DE3789679T2

DE3789679T2 - Genetische Sonden.

Info

Publication number: DE3789679T2
Application number: DE3789679T
Authority: DE
Inventors: Alec John Jeffreys
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1986-03-19
Filing date: 1987-03-18
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2007-03-19
Also published as: PT84502A; US5175082A; ZA871993B; EP0238329B1; DE3789679D1; IL81936A0; AU604686B2; JPS62282600A; GB2188323A; AU7070187A; GB8706401D0; EP0238329A2; JPH05276948A; AU7738887A; NO871122L; PT84502B; KR870009024A; GB2188323B; IE59859B1; RU1788970C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Polynucleotide und DNA- und RNA-Sonden, ihre Herstellung und ihre Verwendung bei der genetischen Charakterisierung. Derartige Verwendungen können beispielsweise die Feststellung einer menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Herkunft einschließen, und die Polynucleotide und Sonden der vorliegenden Erfindung können daher beispielsweise Anwendung finden bei Vaterschaftsstreitigkeiten oder in der Gerichtsmedizin oder bei der Vorsorge, Diagnose und Behandlung von genetischen Erkrankungen oder Veranlagungen.
In dem britischen Patent 2166445 (Lister Institute of Preventive Medicine) und in dem entsprechenden europäischen Patent Nr. 0186271 werden chemisch verschiedene DNA-Sequenzen beschrieben und beansprucht, die als Sonden verwendet werden können, um individuell mit einer Vielzahl von polymorphen Positionen innerhalb eines humanen und tierischen Genoms zu hybridisieren, was die Erzeugung eines "Fingerprints" ermöglicht, der sich aus markierten Banden unterschiedlicher Molekulargewichte zusammensetzt. Der Fingerprint ist als ein Ganzes charakteristisch für das betreffende Individuum, und die Herkunft der unterschiedlichen Banden kann in der Reihe der Vorfahren des Individuums verfolgt werden und kann in bestimmten Fällen als mit bestimmten genetischen Störungen verbunden angesehen werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß informative genetische Loci in dem Genom unter Verwendung von Multi-Locus-Sonden identifiziert werden können, und daß Polynucleotide und Polynucleotidsonden hergestellt werden können, von denen jede für einen einzelnen derartigen informativen genetischen Locus spezifisch ist.
Bisher wurde nur eine begrenzte Anzahl von hypervariablen Loci in humaner DNA entdeckt; diese schließen ein die Minisatelliten 5' zum Insulingen (Bell, Selby und Rutter, 1982), 3' zum c-Ha-rasl-Gen (Capon et al., 1983), zum Typ II-Collagen- Gen (Stocker et al., 1985) und zwischen den 2- und 1-Globingenen (Goodbourn et al., 1983) sowie den Dl4Sl-Locus, der durch einen anonymen DNA-Klon definiert wird, der der telomeren Region des langen Arms des Chromosoms 14 entstammt (Wyman und White, 1980; Balazs et al., 1982; Wyman, Wolfe und Botstein, 1984). Diese Minisatelliten unterscheiden sich in ihrer Variabilität wesentlich, und zwar beginnend mit nur sechs unterschiedlichen Allelen, die in dem hypervariablen Bereich des Collagens ermittelt wurden (Sykes, Ogilvie und Wordsworth, 1985) bis hin zu mehr als 80 in dem D14Sl-Locus (Balazs et al., 1986). Die Gesamtzahl an hypervariablen Loci in dem humanen Genom ist unbekannt, ist jedoch wahrscheinlich sehr groß. Tatsächlich könnte das humane Genom wenigstens 1500 hypervariable Regionen enthalten.
Es wurde nunmehr gefunden, daß es möglich ist, ein DNA-Fragment zu klonieren, das durch Hybridisation von Fragmenten von Genom-DNA mit einer Polynucleotidsonde identifiziert wurde, die in der Lage ist, DNA unter Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Locus zu unterscheiden, beispielsweise die Sonden 33.6 und 33.15, die in dem obigen britischen Patent Nr. 2,166,445 und dem entsprechenden Europäischen Patent Nr. 0186271 beschrieben und beansprucht werden, und daraus ein Polynucleotid oder eine Sonde herzustellen, die in der Lage ist, mit einem DNA- Fragment zu hybridisieren, das einen Minisatelliten enthält, der für einen speziellen Bereich oder Locus im Genom spezifisch ist, wobei der genannten Bereich oder Locus ein informativer genetischer Locus ist.
Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung stellen wir somit ein Verfahren zur Charakterisierung einer Testprobe von genomischer DNA durch Bezugnahme auf eine oder mehrere Kontrollproben bereit, wobei das Verfahren umfaßt das Fragmentieren einer Proben-DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, die eine Sequenz, die einem Tandem-Repeat entspricht, in keinem nennenswerten Umfange spalten, das Umsetzen der erhaltenen DNA-Fragmente mit einem Polynucleotid oder einer Polynucleotidsonde, die eine Nucleotid-Sequenz aufweisen, die für einen einzelnen Minisatellitenbereich oder einen hypervariablen Locus spezifisch ist, das Nachweisen hybridisierter DNA-Fragmente sowie einen Vergleich der hybridisierten Fragmente mit der oder den Kontrollprobe(n); und worin der einzelne Bereich oder Locus eine Übereinstimmungs-Repeat- Sequenzeinheit aufweist, die aus irgendeiner der folgenden Sequenzen ausgewählt ist:
AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3
GTGGAYAGG 4
TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5
GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6
GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7
AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8
TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9
(worin Y = C, T oder U, X = G oder C, R = A oder G und T = T oder U) oder einer komplementären Sequenz dazu.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geschaffen, das bis zu 10000 Tandem-Repeats einer Übereinstimmungs-Repeat-Sequenzeinheit aufweist, die ausgewählt ist aus irgendeiner der Sequenzen
AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3
GTGGAYAGG 4
TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5
GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6
GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7
AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8
TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9
(worin Y = C, T oder U, X = G oder C, R = A oder G und T = T oder U) oder einer komplementären Sequenz dazu.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen Polynucleotide und die Polynucleotide, die nach dem oben definierten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, hergestellt durch eine mikrobiologische Produktion von kloniertem Material oder durch direkte Synthese.
Die Erfindung schließt Polynucleotide von DNA, RNA sowie irgendeiner anderen Art ein, die mit einer DNA hybridisierbar ist. Die oben definierten Polynucleotide sind nicht markiert und können in doppelsträngiger Form (ds) oder als einzelne Stränge (ss) vorliegen.
Die Erfindung schließt markierte Polynucleotide in der ss- Form zur Verwendung als Sonden sowie deren markierte ds-Vorläufer, aus denen ss-Sonden hergestellt werden können, ein.
Somit wird gemäß einem weiteren Merkmal eine Polynucleotidsonde zur Verwendung bei-dem erfindungsgemäßen Verfahren geschaffen, die ein erfindungsgemäßes Polynucleotid wie oben definiert oder ein Polynucleotid, das nach einem Verfahren hergestellt wurde, wie es oben definiert wurde, umfaßt, die eine Label- oder Markierungs-Komponente aufweisen. Im allgemeinen liegt wenigstens die Nucleotidsequenz des Polynucleotids in einzelsträngiger Form vor, wobei die Sonde jedoch vorzugsweise das Polynucleotid vollständig in einzelsträngiger Form aufweist.
Gemäß einem weiteren Merkmal schaffen wir eine Polynucleotidsonde zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, die irgendeine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus:
AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3
GTGGAYAGG 4
TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5
GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6
GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7
AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8
TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9
(worin Y = C, T oder U, X = G oder C, R = A oder G und T = T oder U) oder einer komplementären Sequenz dazu.
Gemäß noch einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Polynucleotidsonde geschaffen, wie sie weiter oben definiert wurde, das das Labeln oder Markieren eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung, wie es weiter oben definiert wurde, oder eines Polynucleotids, das nach einem Verfahren hergestellt wurde, wie es weiter oben definiert wurde, umfaßt.
Die Polynucleotidsonden der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise ³²P-radiomarkiert auf irgendeine herkömmliche Weise, sie können jedoch alternativ dazu aufandere, auf dem Gebiet der Hybridisierung gut bekannte Art und Weise radioaktiv markiert sein, so daß z. B. ³&sup5;S-radiomarkierte Proben erhalten werden. Sie können auch mit Biotin oder ähnlichen Spezies nach dem Verfahren von D. C. Ward et al. markiert werden, wie beschrieben wird in Proceedings of the 1981 ICN-UCLA Symposium on Devolopmental Biology using Purified Genes abgehalten in Keystone, Colorado am 15. bis 20. März 1981, Vol. XXIII 1981, Seiten 647-658, Academic Press; Herausgeber Donald D. Brown et al., oder die sogar enzymmarkiert sein können nach dem Verfahren von A. D. B. Malcolm et al., Abstracts of the 604th Biochemical Society Meeting, Cambridge, England (Meeting vom 1. Juli 1983). Vorzugsweise ist die Proben-DNA humane DNA.
In dieser Beschreibung definieren wir einen informativen genetischen Locus als einen solchen, an dem wenigstens drei unterschiedliche Allele in irgendeiner Probe von 100 statistisch ausgewählten, nicht verwandten Individuen unterschieden werden können. Das wird hierin durch die Angabe ausgedrückt, daß der Locus eine Allelvariation von wenigstens 3 (100) aufweist. Vorzugsweise beträgt die Probe an statistisch ausgewählten nicht verwandten Individuen 500, stärker bevorzugt 1000, und die Fähigkeit, wenigstens drei unterschiedliche Allele in derartigen Proben zu unterscheiden, wird hierin als 3 (500) bzw. 3 (1000) bezeichnet. Es ist wesentlich, daß die Proben von 100, 500 oder 1000 statistisch ausgewählten nicht verwandten Individuen tatsächlich statistisch ausgewählt werden, da es üblicherweise möglich sein wird, 100, 500 oder 1000 Individuen zu identifizieren, die weniger als drei Allele an einem gegebenen informativen genetischen Locus aufweisen, wenn man eine ausreichend große Anzahl von Gliedern der Gesamtbevölkerung sichtet.
Je höher diese Polymorphie an einem gegebenen informativen genetischen Locus ist, umso nützlicher und informativer ist die locus-spezifische Sonde bei der genetischen Charakterisierung, beispielsweise die individuelle Identifikation für die Vaterschaftsfeststellung oder die Gerichtsmedizin.
Es versteht sich dabei, daß in diesem Zusammenhang der Begriff "individuell" oben dazu verwendet wurde, nicht nur Menschen zu bezeichnen, sondern auch andere Tiere sowie auch Pflanzen und Zellinien, die sich von solchen Menschen, Tieren und Pflanzen ableiten. In jedem Fall stammt jedoch die Probe von statistisch ausgewählten nicht verwandten Individuen vollständig von der gleichen Art.
Im Hinblick auf die humanen Anwendungen der vorliegenden Erfindung kann der Ausdruck "informativer genetischer Locus", wie er hierin verwendet wird, alternativ auch als ein solcher definiert werden, an dem wenigstens drei unterschiedliche Allele in einer DNA unterschieden werden können, die aus irgendwelchen 20 Zellinien extrahiert wurde, die aus den folgenden ausgewählt sind, wobei diese Zellinien bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt sind:
Zellinie ATCC Hinterlegungsnr.
Hela CCL2
RPHI 2650 CCL 30
Detroit 532 CCL 54
Detroit 525 CCL 65
Detroit 529 CCL 66
Detroit 510 CCL 72
WI-38 CCL 75
Citrullinemia CCL 76
EB-3 CCL 85
RAJI CCL 83
JIYOYE (P-2003) CCL 87
WI-26 CCL 95
Detroit 551 CCL 110
RPMI 6666 CCL 113
RFMI 7666 CCL 114
CCRF-CEM CCL 119
CCRF-SB CCL 120
HT-1080 CCL 121
HG 261 CCL 122
CHP3 (M.W.) CCL 132
LL47 (MaDo) CCL 135
HEL 299 CCL 137
LL 24 CCL 151
HFLI CCL 153
WI-1003 CCL 154
MRC-5 CCL 171
IMR-90 CCL 186
LS 174T CCL 188
LL 86(Lesa) CCL 190
LL 97A (AIMy) CCL 191
HLF-a CCL 199
CCD-13Lu CCL 200
CCD-8Lu CCL 201
CCD-11Lu CCL 202
CCD-14Br CCL 203
CCD-16Lu CCL 204
CCD-18Lu CCL 205
CCD-19Lu CCL 210
Zellinie ATCC Hinterlegungsnr.
Hs888Lu CCL 21
MRC-9 CCL 212
Daudi CCL 213
CCD-25Lu CCL 215
SW403 CCL 230
NAMALWA CRL 1432
Alle oben erwähnten Zellinien sind frei erhältlich bei ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, USA, und werden in dem ATCC-Katalog von Zellinien und Hybridomen aufgeführt. Alle oben erwähnten Zellinien waren bei ATCC schon vor 1985 hinterlegt.
Zusätzlich werden die folgenden Begriff erläutert:

Hypervariabel

Ein Bereich einer humanen, tierischen oder pflanzlichen DNA an einem erkannten Locus oder einer erkannten Position wird als hypervariabel bezeichnet, wenn er in vielen unterschiedlichen Formen auftritt, z. B. im Hinblick auf seine Länge oder Sequenz.

