DD263792A5 - Verfahren zur Kennzeichnung einer Testprobe genomer DNS - Google Patents
Verfahren zur Kennzeichnung einer Testprobe genomer DNSInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kennzeichnung einer Testprobe genomer DNS mit einem oder mehreren Vergleichsmaterialien. Das Verfahren besteht in der Fragmentierung der DNS-Probe mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, welche nicht in merklichem Umfang eine Sequenz spalten, die einer Tandem-Wiederholung entspricht, Sondierung der DNS-Fragmente mit einem Polynucleotid oder einer Polynucleotidsonde, die eine Nucleotidsequenz enthaelt, welche spezifisch fuer einen einzelnen Minisatellitenbereich oder einen hypervariablen Lokus ist und damit homolog ist bis zu einem Grade, der die Hybridisierung der Nucleotidsequenz zu einem entsprechenden DNS-Fragment ermoeglicht, welches einen Minisatelliten aus der genannten einzelnen Minisatellitenregion oder dem hypervariablen Lokus enthaelt, Nachweis der hybridisierten DNS-Fragmente und Vergleich der hybridisierten Fragmente mit einem genannten Vergleichsmaterial oder Vergleichsmaterialien, worin1) die genannte Minisatellitregion oder der hypervariable Lokus eine allelische Variation von mindestens 3(100) oder einen Polymorphiegrad von mindestens 3 hat und2) die genannte Region oder der Lokus mit einer Polynucleotidsonde nachweisbar ist, welche geeignet ist, die DNA durch Bezugnahme auf mehr als eine polymorphe Minisatellitregion oder hypervariablen Lokus zu differenzieren.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kennzeichnung einer Testprobe genomer DNS durch Vergleich mit einem oder mehreren Vergleichsmaterialien.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Polynukleotide und DNA- und RNA-Sonden, deren Herstellung und Anwendung in der genetischen Charakterisierung. Zu diesen Anwendungen können beispielsweise Human-, Tier- oder Pflanzonabkunft gehören, und die Polynukleotide und Sonden der Erfindung können damit beispielsweise in Streitfällen um die Vaterschaftsbestimmung oder in der Gerichtsmedizin oder bei der Vorbeugung, Diagnose und Behandlung von genetischen Störungen oder Prädispositionen eingesetzt weiden.
In der GB-Patentanmeldung Nr.8525252 (GB-PS Nr. 2166445) worden verschiedene DNA Folgen beschrieben, die als Sonden zur individuellen Hybridisierung bei einer Reihe von polymorphen Stellen innerhalb der menschlichen und tierischen Genome verwendet werden können, wodurch die Produktion eines „Fingerabdrucks" ermöglicht wird, der sich aus gekennzeichneten Bändern differierenden Molekulargewichts zusammensetzt. Der Fingerabdruck als Ganzes ist charakteristisch für das Lo'reffende Individuum, und der Ursprung der differierenden Bänder kann durch die Abstammung des Individuums 7 jrückverfolgt werden und kann in bestimmten Fällen als bestimmten genetischen Störungen zugeordnet postuliert werden.
Es ist das Ziel der Erfindung, die genetische Charakterisierung, beispielsweise bei der Human-, Tier- oder Pflanzenabkunft zu verbessern.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verbesserungen an genetischen Sonden zu schaffen, um somit die genetische Charakterisierung zu verbessern.
Vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß informative genetische Loki im Genom durch den Einsatz von MultiLokus-Sonden identifiziert werden können und das Polynukleotide und Polynukleotidsonden hergestellt werden können, die jeweils spezifisch für einen einzigen dieser informativen genetischen Loki sind.
Bisher wurde nur eine begrenzte Zahl hypervariabler Loki in Human-DNA festgestellt; dazu gehören die Minisatellite 5' zum Insulingen (Bell, Solby und Rutter, 1982), 3' zum c-Ha-ras1-Gen (Capon u.a., 1983), Collagen-Gen Typ Il (Stoker u.a., 1986) und zwischen den ζ 2- und ψζΙ-Globin-Genen (Goodbourn u.a., 1983) sowie der D14 S1-Lokus, der durch einen anonymen DNA-Klon definiert wird, der vom telomeren Bereich des langen Arms von Chromosom 14 abgeleitet wird (Wyman und White, 1980; Balazs u. a., 1982; Wyman, Wolfe und Botstein, 1984). Diese Minisatelliten unterscheiden sich in ihrer Variabilität wesentlich, sie liegt zwischen nur 6 verschiedenen Allelen, die bei der collagen-hypervariablen Region entdeckt wurden (Sykes, Ogilvie und Wordsworth, 1985) und mehr als 80 beim D14S 1-Lokus (BaIa zs u.a„ 1986). Die Gesamtzahl der hypervariablen Loki im Humangenom ist unbekannt, aber sie ist wahrscheinlich groß. Tatsächlich könnte das Humangenom wenigstens 1500 hypervariable Bereiche enthalten.
Es wurde festgestellt, daß es η öglich ist, ein identifiziertes DNA-Fragment durch Hybridisierung von Fragmenten der genomischen DNA mit einer Polynukleotidsonde zu klonen, die in der Lage ist, DNA durch Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus zu unterscheiden, beispielsweise die Sonden 33,6 und 33,15, die in der oben genannten GB-Patentanmeldung Nr. 8525252 (GB-PS Nr. 2166445) beschrieben und zum Patent angemeldet wurden, und daraus ein Polynukleotid oder eine Sonde herzustellen, die auf ein DNA-Fragrnent hybridisiert werden kann, das einen Minisatelliten enthält, der spezifisch hinsichtlich des besonderen Bereichs oder Lokus des Genoms ist, wobei dieser Bereich oder Lokus ein informativer genetischer Lokus ist. in der vorliegenden Beschreibung wird ein informativer genetischer Lokus als ein Lokus definiert, an dem wenigstens 3 verschiedene AIIeIe in einer beliebigen Probe von 100 zufällig ausgewählten, nicht miteinander im Zusammenhang stehenden Individuen unterschieden werden können.
Das wird hier durch die Aussage formuliert, daß der Lokus eine allelische Variation von wenigstens 3(100) hat. Vorzugsweise ist die Probe der zufällig ausgewählten, nicht miteinander verwandten Individuen gleich 500, besser noch gleich 1000, und die Fähigkeit, wenigstens 3 verschiedene AIIeIe in diesen Proben zu unterscheiden, wird nachstehend als 3(500) bzw. 3(1000) bezeichnet. Es ist wesentlich, daß die Probe von 100,500 oder 1000 zufällig ausgewählten, nicht miteinander verwandten Individuen tatsächlich zufällig ausgewählt wird, da es in der Regel möglich ist, 100,500 oder 1000 Individuen zu identifizieren, die weniger als 3 AIIeIe an einem gegebenen informativen genetischen Lokus haben, durch Sichtung einer ausreichend großen Zahl von Angehörigen der Gesamtpopulation.
Je größer dieser Polymorphismus an einem gegebenen informativen genetischen Lokus ist, desto nützlicher und informativer ist die lokusspezifische Sonde bei der genetischen Charakterisierung, beispielsweise bei der Identifizierung von Individuen zur Vaterschaftsbestimmung oder gerichtsmedizinischen Untersuchung.
Es wird in diesem Zusammenhang offensichtlich, daß der Begriff „Individuum" oben nicht nur in Bezug auf Menschen, sondern auch auf Tiere sowie Pflanzern und Zellstämme, die von diesen Menschen, Pflanzen und Tieren abgeleitet wurden, angewendet wurde. In jedem Fall aber ist die Probe der zufällig ausgewählten, nicht miteinander verwandten Individuen jeweils immer von derselben Spezies.
Im Zusammenhang mit Humananwendungen der vorliegenden Erfindung kann der hier verwendete Begriff „informativer genetischer Lokus" alternativ definiert werden als ein Lokus, an dem wenigstens 3 verschiedene AIIeIe in der DNA unterschieden werden können, die aus beliebigen 20 Zellstämmen estrahiert wurde, die aus den folgenden ausgewählt wurden, wobei die Zellstämme beim American Type Culture Collection (ATCC) deponiert wurden:
| Zellstamm | ATCC-Deponierungs-Nr |
| HeIa | CCL 2 |
| RPMI2650 | CCL 30 |
| Detroit 532 | CCL 54 |
| Detroit 525 | CCL 65 |
| Detroit 529 | CCL 66 |
| Detroit 510 | CCL 72 |
| WI-38 | CCL75 |
| Citrullinemia | CCL 76 |
| EB-3 | CCL85 |
| RAJI | CCL 83 |
| JYOYE(P-2003) | CCL 87 |
| WI-26 | CCL95 |
| Detroit 551 | CCL110 |
| RPMI6666 | CCL113 |
| RPMI7666 | CCL114 |
| CCRF-CEM | CCL119 |
| CCRF-SB | CCL120 |
| HT-1080 | CCL121 |
| HG 261 | CCL122 |
| CHP3(M.W.) | CCL132 |
| LL 47 (MaDo) | CCL135 |
| HEL299 | CCL137 |
| Zellstamm | ATCC-Deponierungs-Nr |
| 1124 | CCL151 |
| HFLI | CCL153 |
| WI-1003 | CCL154 |
| MRC-5 | CCL171 |
| IMR-90 | CCL186 |
| LS174 T | CCL190 |
| LL 86 (LeSa) | CCL191 |
| LL97A(AIMy) | CCL199 |
| CCD-13LU | CCL200 |
| CCD-8LU | CCL201 |
| CCD-11 Lu | CCL202 |
| CCD-14Br | CCL203 |
| CCD-16LU | CCL204 |
| CCD-18 Lu | CCL205 |
| CCD-19LU | CCL210 |
| Hs888 Lu | CCL21 |
| MRC-9 | CCL212 |
| Daudi | CCL21S |
| CCD-23Lu | CCL215 |
| SW403 | CCL230 |
| NAMALWA | CRL1432 |
Alle oben genannten Zellstämme sind frei vom ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, USA, erhältlich und sind im ATCC-Katalog von Zellstämmen und Hybridomas aufgeführt. Alle oben genannten Zellstämme wurden vor 1985 beim ATCC deponiert. ,
So wird nach einem Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Methode zur Herstellung eines Polynukleotids geschaffen, das auf ein DNA-Fragment hybridisiert werden kann, das einen Minisatelliten enthält, der spezifisch hinsichtlich eines bestimmten Bereiches oder Lokus' im Genom ist, wobei der genannte Bereich oder Lokus eine altaiische Variation (wie sie nachstehend definiert wird) von wenigstens 3(100) hat, wobei diese Methode darin besteht, ein DAN-Fraginent, identifiziert durch Hybridisierung von Fragmenten der genomischen DNA, mit einer Polynukleotidsonde zu klonen, die DNA durch Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus unterscheiden kann; und daraus ein Polynukleotid herzustellen, das auf ein DNA-Fragment hybridisiert werden kann, das spezifisch für einen bestimmten Bereich oder Lokus im Genom ist, wobei der genannte Bereich oder Lokus eine allelische Variation (wie sie nachstehend definiert wird) von wenigstens 3(100) hat.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine Methode geschaffen zur Herstellung eines Polynukleotids, das auf ein DNA-Fragment hybridisiert werden kann, das einen Minisatelliten enthält, der spezifisch hinsichtlich eines bestimmten Bereichs oder Lokus' im Genom ist, wobei der genannte Bereich oder Lokus einen Polymorphismusgrad von wenigstens 3 (wie das nachstehend definiert wird) hat, wobei diese Methode darin besteht, ein durch Hybridisierung von Fragmenten der genomischen DNA identifiziertes DNA-Fragment mit einer Polynukleotidsonde zu klonen, die DNA durch Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus unterscheiden kann; und daraus ein Polynukleotid herzustellen, das auf ein DNA-Fragment hybridisieren kann, welches einen Minisatelliten enthält, der spezifisch hinsichtlich eines bestimmten Bereichs oder Lokus' in dom Genom ist, wobei der genannte Bereich oder Lokus einen Grad des Polymorphismus von wenigstens 3 (wie das nachstehend definiert wird) hat.
