ausgewählten Alphoid DNS haben nur 65 bis 94% Homologie. Monomer 1 ist eines der divergierteren dieser Monomere. Es zeigt auch eine niedrige Homologie, verglichen mit den Monomeren anderer bekannter Alphoid DNS′s und ist weniger als 65% homolog mit der Konsensus-Alphoid-Sequenz. Somit bestätigte die spezifische Hybridisierung von Monomer 1 zu Chromosom 17 den vorläufigen Selektions- oder Auswahlprozeß.

Es wurde sodann festgestellt, daß mindestens eine Region der Monomer 1 Sequenz hinreichend einzigartig war, daß sie mit anderen Alphas nicht kreuz- oder querhybridisieren würde. Die Region von bp 141 bis 151 von pHuR 22-1 enthält ein Cluster oder eine Zusammenballung von Basen, die von sowohl menschlichem Alpha I und II Konsensussequenzen differieren. Ein 42-bp-Oligomer, welches diese Region enthält, wurde synthetisiert, und zwar Nucleotide 111-152 von pHuR 22-1 überspannend. Das Oligonucleotid wurde biotinyliert durch terminale Transferase, Verbindung mit bio-dCTP und hybridisiert in menschliche Metaphasechromosome mit 30% Formamid bei 37°C, einem normalen Striktheitsniveau. Die Probe verband sich spezifisch mit Chromosom 17. Die gesamte Sequenz von pHuR 22-1 mit der Chromosom 17 spezifischen Probe (unterstrichen) ist in der Tabelle C dargestellt.

Die Synthese der chromosomenspezifischen Oligomere ist nicht auf Sequenzen von divergierten Regionen nativer DNS-Proben beschränkt. Eine Nucleotidsequenz kann aus veröffentlichten Konsensussequenzen von Wiederholfamilien ausgewählt sein. Ein Oligomer wird mit einer Wiederholsequenz aus einer hochdivergenten Region der veröffentlichten Sequenz synthetisiert. Die Chromosomenpreferenz des synthetisierten Oligomer wird sodann, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Chromosomenspezifizität kann ferner durch Bestimmung von Regionen verbessert werden, und zwar innerhalb der ausgewählten Sequenz mit einer niedrigen Homologie mit anderen Regionen der ausgewählten Sequenz.

Chromosomenspezifische repetitive DNS-Markierungen sehen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Identifizierung von menschlichen Chromosomen vor, aber die Spezifizität der repetitiven DNS-Proben hängt von dem Ausmaß der Homologie der Probensequenz ab mit den Komplexsequenzen der verschiedenen DNS-Subfamilien, die in menschlichen Chromosomen vorhanden sind. Die Anreicherung einer bestimmten Subfamilie an einem individuellen Chromosom kann für sich allein keine Chromosomenspezifizität bewirken. Das Vorhandensein der gleichen oder eng verwandter Subfamilien an anderen Chromosomen kann zur Kreuzhybridisierung unter normalen Striktheitsbedingungen führen und die Brauchbarkeit der Probe verdünnen, insbesondere für die Hybridisierung zu Interphasennuclei. Proben, die gemäß der Erfindung identifiziert sind, enthalten nur den Teil der Tandemwiederholung, der für das identifizierte Chromosom einzigartig ist. Die Sequenzanalyse kann dazu verwendet werden, um zu bestimmen, welche Segmente der Wiederholfrequenz am divergentesten sind und die Probe kann durch Restriktion oder Synthese gekürzt werden zur spezifischeren Hybridisierung zum Target- oder Zielchromosom unter Verwendung normaler Striktheitsbedingungen.

Die oben genannten Beispiele veranschaulichen, daß chromosomenspezifische Proben unter Verwendung des oben genannten Identifikationsverfahrens formuliert werden können. Obwohl chromosomenspezifische Sequenzen nicht für jedes Chromosom identifiziert wurden, so ist das oben genannte Verfahren von Natur aus in der Lage, die Identifikationen auszuführen. Die Erfindung umfaßt somit die Oligomere, identifiziert durch das obige Verfahren, aus denen chromosomenspezifische Proben synthetisiert werden können.

Die Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt.

Zusammenfassend sieht die Erfindung folgendes vor:

Es ist ein Verfahren vorgesehen zur Bestimmung spezifischer Nucleotidsequenzen, die brauchbar sind bei der Bildung einer Probe, die verwendet werden kann zur Identifikation spezifischer Chromosome, vorzugsweise durch in situ Hybridisierung mit der Zelle selbst. Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden chromosomenbevorzugte Nucleotidsequenzen zuerst aus einer Bücherei aus Rekombinations DNS-Clonen bestimmt mit Familien repetitiver Sequenzen. Bücherei-Clonen werden identifiziert mit einer niedrigen Homologie mit einer Sequenz von repetitiven DNS-Familien, zu denen die ersten Clone jeweils gehören und Variantensequenzen werden sodann durch Auswahl der Clone identifiziert mit einem Muster der Hybridisierung mit genomischem DNS unähnlich dem Hybridisiermuster, welches durch die entsprechenden Familien gezeigt wird. Bei dem anderen Ausführungsbeispiel werden die Variantensequenzen aus einer Sequenz einer bekannten repetitiven DNS-Familie ausgewählt. Die ausgewählte Variantensequenz wird als chromosomspezifisch, chromosombevorzugt oder chromosom-nicht-spezifisch klassifiziert. Sequenzen, die als chromosomenbevorzugt klassifiziert sind, werden weiter sequenziert und Regionen werden identifiziert, die eine niedrige Homologie mit anderen Regionen der chromosombevorzugten Sequenz besitzen oder mit bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder und Konsensussequenzen der repetitiven DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Sequenzen. Die ausgewählten eine niedrige Homologie besitzenden Regionen werden sodann hybridisiert mit Chromosomen zur Bestimmung derjenigen niedrigen Homologieregionen, hybridisiert mit einem spezifischen Chromosom unter normalen Striktheitsbedingungen. Gemäß der Erfindung werden Oligomere vorgesehen, die bei der Bildung einer Probe brauchbar sind für die spezifische Chromosomidentifikation unter normalen Striktheitsbedingungen.