Minisatellit

Ein Bereich einer humanen, tierischen oder pflanzlichen DNA, der aus Tandem-Repeats einer kurzen DNA-Sequenz besteht. Es müssen nicht alle Repeat-Einheiten eine perfekte Identität aufweisen.

Polymorph

Ein Gen oder ein anderes Segment einer DNA, das von Individuum zu Individuum oder zwischen den paarigen Chromosomen eines gegebenen Individuums eine Variabilität zeigt, wird als polymorph bezeichnet.

Repeat oder Tandem-Repeat (Sequenz)

Eine Polynucleotidsequenz, die perfekt oder nicht ganz perfekt in Serien wiederholt wird. Im allgemeinen wird eine Sequenz, die man als tandemartig wiederholt bezeichnet, wenigstens dreimal wiederholt.

Nicht-perfekte Wiederholung (Sequenz)

Eine Sequenz, die keine exakte Wiederholung (Repeat) entweder im Hinblick auf die Anzahl oder die Art der Nucleotide ist, die jedoch als ein "Repeat" einer Übereinstimmungssequenz erkennbar ist.

% Homologie

Wenn man zwei Repeat- oder Tandem-Repeat-Sequenzen A und B vergleicht, wird die prozentuale Homologie durch die Anzahl von Basenpaaren in A minus der Anzahl von Basenpaar-Substitutionen, -Hinzufügungen oder -Deletionen in B angegeben, die erforderlich wären, damit man A erhält, und zwar ausgedrückt als prozentualer Anteil. Somit beträgt die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ATGC und AGC 75%.

Übereinstimmungskern (Sequenz)