Vorzugsweise besteht die Polynukleotidsonde unter Einbeziehung einer markierten oder Marker-Komponente aus einem Polynukleotid, das wenigstens drei Tandemwiederholungen (es besteht im Durchschnitt eine Homologie von wenigstens 70% zwischen allen tandem-wiederholton Folgen) von Folgen aufweist, die mit einem Minisatellitenbereich des Genoms bis zu einem Grad homolog sind, der die Hybridisierung der Sonde auf ein entsprechendes DNA-Fragment ermöglicht, das durch Fragmentierung der Probe-DNA mit einer Restriktionsendonuklease gewonnen wurde, worin:
a) die Wiederholungen jeweils einen Kern enthalten, der zu wenigstens 70% homolog mit einem Konsensus-Kernbereich ähnlicher Länge ist der in einer Vielzahl von Minisatelliten von verschiedenen genomischen Loki vorhanden ist;
b) der Kern zwiscne'i 6 und 16 Nukleotide lang ist;
c) die Gesamtzahl der Wi/kleotido innerhalb der Wiederholungseinheit, die nicht zum Kern beitragen, nicht mehr als 15 beträgt. Vorteilhaft enthält das genannte DNA-Fragment einen Minisatelliten aus einem Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus, wobei dieser Bereich oder Lokus feststellbar ist durch eine Polynukleotidsonde, die aus wenigstens drei Tandem-Wiederholungen der Folge (einschließlich komplementärer Folgen) besteht:
(AtAGGGCTGGAGG (1)
(worin T T oder U ist und (A) vorhanden sein oder fehlen kann) oder der Folge (einschließlich komplementärer Folgen): AGAGGTGGGCAGGTGG (2)
(worin T gleich T oder U ist).
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid in isolierter oder geklönter Form geschaffen, das aus einer Nukleotidfolge besteht, die spezifisch zu einem einzelnen Minisatellitenbereich odor hypervariablen Lokus ist und die damit bis zu einem Grad homolog ist, welcher die Hybridisierung der Nukleotidfolge auf 6in entsprechendes DNA-Fragment ermöglicht, welches durch Fragmentierung genomischer Proben-DNA mit einer Restriktionendonuklease gewonnen wurde, wobei das genannte DNA-Fragment einen Minisatelliten aus dem genannten Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus enthält,
worin:
1) der genannte Bereich oder Lokus eine allelische Variation (w' j sie nachstehend definiert ist) von wenigsten 3(100) hat und
2) der genannte Bereich oder Lokus feststellbar ist durch eine /olynukleotidfolge, die wenigstens drei Tandemwiederholungen aufweist der Folge (einschließlich komplementärer Folgen):
(A)AGGGGCTGGAGG 1
(worin T gleich T oder U ist und (A) vorhanden sein oder fehlen kann) oder der Folge (einschließlich komplementärer Folgen):
AGAGGTGGGCAGGTGG · 2/
(worin T gleich T oder U ist).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein entsprechendes Polynukleotid, in welchem der oben genannte Bereich oder Lokus einen Grad von Polymorphismus hat, der wenigstens 3 gegenüber einer alielischen Variation von wenigstens 3 beträgt. Nach weiteren Merkmalen der vorliegenden Erfindung werden die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung und Polynukleotide, die nach der vorstehend definierten Methode der Erfindung hergestellt werden, hergestellt durch mikrobiologische Reproduktion des geklonten Materials oder durch direkte Synthese.
Die Erfindung schließt Polynukleotide von DNA, RNA und jeder anderen Art, die auf DNA hybridisierbar ist, ein. Die oben definierten Polynukleotide sind nicht markiert und können in Doppelstrang- (ds) oder Einzelstrangform (ss) vorkommen. Die Erfindung schließt markierte Polynukleotide in ss-Form für die Verwendung als Sonden sowie deren markierte ds-Vorläufer, aus denen ss-Sonden hergestellt werden können, ein.
So ist nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Polynukleotidsonde vorgesehen, die besteht aus einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, wie es vorstehend definiert wurde, oder aus einem Polynukleotid, das nach einer vorstehend definierten Methode hergestellt wurde, mit einer markierten oder Marker-Komponente. Im allgemeinen ist wenigstens die Nukleotidfolge des Polynukleotids in einsträngiger Form, vorzugsweise aber besieht die Sonde aus einem Polynukleotid, das vollständig in einsträngiger Form vorhanden ist.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur Herstellung einer Polynukleotidsonde, wie sie oben definiert wurde, vorgesehen, welche in der Kennzeichnung oder Markierung eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung, wie sie vorstehend definiert wurde, oder eines Polynukleotids, das nach einer Methode der vorliegenden Erfindung, wie sie vorstehend definiert wurde, hergestellt wurde, besteht.
Die Polynukleotidsonden der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise auf herkömmliche Weise mit 32P-Leitisotopen markiert, können alternativ aber auch mit anderen auf dem Gebiet der Hybridisierung bekannten Methoden markiert werden, um beispielsweise 35S-markierte Sonden zu ergeben. Sie können auch mit Biotin oder einer ähnlichen Spezies nach der Methode von D. C. Ward u.a. markiert werden, wie das in den Proceedings of the 1981ICN-UCLA Symposium on Developmental Biology using Punfied Genes (Beiträge des ICN-UCLA-Symposiums von 1981 zur Entwicklungsbiologie unter Verwendung gereinigter Gene), durchgeführt vom 15. bis 20. März 1981 in Keystone, Colorado, Bd. XXII11981, S. 647-658, Academic Press; Herausgeber Donald D. Brown u. a., beschrieben wird, oder sogar enzymmarkiert nach der Methode von A. D. B. Malcolm u. a., Abstracts of the 604th Biochemical Society Meeting (Zusammenfassungen der 604. Zusammenkunft der biochemischen Gesellschart), Cambridge, England (Zusammenkunft vom 1.JuIi 1983).
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird eine Methoda zur Charakterisierung einer Versuchsprobe der genomischen DNA durch Bezugnahme auf eine oder mehrere Kontrollproben geschaffen, die darin besteht, Probe-DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen zu fragmentieren, welche eine Folge, die einer Tandem-Wiederholung entspricht, nicht im relevantem Maße spalten, die DNA-Fragmente mit einem Polynukleotid oder einer Polynukleotidsonde zu sondieren, die aus einer Nukleotidfolge besteht, welche hinsichtlich eines einzelnen Minisatellitenbereichs oder hypervariablen Lokus' spezifisch ist und welche damit bis zu einem Grad homolog ist, der die Hybridisierung der Nukleotidfolge auf ein entsprechendes DNA-Fragment ermöglicht, das einen Minisatelliten aus dem genannten einzelnen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus enthält, hybridisierte Fragmente von DNA festzustellen und die hybridisierten Fragmente mit einer genannten Kontrollprobe oder Kontrollproben zu vergleichen, worin:
1) der genannte Minisatellitbereich oder hypervariable Lokus einer allelische Variation von wenigstens 3(100) hat und
2) der genannte Bereich oder Lokus feststellbar ist durch eine Polynukleotidsonde, die DNA durch Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus unterscheiden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine entsprechende Methode zur Charakterisierung einer Versuchsprobe, in welcher der oben genannte Bereich oder Lokus einen Grad des Polymorphismus von wenigstens 3 gegenüber eine alielischen Variation von wenigstens 3 hat.
Die Methode der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ausgeführt durch Verwendung eines Polynukleotids oder eines nach einer Methode der vorliegenden Erfindung hergestellten Polinukleotids oder einer Polynukleotidsonde der Erfindung, wie sie vorstehend definiert wurde.
Die Proben-DNA ist vorzugsweise eine Human-DNA.
Zur Unterstützung des Lesers werden folgende Erklärungen der vorliegenden Spezifikation gegeben:
Hypervariabel
Ein Bereich von menschlicher, tierischer oder pflanzlicher DNA an einem erkannten Lokus oder einer Stelle wird als hypervariabel bezeichnet, wenn er in vielen verschiedenen Formen, z. B. hinsichtlich der Länge oder Folge, auftritt.
Minisatellit
Ein Bereich von menschlicher, tierischer oder pflanzlicher DNA, der aus Tandem-Wiederholungen einer kurzen DNA-Folge besteht. Nicht alle Wiederholungseinheiten müssen unbedingt perfekte Identität aufweisen.
Polymorph
Ein Gen oder ein anderes Segment der DNA, das von einem Individuum zum anderen oder zwischen den gepaarten Chromosomen eines gegebenen Individuums Variabilität aufweist, wird als polymorph bezeichnet.
Wiederholung oder Tandem-Wiederholung (Folge)
Eine Polynukleotidfolge, die vollständig oder unvollständig in Reihe wiederholt wird. Im allgemeinen wird eine Folge, die als tandem-wiederholt bezeichnet wird, wenigstens dreimal wiederholt.