Claims (13)

1. Verfahren zur Auswahl chromosomenspezifischer repetitiver DNS-Sequenzen aus einer Bücherei von Rekombinations DNS-Clonen mit Familien repetitiver Sequenzen, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind:
Auswahl erster Clone aus der Bücherei mit einer niedrigen Homologie mit der Sequenz repetitiver DNS-Familien, zu denen die ersten Clone in entsprechender Weise gehören;
Hybridisierung der ausgewählten ersten Clone zu totalem genomischen DNA;
Auswahl varianter Clone mit einem Muster für die erwähnte Hybridisierung unähnlich einem prädominanten Hybridisationsmuster, gezeigt durch die entsprechenden Familien;
Klassifikation der varianten Clone als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch;
Feststellung der Regionen der Chromosomen bevorzugten Clone mit einer Sequenz mit niedriger Homologie relativ zu den bekannten Sequenzen anderer Familienmitglieder und Konsenssequenzen der repetitiven DNS-Familien für die chromosomenbevorzugten Clone; und
Hybridisieren der eine niedrige Homologie besitzenden Regionen mit Chromosomen zur Auswahl einer Nucleotidsequenz effektiv zum in-situ-Vorsehen von Chromosomenspezifizität bei normalem Striktheitsniveau.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Klassifikation der varianten Clone den Schlitz der "blot" Hybridisierung umfaßt zur Detektion des Vorhandenseins jeder der Variantenclone hybridisiert zu spezifischen Chromosomen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Klassifikation der Variantenclone die in-situ-Hybridisierung jedes des Variantenclones in menschliche Chromosome umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Bestimmung der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Bestimmung der Sequenz von Regionen zwischen Restriktionsenzymplätzen auf den chromosomenbevorzugten Clonen umfaßt für den Vergleich mit den Familienglied bekannten Sequenzen und der erwähnten Konsensussequenz der Familie.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Bestimmung der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Auswahl einer Basispaarregion umfaßt mit einer relativ kleinen Anzahl von Basen und mit einer geringsten Homologie mit den bekannten Familien- und Konsensussequenzen.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt der Bestimmung der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Bestimmung der Sequenz von Regionen zwischen Restriktionsenzymplätzen auf den chromosomenbevorzugten Clonen umfaßt für den Vergleich mit den Familienglied bekannten Sequenzen und der erwähnten Konsensussequenz der Familie.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt der Bestimmung der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Auswahl einer Basispaarregion umfaßt mit einer relativ kleinen Anzahl von Basen und mit einer Mindesthomologie mit den bekannten Familien- und Konsensussequenzen.

8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Bestimmung der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Bestimmung der Sequenz der Regionen umfaßt, und zwar zwischen den Einschränkungs- oder Restriktionsenzymplätzen auf den Chromosomenpreferenzclonen für Vergleich mit den Familienglied bekannten Sequenzen und der Konsensussequenz der Familie.

9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Bestimmung der Regionen niedriger Homologie den Schritt der Auswahl einer Basispaarregion umfaßt mit einer relativ kleinen Anzahl von Basen und mit der Mindesthomologie mit den bekannten Familien- und Konsensussequenzen.

10. Verfahren zur Bestimmung einer repetitiven Nucleotidsequenz effektiv zur Identifikation eines bestimmten Chromosoms unter normalen Bedingungen der Striktheit für die Hybridisierung, wobei die folgenden Schritte vorgesehen sind:
Auswahl einer ersten repetitiven Nucleotidsequenz aus einer Variantensequenz innerhalb einer Sequenz einer bekannten repetitiven DNS-Familie;
Klassifikation der ersten repetitiven Nucleotidsequenz als chromosomenspezifisch, chromosomenbevorzugt oder chromosomen-nicht-spezifisch; und
Bestimmung von Zonen einer klassifizierten Chromosomenpreferenzsequenz mit einer niedrigen Homologie mit anderen Regionen der erwähnten Chromosomenpreferenzsequenz, während Effektivität vorliegt zur Hybridisierung mit einem spezifischen Chromosom unter den normalen Striktheitsbedingungen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch den Schritt der Synthetisierung eines Oligomers, welches die bestimmte niedrig-homologe Sequenz enthält.

12. Oligomer effektiv zur Bildung einer Probe, die mit einem bestimmten Chromosom hybridisiert, wobei eine Nucleotidsequenz bestimmt gemäß Anspruch 1 vorgesehen ist.

13. Ein Oligomer effektiv zur Bildung einer Probe, die mit einem bestimmten Chromosom hybridisiert, und zwar unter einer normalen Striktheitsbedingung und wobei eine Nucleotidsequenz bestimmt gemäß Anspruch 10 vorgesehen ist.