Eine Sequenz, die als genaueste Übereinstimmung unter einer Vielzahl von Repeat-Sequenzen identifiziert werden kann. Und zwar üblicherweise unter den Repeat-Einheiten von 2 oder mehreren unterschiedlichen Minisatelliten.
Nucleotid(nt) und Basenpaar (bp) werden synonym verwendet. Beide können eine DNA oder eine RNA bezeichnen. Die Abkürzungen C, A, G, T bezeichnen im üblichen Sinne (Desoxy)cytidin, (Desoxy)adenosin, (Desoxy)guanosin und entweder Desoxythymidin oder Uridin. Es versteht sich dabei jedoch, daß die Abkürzungen A, C, G und T andere basenmodifizierte Nucleoside einschließen können, die in der Lage sind, sich mit einem der herkömmlichen Nucleoside (Desoxy)adenosin, (Desoxy)cytidin, (Desoxy)guanosin und entweder Desoxythymidin oder Uridin zu paaren. Derartige basenmodifizierte Nucleoside schließen ein (Desoxy)inosin und (Desoxy)8-azaguanosin.
Wenn das Polynucleotid oder die Polynucleotidsonde der vorliegenden Erfindung eine tandem-wiederholte Sequenz umfaßt, können die Tandem-Repeats perfekte Repeats oder nicht-perfekte Repeats sein oder eine Mischung von perfekten und nicht-perfekten Repeats. In der Sondensequenz liegen vorzugsweise wenigstens drei Repeats und stärker bevorzugt wenigstens sieben Repeats vor.
Die erfindungsgemäßen Sonden, die einzeln oder in Kombination mit anderen locus-spezifischen Sonden entweder in einer Folge von Tests oder in einem Einzeltest unter Verwendung einer Mischung oder eines Cocktails von Sonden verwendet werden können, können auf den folgenden Gebieten von Nutzen sein:
1. Vaterschafts- und Mutterschaftsbestimmung beim Menschen.
2. Familiengruppenüberprüfung bei z. B. Immigrationsstreitigkeiten und Erbschaftsstreitigkeiten.
3. Bestimmung der Einigkeit bei Zwillingen.
4. Tests auf Inzucht beim Menschen.
5. Allgemeine Stammbaumanalyse beim Menschen.
6. Identifikation von Loci, die mit einer genetischen Erkrankung beim Menschen verknüpft sind, wodurch spezifische Sonden konstruiert werden können, um einen genetischen Defekt festzustellen.
7. Gerichtsmedizin, beispielsweise
(a) Herstellung von Fingerprints von Samenproben von Vergewaltigungsopfern
(b) Herstellung von Fingerprints von Blut-, Haar- und Samenproben von z. B. verschmutzter Bekleidung
(c) Identifikation von menschlichen Überresten
(d) Charakterisierung anderer gerichtsmedizinischer Gewebeproben, beispielsweise von Haut.
8. Untersuchungen des Zellchimaerismus, z. B. zur Verfolgung von Donorzellen gegenüber Empfängerzellen nach einer Knochenmarkstransplantation.
9. Viehzüchtung und Stammbaumanalyse/-Beglaubigung.
(Das könnte beispielsweise die Routinekontrolle und -prüfung von reinen Tierstämmen einschließen sowie das Bestimmen von Stammbäumen im Falle von Streitigkeiten, bei denen es z. B. um Rennpferdzüchtung und Hundezüchtung geht.) Auch zur Schaffung von genetischen Markern, die einen Bezug zu ererbten Anlagen von wirtschaftlicher Bedeutung zeigen könnten.
10. Routine-Qualitätskontrolle von kultivierten Tier- oder Pflanzen-Zellinien, die Prüfung reiner Zellinien auf Kontamination und zur routinemäßigen Bestimmung.
11. Analyse von Tumorzellen und Tumoren auf molekulare Anormalitäten.
12. Es ist zu erwarten, daß die Polynucleotide oder die davon abgeleiteten Sonden eine potentielle Verwendung in der Pflanzenzucht haben.
Die locus-spezifischen Sonden der vorliegenden Erfindung sind jedoch ganz besonders nützlich in der Gerichtsmedizin, wie im folgenden Beispiel 3 gezeigt wird, und wenigstens die Sonde pλg3 kann mit der heterozellularen Form einer ererbten Persistenz des fötalen Hämoglobins cosegregieren. Die Sonden stellen auch ein starkes Verfahren zur Verwendung bei Vaterschaftsbestimmungen und verwandten Anwendungen (vgl. die obigen Anwendungen 2 und 5) sowie bei Untersuchungen des Zellchimaerismus dar.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1A zeigt die gelelektrophoretische Reinigung eines spezifizierten hypervariablen DNA-Fragments aus einem DNA-Fingerprint, wobei das Fragment darin als "Fragment g" bezeichnet ist. Fig. 1B zeigt den Aufbau des DNA-Fragments g mit Hilfe einer Restriktionskarte einer klonierten DNA;
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des hypervariablen Fragments g, wobei die Übereinstimmungs-Repeat-Sequenz und deren Zuordnung zu der "Kern-Sequenz" der britischen Patentveröffentlichung Nr. 2,166,445 besonders hervorgehoben wird.
Fig. 3 zeigt die Mendel'sche Vererbung von polymorphen DNA- Fragmenten, nachgewiesen durch pλg3;
Fig. 4 zeigt die Verteilung von Minisatelliten-Allelpositionen, nachgewiesen durch Hybridisierung an pλg3;
Fig. 5 zeigt das Screening von λMS-Rekombinanten auflocusspezifische hypervariable DNA-Sonden;
Fig. 6 zeigt die Übereinstimmungs-Repeat-Sequenzeinheiten der QMS-Serie von Minisatelliten und des pλg3-Minisatelliten;
Fig. 7 zeigt die Mendel'sche Vererbung des hypervariablen Locus, nachgewiesen mit der Sonde, die hierin also λMS32 bezeichnet wird;
Fig. 8 zeigt eine Abschätzung der allelischen Variabilität bei dem hypervariablen Locus, nachgewiesen durch die Sonde, die hierin als λMS43 bezeichnet wird.
Fig. 9 zeigt eine Analyse einer allelischen Längenvariation in hypervariablen Loci in Pools humaner DNA;
Fig. 10 zeigt die Segregation des hypervariablen Locus, nachgewiesen durch die Sonde, die hierin als 25as λMS32 bezeichnet wird, in einer Palette von Mensch-Nagetier-Somazellhybrid-DNA, verdaut mit Alu I;
Fig. 11 zeigt eine Bestimmung der Empfindlichkeit von locusspezifischen hypervariablen Sonden und ihrer Anwendung auf die gerichtsmedizinische Analyse eines doppelten Vergewaltigungs/Mordfalles; und
Fig. 12 zeigt die Bestimmung von mehrfach hypervariablen Loci in humaner DNA durch Hybridisation mit gepoolten Minisatellitsonden der vorliegenden Erfindung.
Die Polynucleotide der Erfindung, Polynucleotide, die nach den Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, und erfindungsgemäße Sonden sind in der Lage, mit Fragmenten von DNA zu hybridisieren, die einen Minisatelliten aus einem einzigen spezifischen Minisatellitenbereich oder einem hypervariablen Locus enthalten und sind somit locus-spezifisch. Im allgemeinen sind die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Sonden locus-spezifisch unter strikten Hybridisierungsbedingungen. In diesem Zusammenhang wird der Ausdruck "locus-spezifisch" hierin im Hinblick auf ein Polynucleotid oder eine Sonde so gebraucht, daß er bedeutet, daß das Polynucleotid oder die Sonde unter Hybridisierungsbedingungen verwendet werden kann, die sicherstellen, daß das Polynucleotid oder die Sonde nur mit einem einzigen spezifischen Locus hybridisiert.
Es versteht sich jedoch, daß die locus-spezifischen Sonden der vorliegenden Erfindung, wenn sie unter weniger strikten Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, in der Lage sein können, DNA im Hinblick -auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Locus zu unterscheiden und somit verwendet werden können, andere informative genetische Loci zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen locus-spezifischen Polynucleotide und Sonden können homolog zu dem Minisatelliten des den Minisatelliten enthaltenden DNA-Fragments, oder weniger bevorzugt zu einer Sequenz sein, die den Minisatelliten flankiert.
Wenn die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Sonden Tandem- Repeats einer speziellen Sequenz aufweisen, wird eine derartige Sequenz im allgemeinen wenigstens dreimal wiederholt, und derartige Repeats müssen nicht unbedingt exakt wiederholte Repeats sein. Repeats, die nicht exakt wiederholt sind, werden an anderer Stelle als nicht perfekte Repeats beschrieben. Derartige Repeats werden nichtsdestotrotz erkennbar wiederholt. Im allgemeinen bedeutet das, daß im Durchschnitt eine wenigstens 70%ige Homologie zwischen allen sich wiederholenden Einheiten besteht. Vorzugsweise beträgt die Homologie wenigstens 80%, stärker bevorzugt wenigstens 85% und insbesondere 90% zwischen allen wiederholten Einheiten. Es versteht sich jedoch, daß die Nucleotid-Sequenz oder "Repetiereinheit" überhaupt nicht wiederholt wird, wenn das gewünscht ist.
Die Anzahl an Repetiereinheiten, n, beträgt vorteilhafterweise wenigstens 5, vorzugsweise jedoch wenigstens 10. Geeigneterweise ist n 10 bis 40, im Prinzip kann n jedoch irgendeine Zahl sein, und zwar von sogar 1 bis hinauf zu 10000.
Wenn die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Sonden Tandem- Repeats einer speziellen Sequenz aufweisen, sind irgendwelche flankierenden Sequenzen weitestgehend irrelevant. Sie können weggelassen werden oder können in irgendeiner Anzahl von Nucleotiden vorhanden sein, beispielsweise bis zu 50000, wobei jedoch das Arbeiten mit einer derartig langen Sonde normalerweise nicht empfindlich sein würde. Derartige große Polynucleotide können nichtsdestotrotz als Träger dienen, aus denen kleinere Polynucleotide, die als Sonden besonders nützlich sind, herausgeschnitten werden können. Die Flankiersequenzen können ein Teil entweder einer ds-DNA oder einer ss- DNA sein, selbst wenn die Repeat-Sequenzen einer ss-DNA entsprechen.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden weisen irgendeine Sequenz auf, die ausgewählt ist aus den Formeln 3 bis 9, die weiter oben angegeben sind, oder eine dazu komplementäre Sequenz oder Tandem-Repeats davon (wobei im Mittel eine wenigstens 70%ige Homologie zwischen allen tandem-wiederholten Sequenzen besteht), oder eine dazu komplementäre Sequenz.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynucleotid weist somit die Sequenz der weiter oben definierten Formel 3 oder Tandem- Repeats davon oder eine dazu komplementäre Sequenz auf. Eine derartige Nucleotid-Sequenz ist spezifisch zu einem autosomalen Locus, der auf dem Chromosom 7 lokalisiert ist.
Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden, die eine derartige Sequenz aufweisen, werden hierin als pλg3 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynucleotid weist die Sequenz der oben definierten Formel 4 oder Tandem- Repeats davon oder eine dazu komplementäre Sequenz auf. Eine derartige Nucleotid-Sequenz ist spezifisch für einen Locus, der auf dem Chromosom 1 lokalisiert ist. Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden, die eine derartige Sequenz aufweisen, werden hierin als λMSl bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynucleotid weist die Sequenz der oben definierten Formel 5 oder Tandem- Wiederholungen davon oder eine dazu komplementäre Sequenz auf. Eine derartige Nucleotid-Sequenz ist spezifisch für einen Locus, der auf dem Chromosom 7 lokalisiert ist.
Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden, die eine derartige Sequenz aufweisen, werden hierin als λMS31 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynucleotid weist die Sequenz der oben definierten Formel 6 oder Tandem- Repeats davon oder eine dazu komplementäre Sequenz auf. Eine derartige Sequenz ist spezifisch für einen Locus, der auf dem Chromosom 1 lokalisiert ist. Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden, die eine derartige Sequenz aufweisen, werden hierin als λMS32 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynucleotid weist eine Sequenz auf, die aus den oben definierten Formeln 7 und 8 ausgewählt ist oder Tandem-Repeats davon oder eine dazu komplementäre Sequenz. Eine derartige Nucleotid-Sequenz ist für einen Locus spezifisch, der auf dem Chromosom 5 lokalisiert ist. Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden, die derartige Sequenzen aufweisen, werden hierin als λMS8 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Polynucleotid weist die Sequenz der oben definierten Formel 9 oder Tandem- Repeats davon oder eine dazu komplementäre Sequenz auf. Eine derartige Nucleotid-Sequenz ist für einen Locus spezifisch, der auf dem Chromosom 12 lokalisiert ist. Polynucleotide und Polynucleotid-Sonden, die eine derartige Sequenz aufweisen, werden hierin als λMS43 bezeichnet.
Wie oben angegeben wurde, besteht im allgemeinen wenigstens 70%, vorteilhafterweise wenigstens 80% vorzugsweise wenigstens 85% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Homologie zwischen Repeat-Einheiten. Es ist jedoch besonders bevorzugt, daß jede der Sequenzen der Formeln 3 bis 9 exakt wiederholt wird. Es versteht sich in dieser Beziehung, daß die letztgenannte Anforderung erfüllt werden kann, vorausgesetzt, daß jede Repeat-Einheit eine Sequenz aufweist, die in den Bereich der gewünschten Formel fällt; es ist nicht notwendig, das jede Repeat-Einheit exakt die gleiche Sequenz besitzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren gemäß dem oben offenbarten Verfahren zur Charakterisierung einer Testprobe einer Genom-DNA geschaffen, das die Identität oder Nicht-Identität des Testproben-Donors mit einem oder mehreren Kontrollproben-Donoren feststellt, wobei die Kontrollprobe(n) in ähnlicher Weise fragmentiert sind, und wobei ein Vergleich der hybridisierten Fragmente der entsprechenden Proben angestellt wird.
Die obigen Verfahren können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polynucleotide oder Sonden entweder 30 einfach oder durch Verwendung von wenigstens zwei erfindungsgemäßen Polynucleotiden oder Sonden entweder in einer Folge von Tests oder in einem einzigen Test unter Verwendung einer Mischung der genannten Polynucleotide oder Sonden durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Sonden, die wir getestet haben, dienen alle als locus-spezifische Sonden unter sehr strikten Hybridisierungsbedingungen.
Die extreme Variabilität von Loci, die durch diese erfindungsgemäßen Sonden festgestellt werden, die wir getestet haben, kombiniert mit ihrer Empfindlichkeit in Southern-blot- Hybridisierungen, stellen ein besonders wertvolles Werkzeug zur individuellen Identifizierung dar, insbesondere dann, wenn nicht genug DNA für eine Multi-Locus-DNA-Fingerprint- Analyse vorhanden ist, wie sie in dem britischen Patent Nr. 2166445 und dem entsprechenden europäischen Patent Nr.
0186271 beschrieben und beansprucht ist. Multi-Locus-DNA-Fingerprints können aus 0,5 ug DNA erhalten werden, während die locus-spezifischen Sonden um wenigstens eine Größenordnung empfindlicher sind und mit so geringen Mengen wie 1 ul Blut angewandt werden können.
In irgendeiner ungewöhnlichen Situation, wenn noch kleinere Probenmengen getestet werden müssen, ist die vorliegende Erfindung besonders wertvoll in Verbindung mit der Vervielfältigungstechnik, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 86302299.2 (Veröffentlichungs Nr. 0201184) beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, informative genetische Loci im humanen Genom zu identifizieren und ermöglicht dadurch die Herstellung locus-spezifischer Sonden, wobei jede locus-spezifische Sonde für einen einzigen informativen genetischen Locus spezifisch ist. Wir haben sechs unterschiedliche sehr informative genetische Loci identifiziert, die sehr hohe Heterozygositäten in der untersuchten Population besitzen (wenigstens 90%), und die zu den am stärksten polymorphen gehören, die bis heute isoliert wurden, und wir haben eine locus-spezifische Sonde für jeden Locus hergestellt, wobei wird diese Sonden pλg3, λMSl, λMS8, λMS31, λMS32 und λMS43 (wie weiter oben definiert) genannt haben.
Der Grad der individuellen Spezifität von Genomtypen, die mit locus-spezifischen Sonden bestimmt wurde, läßt sich aus der Heterozygosität H an jedem Locus abschätzen. Die mittlere Allelhäufigkeit q an einem Locus wird angegeben durch (1-H), und die Wahrscheinlichkeit, daß zwei statistisch ausgewählte Individuen den gleichen Genotyp teilen, beträgt q²(2-q). Diese Wahrscheinlichkeit einer falschen Zuordnung von zwei Individuen, variiert von 0,02 für λMS8 bis 0,0002 für λMS31, und stellt eine vorsichtige Abschätzung, da die Heterogenität bei q diese Wahrscheinlichkeiten vermindert. Die kumulative Wahrscheinlichkeit einer falschen Zuordnung für alle sechs Minisatelliten-Sonden beträgt ungefähr 10&supmin;¹&sup6;, was vergleichbar ist mit den Chancen, daß zwei statistisch ausgewählte DNA-Fingerprints, die von einer Multi-Locus-Sonde festgestellt wurden, identisch sind (vgl. britische Patentanmeldung Nr. 8525252). Im Gegensatz dazu ist die Chance, daß zwei Geschwister im Hinblick auf einen gegebenen hypervariablen Locus identisch sind, gegeben durch 1/4 (1+q)². Die kumulative Wahrscheinlichkeit einer Geschwisteridentität für alle sechs Sonden beträgt 0,0004, verglichen mit ungefähr 10&supmin;&sup7; für einen DNA-Fingerprint unter Verwendung einer Multi- Locus-Sonde.
Diese locus-spezifischen hypervariablen Sonden sollten sich in der Gerichtsmedizin als besonders nützlich erweisen, wie anhand des in Fig. 11C analysierten Mordfalls gezeigt wird, bei dem aus zweien der gerichtsmedizinischen Proben für eine DNA-Fingerprint-Analyse nicht ausreichende DNA gewonnen wurde. Samen-DNA beider Opfer zeigte einen gemeinsamen Phänotyp mit den Sonden λMSl und λMS31, der sich von dem des Verdächtigten unterschied. Aus der obigen Diskussion können wir die Wahrscheinlichkeit, daß die Opfer X und Y von unterschiedlichen, nicht-verwandten Männern sexuell vergewaltigt wurden, als 2·10&supmin;&sup7; errechnen. In ähnlicher Weise ist die Chance, daß die beiden hypothetischen Vergewaltiger Verwandte ersten Grades waren, beispielsweise Brüder, 0,07. Das liefert einen starken Beweis dafür, daß X und Y von dem gleichen Mann sexuell vergewaltigt wurden, ein Schluß, der anschließend von einer DNA-Fingerprint-Analyse größerer Mengen gerichtsmedizinischen Materials bestätigt wurde. Außerdem stammen die Samenflecken bei X und Y mit nahezu vollständiger Sicherheit von einem einzigen Individuum und nicht von zwei oder mehr Vergewaltigern. In diesem Zusammenhang ist beispielsweise Fleck b in Fig. 11C zu betrachten, der zwei Allele des Opfers und zwei zusätzliche Allele des Vergewaltigers zeigt. Die Chancen, daß ein Pool von drei Individuen (zwei Vergewaltiger und ein Opfer) vier oder weniger auf lösbare Allele zeigen würde, wird angegeben durch q²(55-210q+216q²). Für die Sonde λMSl beträgt diese Wahrscheinlichkeit 0,02, und für die Sonde λMS31 0,005, was eine kombinierte Wahrscheinlichkeit dafür, daß X sexuell von zwei Männern mißbraucht wurde, und nicht von einem, von 10&supmin;&sup4; ergibt. Das belegt, daß X und Y von einem einzigen Individuum attackiert wurde, und zeigt, daß locus-spezifische Sonden, anders als Multi-Locus-DNA-Fingerprint-Sonden, dazu verwendet werden können, die Anzahl von Individuen abzuschätzen, die von einer gemischten DNA-Probe repräsentiert werden.
Die Mendel'sche Vererbung der hypervariablen DNA-Fragmente ermöglicht auch deren Verwendung zur Feststellung von Familienbeziehungen bei beispielsweise Vaterschaftsstreitigkeiten. Für eine gegebene locus-spezifische Sonde kann die Wahrscheinlichkeit, daß das väterliche Allel eines Kinds zufällig in einem statistisch ausgewählten Mann vorhanden ist, auf 2qq² geschätzt werden. Für alle sechs Minisatelliten ist die kumulative Wahrscheinlichkeit der falschen Erfassung eines Nicht-Vaters
vergleichbar derjenigen, die man unter Verwendung von zwei DNA-Fingerprint-Sonden erhält. Ähnlich ist die kumulative Wahrscheinlichkeit der falschen Erfassung eines Verwandten ersten Grades des wahren Vaters, beispielsweise eines Bruders, 0,02. Somit kann die aufeinanderfolgende Verwendung dieser hypervariablen locus-spezifischen Sonden ein wirksames Verfahren zur Feststellung von Familienbeziehungen darstellen, mit dem Vorbehalt, daß Mutationen bei Allelen einer neuen Länge an diesen instabilen Loci gelegentlich zu falschen Aussonderungen führen könnte. Die Mutationsrate an diesen hypervariablen Loci ist noch nicht bekannt.
Die Locusspezifität und Empfindlichkeit dieser locus-spezifischen Sonden ermöglicht es, gepoolte Sonden zu verwenden, um Multi-Locus-Southern-Blot-Muster zu erzeugen (Fig. 12). Diese "rekonstituierten DNA-Fingerprints", die durch fünf gepoolte Sonden produziert werden, sind erheblich weniger komplex als ihre Gegenstücke, die man mit Hilfe von Multi-Locus-Sonden findet, und sie sollten besser dafür geeignet sein, digital im Anschluß an ein densitometrisches Scanning kodiert zu werden. Ungeachtet der hohen Variabilität der individuellen Minisatelliten zeigen die Profile der gepoolten Sonden ein erhebliches (18%iges) Niveau an Fragmentübereinstimmung zwischen nicht-verwandten nordeuropäischen Individuen, und zwar hauptsächlich im Ergebnis einer elektrophoretischen Mitwanderung von Minisatellit-Fragmenten aus unterschiedlichen Loci. Dieses Niveau an Bandengemeinsamkeiten ist dem ähnlich, daß man bei herkömmlichen DNA-Fingerprints feststellt, die mit Hilfe von Multi-Locus-Sonden hergestellt wurden, wo das Niveau an Bandenübereinstimmung ungefähr 25% zwischen statistisch ausgewählten Individuen beträgt. Da im Durchschnitt 8,4 DNA-Fragmente in einem Mischsondenmuster aufgelöst werden, kann die Chance, daß alle diese Fragmente eines Individuums in einem zweiten statistisch ausgewählten Individuum vorhanden sind, vorsichtig geschätzt werden auf 0,188,4 - 6·10&supmin;&sup7;. Diese Muster gewährleisten daher ein hohes Ausmaß an individueller Spezifität, auch wenn dieses nicht so hoch ist, wie es unter Verwendung von Multi-Locus-Sonden erhalten werden kann oder bei Verwendung einer aufeinanderfolgenden Hybridisierung mit locus-spezifischen Sonden (vgl. oben).
Sowohl die gepoolten Sonden als auch die individuellen locusspezifischen Sonden erweisen sich besonders nützlich bei Untersuchungen des Zellchimaerismus, insbesondere im Hinblick auf die Schaffung von Markierungen eines Donors gegenüber einem Empfänger zur Verfolgung einer Einprägung nach einer Knochenmarkstransplantation; DNA-Mischversuche (Fig. 12) zeigen, daß unter Verwendung dieser Sonden niedrige Mengen an Chimaerismus festgestellt werden können.
In den folgenden Beispielen werden Temperaturen in ºC angegeben, und die Sonden 33.6 und 33.15 sind die in der britischen Patenveröffentlichung 2,166,445 beschriebenen, die die Übereinstimmungs-Wiederholungssequenz aufweisen:
(A) AGGGCTGGAGG bzw. AGAGGTGGGCAGGTGG.

Beispiel 1

Diese Beispiel beschreibt die Isolierung und die Eigenschaften eines spezifizierten Minisatelliten-Fragments in einem DNA-Fingerprint.