Unvollständige Wiederholung (Folge)
Eine Folge, die weder hinsichtlich der Anzahl noch der Art der Nukleotide eine exekte Wiederholung ist, aber als Wiederholung einer Konsensus-Folge erkennbar ist.
% Homologie
Beim Vergleich von zwei Wiederholungs- oder Ta idum-Wiederholungsfolgen A und B wird die prozentuale Homologie durch die Anzahl der Basispaare in A minus der Anzahl der Basispaarsubstitutionen, Additionen oder Streichungen in B gegeben, welche notwendig wäre, urn A zu ergeben, ausgedrückt als Prozentsatz. So ist die prozentuale Homologie zwischen den beiden Folgen ATGC und AGC gleich 75%.
Konsensus-Kern (Folge)
Eine Folge, die als engste Annäherung von einer Reihe von Wiedorholungsfolgen betrachtet werden kann; in der Regel zwischen den Wiederholungseinheiten von zwei oder mehr verschiedenen Minisatelliten.
Nukleotid (nt) und Basispaar (bp) werden synonym verwendet. Beide können sich auf DNA oder RNA beziehen. Die Abkürzungen C, A, G, T beziehen sich konventionell auf (Oeoxy)zytidin, (Deoxy)adenosin, (Deoxy)guanosin und entweder Doxythymidin oder Uridin. Mann kann jedoch erkennen, daß die Abkürzungen A, C, G und Tauch andere basismodifizierte Nukleosideeinschließen, die zur Basispaarbildung mit einem der konventionellen Nukleoside (Deoxy)ddenosin, (Deoxy)zytidin, (Deoxy)guanosin und entweder Deoxythimidin oder Uridin in der Lage sind. Solche basismodifizierte Nukleoside schließen (Deoxy)inosin und (Deoxy)8-azaguanosin sein.
Wenn das Polynukleotid oder die Polynukleotidfolge der vorliegenden Erfindung aus einer tandemwiederholten Folge besteht, können die Tandemwiederholungen perfekte Wiederholungen oder unvollständige Wiederholungen oder eine Mischung aus perfekten und unvollständigen Wiederholungen sein. Zu einer Sondenfolge sollten vorzugsweise wenigstens drei Wiederholungen gehören, besser noch wenigstens 7 Wiederholungen.
Die Sonden der Erfindung, die einzeln oder in Kombination mit anderen lokusspezifschen Sonden entweder in einer Folge von Versuchen oder in einem einzelnen Versuch mit einer Mischung oder einem Cocktail von Sonden eingesetzt werden können, sind erfolgreich in den folgenden Anwendungsgebieten einsetzbar:
1. Vaterschafts- und Mutterschaftsprüfung beim Menschen.
2. Familiengruppennachweis, beispielsweise bei Einwanderungskiagen und Erbschaftsklagen.
3. Zygositätsprüfung bei Zwillingen.
4. Prüfungen auf Inzucht beim Menschen.
5. Allgemeine Stammbaumanalyse beim Menschen.
6. Identifizierung von Loki, die genetischen Krankheiten beim Menschen zugeordnet sind, dadurch Schaffung der Möglichkeit, spezifische Sonden zu konstruieren, um einen genetischen Defekt feststellen zu können.
7. Gerichtsmedizin, beispielsweise
(a) Schaffung des Fingerabdrucks von Spermaproben von Opfern von Vergewaltigungen
(b) Fingerabdrucknahme von Blut-, Haar- und Spermaproben von z. B. mit Erde verschmutzter Kleidung
(c) Identifizierung menschlicher Überreste
(d) Charakterisierung anderer gerichtsmedizinischer Gewebeproben, z. B. der Haut.
8. Zell-Chimaerismusuntersuchungen, beispielsweise bei der Verfolgung von Geber- zu Empfängerzellen nach einer Knochenmarktransplantation.
9. Viehzucht- und StammbaumanalyseAauthentizierung. (Das könnte beispielsweise die Routinekontrolle und Überprüfung reiner Tierstämme und die Überprüfung von Stammbäumen bei Streitfällen z.B. bei Rennpferden und in der Hundezucht einschließen.) Außerdem Schaffung genetischer Marker, welche die Zuordnung von ererbten Tendenzen von wirtschaftlicher Bedeutung zeigen.
10. Routinequalitätskontrolle von Zuchttier- oder Pflanzenzellstämmen, Überprüfung auf Kontamination reiner Zellstämme und zur Routine-Identifikationsarbeit.
11. Analyse von Tumorzellen und Tumoren auf molekulare Abnormalitäten.
12. Es wird erwartet, daß die Polynukleotide oder die davon abgeleiteten Sonden potentiell Anwendung in der Pflanzenzucht finden werden.
Die lokusspezifischen Sonden der vorliegenden Erfindung sind jedoch von besonderer Bedeutung für die Gerichtsmedizin, wie unten im Beispiel 3 gezeigt wird, und zumindest die Sonde ρ Xg 3 kann mit der heterozellularen Form der Erbpersistenz des fötalen Hämoglobins kosegregieren. Die Sonden sind auch eine aussagekräftige Methode für die Vaterschaftsbestimmung und ähnliche Bereiche (siehe die oben genannten Positionen 2 und 5) sowie bei Untersuchungen des Zell-Chimaerismus.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Abb. 1A zeigt die gel-elektrophoretische Reinigung eines spezifizierten hypervariablen DNA-Fragmentes von einem DNA-Fingerabdruck, wobei das Fragment mit „Fragment g" bezeichnet wird. Abb. 1 B zeigt die Gliederung von Fragment g anhand einer Restriktionskarte der gekionten DNA;
Abb. 2 zeigt die DNA-Folge des hypervariablen Fragmentes g, wobei besonders die Konsensus-Wiederholungsfolge und deren Ausrichtung mit der „Kernfolge" der britischen Patentveröffentlichung Nr.2166445 hervorgeheben werden; Abb. 3 zeigt das Mendeische Erbgut der polymorphen DNA-Fragmente, die durch pAg 3 festgestellt wurden; Abb. 4 zeigt die Verteilung von Minisatellit-Allei-Größen, die durch Hybridisierung auf ρλ3 festgestellt wurde; Abb. 5 zeigt die Siebung von AMS-Rekombinanten auf lokusspezifische hypervariable DNA-Sonden; Abb.6 zeigt die Konsensus-Wiederholungsfolgeeinheiten der XMS-Serie von Minisatelüten und den pXg3-Minisatelliten; Abb.7 zeigt das Mendeische Erbgut des hypervariablen Lokus, der durch die Sonde entdeckt wurde, nachstehend bezeichnet alsAMS32;
Abb.8 zeigt eine Schätzung der allelischen Variabilität an dem hypervariablen Lokus, der durch die hier mit AMS43 bezeichnete Sondo entdeckt wurde;
Abb.9 zeigt eine Analyse der allelischen Längenvariation an hypervariablen Loki in Pools von Human-ONA; Abb. 10 zeigt die Segregation des hypervariablen Lokus, der durch die hier als AMS32 bezeichnete Sonde entdeckt wurde, in einer Tafel von Körperzellhybrid-DNA, die mit AIu I dheriert wurden;
Abb. 11 zeigt eine Einschätzung der Sensitivität von lokusspezifischen hypervariablen Sonden und deren Anwendung bei der gerichtsmedizinischen Analyse in einem Doppelvergewaltigungs-AMordfall und Abb. 12 zeigt die Feststellung von mehreren hypervariablen Loki in Human-DNA durch Hybridisierung mit gepoolten Minisatellitsonden der vorliegenden Erfindung.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung und die Polynukleotide, die nach Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, und die Polynukleotidsonden der vorliegenden Erfindung sind vorteilhaft geeignet für die Hybridisierung mit Fragmenten der DNA, die einen Minisatelliten aus einem Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus enthalten, der identifizierbar ist durch eine Polynukleotidsonde, die aus einer der Folgen besteht, die ausgewählt werden aus:
AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3
GTGGAYAGG 4
TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5
GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6
GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTCTTGG 7
AGGCTGGGTAGATGGTGGAGGAAGAGrAC 8
TCTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9
(worin Y gleich C, T oder U ist, X gleich G oder C ist, R gleich A oder G ist und T gleich T oder U ist) oder deren Tandem-Wiederholungen, oder eine komplementäre Folge dazu.
Die Polynukleotide der Erfindung, Polynukleotide, die nach den Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, und Sonden der vorliegenden Erfindung sind für die Hybridisierung mit Fragmenten von DNA geeignet, die einen Minisatelliten von einem einzelnen spezifischen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus enthalten, und sind damit lokusspezifisch. Im allgemeinen sind die Polynukleotide und Sonden der vorliegenden Erfindung unter sehr strengen Hybridisierungsbedingungen lokusspezifisch. In diesem Zusammenhang wird der Begriff „lokusspezifisch'' hier in Verbindung mit einem Polynukleotid oder einer Sonde gebraucht, um anzugeben, daß das Polynukleotid oder die Sonde unter Hybridisierungsbedingungen eingesetzt werden kann, welche gewährleisten, daß das Polynukleotid oder die Sonde nur an einen einzigen spezifischen Lokus hybridisieren.
Es ist jedoch offensichtlich, daß die lokusspezifischen Sonden der vorliegenden Erfindung, wenn sie unter geminderten Hybridisierungszwängen eingesetzt werden, in der Lage sein können, DNA durch Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus zu unterscheiden und damit für die Identifizierung anderer informativer genetischer Loki verwendet werden können.
So wird nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Methode zur Herstellung eines Polynukleotids geschaffen, das auf ein DNA-Fragment hybridisieren kann, welches einen Minisatelliten enthält, der spezifisch hinsichtlich eines bestimmten Bereiches oder Lokus im Genom ist, wobei der genannte Bereich oder Lokus eine allelische Variation (wie sie vorstehend definiert wurde) von wenigstens 3(10C) hat, wobei die Methode darin besteht, ein DNA-Fragment, das durch Hybridisierung von Fragmenten genornischer DNA identifiziert wurde, mit einer Polynukleotidsonde zu klonen, wie sie vorstehend definiert wurde, und daraus ein Polynukleotid herzustellen, das für die Hybridisierung auf ein DNA-Fragment geeignet ist, welches einen Minisatelliten enthält, dei hinsichtlich eines bestimmten Bereiches oder Lokus auf dem Genom spezifisch ist, wobei der genannte Bereich oder Lokus eine Allelvariation (wie sie vorstehend definiert wurde) von wenigstens 3(100) hat; wobei die Methode unter Hybridisierungsbedingungen ausgeführt wird, welche die Sonde in die Lage versetzen, DNA durch Bezugnahme auf mehr als einen polymorphen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus zu unterscheiden. Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid in isolierter oder geklönter Form geschaffen, welches eine Nukleotidfolge aufweist, die spezifisch für einen einzelnen Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus ist und welches mit diesem bis zu einem Grad homolog ist, der die Hybridisierung der Nukleotidfolge auf ein entsprechendes DNA-Fragment ermöglicht, das durch Fragmentierung genomischer Proben-DNA mit einer Restriktionsendonuklease gewonnen wurde, wobei das genannte DNA-Fragment einen Minisatelliten aus dem genannten Minisatellitenbereich oder hypervariablen Lokus enthält, worin:
1) der genannte Bereich oder Lokus eine allelische Variation (wie sie oben definiert wurde) von wenigstens 3(100) hat und
2) der genannte Bereich oder Lokus durch eine lokusspezifische Polynukleotidsonde, wie sis oben definiert wurde, feststellbar ist.