Allgemeine Verfahren

DNA wurde aus weißen Blutkörperchen isoliert wie beschrieben wird von Jeffreys A.J. et al. (1985) Nature 316, 76-79 sowie aus einer mit dem Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zellinie (vgl. Nilsson, K. et al. (1971) Int. J. Cancer 8, 443-450), die von dem Individuum III 9 des HPFH- Stammbaums stammt, das beschrieben ist von Jeffreys et al., Am. J. Hum. Genet. 39, 11-24. Eine Restriktionsverdauung und Southern-Blot-Hybridisierungen wurden durchgeführt, wie an anderer Stelle in den obigen Publikationen von Jeffreys A.J. et al. beschrieben wird. Doppelsträngige DNA-Sonden-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf DE81-Papier isoliert, wie von Dretzen, G. et al. (1981) Anal. Biochem. 112, 295-298 beschrieben wird, und mit ³²P markiert durch statistisches Oligonucleotid-Priming, wie beschrieben wird von Feinberg A.P. et al. (1984), Anal. Biochem. 137, 266-267; die einzelsträngige Minisatelliten-Sonde 33.15 wurde hergestellt, wie beschrieben wird von Jeffreys et al. (1985) Nature 314, 67-73.

Klonieren des hypervariablen Fragments q

600 ug der DNA der lymphoblastoiden Zellinie des Individuums III 9, die mit Sau3A verdaut worden war, wurde durch Elektrophorese durch ein 0,5%iges Agarosegel fraktioniert, und relevante Größenfraktionen wurden durch Elektroelution auf eine Dialysemembran gesammelt, wie beschrieben wird in Yang, R.C.A. et al., (1979) Meth. Enzymol, 68, 176-182. Nach zwei Zyklen einer präparativen Gelelektrophorese wurde das Fragment g 1000fach gereinigt (Ausbeute 150 ng DNA). 20 ng dieser teilweise gereinigten Fraktion wurde an 60 ng λL47.1-Arme ligiert, die nach einer Spaltung mit BamHI isoliert wurden (vgl. Loenen, W. A. M . . und Branmar, W.J. (1980), Gene, 20, 249-259), in vitro verpackt und auf E.coli WL95 ausgebracht (803, supE, supF, hsdRk&supmin;, hsdMk&spplus;, tonA, trpR&supmin;, metβ, Lysogen für P2) [vgl. die obige Publikation von Loenen und Jeffreys, A.J. et al. (1982) J. Mol. Biol. 156, 487-503], um Rekombinanten herauszusuchen. Die erhaltene Bibliothek von 1500 rekombinanten Phagen wurde durch Plaquehybridisierung mit der Minisatelliten-Sonde 33.15 gescreent. Vier positive Plaques wurden erneut ausplattiert und wiederum an E.coli ED8910 gescreent (803, supE, supF, recB21, recC22, hasS) [vgl. die obige Veröffentlichung von Loenen], und rekombinante Phagen- DNA wurde nach dem Verfahren von Blattner et al. (1977), Science 194, 161-169 hergestellt. Das Sau3A-Insert des rekombinanten Phagen g3 wurde in die BamHI-Position von pUC13 subkloniert [Vieira J. und Messing J. (1982), Gene 19, 259-268] und in ein recA-Derivat von E.coli JM83 JM83, Δ (recA-srlR) 306::Tn10 propagiert [vgl. Matfield, M (1983) Dissertation, University of Leicester].

DNA-Seqquenz-Analyse

p λg3-DNA wurde durch Beschallung aufgeschlossen, größenselektiert und im Schrotschußverfahren in die SmaI-Position von Ml3mpl9 kloniert [vgl. Yanis-Perron C. et al. (1985), Gene 33, 103-119]. Um die DNA-Sequenz des tandem-repetitiven Bereichs von p λg3 zu bestimmen, wurden 12 statistische Klone nach dem Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren sequenziert [vgl. Sanger, F. et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 , und Biggin M.D. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3963-3965]. Acht dieser Klone wurden aus dem tandem-repetitiven Minisatelliten-Bereich von pλg3 erhalten und wurden dazu verwendet, die Übereinstimmungs-Repeat-Sequenz zu definieren. Ml3-Klone, die die 5' und 3'-Flankierungsbereiche enthielten, wurden durch Hybridisierung mit ³²P-markierten Flankierungssonden a und b nachgewiesen (vgl. die unten beschriebene Fig. 1) und sequenziert, um die Sequenz des flankierenden Bereichs zu bestimmen sowie die Anfangs- und Endpunkte des Minisatelliten.

Ergebnisse

Isolation eines spezifischen Minisatelliten aus einem DNA- Fingerprint

Das Individuum III 9 aus dem Gujarati-Stammbaum, beschrieben von Jeffreys et al. [(1986), Am. J. Hum. Genet. 39, 11-24] leidet an HPFH (ererbte Persistenz von fötalem Hämoglobin), und ihr DNA-Fingerprint, nachgewiesen in einem Sau3A-Verdauungsprodukt mit der Minisatelliten-Sonde 33,15, enthält ein polymorphes Fragment von 8,2 kb (Fragment "g"; Fig. 1A), das dazu neigt, mit HPFH bei anderen Mitgliedern dieses Stammbaums cosegregiert zu werden, wie beschrieben wird in (1986) Am. J. Hum. Genet. 39, 11-24. Dieses DNA-Fragmentwurde aus anderen Minisatelliten-Fragmenten herausgereinigt unter Verwendung von zwei Durchgängen einer präparativen Gelelektrophorese (Fig. 1).
Fig. 1 illustriert diese Reinigung durch Gelelektrophorese. DNA des Individuums III9 in dem von Jeffreys et al. beschriebenen Stammbaum wurde mit Sau3A verdaut, und 6 bis 9 kb-Fragmente wurden durch präparative Gelelektrophorese gesammelt (Fraktion 1). Diese Fragmente wurden noch einmal elektrophoresiert und lieferten die Fraktionen 2 bis 5. Teilmengen der mit Sau3A verdauten III9 DNA sowie jeder Fraktion wurden durch ein 0,8% Agarosegel elektrophoresiert und dann Southern-Blot-hybridisiert mit der Minisatellitensonde 33.15. Fragment g (8,2 kb), das die Neigung zeigt, mit HPFH zu cosegregieren, ist in Fraktion 3 etwa 1000fach gereinigt.
Das Fragment "g", das in dem oben bezeichneten Sau3A-Verdauungsprodukt entdeckt wurde, und das wie beschrieben gereinigt worden war, so daß eine etwa 1000fach angereicherte Fragment "g"-Fraktion hergestellt wurde, wurde in λL47.1 kloniert, wie in der oben beschriebenen Veröffentlichung von Loenen und Brammer beschrieben wird, und an P2-lysogenem rec&spplus; E. coli propagiert, um rekombinante Phagen zu selektieren. Die erhaltene Bibliothek wurde durch Hybridisierung mit Sonde 33.15 gescreent. Die vier erhaltenen positiven Plaques waren sehr klein (Plaques < 0,1 mm Durchmesser), konnten jedoch mit einer niedrigen Effizient wieder ausplattiert werden (0-8 pfu/Plaque) auf recB, recC E. coli, wobei Plaques von Normalgröße (1 mm Durchmesser) erzeugt wurden. Zwei Klone, λgl und λg3 wurden weiter charakterisiert, und es wurde gezeigt, daß sie ein Sau3A-Insert von 7,7 bzw. 7,8 kb enthielten. Diese Klone leiteten sich beide aus dem Band g (vgl. unten) ab, waren jedoch um 0,5 bzw. 0,4 kb kürzer als das Band g. Da es keine Größenheterogenität der Sau3A-Inserts bei irgendeinem λg1 oder λg3, gezüchtet auf recB, recC E. coli (Daten nicht gezeigt) gab, schließen wir, daß ein Teil des Inserts aus jedem Klon verloren gegangen war, während ihrer anfänglichen Propagierung in rec&spplus; E. coli.
Die Ausbeuten an λg1 und λg3 DNA, hergestellt nach dem Blattner-Verfahren [vgl. (1977), Science 194, 161-1969] waren sehr niedrig (1% der Normalausbeuten von λL47.1 rekombinanter DNA), was wiederum auf anormale Wachstumseigenschaften dieser Minisatellitenklone hinweist. Der Sau3A-Insert wurde daher in pUC13 subkloniert [vgl. Vieira, J. und Messing J. (1982), Gene 19, 259-268], und in einem recA-Derivat von E. coli JM83 propagiert [vgl. Matfield M. (1983) Dissertation University of Leicester], um eine Umlagerung des Inserts minimal zu halten. Der erhaltene Subklon, p λg3 (vgl. die unten beschriebene Fig. 1B) enthielt einen 7,1 kb Sau3A-Insert, der 0,7 kb kürzer war als der Insert in λg3.

Organisation des Minisatellitenfragments q

Die Struktur des Minisatellitenfragments in pλg3 wurde durch Restriktionskartierung (Fig. 1B) und DNA-Sequenzierung (Fig. 2) bestimmt.
Fig. 1B zeigt die Organisation des DNA-Fragments g. Der Sau3A-Insert in pλg3 wurde mit den Restriktionsendonukleasen AluI (A), DdeI (D), Hae III (H), MboII (M), PstI (P) und Sau3A (S) kartiert. Es existiert keine Spaltstelle für HinfI oder RsaI. Der 7,14 kb-Insert enthält 171 Tandem-Repeats einer 37 bp-Sequenz (vgl. Fig. 2) plus 747 bp an Flankierungs-DNA. Der 5'-flankierende Bereich enthält den Anfang eines invertierten Alu-Elements (schattiert). Die Ursprünge der einzigartigen Sequenz-flankierenden Sonden a und b sind gezeigt.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des hypervariablen Fragments g. Die Sequenz der die 5'- und 3'-Flankierungsbereiche sowie der Anfang und das Ende des Minisatelliten ist zusammen mit den Wiederholungssequenzen von 3 statistischen Bereichen (a-c) aus dem Minisatelliten gezeigt. Der Anfang des invertierten Alu-Elements ist in unterstrichenen Großbuchstaben gezeigt, und verschiedene einfache Sequenzbereiche in dem 5'-Flankierungsbereich sind unterstrichen. Die Übereinstimmungssequenz (con) der 37 bp-Minisatelliten-Repeateinheit ist gezeigt, und Abweichungen von dieser Übereinstimmung werden für individuelle Repeat-Einheiten angegeben. Die zweite Repeat-Einheit im Bereich c enthält eine HaeIII-Spaltstelle (unterstrichen), und dieser Bereich überbrückt daher die interne HaeIII-Stelle im Minisatelliten (Fig. 1B). Die Übereinstimmungs-Repeat-Sequenz ist auch in Ausrichtung mit der "Kern"-Sequenz in einer ähnlichen Weise gezeigt, wie in der britischen Patentveröffentlichung Nr. 2166445.
Der Klon pλg3 enthält einen 6,3 kb-Minisatelliten ohne Restriktionsstellen, abgesehen von einer einzigen internen HaeIII-Stelle. Der Minisatellit wird von 171 Wiederholungen einer 37 bp-Einheit gebildet, die die Sequenz GTGGGCAGG enthält; diese Sequenz entspricht präzise dem am wenigstens variablen Teil der 11 bis 16 bp-Kernsequenz, von der bereits vorher festgestellt worden war, daß sie bei verschiedenen unterschiedlichen humanen Minisatelliten auftritt (vgl. britischen Patentpublikation Nr. 2166445 und Fig. 2 hierin). Die Repeat-Einheiten sind nicht vollständig homogen; eine Sequenzanalyse von verschiedenen statistisch ausgewählten Bereichen aus dem Minisatelliten führte zur Feststellung einer begrenzten Menge an Repeat-Sequenz-Variation. Die meisten Varianten, einschließlich einer 4 bp-Deletion, die eine Untergruppe von 33 bp-Repeat-Einheiten erzeugt, sind über mehr als eine Repeat-Einheit verstreut. Eine Variante (eine A-> C-Transversion in Region C) erzeugt die einzige interne HaeIII-Stelle und wird daher wahrscheinlich nur in einer Repeat-Einheit gefunden. Die Start- und End-Repeat- Einheiten des Minisatelliten zeigen bemerkenswert stärkere Sequenzabweichungen als interne Repeats.
Der Minisatellit in pλg3 wird von einer nicht-wiederholten DNA flankiert, die die normale Dichte an Restriktionsstellen (Fig. 1B) aufweist. Der Anfang des 5'-Flankierungsbereichs wird von dem- Kopf eines invertierten Alu-Elements gebildet. Die restlichen 5'- und 3'-Flankierungsbereiche, die durch die Hybridisierungssonden a und b definiert werden (Fig. 1B) stellen eine einzigartige Sequenz DNA dar und hybridisieren nur mit diesem Locus der gesamten DNA (Daten nicht gezeigt). Der 5'-Flankierungsbereich enthält eine erhebliche Menge an einfacher Sequenz DNA [Polypurin und (ACC)n] (Fig. 2).

Das Minisatelliten-Fragment g weist einen einzelnen polymorphen Locus nach

Um zu bestimmen, ob das gesamte klonierte Minisatelliten- Fragment als eine Hybridisierungs-Sonde zum spezifischen Nachweis des entsprechenden Locus in humaner DNA verwendet werden kann, wurde der Sau3A-Insert aus pλg3 in Gegenwart von humaner Konkurrenz DNA zu einer mit HinfI, dem routinemäßig für DNA-Fingerprint verwendeten Restriktionsenzym, verdauten humanen DNA hybridisiert (Fig. 3).
Fig. 3 zeigt die Mendel'sche Vererbung von polymorphen DNA- Fragmenten, die durch pλg3 nachgewiesen werden. 8 ug-Proben von humaner DNA wurden mit HinfI verdaut und durch ein 0,8% Agarosegel elektrophorisiert. Die Verdauungsprodukte wurden mit dem Sau3A-Insert aus pλg3 Southern-Blot-hybridisiert, in 1 · SSC bei 65ºC in Gegenwart von 6% Polyethylenglykol und 50 ug/ml Alkali-geschnittener humaner Placenta-Konkurrenz-DNA, und nach einer Hybridisierung in 0,2 · SSC bei 65ºC gewaschen. pλg3 weist einen einzigen Locus nach, der bei allen gezeigten Individuen heterozygot ist. Die Vererbung der Allele (durch Buchstaben angezeigt) ist Mendelsch.
Bei hoher Stringenz (0,2 · SSC, 65ºC) wurden entweder eines oder zwei hybridisierende Fragmente bei allen untersuchten Individuen festgestellt. pλg3 wies das 8,2 kb-Fragment g in vorher getesteten Verwandten von III9 nach, was bestätigt, daß das Band g geklont worden war (Daten nicht gezeigt). Bei niedrigerer Stringenz (1 · SSC, 65ºC) wurden zusätzliche schwach hybridisierende polymorphe DNA-Fragmente nachgewiesen.
Die durch p g3 bei hoher Stringenz nachgewiesenen DNA-Fingerprints segregieren auf Mendel'sche Weise als Allele eines einzigen Locus (Fig. 3). Dieser Locus ist nicht geschlechtsgebunden und wies außerdem keine signifikante, jedoch unvollständige Geschlechtsgebundenheit bei zwei großen untersuchten Stammbäumen auf (61 Abkömmlinge getestet, = 0,18 bei = 0,43). Der Locus verhält sich daher als autosomaler Locus und wurde auf Chromosom 7 lokalisiert (vgl. Tabelle 1).

Extreme polymorphe Variation an diesem Minisatelliten-Locus

HinfI-Verdauungsprodukte von DNA von 79 statistisch ausgewählten britischen Kaukasiern wurden mit dem Insert aus pλg3 gescreent, und zwar zuerst einzeln und dann in Pools von 14 Personen (1 ug DNA pro Individuum), die durch ein 35 cm langes 0,7% Agarosegel elektrophoresiert worden waren, um die Allel-Auflösung maximal zu machen. Die Längen der in dieser Populationsprobe nachgewiesenen unterschiedlichen Allele sind in Fig. 4 gezeigt, und zwar zusammen mit der geschätzten Anzahl von Wiederholungseinheiten in jedem Allel sowie den Allel-Häufigkeiten. Somit zeigt Fig. 4 die Verteilung von Minisatelliten-Allelgrößen. Die Länge des Minisatelliten bei dem kürzesten üblichen Allel wurde durch Genom-Kartierung dieses Fragments in einer Homozygote bestimmt, wobei die flankierenden Einzelkopie-Sonden a und b verwendet wurden (Fig. 1) (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Anzahl der Wiederholungen pro Allel ist angenähert und hängt vom Verhältnis der 37 bp-Repeat-Einheiten zu den 33 bp-Repeat-Einheiten in dem Minisatelliten ab. Nach Ausschluß des kurzen gemeinsamen Allels wurden die restlichen Allele entweder auf einmal gesammelt (42 Allele), zweimal (12 Allele), dreimal (12 Allele) oder viermal (5 Allele). Diese Verteilung unterscheidet sich nicht nennenswert von derjenigen, die vorausgesagt wird, wenn alle diese Allele einheitlich selten sind (q = 0,0081, ²[4 d.f.] ist 4,0), und sie ist daher mit einem einfachen Modell eines gemeinsamen kurzen Alleles (q = 0,165) und 103 gleichmäßig seltenen Allelen (q = 0,0081 pro Allel) konsistent, die in der Population vorhanden sind.
Wenigstens 77 unterschiedliche Allele konnten in dieser Populationsprobe aufgelöst werden, wobei die Repeat-Zahlen von 14 bis ungefähr 525 pro Allel lagen. Die Homozygoten in der Populationsprobe waren alle für das kürzeste Allel homozygot. Die obige Schätzung der Anzahl an Allelen und die mittlere Häufigkeit von seltenen Allelen werden durch die Gelauflösung limitiert, und die wahre Anzahl von Allelen unterschiedlicher Länge in dieser Probe kann größer sein.
Die Verteilung von Allel-Längen scheint nicht vollständig statistisch zu sein, zeigt jedoch Anzeichen einer Trimodalität (Fig. 4), mit kurzen (14 bis 16 Repeats), mittleren (41 bis 68 Repeats) und langen (107 bis 525 Repeats) Klassen von Allelen. Eine bimodale Verteilung von Allel-Längen wurde vorher bei Kaukasiern für den hypervariablen Bereich festgestellt, der in 5'-Stellung zum humanen Insulingen-lokalisiert ist [vgl. Bell, G.I. et al. (1982), Nature 295, 31 bis 35], obwohl diese Bimodalität bei Schwarzen nicht hervortritt [Lebo, R.V. et al. (1983), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 4804-4812].
Die Isolation des Fragments g demonstriert, daß die großen und stark polymorphen DNA-Fragmente im DNA-Fingerprint im Prinzip für ein molekulares Klonieren geeignet sind und locus-spezifische Sonden liefern, die geeignet sind, individuelle hypervariable Regionen zu untersuchen. Während das Fragment g im Bakteriophagen λ kloniert werden konnte, zeigten die resultierenden Klone anormale Wachstumseigenschaften auf rec&spplus; E. coli. Das führt zu einer Verarmung von Minisatelliten-Klonen aus herkömmlich vermehrten humanen Bibliotheken im Phagen. Der klonierte Minisatellit ist instabil sowohl im als auch beim Subklonieren im pUCl3 in recA E. coli; der endgültige rekombinante pλg3 hatte etwa 30 Repeat-Einheiten im Vergleich mit dem Fragment g verloren. Die physische Karte von pλg3 (Fig. 1) gibt daher die Organisation des Fragments g nicht vollständig wieder.
Das klonierte DNA-Fragment weist die Struktur auf, die man für einen Minisatelliten erwartet, wodurch nachgewiesen wird, daß das Fragment g sich nicht von einer längeren Satelliten- DNA ableitet. Ungeachtet des Vorhandenseins sowohl einer "Kern"-Sequenz in jeder Repeat-Einheit als auch des Teils einer Alu-Sequenz in dem 5'-Flankierungsbereich wirkt das klonierte Fragment g in Gegenwart von humaner Konkurrenz-DNA als eine locus-spezifische Sonde. Die Tatsache, daß pλg3 im Hinblick auf einen wirksamen Nachweis anderer kernhaltiger Minisatelliten versagt, ist auf die zusätzliche Nicht-Kern- DNA zurückzuführen, die in jeder Repeat-Einheit vorhanden ist, die wahrscheinlich die Kreuz-Hybridisierung mit anderen Minisatelliten stört (vgl. britische Patentveröffentlichung Nr. 2166445).
Der klonierte Minisatellit zeigt eine extreme Längenpolymorphie, vermutlich in Folge einer allelischen Variation sowohl bei der Anzahl der Repeat-Einheiten als auch bei dem Verhältnis von 37 bp- zu 33 bp-Repeat-Typen in jedem Allel. Bei einer statistischen Populationsprobe von 158 Chromosomen konnten ein gemeinsames und wenigstens 73 seltene Allele aufgelöst werden. Dieser Locus ist sehr viel stärker polymorph als die meisten oder alle klonierten humanen hypervariablen Bereiche, die bisher charakterisiert wurden, einschließlich der Auswahl von relativ kurzen geklonten Minisatelliten, wie man sie ursprünglich verwendete, um die "Kern"-Sequenz zu definieren [vgl. britische Patentveröffentlichung Nr. 2166445]. Die Heterozygosität an diesem Locus beträgt wenigstens 96,6 %, wobei sich die Hauptmenge an Homozygosität aus dem kurzen gemeinsamen Allel ergibt.
Neue Allele an diesem Locus werden durch die Veränderung der Repeat-Anzahl erzeugt, und zwar entweder durch Verrutschen während der DNA-Replikation oder durch einen ungleichmäßigen Austausch, der von der "Kern"-Sequenz gefördert wird, die als Rekombinationssignal gilt. Nach der Hypothese des statistischen Drifts einer neutralen Mutation kann der Parameter 4Nev (R), worin Ne die wirksame Populationsgröße ist und v die Mutationsrate pro Gamete zu einem Allel neuer Länge ist, sehr genau abgeschätzt werden aus der Anzahl von unterschiedlichen Allelen, die in einer Populationsprobe gezählt werden, und zwar unter Verwendung eines infiniten Allel-Modells [vgl. Ewens W. J. (1972) Theor. Popul. Biol. 3, 87-112]. Wir schätzen e auf 60 bis 90 für diesen Locus, und zwar in Abhängigkeit davon, ob man das gemeinsame kurze Allel einschließt oder nicht. Da Ne für den Menschen ungefähr 104 beträgt, ist die Mutationsrate v zu Allelen neuer Länge an diesem Locus etwa 0,002 pro Gamete. Dieser Wert von v ist eine Niedrigschätzung, da die Anzahl von nachgewiesenen Allelen durch die Gel-Auflösung limitiert ist und da die Anzahl von potentiell auflösbaren Allelen nicht unbegrenzt ist. Die mittlere Länge der Minisatelliten DNA an diesem Locus beträgt 5 kb, und somit beträgt die Mutations-(Rekombinations-)Rate pro kb des Minisatelliten > 4 · 10-4, vgl. mit 10&supmin;&sup4; pro kb, wie sie für andere kürze kernhaltige Minisatelliten und eine mittlere meotische Rekombinationsrate von. 10&supmin;&sup5; pro kb für humane DNA abgeschätzt wird [vgl. Jeffreys, A. J. et al. (1985), Nature 314, 67-73]. Somit ist die Rate der Erzeugung neuer Allele an diesem Minisatelliten-Locus bemerkenswert hoch, was konsistent ist mit den früheren Annahmen des Erfinders, daß diese kernreichen Regionen heiße Punkte für die Rekombination sein können. Vermutlich ist die Mutationsrate für kurze Allele relativ niedrig, was erklären könnte, wie das kürzeste Allel driften konnte, so daß es eine signifikante Häufigkeit in der Population erreicht, ohne daß es durch einen ungleichen Austausch während dieses Prozesses zerrissen wurde.
DNA-Fingerprints haben sich als ein wirksames Verfahren zur individuellen Identifizierung und zur Feststellung von Familienbeziehungen in beispielsweise Vaterschafts- und Immigrations-Streitigkeiten erwiesen. Die Genauigkeit dieses Verfahrens wird durch die niedrige mittlere Wahrscheinlich x bestimmt, daß ein Band von zwei statistisch ausgewählten Individuen geteilt wird. Für britische Kaukasier wurde x empirisch auf 0,2 abgeschätzt für DNA-Fingerprint-HinfI-Fragmente, die länger sind als 4 kb. In Fällen, in denen es zu einem gemeinsamen Band zwischen Individuen kommt (d. h. wenn ein Band bei einem Individuum mit einem zweiten Individuum durch ein Band von ähnlicher Mobilität und Autoradiographie- Intensität simuliert wird), ist es nicht klar, ob die gemeinsamen Bänder identische Allele des gleichen Minisatelliten- Locus repräsentieren. Die Allel-Verteilung in Fig. 4 ermöglicht es uns, x für Allele > 4 kb zu errechnen; für diesen spezifischen Minisatelliten-Locus x = 0,016, d. h. eine Größenordnung niedriger als die Schätzung aus Multi-Locus-DNA- Fingerprints. Wenn dieser klonierte Minisatellit typisch für Loci ist, die in DNA-Fingerprints erscheinen, dann sind die meisten Banden, die von nicht miteinander verwandten DNA-Fingerprints geteilt werden, folgen einer zufälligen Comigration von unterschiedlichen Minisatelliten-Fragmenten. Die wichtige praktische Konsequenz davon ist die, daß in Fällen eines Nicht-Ausschlusses bei beispielsweise Vaterschafts-Streitigkeiten, in denen alle väterlichen Bänder in einem Kind präzise in dem DNA-Fingerprint des angenommenen Vaters vorhanden sind, die sehr niedrige Wahrscheinlichkeit einer falschen Erfassung, die vorher für x = 0,2 errechnet wurde, eine grobe Überschätzung der wirklichen Wahrscheinlichkeit ist (für x = 0,016).
Unter Verwendung der DNA-Fingerprint-Sonden 33.6 und 33.15 ist es möglich, die Segregation von bis zu 34 dispersen autosomalen Loci in großen humanen Verwandtschaften zu verfolgen. Bei den meisten untersuchten Loci ist nur eines der beiden Allele in dem Satz von größeren (> 4 kb) aufgelösten DNA-Fingerprint-Fragmenten zählbar, was es nahelegt, daß zwischen Minisatelliten-Allelen starke Größenunterschiede existieren, wobei viele Allele in dem schlecht aufgelösten (< 4 kb)-Bereich des DNA-Fingerprints lokalisiert sind. Das ist auch für den klonierten Minisatelliten zu erkennen; HinfI-Allele an diesem Locus variieren von 1,7 bis 20,4 kb in ihrer Länge, und die Allel-Häufigkeitsverteilung in Fig. 4 zeigt, daß beide Allele dieses Locus in den DNA-Fingerprints von nur 40 % der Individuen aufgelöst würden, während keines der Allele bei 14% der Leute bewertbar wäre.
Die Minisatelliten-Sonden 33.6 und 33.15 weisen zusammen etwa 60 hypervariable Loci nach, von denen viele nunmehr für ein Klonieren geeignet sein sollten, so daß eine Bank von hoch informativen Einzel-Locus-Sonden geschaffen wird, die beispielsweise ideal ist für Verknüpfungsuntersuchungen beim Menschen. Eine Verknüpfungsanalyse von vererbten Erkrankungen ist auch bei einzelnen großen Familien möglich, unter Verwendung des gesamten DNA-Fingerprints. Wenn ein polymorphes Fragment nachgewiesen wird, das mit der Erkrankung cosegregiert zu werden scheint, ist es wesentlich, daß dieses Fragment kloniert wird, um eine locus-spezifische Sonde zu erhalten, um die Verknüpfungsanalyse auf zusätzliche betroffene Familien auszudehnen.
In dem nachfolgenden Beispiel 2 wurden die nachfolgend erläuterten Materialien und Methoden verwendet.