Die Erfindung betrifft auch eine entsprechende Methode und ein entsprechendes Polynukleotid, bei welchem der genannte Bereich oder Lokus einen Grad des Polymorphismus von wenigstens 3 hat.
Die Erfindung betrifft außerdem Sonden, die derartige lokusspezifische Polynukleotide enthalten, und eine Methode zur Charakterisierung einer Versuchsprobe vor DNA unter Verwendung dieser Polynukleotide und Polynukleotidsonden.
Die lokusspezifischen Polynukleotide und Sonden der vorliegenden Erfindung können mit dem Minisat« liiten des minisatellitenenthaltenclen DNA-Fragmentes oder, was weniger günstig ist, mit einer Folge, die den Minisate.üten flankiert, homolog sein.
Wenn die Polynukleotide und Sonden der vorliegenden Erfindung Tandem-Wiederholungen einer bestimmten Folge aufweisen, wird diese Folge im allgemeinen wenigstens dreimal widderholt, und diese Wiederholungen müssen nicht unbedingt exakte Wiederholungen sein. Wiederholungen, die nicht exakt sind, werden an anderer Stelle als imperfekte oder unvollständige Wiederholungen beschrieben. Diese Wiederholungen werden trotzdem erkennbar wiederholt. Im allgemeinen heißt das, daß im Durchschnitt eine Homologie von wenigstens 70% zwischen allen wiederholenden Einheiten besteht. Vorzugsweise besteht eine Homologio von wenigstens 80%, besser noch von wenigstens 85% und günstigenfalls von 90% zwischen allen Wiederholungseinheiten. Es ist aber durchaus erkennbar, daß die Nukleotidfolge oder „Wiederholungseinheit", wenn das gewünscht wird, auch überhaupt nicht wiederholt zu werden braucht.
Die Anzahl der Wiederholungseinheiten, n, beträgt vorteilhaft wenigstens 5, besser noch wenigstens 10. Günstig ist ein Wert von
η zwischen 10 und 40, im Prinzip jedoch kann η jede Zahl sein, selbst von 1 bis 10000.
Wenn die Polynukleotide und Sonden der vorliegenden Erfindung Tandem-Wiederholungen einer bestimmten Folge aufweisen, sind alle flankierenden Folgen im wesentlichen irrelevant.
Sie können weggelassen werden oder können in einer beliebigen Zahl von Nuklsotiden vorhanden sein, beispielsweise bis zu 50000, obwohl es in der Regel nicht sensibel wäre, mit einer so langen Sonde zu arbeiten. Trotzdem können so große Polynukleotido als Träger dienen, von denen kleinere Polynukleotide, die besonders nützlich als Sonden sind, entnommen werden können. Diese flankierenden Folgen können Teil von ds-DNA oder ss-DNA sein, selbst wenn die Wiederholungsfolgen von ss-DNA sind.
Vorzugsweise weisen die Polynukleotide und Polynukleotidsonden der vorliegenden Erfindung eine der Folgen auf, die aus den oben definierten Formeln 3 bis 9 ausgewählt wurden, oder eine komplementäre Folge dazu oder deren Tandem-Wiederholungen (wobei zwischen allen tandemwiederholten Folgen im Durchschnitt eine Homologie von wenigstens 70% besteht) oder eine komplementäre Folge dazu.
Ein bevorzugtes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht beispielsweise aus der Folge mit der Formel 3, wie sie vorstehend definiert wurde, oder deren Tandem-Wiederholungen oder einer komplementären Folge dazu-. Eine solche Nukleotidfolge ist spezifisch hinsichtlich des Autosomallokus an Chromosom 7. Polynukleotide und Polynukleotidsonden, die eine solche Folge enthalten, werden im folgenden als pAg3 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Folge mit der Formel 4. wie sie oben definiert wurde, oder deren Tandem-Wiederholuny (en) oder einer komplementären Folge dazu. Eine solche Nukleotidfolge ist spezifisch hinsichtlich eines Lokus am Chromosom 1. Polynukleotide und Polynukleotidsonden, die eine solche Folge aufweisen, werden nachstehend als MVIS1 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes Polynukleotid '.ler vorliegenden Erfindung besteht aus der Folge mit der Formel 5, wie sie oben definiert wurde, oder deren Tandem-Wiedeiholung(en) oder einer komplementären Folge dazu. Eine solche Nukleotidfolge ist spezifisch hinsichtlich eines Lokus am Chromosom 7. Polynukleotide und Polynukleotidsonden, die eine solche Folge aufweisen, werden nachstehend als AMS31 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Folge mit der Formel 6, wie sie oben definiert wurde, oder deren Tandem-Wicderholung(en) oder einer komplementären Folge dazu. Eine solche Nukleotidfolge ist spezifisch hinsichtlich eines Lokus an Chromosom 1. Polynukleotide und Polynukleotidsonden, die eine solche Folge aufweisen, werden nachstehend als AMS32 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Folge, die aus den Formeln 7 und 8, wie sie oben definiert wurden, ausgewählt wurde, oder deren Tandem-Wiederholung(en) oder einer komplementären Folge dazu. Eine solche Nukleotiatolge ist spezifisch hinsichtlich eines Lokus am Chromosom 5. Polynukleotide und Polynukleotidsonden die eine solche Folge aufweisen, werden nachstehend als MVIS8 bezeichnet.
Ein weiteres bevorzugtes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Folge mit der Formel 9, wie sie oben definiert wurde, oder deren Tandem-Wiederholung(en) oder einer komplementären Folge dazu. Eine solche Nukleotidfolge ist spezifisch hinsichtlich eines Lokus an Chromosom 12.
Poiynukleotide und Polynukleotidsonden, welche eine solche Folge enthalten, werden nachstehend als λ Μ S 43 bezeichnet.
Wie oben angegeben, besteht im allgemeinen eine Homologie von wenigstens 70%, vorteilhaft wenigstens 80%, besser von wenigstens 85% und günstigstenfalls von wenigstens 90% zwischen den Wiederholungseinheiten. Besonders vorteilhaft jedoch ist es, wenn jede einzelne der Folgen der Formeln 3 bis 9 exakt wiedei holt wird. In diesem Zusammenhang wird davon ausgegangen, daß diese letztgenannte Forderung erfüllt werden kann, vorausgesetzt, daß jede Wiederholungseinheit eine Folge hat, die im Rahmen dor gewünschten Formel liegt; es ist also nicht notwendig, daß jede Wiederholungseinheit exakt die gleiche Folge enthält.
Bei einem bevorzugten Aur.führungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird eine Methode geschaffen zur Feststellung der Identität des Versuchsprjbenspenders bei einer oder mehreren Kontrollprobenspendern, wobei die Kontrollprobe(n) ähnlich fragmentiert ist (sind) und ein Vergleich der hybridisierten Fragmente von den entsprechenden Proben gemacht wird.
Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel wird eine Methode geschaffen zur Bestimmung einer Familienbindung zwischen dem Versuchsprobenspender und einem oder mehreren Kontroiiprobenspendern, wobei die Kontrollprobe(n) ähnlich fragmentiert ist (sind) und ein Vergleich der hybridisierten Fragmente von den entsprechenden Proben gemacht wird.
Die oben genannten Methoden können ausgeführt werden durch Anwendung der Polynukleotide oder Sonden der vorliegenden Erfindung, entweder einzeln oder unter Verwendung vo.i wenigstens zwei Polynukleotiden oder Sonden der vorliegenden Erfindung entweder in einer Folge von Versuchen oder in einem einzigen Versuch, unter Verwendung einer Mischung der genannten Polynukleotide oder Sonden.
Nach einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird eine Methode geschaffen für die Diagnose einer Erbkrankheit, Abnormalität oder Eigenschaft, die darin besteht, die Vorsuchsprobe mit wenigstens einem Polynukleotid oder einer Polynukleotidsonde, wie sie oben definiert wurde, zu sondieren, wobei die genannte Sonde einer bestimmten ererbton Krankheit, Abnormalität oder Eigenschaft zugeordnet ist.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung, die geprüft wurden, dienen alle als lokusspezifische Sonden unter sehr iitrengnn Hybridisierungsbedingungen.
Die extreme Variabilität der durch diese Sonden der vorliegenden Erfindung nachgewiesenen Loki, die von den Autcren geprüft wurde, verbunden mit deren Sensitivität bei Southern-Fleck-Hybridisationen, stellt ein besonders nutzliches Instrument bei der Identifizierung von Individuen dar, besonders, wenn nicht genügend DNA für die Multi-LokusDNA-Fingerabdruck-Analyse zur Verfügung steht, die in der GB-Patentanmeldung Nr.8525252 (GB-PS Nr.2166445) beschrieben wird; Multi-Lokus-DNA-Fingerabdrücke können von 0,5pg DNA gewonnen werden, während die lokusspezifischen Sonden um wenigstens eine Größenordnung sensitiver sind und bereits bei einer so geringen Menge wie 1 μΙ Blut anwendbar sind. In ungewöhnlichen Situationen, in denen möglicherweise noch geringere Mengen der Probe untersucht werden müssen, erweist sich die vorliegende Erfindung als besonders wertvoll in Verbindung mit der Vergrößerungsmethode, die in der EP Patentanmeldung Nr.86302299.2 (EP-PS Nr.0201184) beschrieben wurde.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, im menschlichen Genom informative genetische Loki zu identifizieren, und ermöglicht es damit, lokusspezifische Sonden herzustellen, wobei jede dieser lokusspezifischen Sonden hinsichtlich eines einzigen informativen genetischen Lokus spezifisch ist. Speziell wurden sechs verschiedene, sehr informative genetische Loki identifiziert, welche eine sehr hohe Heterozygosität in der getesteten Population haben (wenigstens 90%) und die zu den am stärksten polymorphen gehören, die bisher isoliert wurden, und es wurde eine lokusspezifische Sonde für jeden Lokus geschaffen, die als pAg3, AMS1, AMS8, AMS31, AMS32 und AMS43 (wie sie vorstehend definiert wurden) bezeichnet werden. Der Grad der individuellen Spezifizität von Genotypen, die durch lokusspezifische Sonden best.mmt werden, kann aus der Heterozygosität H an den einzelnen Loki bestimmt werden.
Die mittlere A.'lelfrequenz q an einem Lokus wird durch (1 - H) gegeben, und die Wahrscheinlichkeit, daß zwei zufällig ausgewählte Individuen denselben Genotyp aufweisen, ist gleich q2(2 - q). Diese Wahrscheinlichkeit der falschen Zuordnung von zwei Individuen schwankt zwischen 0,02 für AMS8 und 0,0002 für AMS31 und ist eine konservative Schätzung insofern, als die Heterogenität in q diese Wahrscheinlichkeiten verringert. Die kumulative Wahrscheinlichkeit der falschen Zuordnung für alle sechs Minisatellitensonden ist ~ 10~16, vergleichbar mit dem seltenen Ereignis, daß zwei zufällig ausgewählte DNA-Fingerabdrucke, die von einer Multi-Lokus-Sonde festgestellt werden, identisch sind (siehe britische Patentanmeldung Nr.8525252). Dagegen wird die Aussicht, daß zwei Verwandte für einen gegebenen hypervariablen Lokus identisch sind, durch 1Ad + q)2 gegeben. Die kumulative Wahrscheinlichkeit der Verwandtenidentität bei allen sechs Sonden ist 0,0004, im Vergleich zu ~ 10~7 bei einem DNA-Fingerabdruck, der unter Verwendung einer Multi-Lokus-Sonde ermittelt wurde. Diese lokusspezifischen hypervariablen Sonden sollten sich in der Gerichtsmedizin als besonders nützlich erweisen, wie durch den in Abb. 11C analysierten Mordfall veranschaulicht wird, bei dem aus den zwei dor gerichtsmedizinischen Proben für die DNA-Fingerabdruckanalyse zu wenig DNA gewonnen wurde. Sperma-DNA von beiden Opfern wies einen gemeinsamen Phänotyp auf, wobei sich die Sonden AMS1 und AMS31 von denen des Verdächtigen unterschieden. Aus der vorstehenden Diskussion kann man die Wahrscheinlichkeit berechnen, daß die Opfer X und Y von verschiedenen, nicht miteinander verwandten Männern sexuell angegriffen wurden, sie beträgt 2 χ 10"7.
Ebenso ist die Chance, daß die beiden hypothetischen Angreifer Verwandte ersten Grades, beispielsweise Brüder waren, gleich 0,07. Das ist ein starker Hinweis darauf, daß X und Y von demselben Mann angegriffen wurden, eine Schlußfolgerung, die später durch DNA-Fingerabdruckanalyse größerer Mengen gerichtsmeriizinischer Proben bestätigt wurde. Außerdem stammen die Spermaflecken von X und Y beinahe sicher von einer einzelnen Person, nicht von zwei oder mehr Angreifern. Betrachtet man beispielsweise Fleck b in der Abb. 11C, so zeigt dieser zwei Opfer-Allele und zwei zusätzlicher Angreifer-Allele. Die Aussichten, daß ein Pool von drei Personen (zwei Angreifern und einem Opfer) vier oder weniger auflösbare AIIeIe aufweisen würde, wird durch q2 (55 - 21Oq + 216q2)gegeben.BeiSondeAMS1 beträgt diese Wahrscheinlichkeit 0,02 und bei Sonde AMS 31 0,005, was eine kombinierte Wahrscheinlichkeit ergibt, daß X von zwei Männern sexuell angegriffen wurde, nicht von einem, von 10~1. Das bestätigt, daß X und Y von derselben Person angegriffen wurden, und zeigt, daß lokusspezifische Sonden im Gegensatz zu Multilokus-DNA-Fingerabdruck-Sonden dazu verwendet werden, die Zahl der Personen zu bestimmen, die in einer gemischten DNA-Probe repräsentiert sind.
Die Mendelsche Vererbung der hypervariablen DNA-Fragmente ermöglicht es auch, sie für die Bestimmung von familiären Beziehungen, beispielsweise bei Vaterschaftsklagen, einzusetzen. Bei einer gegebenen lokusspezifischen Sonde kann die Wahrscheinlichkeit, daß das väterliche AIIeI eines Kindes zufällig in einem willkürlich ausgewählten Mann vorhanden ist, mit 2q - 2q2 geschätzt werden. Bei allen sechs Minisatelliten ist die kumulative Wahrscheinlichkeit der fälschlichen Einbeziehung
eines Nicht-Vaters gleich π (2qi - q;2) = 10"7, was mit der vergleichbar ist, die bei der Verwendung von zwei DNA-Fingerabdruck-Sonden erzielt wird. Ebenso ist die kumulative Wahrscheinlichkeit einer fälschlichen Einbeziehung eines Verwandten ersten Grades des echten Vaters, beispielsweise eines Bruders, gleich 0,02. So kann die sequentielle Anwendung dieser hypervariablen, lokusspezifischen Sonden eine erfolgreiche Methode zur Bestimmung familiärer Beziehungen sein, unter dem Einwand, daß Mutationen zu Allelen von neuer Länge an dieses instabilen Loki gelegentlich zu fälschlichen Ausschließen führen können. Die Mutationsrate an diesen hypervariablen Loki ist noch nicht bekannt.
Die Lokusspezifizität und Sensitivität dieser lokusspezifischen Sonden ermöglichte es, gepoolte Sonden dazu zu verwenden, Multilokus-Southern-Blot-Schemata zu erzeugen (Abb. 12). Diese „rekonstituierten DNA-Fingerabdmcke", die djrch fünf gepoolte Sonden erzeugt werden, sind wesentlich weniger komplex als die entsprechenden Gegenstücke, die durch Multilokus-Sonden festgestellt werden, und sie dürften besser für die digitale Verschlüsselung nach der densitometrischen Abtastung geeignet sein. Ungeachtet der hohen Variabilität der einzelnen Minisatelliten, weisen die Profile der gepoolten Sonde einen beachtlichen Anteil (18%) an Fragnientgemeinsamkeit zwischen nicht miteinander verwandten nordeuropäischsn Personen auf, vor allem im Ergebnis der elektrophoretischen Komigration von Minisatellitfragmenten aus verschiedenen Loki. Dieses Niveau der Bandteilung entspricht dem bei herkömmlichen DNA-Fingerabdrücken festgestellten, die durch Multilokus-Sonden erzeugt werden, wobei das Niveau der Bandteilung ~ 25% zwischen willkürlich ausgewählten Personen beträgt. Da im Durchschnitt 8,4 DNA-Fragmente in einem Gemischtsondenschema aufgelöst werden, kann der Zufall, daß alle diese Fragmente in einer Person in einer zweiten, willkürlich ausgewählten Person vorhanden sind, konservativ mit 0,18w = 6 χ 10~7 geschätzt werden. Diese Schemata weisen damit ein hohes Maß an individueller Spezifität auf, wenn sie auch nicht so hoch ist, wie sie bei Verwendung von Multilokus-Sonden oder durch sequentielle Hybridisierung mit lokusspezifischen Sonden (siehe oben) erreicht
werden kann. Sowohl die gepoolten Sonden als auch einzelne lokusspezit'ische Sonden erweisen sich als besonders nützlich bei der Untersuchung von Zell-Chimän'smus. besonders bei der Schaffung von Spender- im Verhältnis zu Rezipientenmarkern für das nachfolgende Gravieren im Anschluß an Knochanmarktransplantationen; DNA-Mischungsexperimente (Abb. 12) zeigen, daß mit diesen Sonden ein geringes Niveau an Chimärismus festgestellt werden kann.
Ausführungsbeispiel
Diu Erfindung wird nachstehend an einigen Pnispielen näher erläutert.
In den nachfolgenden Beispielen werden die Temperaturen in Grad Celsius gegeben, und die Sonden 33,6 und 33.15 entsprechen denen der GB-PS Nr. 2166455 mit der Konsensus-Wiederholungsfolge:
(AiAGGGCTGGAGG bzw. AGAGGTGGGCAGGTGG
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung und die Eigenschaften eines spezifizierten Minisatellitenfragmentes in einem DNA-Fingerabdruck.
Allgemeine Methoden
DNA wurde aus weißen Blutzellen, wie das von Jeffreys, A. J. u. a. (1985), Nature 316,76-79. beschrieben wird, und aus einem mit einem Epstein-Barr-Virus transformierten Lymphoblastoidzellstamm (siehe Nilsson, K. u.a. [197Ί), Inter. J. Cancer8,443-450) isoliert, die von Person 1119 dr: HPFH-Stammbaumes abgeleitet wurden, der von Jeffreys u. a., Am. J. Hum. Gen. 39,11-24, beschrieben wurde. Restr' .lonsdigestions- und Southern-Blot-Hybridisationen wurden durchgeführt, wie das an anderer Stelle in den oben genannten Referenzen von Jeffreys, A. J. u.a. beschrieben wird. Doppelsträngige DNA-Sondenfragmente wwrdo durch Elektrophorese auf DE81 -Papier isoliert, wie das von Dretzen, G. u.a. (1981), Anal. Biochem. 112, 295-298, beschrieben wird, und mit 32P durch zufällige Oligonukleotidvorberaitung markiert, wie das von Feinberg, A.P. u.a. (1984), Anal. Biochem. 137,266-267, beschrieben wird; die einsträngige Mhisatellitsonde 33,15 wurde so hergestellt, wie das von Heffreys u.a. (1985), Nature 314,67-73, beschrieben wird.