a) Klonieren einer Auswahl von großen Minisatelliten

5 ug Blut-DNA von jedem von 40 statistisch ausgewählten Individuen wurden gepoolt, vollständig mit Sau3A verdaut, und 5 bis 15 kb-Fragmente wurden durch präparative Elektrophorese in einem 0,6% Agarosegel isoliert, woran sich eine Elektroelution auf eine Dialysemembran anschloß. Die gereinigte Fraktion wurde elektrophoresiert in einem zweiten präparativen Gel, um alle Spuren von kontaminierenden kleinen Sau3A- Fragmenten zu entfernen. 50 ng der 5 bis 15 kb-Fraktion wurden an 100 ng λL47.1 Arme ligiert, die man nach einer Spaltung mit BamHI [Loenen und Brammer, (1980), Gene 20, 249 bis 259] isoliert hatte, in vitro verpackt, und es wurde eine Bibliothek konstruiert, mit humanen Minisatelliten-Sonden 33.6 und 33.15 gescreent (vgl. britische Patentveröffentlichung Nr. 2166445), und positive Plaques wurden wie im Beispiel 1 beschrieben isoliert, um die MS-Reihe des rekombinanten Phagen zu erzeugen.

b) Isolierung von Minisatelliten-Hybridisierungs-Sonden

Rekombinante Phagen-DNA wurde mit Sau3A verdaut, und das große Insert-Fragment wurde von kleinen Vektor-Fragmenten durch Elektrophorese in einer Agarose von niedriger Geliertemperatur getrennt (Sea Plaque). Der Gelauschnitt, der den Insert enthielt, wurde in drei Volumina Wasser bei 65ºC aufgelöst, und Teilmengen, die 10 ng Insert-DNA enthielten, wurden durch statistisches Polynucleotid-Priming mit ³²P markiert [Feinberg und Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137, 266-267].

c) Southern-Blot-Hybridisierung

Genom-DNA-Proben wurden gespalten und elektrophoresiert, wie von Jeffreys et al. (1986) Am. J. Hum. Genet. 39, 11-24 beschrieben wird. DNA wurde auf Hybond-N (Amersham) übertragen, durch UV-Bestrahlung fixiert und bei 65ºC 5 Minuten in 0,5 M Natriumphosphat, 7% SDS, 1mM EDTA (pH 7,2) vorhybridisiert [Church und Gilbert, (1984), Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81, 1991-1995]. Filter wurden über Nacht mit 0,5 ug/ml ³²P-markierter Sonden-DNA (spezifische Aktivität ungefähr 109 cpm/ug DNA) in Gegenwart von 25 ug/ml gespaltener einzelsträngiger humaner Placenta-Konkurrenz DNA hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei 65ºC in 40 mM Natriumphosphat, 1% SDS (pH 7,2) gewaschen, woran sich ein Waschen mit hoher Stringenz bei 65ºC in 0,1 · SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat, pH 7,0), 0,01% SDS anschloß. Die Filter wurden autoradiographiert für drei Stunden bis zu einer Woche bei -80ºC in Gegenwart eines Verstärkungsschirms.

d) Bestimmung der Tandem-Repeat-Sequenz der MS-Rekombinanten

Jede DNA der MS-Rekombinanten wurden sonifiziert und 0,3 bis 0,6 kb-Fragmente wurden größenselektioniert und im Schrotschußverfahren in die SmaI-Position von Ml3mpl9 kloniert [Yanis-Perron, Vieira und Messing, (1985), Gene 33, 103-119]. Rekombinante Phagen wurden durch Plaque-Hybridisierung mit ³²P-markierter MS-Insert-DNA gescreent. Zehn stark positive einzelsträngige Phagen-DNAs aus einem gegebenen MS-Rekombinanten wurden paarweise nach dem C-Test verglichen [Winter und Fields (1980) Nucleic Acids Res. 8, 1965-1974]; die meisten DNA fielen in zwei komplementäre C-Test-Gruppen, weshalb sie sich wahrscheinlich von dem langen, tandem-repetitiven Bereich des λMS-Inserts ableiteten. Zwei Ml3-Rekombinanten aus jeder der beiden komplementären Gruppen wurden nach der die Desoxynucleotid-Ketten-Abbruchmethode sequenziert [Sanger, Nicklen und Coulson, (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467; Biggin, Gibson und Hong (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963-3965], um die Übereinstimmungs-Repeat-Sequenz eines jeden MS-Rekombinanten an beiden Strängen zu bestimmen.

Beispiel 2

a) Isolierung einer Auswahl von locus-spezifischen hyoervariablen DNA-Sonden

Die Strategie zum Klonieren eines ausgewählten Fragments aus einem humanen DNA-Fingerprint durch Isolierung des Fragments durch präparative Gelelektrophorese und anschließendes Klonieren in Bakteriophagen wurde in Beispiel 1 beschrieben. Um einen größeren Bereich von Minisatelliten zu isolieren, wurden 6 bis 15 kb-größen-selektierte Sau3A-Fragmente aus DNA, die aus 40 statistisch ausgewählten Individuen gepoolt worden war, in den BamHI-Ersatzvektor λL47.1 kloniert [Leonen und Brammer, (1980); "A bacteriophage lambda vector for cloning large DNA fragments made with several restriction enzymes", Gene 20, 249, 259]. Da humane Minisatelliten eine beträchtliche Allel-Variation bezüglich ihrer Länge aufweisen können, wie in Beispiel 1 gezeigt worden war, sollte die Verwendung von gepoolten humanen DNA-Proben zur Klonierung großer Sau3A- Fragmente die Anzahl von klonierbaren variablen Loci, die große Sau3A-Allele aufweisen, maximieren. Aus einer Bibliothek von 2000 Rekombinanten wurden 5 Phagen isoliert durch Hybridisierung mit der humanen Minisatelliten-Sonde 33.15, und weitere 5 Phagen wurden durch Sonde 33.6 nachgewiesen, wodurch die MS-Reihe von Rekombinanten erzeugt wurde (vgl. Tabelle 1). Tabelle 1 Zusammenstellung von hypervariablen locus-spezifischen Minisatelliten-Sonden Klon nachgewiesen durch andere Isolate Sau3A Variation Insertlänge nachgewiesen mit Heterozygosität Allel-Länge Bereich Chromosomen Zuordnung
Um zu bestimmen, ob jede λMS-Rekombinante als eine locusspezifische Sonde für einen hypervariablen Minisatelliten dienen könnte, wurde der Sau3A-Insert einer jeder Rekombinanten hybridisiert in Gegenwart von humaner Konkurrenz DNA zu HinfI-Verdauungsprodukten von drei statistisch ausgewählten Individuen, oder zu AluI-Verdauungsprodukten für λMS32, deren Minisatelliten-Tandem-Repeat-Einheiten eine HinfI-Position (Fig. 5) enthalten. Acht von 10 der Rekombinanten hybridisierten an eines oder zwei große variable DNA-Fragmente in jeder untersuchten humanen DNA. Vier der durch die Sonde 33.6 nachgewiesenen Rekombinanten (λMS8, 40, 42 und 47) hybridisierten mit demselben Muster von variablen DNA-Fragmenten und leiten sich deshalb von dem gleichen hypervariablen Locus ab (Fig. 5, Tabelle 1).
Fig. 5. zeigt ein Beispiel für das Screening von λMS-Rekombinanten auf locus-spezifische hypervariable DNA-Sonden. 2 ug-Proben von DNA aus drei nicht miteinander verwandten Individuen wurden mit HinfI verdaut, durch ein 0,8% Agarosegel elektrophoresiert und Southern-Blot-hybridisiert mit 32 P-markierten Sau3A-Inserts aus pλg3 (Beispiel 1), λMS8 und λMS40, wie sie hierin in "Materialien und Methoden" beschrieben sind. Die Filter wurden nach der Hybridisierung in 0,1 · SSC bei 65ºC gewaschen, und in Gegenwart eines Verstärkungsschirms einen Tag (linke Platte) oder eine Wochen (rechte Platte) autoradiographiert. Es ist darauf hinzuweisen, daß λMS8 und λMS40 den gleichen hypervariablen Locus nachweisen und daß bei einer verlängerten Autoradiographie zusätzliche variable DNA-Fragmente nachweisbar werden.
Die restlichen Rekombinanten λMSl, 31, 32 und 43 leiteten sich von anderen Loci ab, die nicht den vorher charakterisierten pλg3 Locus einschlossen (vgl. Beispiel 1 und Fig. 5). Obwohl keine dieser λMS-Rekombinanten DNA "Fingerprints" von multiplen variablen Fragmenten erzeugte, wurde festgestellt, daß die meisten λMS-Sonden schwach mit zusätzlichen polymorphen DNA-Fragmenten bei einer verlängerten Autoradiographie-Entwicklung kreuzhybridisierten (Fig. 5).
Zwei der λMS-Rekombinanten, die durch die Sonde 33.15 nachgewiesen wurden, λMS3 und λMS30, versagten im Hinblick auf einen Nachweis eines spezifischen Locus in einer humanen DNA, die mit HinfI oder Sau3A verdaut worden war und zwar sowohl in Anwesenheit oder in Abwesenheit von humaner Konkurrenz- DNA. Bei verlängerter Autoradiographie wiesen beide Rekombinanten das gleiche Scheinmuster von variablen DNA-Fragmenten nach (Ergebnisse nicht gezeigt). Wir haben keine Erklärung für diesen Mangel an Locus-Spezifität, und diese beiden MS-Rekombinanten wurden nicht weiter charakterisiert.
Somit waren wir ungeachtet der vorher berichteten Schwierigkeiten beim Klonieren von großen und instabilen humanen Minisatelliten [vgl. z. B. Nicholls et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 7569-7578 und Wyman et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 6754-6758] in der Lage, zu demonstrieren, daß wenigstens einige der größten und am stärksten variablen DNA- Fragmente, die in einem DNA-Fingerprint nachgewiesen werden, für ein Klonieren im Bakteriophagen λ zugänglich sind, vorausgesetzt, daß die Inserts durch eine Propagierung des Phagen in einem recBC E. coli-Wirt stabilisiert werden.