Klonung des hvpervaridblen Fragmentes g
600pg der Lymphoblastoidzellstamm-DNA von Person III 9, digeriert mit Sau3A, wurden durch Elektrophorese durch ein 0,5%iges Agarose-Gel fraktioniert, und die relevanten Größenfraktionen wurden durch Elektroeluierung auf üialysemembran aufgefangen, wie das von Y?ng, R.C. A. u.a. (1979), Meth. Enzymol. 68,176-182, beschrieben wird. Nach zwei Zyklen der präpa ativen Gel-Elektrophorese wurde Fragment g eintausendfach gereinigt (Ertrag 150 ng DNA). 20ng dieser partiell gereinigten Fraktion wurden an 60ng L47.1-Arm3Ügiert, die nach Spaltung mit BAMHI (siehe Loenen, W.A. M. und Branmar, W. J. [1980] Gene. 20, 249-259) isoliert wurden, in vitro gepackt und auf E.coli WL95 (803, supE, supF, hsdRk", hsdMk\ tonA, trpR", metß, lysogen für P2) plattiert (siehe Loenen-Quelle, oben, und Jeffreys, A. J. u.a. [1982], J. Mol. Biol. 156,487-503), um nach Rekombinanten zu wählen. Die resultierende Bibliothek von 1500 Rekombinantphagen wurde durch Fleck-Hybridisierung mit Minisatellitsonde 33.15 gesichtet. Vier positive Flecke wurden erneut plattiert und erneut auf E.coli ED8910 (803, supE, supF, recB21, recC22, hsdS) gesichtet (siehe oben genannte Loenen-Quelle), und die Rekombinant-Phag-DNA wurde durch die Methode von Blattner u.a. [1977], Science 194,161-169, hergestellt. DieSau3A-Einfügung von Rekombinant-Phagg3wurdein die BamHI-Stelle von pUC 13 subgeklont (Vieira J. und Messing Jl [1982] Gene 19, 259-268) und in ein recA-Derivat von E. coli JM83, -(recA-sr 1 R) 306: :Tn 10 propagiert (siehe Matfield, M. [19831, Dissertationsschrift, Universität von Leicester). DNA-Folge-Analyse
pÄg3-DNA wurde isoliert, größenselektiert und in die Sma I-Stelle von M13mp 19 geklont (siehe Yanis-Perron C. u.a. [1985] Gene 33,103-119). Um die DNA-Folge des tandem-repetitiven Bereiches von p\g 3 zu bestimmen, wurden 12 zufällige Klone durch die Dideoxynukleotidkettenterminationsmethode sequentiert (siehe Sanger, F. u.a. [1977] Proc. Nat. Acad. Sei. USA74,5463-5467, und Biggin, M. D. u. a. [1983] Proc. Natl, Acad. Sei USA 80,3S63-3965). Acht dieser Klone wurden von dem tandemrepetitiven Minisatellitenbereich von pAg3 abgeleitet und wurden dazu verwendet, die Konsensus-Wiederholungsfolge zu definierten. M 13-Klone, welche die 5'- und 3'-Flankierungsbereiche enthielten, wurden durch Hybridisierung mit 32P-markierten Flankierungssonden a und b (siehe unten beschriebene Abb. 1) festgestellt und sequentiert, um die Flankierungsbereichfolge und die Anfangs- und Endpunkte des Minisatelliten zu bestimmen.
Ergebnisse
Isolierung eines spezifischen Minisatelliten aus einem DNA-Fingerabdruck
Person III 9 aus dem Gujarati-Stammbaum, der von Jeffreys u.a. '!1986), Am. J. Hum. Gen. 39,11-24, beschrieben wird, leidet an HPFH (erblicher Persistenz des fötalen Hämoglobins) und ihr DNA-Fingerabdruck, der im Sau3 Α-Digest durch Minisatellitensonde 33.15 entdeckt wurde, enthalt ein polymorphes 8,2kb-Fragment (Fragment 'g'; Abb. 1 A), welches zur Kosegregation mit HPFH bei anderen Angehörigen dieses Stammbai'ms tendiert, wie das im (1986) Am. J. Genet. 3S, 11-24, beschrieben wurde. Dieses DNA-Fragment wurde aus anderen Minisatellitenfragmenten durch zwei Zyklen der präparativen Gel-Elektrophorese (Abb. 1) heraus gereinigt.
Abb. 1 zeigt diese Reinigung durch Gel-Elektrophorese. DNA von Pjrson III 9 in dem von Jeffreys u.a. beschriebenen Stammbaum wurde mit Sau3 A digeriert, und 6-9kb-Fragmente wurden durch präparative Gel-Elektrophorese aufgegangen (Fraktion 1). Diese Fragmente wurden erneut elektrophoresiert und ergaben die Fraktionen 2 bis 5. Aliquote der III 9-DNA, die mit Sau3A digeriert worden war, und jeder Fraktion wurden durch ein 0,8%iges Agarose-Gel elektrophoresiert und mit der Minisatellitsonde 33.15 Southern-Blot-hybriüsiert. Franment g (8,2kg), das zur Kosegregation mit HPFH tendiert, ist in Fraktion ο etwa eintausendfach gereinigt.
Fragment 'g' das in dem oben genannten Sau 3 Α-Digest festgestellt und in der beschriebenen Weise gereinigt wurde, um eine etwa eintausendfach angereicherte Fraktion von Fragment 'g' zu erzeugen, wurde in AL47.1 geklont, wie das in der oben genannte Quelle von Loenen und Brammar beschrieben wurde, und auf P2-Ivsogene rec+-E. coil übertragen, um das Rekombinant-Phag zu wählen. Die resultierende Bibliothek wurde durch Hybridisierung auf Sonde 33.15 gesichtet. Die vier positiven Flecke, die gewonnen wurden, waren sehr klein (Durchmesser ~ 0,1 mm), konnten aber mit geringer Effizienz (0-8 pfu/ Fleck) auf recB, recC E.coil replattiert werden, um normal große Flecken (1 mm Durchmesser) zu erzeugen. Zwei Klone, Ag 1 und Ag 3, wurden weiter charakterisiert und nachgewiesen, daß sie eine Sau3 A-Einffigung von 7,7 bzw. 7,8kg enthielten. Diese Klone wurden beide von Band g (siehe unten) abgeleitet, waren aber um 0,5 bzw. 0,4 kb kürzer als Band g. Da keine Größer.heterogenität der Sau3 Α-Einfügung in Ag 1 noch in Ag 3 bestand, die auf RecB, recC E.coil (Daten nicht gezeigt) gezüchtet wurden, wurde geschlußfolgert, daß ein Teil der Einfügung während der anfänglichen Übertragung in rec+-E. coil verlorengegangen Ist. Die Erträge an Ag 1 - und Ag 3-DNA, die nach der Blattner-Methode gewonnen wurden (siehe [1977] Science 194,161-169), waren , sehr gering (1 % der normalen Erträge an A47.1 -Rekombinant-DNA), was erneut auf die normalen Wachstumseigenschaften diener Minisatellitenklone hinweist. Die Einfügung Sau3 A wurde daher in pUC 13 subgeklont (siehe Vieira, J. und Messing, J. [Gene 19 [1982]}, 259-268) und in ein recA-Derivat von E.coliJM33 (siehe Matfield, M. [1983] Dissertationsschrift, Universität von Leiesster) übertragen, um die 'Jmordnung der Einfügung auf ein Minimum zu reduzieren. Das resultierende Subklon, p.\g3 (siehe Abb. 1B, die unten beschrieben wird) enthielt eine SAU3A-Einfügung zu 7,1 kb, um 0,7 kb kürzer als die Einfügung in g3.
Organisation des Minisatellitenfragmentes g
Die Struktur des Minisatellitenfragmentes in pAg 3 wurde durch Restriktionskartographierung (Abb. 1 B) und DNA-Sequentierung (Abb. 2) bestimmt.
Abb. 1B zeigt den Aufbau des DNA-Fragmentes g. Die Sau3Α-Einfügung in pAg3 wurde mit Restriktior.sendonuklaase AIuI (A), Ddel (D), Hae III (H) Mbo H(M), Pst I (P) und Sau 3 A (S) kartiert. Es sind keine Teilungsstellung für Hinfl oder Rsa I vorhanden. Die 7,14kb-Einfügung enthält 171 Tandem-Wiederholungen einer 37bp-Folge (siehe Abb.2) plus747bp-Flankieriings-DNA. Der 5'-Flankierungsbereich enthält des Anfang eines invertierten Alu-Elementes (schraffiert). Es werden die Ursprünge der einzigartigen Folgeflankierungssonden a und b gezeigt.
Abb. 2 zeigt die DNA-Folge des hypervariablen Fragmentes g. Die Folge der 5'- und 3'-Flankiarungsbereiche und der Anfang und das Ende des Minisatelliten werden zusammen mit den Wiederholungsfolgen von drei zufälligen Bereichen (a-c) aus dem Minisatelüten gezeigt. Der Anfang des invertierten Alu-Elementes wird in unterstrichenen Großbuchstaben gezeigt, und mehrere einfache Folgebereiche im 5'-Flankierungsbereich sind unterstrichen. Die Konsensusfolge (con) der aus 37 bp bestehenden Minisatelliten-Wiederholungseinhc't wird gezeigt, und Unterschiede zu diesem Konsensus werden für einzelne Wiederholungseinheiten gegeben. Die zweite Wiederholungseinheit im Bereich c enthält die Haelll-Spaltungsstelle (unterstrichen), und dieser Bereich überspannt somit die innere Haelll-Stelle im Minisatelliten (Abb. 1 B). Die Konsensus-Wiederholungsfolge wird auch ausgerichtet mit der „Kernfolge" auf die gleiche Art und Weise gezeigt, wie das in der GBPS Nr. 2166445 gezeigt wird.
Klon pAg3 enthält einen 6,3kg-Minisatelliten ohne Restriktionsstellen, ausgenommen eine einzelne innere Haelll-Stelle. Der Minisatellit setzt sich zusammen as 171 Wiederholungen einer 37 bp-Einheit, walche die Folge GTGGGCAGG enthält; diese Folge entspricht genau dem am stärksten invarianten Teil der aus 11 bis 16bp bestehenden Kernfolge, die oben als mehreren verschiedenen humanen Minisatelliten gemfiinsam identifiziert wurde (siehe GB-PS Nr.2165445 und Abb. 2 in der vorliegenden. Die Wiederholungseinheiten sind nicht vollkommen homogen; die Folgeanalyse von mehreren zufällig ausgewählten Bereichen innerhalb des Minisatelüten zeigte eine begrenzte Menge von Wiederholungsfolgevariationen. Die meisten Varianten, einschließlich einer 4 bp-Deletion, die ainen Untersatz von 33 bp-Wiederholungseinheiten bildet, sind über mehr als eine Wiederholungseinheit diffundiert.
Fine Variante (eine A-» C-Transversion !m Bereich C) erzeugt die einzigartige innere Haelll-Stelle und ist daher folglich nur in einer Wiederholungseinheit zu finden. Die Anfangs- und Endwiedarholungseinheiten des Minisatelüten sind in der Folge merklich stärker divergent als die inneren Wiederholungen.
Der Minisatellit in pAg 3 ist flankiert durch nicht-wiederholte DNA, welche die normale Dichte von Restriktionsstellon enthält (Abb. 1 B). Der Anfang des B'-Flankierungsboreiches wird gebildet durch den Kopf eines invertierten Alu-Elementes. Der restlichen 5'- und S'-Flankierungsbereiche, die durch Hybridisierungssonden a und b (Abb. 1 B) definiert sind, sind einzigartige Folge-DNA und hybridisieren in der gesamten DNA nur auf diesen Lokus (Daten nicht gezeigt). Der 5'-Flankierungsbereich mthält einen beachtlichen Umfang von einfacher Folge-DNA (Polypurin und [ACC)r) (Abb.2).
2) Minisatellitenfragment g entdeckt einen einzelnen polymorphen Lokus
Um festzustellen, ob das gesamte geklonte Minisatollitenfragment als Hybridierungssonde verwendet werden kann, um speziell den entsprechenden Lokus in Human-DNA zu entdecken, wurde die Einfügung San3 A von pAg3 bei Vorhandensein menschlicher Kompetitor-DNA auf Human-DNA hybridisiert, die mit HINfI digeriert war, dem Restriktionsenzym, das routinemäßig für DNA-Fingerabdrücke verwendet wird (Abb.3).
Abb.3 zeigt die Mendelsche Vererbung von polymorphen DNA-Fragmenten, die durch pAg3 entdeckt wurden. Proben von Human-DNA zu 8pg wurden mit Hinfl digeriert und durch ein 0,8%iges Agarose-Gel elektrophoresiert. Die Digests wurden mit der Einfügung Sau3 A von pAg 3 in 1 χ SSC bei 650C bei Vorhandensein von 6% Polyethylenglykol und öOpg/ml alkaliverriebener menschlicher Plazental-Kompetitor-DNA Southern-Blot-hybririisiert und nach der Hybridisation in 0,2 x SCC bei 650C gewaschen. pAg 3 entdeckt einen einzelnen Lokus, der bei allen gezeigten Personen heterozyg ist. Die Vererbung von Allelen (durch Buchstaben bezeichnet) ist mendelisch.
Sei hohen Schänen (0,2 χ SSC, 650C) wurden bei allen untersuchten Personen entweder ein oder zwei Hybridisierungsfragmente entdeckt. pAg 3 entdeckte das 8,2 kb-Fragment g in vorher getesteten Verwandten von III 9, was bestätigt, daß Band g geklont wurde (Daten nicht gezeigt). Bei geringeren Schärfen (1 x SCC, 65"C) wurde ein zusätzliches, blaß hybridisierendes polymorphes DNA-Fragment entdeckt (die Daten werden nicht gezeigt).
DNA-Fragmente, die durch pAg3 bei hohen Schärfen entdeckt wurdon, segregieren auf Mendelsche Weise als AIIeIe eines einzelnen Lokus (Abb.3). Dieser Lokus ist nicht geschlechtsgebunden und zeigte auch keine signifikante, sondern eine unvollständige Geschlechtsbindung bei zwei großen untersuchter, Stammbäumen (61 Nachkommen getestet, 2 = 0,18 bei © 0,43; Daten nicht gezeigt); er verhält sich folglich wie ein autosomaler Lokus und wurde auf Chromosom 7 loziert (Tabelle 1).
Hinf I-Digests der DNA von 79 zufällig ausgewählten britischen Kaukasiern wurden mit der Einfügung von p\g 3 gesichtet, zuerst einzeln, dann in Pools von 14 Personen (1 pg DNA je Person), die durch ein 35 cm langes, 0,7%iges Agarose-Gel elektrophoresiert wurden, um die Allel-Auflösung zu maximieren. Die Länge der verschiedenen AIIeIe, die in dieser Populationsprobe entdeckt wurden, wird in der Abb.4 zusammenm mit der geschätzten Zahl der Wiederholungseinheiten in jedem AIIeI und den AIIeI-Häufigkeiten gezeigt. So zeigt die Abb.4 die Verteilung von Minisatellit-Allelgrößen. Die Länge des Minisatelliten im kürzesten gemeinsamen AIIeI wurde durch genomische Kartierung dieses Fragments in einem Homozygot unter Vorwendung von Flankierungseinzelkopiesonden a und b (Abb. 1) bestimmt (Daten nicht gezeigt). Die Anzahl der Wiederholungen je AIIeI ist angenähert und ist vom Verhältnis von 37 zu 33bp-Wiederholungsoinheiten im Min'satelliten abhängig. Ausgenommen das kurze, gemeinsame AIIeI, wurden die restlichen Adele entweder einmal (42 AIIeIe), zweimal (12 AIIeIe), dreimal (12 AIIeIe) oder viermal (5 AIIeIe) abgetastet. Diese Verteilung unterscheidet sich nicht wesentlich von der vorausgesagten, wenn alle dieses AIIeIe einheitlich Reiten sind (q = 0,0081,2[4 d.f.l = 4,0), und ist daher mit einem einfachen Modell von einem gemeinsamen, kurzen AIIeI (q = 0,165) und 103 gleichermaßen seltenen Allelen (q = 0,0081 je AIIeI) konsistent, die in der Population vorhanden sind.
Wenigstens 77 verschiedene AIIeIe konnten in dieser Populationsprobe aufgelöst werden, wobei die Wiederholungszahlen zwischen 14 und ~ 525 je AIIeI liegen. Die Homozygote in der Populationsprobe waren für das kürzeste AIIeI alle homozyg. Die oben genannten Schätzungen der Anzahl der AIIeIe und dio mittlere Frequenz von seltenen Allelen sind durch die Gelauflösung begrenzt, und die echte Zahl der AIIeIe unterschiedlicher Länge in dieser Probe kann größer sein.
Die Verteilung der Allellängen scheint nicht vollkommen zufällig zu sein, sondern weist Anzeichen von Trimodalität auf (Abb.4), mit kurzen (14-16 Wiederholungen), mittleren (41 bis 68 Wiederholungen) und langen (107-525 Wiederholungen) Klassen von Allelen. Eine bimodale Verteilung der Allellängen wurde vorher Lei Kaukasiern für den hypervariablen Bereich festgestellt, der 5' zum Human-Insulin-Gen loziert ist (siehe Bell, G. I. u. a. [1982] Nature 295,31-35), während diese Bimodalität bei Schwarzen nicht evident ist (Lebo, R. V. u.a. [1983], Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80,4804-4812).
Die Isolierung von Fragment g demonstriert, daß die großen und stark polymorphen DNA-Fragmente für DNA-Fingerabdrücke im Prinzip für die molekulare Klonung geeignet sind, um lokusspezifische Sonden zu schaffen, die für die Untersuchung einzelner, hypervariabler Bereiche geeignet sind. Während Fragment g in Bakteriophag λ geklont werden konnte, zeigten die resultierenden Klone abnormale Wachstumseigenschaften auf rec* E.coli. Das führt zu einer Erschöpfung von Minisatellit-Klonen aus herkömmliche vervielfachten Human-Bibliotheken im Phag. Der geklonte Minisatellit ist instabil sowohl beim als auch nach dem Subklonen in pUC 13 in recA E.coli; das abschließende Rokombinant pXg3 hatte im Vergleich zu Fragment g etwa 30 Wiederholungseinheiten verloren. Die physikalische Karte von pXg 3 (Abb. 1) widerspiegelt daher nicht vollständig die Gliederung und den Aufbau von Fragment g.
Das geklonte DNA-Fragment hat die für einen Minisatelliten erwartete Struktur, was belegt, daß Fragment (j nicht von einer längeren Satelliten-DNA abgeleitet wurde. Ungeachtet des Vorhandenseins sowohl einer, Kernfolge" in jeder Wiederholungseinheit als auch eines Teils einer Alu-Folge im 5'-Flankierungsbereich, wirkt das geklonte Fragment g bei Vorhandensein einer Kompetitor-Human-DNA als lokusspezifische Sonde. Das Versagen von p\g3, effektiv andere kernhaltige Minisatelliten zu entdecken, ist auf die zusätzliche, nicht zum Kern gehörende DNA in jeder Wiederholungseinheit .zurückzuführen, die wahrscheinlich die Querhybridisierung mit anderen Minisatelliten beeinträchtigt (siehe GBPS Nr. 2166445).
Der geklonte Minisatellit weist einen extremen Längenpolymorphismus auf, vermutlich auf Grund der Allelvariation sowohl in der Anzahl der Wiederholungseinheiten als auch im Verhältnis von 33 und 33bp'Wiederhoiungstypen in jedem AIIeI. In einer zufälligen Populationsprobe von 158 Chromosomen konnten ein gemeinsames und wenigstens 76 soltene AIIeIe aufgelöst werden. Dieser Lokus ist stärker polymorph als die meisten oder alle der bisher charakterisierten, geklonten menschlichen, hypervariablen Bereiche, einschließlich der Auswahl von relativ kurzen, geklonten Minisatelliten, die anfänglich verwendet wurden, um die „Kernfolge" zu definierten (siehe GB-PS Nr. 2166445). Die Heterozygosität an diesem Lokus beträgt mindestens 96,6%, wobei die meisten Homozygote vom kurzen, gemeinsamen AIIeI ausgehen.