b) Bestimmung der Repeat-Sequenz-Einheiten von klonierten Minisatelliten

Statistische Segmente von Insert-DNA aus jedem λMS-Rekombinanten wurden sequenziert, um festzustellen, ob jeder klonierte hypervariable Locus aus tandem-repetitiven Minisatelliten bestand (vgl. Materialien und Methoden). Es konnte für λMS-Klone gezeigt werden, daß sie primär aus Tandem-Repeat- Einheiten bestanden, die in ihrer Länge von 9 bp für λMSl bis 45 bp für λMS43 variierten (Fig. 6).
Fig. 6 zeigt die Übereinstimmungs-Wiederholungssequenz-Einheit der λMS-Reihe von Minisatelliten. Statistische Segmente eines jeden klonierten Minisatelliten wurden sequenziert, um die Übereinstimmungs-Repeat-Einheit zu definieren. Variable Positionen in jeder Übereinstimmungs-Einheit sind gezeigt als: R, r = A oder G; Y, y = C oder T; N, n = irgendeine Base. Der Minisatellit in λMS8 besteht aus zwei sich gegenseitig durchsetzenden Wiederholungs-Einheiten von 29 und 30 bp Länge. Die Übereinstimmungs-Wiederholungs-Sequenz von pλg3 ist in Fig. 2 ebenfalls gezeigt. Jede Repeat-Sequenz ist in Ausrichtung mit der Kern-Sequenz dargestellt, wobei Übereinstimmungen in Großbuchstaben gezeigt sind, und eine neue Kern-Sequenz, die sich aus einem Vergleich des Kerns mit pλg3, λMS31 und λMS32 ergibt, wird ebenfalls offenbart. Bei keinem Minisatelliten sind die Repeat-Einheiten vollständig homogen, was mit der Variation zwischen Repeat-Einheiten konsistent ist, die man bei vorher sequenzierten Minisatelliten feststellt (vgl. britische Patentveröffentlichung Nr. 2166445 und Beispiel 1 hierin). Am bemerkenswertesten ist, daß der Minisatellit in λMS8 aus einer vermischten Anordnung von 2 eng verwandten, jedoch unterschiedlichen Repeat- Einheiten einer Länge von 29 und 30 bp besteht (Fig. 6). Die Endpunkte der Minisatelliten in den λMS-Rekombinanten wurden noch nicht bestimmt.
Somit wurden fünf neue hypervariable Loci isoliert, von denen jeder in der Hauptsache aus einem tandem-repetitiven Minisatelliten bestand. Die Tandem-Repeat-Einheiten von pλg3, λMSl, λMS31 und λMS32 enthalten jeweils die Kern-Sequenz, wie zu erwarten war (Fig. 6). Die Kopien der Kern-Sequenz sind jedoch nicht perfekt, und Vergleiche der Repeat-Einheiten dieser Minisatelliten definieren keine klare neue Kern- Sequenz, die vorzugsweise mit diesen großen und extrem variablen Loci assoziiert ist. Es erscheint statt dessen wahrscheinlich, daß ein großer Bereich von Kern-Derivaten mit großen Minisatelliten assoziiert sein kann. Bemerkenswerter ist, daß die Minisatelliten λMS8 und λMS43, die durch die Sonde 33.6 nachgewiesen wurden, die aus Tandem-Repeats einer abweichenden Version der Kern-Sequenz besteht (vgl. britische Patentveröffentlichung Nr. 2166445), stark abweichende Versionen der Kern-Sequenz enthalten (Fig. 2). Wiederum zeigen Vergleiche von λMS8, λMS43 und 33.6 keine klare neue spezifische Sequenz, die vorzugsweise mit diesen drei Loci assoziiert ist (Ergebnisse nicht gezeigt). Es ist klar, daß eine detaillierte Suche nach weiteren Sequenz-Motiven, die mit den am stärksten variablen Minisatelliten, insbesondere den mit der Sonde 33.6 nachgewiesenen, assoziiert ist, die Analyse eines sehr viel größeren Spektrums von klonierten Minisatelliten erfordert.

c) Mendel'sche Vererbung und Variabilität von Loci, die durch klonierte Minisatelliten nachgewiesen werden

Die fünf isolierten neuen Minisatelliten, λMSl, 8, 31, 32 und 33 weisen jeweils einen einzelnen großen und variablen Locus nach. Die Mendel'sche Vererbung aller Loci wurde durch die Analyse der Segregation in großen horizontalen Stammbäumen bestätigt, die von dem CEPH-Programm geliefert werden (Fig. 7).
Fig. 7 zeigt die Mendel'sche Vererbung des hypervariablen Locus, der durch λMS32 nachgewiesen wird. 1 ug DNA-Proben der CEPH-Familie 1413 wurde mit AluI verdaut und mit dem ³²P-markierten Sau3A-Insert aus λMS31 Southern-Blot-hybridisiert. Diese Familie ist an diesem Locus vollständig informativ.
Das Ausmaß der Allel-Variabilität wurde für jede Sonde dadurch abgeschätzt, daß man die Häufigkeit des gemeinsamen Auftretens von Allelen bei statistisch ausgewählten englischen Individuen analysierte (Fig. 8). Fig. 8 liefert eine Abschätzung der Allel-Variabilität an dem hypervariablen Locus, der von λMS43 nachgewiesen wird. 1 ug-Proben von DNA aus 20 statistisch ausgewählten Engländern wurden mit HinfI verdaut und mit λMS43 Southern-Blot-hybridisiert. Alle Individuen sind heterozygot, was zeigt, daß das Ausmaß an Heterozygosität an diesem hypervariablen Locus hoch ist (H > 0,86, p > 0,95). Eine genauere Abschätzung der Heterozygosität kann durchgeführt werden, indem man die Allele in jedem Individuum mit Allelen der sechs nächsten Nachbarn auf dem Autoradiograph vergleicht, um den Grad des gemeinsamen Auftretens der Allele zwischen den Individuen abzuschätzen. Beispielsweise scheint das größere Allel in Individuum 5 in 7 vorhanden zu sein, jedoch nicht in 2, 3, 4, 6 und 8. In ähnlicher Weise ist das kleinere Allel in 5 nicht vorhanden in 2 bis 4 oder 6 bis 8. Über alle untersuchten Individuen wird erhalten s - 0,11, woraus man die mittlere Allel-Häufigkeit q abschätzen kann als q = 1 - (1-s)1/2 - 0,056, sowie die Heterozygosität als (1-q) = 94%. Dies ist eine Minimums-Abschätzung der Heterozygosität, die durch die Auflösung der Gelelektrophorese limitiert ist.
Alle Loci sind hochvariabel, mit Heterozygositäten, die von 90% für λMS8 bis zu 99% λMS31 reichen (vgl. Tabelle 1 oben). Das Ausmaß der Allel-Längenvariation wurde weiter analysiert, indem man das Spektrum von Allelen verglich, das in Pools von 15 und 150 Individuen aufgelöst wurde (Fig. 9). Fig. 9 zeigt eine Analyse der Allel-Längenvariation an den hypervariablen Loci in Pools von humaner DNA. 10 ug-Proben einer DNA aus einem einzigen Individuum (a), aus einem Pool von 15 Individuen (b) und aus einem Pool von 150 Leuten (c) wurden mit AluI (für λMS32) oder HinfI (für alle restlichen Sonden) verdaut und mit den angegebenen locus-spezifischen hypervariablen Sonden Southern-Blot-hybridisiert. Alle Individuen waren statistisch ausgewählte Nordeuropäer. Das Individuum a war auch im Pool b enthalten, und alle Pool b-Individuen waren in Pool c enthalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß λMS43 eine zweite variable Region nachweist, die durch die kurzen HinfI-Allele repräsentiert wird, die mit O markiert sind; dieser Bereich wurde nicht weiter charakterisiert.
Für den am wenigstens variablen Locus, λMS8, gibt es zwei dominierende Allele einer Länge von 5,3 und 7,2 kb sowie 7 weniger häufige Allele, die in dem Pool von 15 Personen auflösbar sind. Daß die beiden überwiegenden Allele nicht das Ergebnis eines Proben-Fehlers bei diesen 15 Individuen sind, wird durch deren ähnliche Dominanz in dem Pool von 150 Individuen gezeigt, zusammen mit einem größeren Spektrum von weniger häufigen Allelen. In ähnlicher Weise zeigt λMS43 (94% Heterozygosität) sieben Hauptallele, die in den Pools von 15 Individuen und 150 Individuen auftreten, jeweils zusammen mit vielen geringeren Allelen. Im Gegensatz dazu liefern die variabelsten Loci λMSl, 31 und 32 und pλg3, bei abgeschätzten Heterozygositäten von 97 bis 99%, keine Allele mit einer signifikanten Populationshäufigkeit, die in gleicher Stärke bei beiden Pools von Individuen auftreten (mit der Ausnahme des kürzesten 1,6 kb-Allels von pλg3, wie oben beschrieben), und somit ist die Anzahl von Allelen an diesen Loci wahrscheinlich sehr hoch. Beispielsweise können in dem Pool von 150 Individuen mindestens 50 unterschiedliche λMS32- Allele aufgelöst werden; das ist eine Minimalschätzung der Gesamtzahl von Allelen, die durch die Gelelektrophoreseauflösung limitiert ist.
Die Längenstreuung von Allelen bei Kaukasiern variiert ebenfalls zwischen diesen hypervariablen Loci (vgl. Fig. 9 und Tabelle 1). Die meisten Allele von λMS31 sind recht gleichförmig über einen relativ engen Größenbereich von 5,5 bis 9,3 kb verteilt, während die Allele von λMSl in ihrer Größe von 2 bis 20 kb variieren. Es gibt Hinweise auf ein ungleichförmige Allel-Längenverteilung in einigen Fällen; insbesondere zeigt λMS43 zwei dominante Allel-Größenklassen von 5 bis 6 kb und 8 bis 14 kb, und pλg3 zeigt drei Größenklassen von 1,6 bis 1,7, 2,8 bis 3,6 und 5 bis 15 kb wie weiter oben in Beispiel ein beschrieben wurde.
Wie oben angegebenen sind die nachgewiesenen Loci extrem variabel und gehören tatsächlich zu den am stärksten polymorphen Loci, die bisher aus humaner DNA isoliert wurden.

d) Chromosomen-Zuordnung der hypervariablen Loci

Keine der hypervariablen locus-spezifischen Sonden hybridisierte mit Nagetier-DNA, weshalb die Segregation dieser Loci in Mensch-Nagetier-Somazellhybriden verfolgt werden könnte [vgl. Fig. 10 und die folgende Tabelle 2]. Die sechs Loci wurden vier unterschiedlichen Autosomen zugeordnet, wobei die Chromosomen 1 und 7 jeweils zwei hypervariable Loci trugen.
Fig. 10 zeigt die Segregation des hypervariablen Locus, der durch λMS32 nachgewiesen wird, in einem Kollektiv von Mensch-Nagetier-Somazell-Hybrid-DNA, die mit AluI verdaut war. Dieser Locus cosegregiert mit dem humanen Chromosom 1 (vgl. Tabelle 2 weiter unten). Interessanterweise trug die Hybridzell-Linie MOG 2C2 zwei Allele sowohl von λMS32 als auch λMSl (Ergebnisse nicht gezeigt). Das deutet stark darauf hin, daß beide Elternkopien des humanen Chromosoms 1 in diesem Hybrid erhalten blieben, und da alle anderen positiven Hybride nur ein einziges Allel an jedem dieser enthielten, liefert dieser Befund einen starken Hilfsbeweis für die Syntenie von λMSl und λMS32. Das Hybrid F4SCl3c112 enthält das Chromosom 1p, ist jedoch negativ für λMS32; λMS32 wird daher provisorisch auf Chromosom 1q lokalisiert.
In der folgenden Fig. 10 wird der folgende Code verwendet:
1. Mensch 2
2. Hamster
3. Maus
4. FGl0
5. PCT BAl8
6. 1α9498
7. SIF4A24EI
8. SIFl5P5
9. CTP34B4
10. Zwilling 19 Dl2
11. Zwilling 19 F9
12. Zwilling 19 F6
13. Zwilling 19 C5
14. MOG 2C2
15. MOG 2E5
16. Mensch 1
17. Ratte
18. DUR 4,3
19. FIR 5
20. C4A
21. DUR 4R3
22. 3W4 cl 5
23. Klon 21
24. WILF 1
25. F4SCl3 cl
26. SIF4A31
27. FST 9/10
28. HORL 411B6
29. HORP 9,5
Tabelle 2 zeigt die Chromosomen-Zuordnung von hypervariablen Loci bei Menschen-Nagetier-Somazellhybriden. Tabelle 2 Chromosomen-Zuordnung von hypervariablen Loci in Menschen-Nagetier-Somazellhybriden Hybrid Nr.
In Tabelle 2 wurden die folgenden Somazell-Hybride typisiert:
1, Dur4,3,; 2, FIR5; 3, C4A; 4, DUR4R3; 5, 3W4c15, 6, Klon 21; 7, WILF.1; 8, F4SCl3cll2; 9, SIF4A31; 10, FST9/10; 11, HORL4llB6; 12, HORP9,5; 13, FGl0; 14, PCTBAl8; 15, 1α9498; 16, SIF4A24El; 17, SIF15P5; 18, CTP34B4; 19, TWIN 19D12; 20, TWIN 19F9, 21, TWIN 19F6; 22, TWIN 19C5; 23, MOG 2C2; 24, MOG2E5 und die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Symbole ist wie folgt:
+, Chromosom oder hypervariabler Locus vorhanden; -, Chromosom oder Locus fehlt; M, das Chromosom ist nur in einigen Zellen vorhanden oder der Locus wird nur schwach durch Southern-Block-Hybridisierung nachgewiesen; N, das Chromosom wurde nicht untersucht oder das Ergebnis ist mehrdeutig, der Locus wurde nicht getestet; P, kurzer Arm vorhanden; D, Chromosom 7pter → q22 vorhanden als eine 7/X-Translocation. Die deduzierte Chromosomen-Zuordnung jeder locus-spezifischen hypervariablen Sonde wird angegeben, zusammen mit der Fraktion von unzweideutig informativen Zellhybriden, die eine Übereinstimmung aufweisen im Hinblick auf die Anwesenheit oder das Fehlen des intakten Chromosoms sowie des hypervariablen Locus. Für jede hypervariable Sonde wurden alle Chromosomen mit Ausnahme eines einzigen mehrfach ausgeschlossen bei dieser Analyse.
Die Hybridisierung von λMSl an das Hybrid 8 (F4Cl3cll2), das das Chromosom 1p enthält, deutet-darauf hin, daß λMSl auf 1p lokalisiert ist. Anders hybridisiert λMS32 nicht mit Hybrid 8, was eine Lokalisierung auf ein 1q suggeriert. pλg3 hybridisiert nicht mit Hybrid 2 (FIR5), das das Chromosom 7pter → q22 enthält. Außerdem sind die Hybride JDA 13.1 und JDA 3, die 7pter → 31.3 bzw. 7q31.3 → qter enthalten, für pλg3 negativ bzw. positiv (Daten nicht gezeigt), was eine Lokalisierung von pλg3 auf 7q31.3 → qter bedingt. Umgekehrt hybridisiert λMS31 mit FIR5 und JDA 13.1, jedoch nicht JDA 3, was eine Lokalisierung auf 7pter → q22 bewirkt. Dieser Mangel an Clusterbildung wurde durch Verknüpfungsanalyse in großen CEPH-Geschwisterschaften bestätigt, die keine signifikante Verknüpfung zwischen jedem Paar synthenischer Marker (z > -2 bei > 0,35 für jedes Paar, Daten nicht gezeigt) zeigte.
Alle sechs klonierten Minisatelliten-Loci, einschließlich pλg3, beschrieben in Beispiel 6, sind autosom und verstreut; von den beiden gefundenen synthenischen Minisatelliten-Paaren zeigt keines eine signifikante paarweise Verknüpfung. Diese autosomale Lokalisierung und der Mangel an Clusterbildung ist völlig konsistent mit vorhergehenden Ergebnissen aus der Segregationsanalyse von DNA-Fingerprints, die zeigten, daß zahlreiche hypervariable DNA-Fragmente, die durch Polykern- Sonden nachgewiesen werden, sich von multiplen und gestreuten autosomalen Loci ableiten, obwohl die Chromosomen-Lokalisation der individuellen Fragmente aus den DNA-Fingerprints nicht abgeleitet werden konnte.
Die bisher lokalisierten Minisatelliten zeigen die Neigung, sich von größeren humanen Autosomen (Tabelle 1) abzuleiten, wie erwartet wird, wenn sie statistisch im humanen Genom verstreut sind. In der Abwesenheit einer präzisen regionalen Lokalisierung bleibt es weiterhin möglich, daß diese Minisatelliten vorzugsweise auf Zentromeren und Telomeren lokalisiert sind, die reich an einer einfachen Sequenz-Satelliten-DNA sind. Die Segregationsanalyse von DNA-Fingerprint-Fragmenten in rekombinanten Inzucht-Stämmen von Mäusen hat jedoch gezeigt, daß Mäuse-Minisatelliten nicht bevorzugt mit Zentromeren oder Telomeren assoziiert sind, und es ist wahrscheinlich, daß ihre humanen Gegenstücke auf ähnliche Weise verstreut sind.

Beispiel 3

Minisatelliten-Sondenempfindlichkeit und gerichtsmedizinische Anwendung

Die tandem-repetitiven Minisatelliten-Sonden, die untersucht wurden, sind sehr empfindlich, vermutlich aufgrund der repetitiven Natur sowohl der Hybridisierungssonde als auch der Ziel-Minisatelliten-DNA. Das nach einer über Nacht-Hybridisierung erhaltene Southern-Blot-Autoradiographiesignal ist bei Sonden-DNA-Konzentrationen von > 0,1 ng/ml gesättigt (Daten nicht gezeigt), und die Signale können auf einfache Weise aus 60 ng oder weniger einer humanen Genom-DNA erhalten werden (vgl. Fig. 11B).
Die Empfindlichkeit und die Variabilität dieser locus-spezifischen Minisatelliten-Sonden macht sie für die Gerichtsmedizin besonders nützlich. Fig. 11C. zeigt eine Analyse von Samenflecken von zwei Opfern, die vergewaltigt und ermordet worden waren, wobei die Menge an DNA, die von dem zweiten Opfer gewonnen werden konnte, für eine herkömmliche DNA-Fingerprint-Analyse nicht ausreichte, die pro Test wenigstens 0,5 ug DNA erfordert (vgl. UK Patentveröffentlichung Nr. 2166445.
Somit zeigt Fig. 11 eine Bestätigung der Empfindlichkeit von locus-spezifischen Sonden und ihrer Anwendung auf die gerichtsmedizinische Analyse eines doppelten Vergewaltigungs/Mordfalles. In Fig 11A wurden abnehmende Mengen von humaner DNA, die mit HinfI verdaut war, mit einer ³²P-markierten Insert-DNA aus λMSl Southern-Blot-hybridisiert. Die Filter wurden in Gegenwart eines Verstärkungsschirms eine Woche autoradiographiert. In Fig. 11B wurden abnehmende Mengen einer DNA des Individuums A mit 4 ug einer DNA des Individuums B in den angegebenen Verhältnissen vermischt, und dann Southern-Blot-hybridisiert, und zwar mit λMSl, wie in Fig. 11A. In Fig. 11C waren die Opfer X und Y vergewaltigt und ermordet worden. Ein Verdächtiger Z war des Mords an Y angeklagt worden, und der gerichtliche Beweis legte ferner nahe, daß sowohl X und Y von der-gleichen Person ermordet worden waren. Es wurde DNA aus den folgenden gerichtlichen Proben isoliert und analysiert: a, Haar von X, gewonnen zwei Tage nach Tod; b, eine Mischung aus Samen und Vaginalflüssigkeit, gewonnen aus dem Schamhaar von X; c, frisches Blut des Verdächtigen Z; d, Herzblut, genommen einen Tag nach dem Tod von Y; e, ein Vaginalabstrich von Y mit Samen, Blut und Vaginalmaterial; f, ein Fleck vom Rock von Y mit Samen und Blut.
Die Proben a und b wurden bei 4ºC drei Jahre trocken gelagert, die Proben d und e bei 4ºC zwei Monate und die Probe f wurde trocken bei 4ºC zwei Monate gelagert. Die DNA wurde nach den Vorgehensweisen von Gill, Jeffreys und Werrett (1985) Nature 318, 577-579, extrahiert, mit HinfI verdaut und mit einem ³²P-markierten λMSl-Insert Southern-Blot-hybridisiert. In jeder Probe wurden 0,8. ug DNA analysiert, mit Ausnahme der Probe e (0,1 ug DNA) und f (0,04 ug DNA). Die Autoradiographie erfolgte eine Woche in Gegenwart eines Verstärkungsschirms. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Samenflecken b, e und f jeweils zwei hybridisierende DNA-Fragmente enthalten, die nicht dem Opfer zugeordnet werden können. Zusätzlich enthält die Probe b die Allele des Opfers, die sich aus der Vaginal-DNA ableiten. Die Samenallele bei b, e und f sind ununterscheidbar, was nahelegt, daß die Opfer X und Y in der Tat von dem gleichen Mann sexuell angegriffen worden waren. Die Allele des Verdächtigen Z passen nicht zu denen der Samenflecken.
Diese Ergebnisse wurden durch Hybridisierung mit λMS31 und durch eine DNA-Fingerprint-Analyse von größeren Mengen gerichtlichen Materials bestätigt. Im Licht dieser Beweise wurde die Anklage gegen den Verdächtigen vom Staatsanwalt fallengelassen.

Beispiel 4

Gepoolte Minisatelliten-Sonden

Die Empfindlichkeit dieser Minisatelliten in Southern-Blot- Hybridisierungen gestattet es, Sondenpools zu verwenden, um variable DNA-Fragmente von verschiedenen Loci gleichzeitig nachzuweisen, wie für einen Pool von fünf Sonden (p g3, λMSl, λMS8, λMS31 und λMS43) in Fig. 10 gezeigt ist. In der Theorie beträgt die Anzahl von unterschiedlichen DNA-Fragmenten, die durch fünf Sonden nachweisbar ist,
wobei Hi die Heterozygosität der i-ten Sonde ist. Für diese fünf Sonden sollten pro Individuum im Durchschnitt 9,78 Fragmente nachgewiesen werden. In der Praxis werden 8,4 ± 1,2 (S.D.) Bänder > 2 kb aufgelöst (40 statistisch ausgewählte Testindividuen). Dieser Verlust an aufgelösten Bändern ist teilweise die Folge des Ausschlusses des kleinen (1,6 kb) und relativ verbreiteten pλg3-Allels (Beispiels 1, mittlerer Verlust pro Individuum = 0,33 Bänder), ist jedoch insbesondere das Ergebnis einer elektrophoretischen Comigration von unterschiedlichen Minisatelliten-Allelen. Die Multilocus- Southern-Blot-Muster sind hoch individuenspezifisch, wobei nur 18% (S.D. ± 11%) von DNA-Fragmenten gemeinsam bei Paaren von statistisch ausgewählten Nordeuropäern auftraten (40 Paare untersucht). Für Blutsverwandte steigt die Menge gemeinsamer Fragmente erwartungsgemäß auf -57% (10 Paar Blutsverwandte untersucht).
Bei Vater/Mutter/Kind-Trios können alle Nachwuchsfragmente zu den Eltern zurückverfolgt werden (Fig. 12). Jeder Nachkomme enthält 3,4 ± 0,5 (S.D.) DNA-Fragmente, die spezifisch väterlicher Herkunft sind, sowie eine gleiche Anzahl von mutterspezifischen DNA-Fragmenten (es wurden 10 Vater/Mutter/Kind- Trios untersucht).
Wie oben angegeben, zeigt Fig. 12 die Bestimmung von multiplen hypervariablen Loci in humaner DNA durch Hybridisierung mit gepoolten Minisatelliten-Sonden. 4 ug DNA-Proben aus einer statistischen Auswahl von Engländern (1 bis 6), von Paaren von Blutsverwandten (7, 8 und 9, 10) sowie von Vater/Kind/Mutter-Familiengruppen (11, 12, 13 und 14, 15, 16) wurden mit HinfI verdaut und durch ein 0,8% Agarosegel elektrophoresiert, bis alle Fragmente von weniger als 2 kb aus dem Gel elektrophoresiert worden waren. Die Verdauungsprodukte wurden mit 2 ng einer Insert-DNA von jeweils pλg3, λMSl, λMS8, λMS31 und λMS43 Southern-Blot-hybridisiert; die Inserts wurden vor dem Markieren mit ³²P durch statistisches Polynucleotid-Markieren gepoolt. Variationen bei der Markierungsintensität der Bänder gehen vermutlich auf Unterschiede der Ausbeute beim Markieren und der Hybridisierung von individuellen Sonden zurück.

Claims

1. Verfahren zur Charakterisierung einer Testprobe einer Genom-DNA durch Bezugnahme auf eine oder mehrere Kontrollprobe(n), wobei das Verfahren das Fragmentieren der Proben-DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzym(en), die eine Sequenz, die einem Tandem-Repeat entspricht, in keinem nennenswerten Umfange spalten, das Umsetzen der erhaltenen DNA-Fragmente mit einem Polynucleotid oder einer Polynucleotid-Sonde, die eine Nucleotid-Sequenz aufweisen, die für einen einzelnen Minisatellitenbereich oder einen hypervariablen Locus spezifisch ist, das Nachweisen hybridisierter DNA Fragmente sowie einen Vergleich der hybridisierten Fragmente mit der oder den Kontrollprobe(n) umfaßt, und worin der einzelne Bereich oder Locus eine Übereinstimmungs-Repeatsequenzeinheit aufweist, die aus irgendeiner der folgenden Sequenzen ausgewählt ist:

AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3

GTGGAYAGG 4

TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5

GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6

GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7

AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8

TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9

(worin Y = C, T oder U, X = G oder C, R = A oder G und T = T oder U) oder einer komplementären Sequenz dazu.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Feststellung der Identität oder Nichtidentität eines Testprobenspenders mit einem oder mehreren Kontrollprobenspender(n), bei dem die Kontrollprobe(n) in ähnlicher Weise fragmentiert ist(sind) und ein Vergleich der hybridisierten Fragmente der jeweiligen Proben durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Testprobe dadurch charakterisiert wird, daß man wenigstens zwei Polynucleotide oder Polynucleotidsonden gemäß Anspruch 1 verwendet.

4. Ein Polynucleotid zur Verwendung in einem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, das bis zu 10.000 Tandem- Repeats einer Übereinstimmungs-Repeatsequenzeinheit aufweist, die ausgewählt ist aus irgendeiner der Sequenzen

AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3

GTGGAYAGG 4

TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5

GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6

GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7

AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8

TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9

(worin Y = C, T oder U, X = G oder C, R = A oder G, T = T oder U) oder einer komplementären Sequenz dazu.

5. Polynucleotid nach Anspruch 4, das bis zu 40 Tandem- Repeats aufweist.

6. Polynucleotid nach Anspruch 4, das bis zu 10 Tandem- Repeats aufweist.

7. Polynucleotidsonde, die ein Polynucleotid, wie es in einem der Ansprüche 4 bis 6 beansprucht wird, zusammen mit einem Label- oder Markierungsbestandteil aufweist.

8. Polynucleotidsonde zur Verwendung in einem Verfahren, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, die irgendeine der Sequenzen aufweist, die ausgewählt ist aus

AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3

GTGGAYAGG 4

TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5

GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6

GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7

AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8

TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9

9. Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotids oder einer Polynucleotid-Sonde, wie sie in irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche definiert sind, wobei das Verfahren die direkte Synthese oder die mikrobiologische Reproduktion von kloniertem Material umfaßt.