Neue AIIeIe an diesem Lokus werden erzeugt durch Änderung in der Wiederholungszahl, entweder durch Rutschen während der DNA-Replikation oder durch ungleichmäßigen Austausch, gesteuert durch die „Kernfolge", ein vermutliches Rekombinationssignal. Unter der Hypothese der mutationsneutralen zufälligen Drift kann der Parameter 4 Νβν(Θ), wobei N„ die effektive Populationsgröße und ν die Mutationsrate je Garnet zu einem neuen Längenallel ist, sehr genau bestimmt werden aus der Anzahl der verschiedenen AIIeIe, die in eine Populationsprobe einbezogen sind, unter Verwendung des Modells des unendlichen AIIeIs (siehe Ewens, W. J. [1972], Theor. Popul. Biol. 3,87-112). Für diesen Lokus wird 0 mit 60 bis 90 geschätzt, in Abhängigkeit davon, ob das gemeinsame kurze AIIeI einbezogen wird oder nicht. Da N8 für den Menschen -104 ist, beträgt die Mutationsrate ν zu neuen Längenallelen an diesem Lokus etwa 0,002 je Garnet. Dieser Wert von ν ist eine Unterschätzung, da die Anzahl der festgestellten AIIeIe durch die Gel-Auflösung begrenzt ist und da es keine unendliche Zahl potentiell auf lösbarer AIIeIe gibt. Dio durchschnittliche Länge der Minisatelliten-DNA an diesem Lokus ist 5kb, und damit ist die Mutationsrate (Rekombinationsrate) je kb Minisatellit > 4 χ 10~4, im Vergleich zu 10"je kb, die für andere kürzere, kernhaltige Minisatelliten geschätzt werden, und einer mittleren meiotischen Rekombinationsrate von 10"5je kb für Human-DNA (siehe Jeffreys, A. J. u.a. [1985], Nature 314,67-73). Also liegt die Rate der Erzeugung neuer AIIeIe an diesem Minisatellitenlokus bemerkenswert hoch, was mit der bereits früher geäußerten Vermutung der Autoren übereinstimmt, daß diese kernreichen Bereiche Rekombinationszentren sein können. Vermutlich ist die Mutationsrate für kurze AIIeIe verhältnismäßig niedrig, was erklären dürfte, wie das kürzeste AIIrI gedriftet ist, um eine signifikante Frequenz in der Population zu erreichen, ohne durch ungleichmäßigen Austausch während dieses Prozesses unterbrochen zu werden.
DNA-Fingerabdrücke haben sich als erfolgreiche Methode für die Personenidentifikation und für die Ermittlung familiärer Beziehungen, beispielsweise in Vaterschafts- und Einwanderungsstreitfällen, e-wiesen. Die Ganauigkeit dieser Methode wird bestimmt durch die niedrige mittlere Wahrscheinlichkeit x, daß zwei zufällig ausgewählte Personen ein Band. niteinander teilen. Bei britischen Kaukasiern wurde χ empirisch mit 0,2 für DNA-Fingerabdruck-Hinc I-Fragmente von mehr als 4 kb bestimmt. In Fällen, in denen zwischen Personen Bandteilung auftritt (d. h., wenn zu einem Band in einer Person ein Band ähnlicher Mobilität und autoradiographischer Dichte einer zweiten Person paßt), ist es nicht klar, o~ Jie gemeinsamen Bänder identische AIIeIe desselben Minisatellitenlokus darsteiler. Dio Aüel-Verteilung in der Abb.4 ermöglicht es, χ für AIIeIe von >4kb zu berechnen; für diesen speziellen Minisatellitenlokus ist χ 3 0,016, eine Größenordnung kleiner als die Schätzung als Multilokus-DNA-Fingerabdrücken.
Wenn dieser geklonte Minisatellit typisch für Loki ist, die in DNA-Fingerabdrücken repräsentiert werdan, dann sind die meisten Bänder, die zwischen DNA-Fingerabdrücken von Nichtverwandten geteilt werden, auf zufällige Komigration von verschiedenen Minisatellitenfragmenten zurückzuführen. Die wichtige praktische Konsequenz daraus ist die, daß in Fällen der NichtAusschließung, beispielsweise bei Vaterschaftsklagen, bei denen alle väterlichen Bänder in einem Kind präzise im DNA-Fingerabdruck des vermutlichen Vaters vorhanden sind, die sehr geringe Wahrscheinlichkeit einer fälschlichen Einbeziehung von χ - 0,2, wio sie oben berechnet wurde, eine grobe Überschätzung der echten Wahrscheinlichkeit ist (für χ = 0,016). Unter Verwendung der DNA-Fingerabdrucksonden 33.6 und 33.15 ist es möglich, die Segregation von bis zu 34 verschiedenen autosomalen Loki in großen menschlichen Familiengruppen zu markieren. Bei den meisten untersuchten Loki ist nur eines der beiden AIIeIe in einem Satz von größeren (>4kb), aufgelösten DMA-Fingerabdruck-Fragmenten markierbar, was daraf schließen läßt, daß große Größenunterschiede zwischen Minisatellitallelen bestehen, wobei sich viele AIIeIe in dem schlecht aufgelöston (<4kb) Bereich des DNA-Fingerabdrucks befinden. Das kann auch für den geklonten Minisatelliten festgestellt worden; Hinf I-AIIeIe a ι diesem Lokus variieren in der Länge zwischen 1,7 und 20/1 kb, und die Allelfrequenzverteilung in der Abb. 4 zeigt, daß beide AIIeIe dieses Lokus' bei den DNA-Fingerabdrücken von nur 40% der Personen aufgelöst würden, während kein AMeI bei 14% der Personen markierbar wäre.
Die Minisatellitsonden 33.6 und 33.15 entdecken zusammen etwa 60 hypervariable Loki, von denen viele nun für dio Klonung geeignet sein dürften, um eine Bank von hoch informativen, einzelnen Lokussonden zu schaffen, beispielsweise ideal für Kopplungsuntersuchungen beim Menschen. Die Kopplungsanalyse vererbter Störungen ist auch in einzelnen Großfamilien unter Verwendung des vollständigen DNA-Fingerabdrucks möglich. Wenn ein polymorphes Fragment entdeckt wird, das mit dieser Krankhe t zu kosegregieren scheint, ist es wesentlich, daß dieses Fragment geklont wird, um eine lokusspezifische Sonde zur Ausdehnung der Kopplungsanalyse auf zusätzliche betroffene Familien zu schaffen. Im folgenden Beispiel 2 werden die dargelegten Materialien und Methoden angewendet.
a) Klonung einer Auswahl von großen Minisatelliten
5pg ßlut-DNA von jeder von 40 zufällig ausgewählten Personen wurden gepoolt, vollständig mit Sau3A digeriert und 5-15kb-Fragmente durch präparative Elektrophorese in einem 0,6%igen Agarose-Gel isoliert, gefolgt von Elektroeluierung auf eine Dialysemembran. Die gereinigte Fraktion wurde in einem zweiten präparativen Gel elektrophoresiert, um alle Spuren des kontaminiertenden, kleinen Sau3A-Fragmentes zu entfernen. 50ng der 5-15kb-Fraktion wurden auf 100ng AL47.1-Arme ligiert, die nach Spaltung mit BamHI isoliert wurden (Loenen und Brammar, [Ί980] Gene 20,249-259), In vitro gepackt und eine Bibliothek konstruiert, gesichtet mit den Human-Minisatellit-Sonden 33.6 und 33.15 (sieho GB-PS Nr. 2166445), und es wurden positive Flecken isoliert, wie das im Bespiel 1 beschrieben wurde, um die MS-Serie des Rekombinantphags zu erzeugen.
b) Isolation von Minisatellithybridisationssonden
Rekombinantphag-DNA wurde mit Sau 3A digeriert, und das große Einfügungsfragment wurde von kleinen Vektorfragmenten durch Elektrophorese in Agarose mit niedriger Geliorungstemperatur abgetrennt. Die Gelscheibe, welche die Einfügung enthält, wurde bei 65°C in 3 Volumen Wasser aufgelöst, und Aliquote, die 10ng Einfügungs-DNA enthielten, wurden durch zufällige Olignnukleotidvorbereitung (Feinberg und Vogelstein [1984], Anal. Biochem. 137,266-267) mit 32P markiert.
c) Southern-Blot-Hybridisierung
Genomische DNA-Proben wurden begrenzt und elektrophoretisiert, wie das von Jeffreys u.a. (1986), Am. J. Hum. Onnet. 39, 11-24, beschrieben wurde. DNA wurde auf Hybond-N (Amersham) übertragen, durch UV-Bestrahlung fixiert und bei 650C für dia Dauer von 5min in 0,5M Natriumphosphat, 7% SDS, 1 niM EDTA (pH-Wert 7,2) vorhybridisiert (Church und Gilbert [19841, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81,1991-1995). Filter wurden über Nacht mit 0,5pg/ml 32P-markierter Sonden-DNA (spezifizierte Aktivität ~ 109cpm/pg DNA) bei Vorhandensein von 25pg/ml zerriebener, einsträngiger Human-Planzentalkompetitor-DNA hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei 65°C in 4OmM Natriumphosphat, 1 % SDS (pH-Wert 7,2) gewaschen, gefolgt von einer scharfen Waschung bei 65°C in 0,1 χ SSC (15mM NaCI, 1,5mM Trinatriumzitrat, pH-Wert 7,0), 0,01 % SDS. Filter wurden bei -SOX bei Vorhandensein eines Vor.jtärkungsschirmes einer Autoradiographbehandlung von 3 Stunden bis zu einer Woche unterzogen. .. ·
d) Bestimmung der Tandem-Wiederholungsfolge der MS-Reknmbinanten
Jede MS-Rekombinant-DNA wurde sonizieit und die Fragmente von 0,3-0,6kb nach der Größe ausgewählt und erzwungen in die Smal-Stelle von M 13mp 19 geklont (Yanis-Perron, Vieira und Messing [1985], Gene 33,103-119). Das Rekombinantphag wurde durch Fleckhybridisierung mit 32P-markierter MS-Einfügungs-DNA gesichtet. 10 stark positive, einsträngige Phag-DNA von einem gegebenen Rekombinant-MS wurden paarweise nach dem C-Test verglichen (Winter und Fields [1980], Nucleic Acids Res. 8,1965-1974); die meisten DNA fielen in zwei komplementäre C-Test-Gruppen und wurden daher wahrscheinlich von dem langen, tandem-repetitiven Bereich der AMS-Einfügung abgeleitet. Zwei M 13-Rekombinanten von jeder der beiden komplementären Gruppen wurden nach der Dideoxynukleotid-Kettenterminationsmethode sequentiert (Sanger, Nicklen und Coulson [1977], Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,5463-5467; Biggin, Gibson und Hong [1983], Proc. Natl. Acad. Sei. USA ÖO, 3963' \, 3965), um die Konsensus-Wiederholungsfoige jedos MS-Rekombinanten an beiden Strängen zu bestimmen.
a) Isolierung einer Auswahl von lokusspezifischen, hypervariablen DNA-Sonden Die Strategie zum Klonen eines ausgewählten Frcgmente.= von einem Human-DNA-Fingerabdruck durch präp.irative gelelektrophoretischß Isolierung des Fragmentes, gefolgt durch Klonung in ein Bakteriophag, wurde im Beispie' 1 beschrieben.
Um einen breiteren Bereich von Minisatelliten -Hi isolieren, wurden nach der Größe ausgewählte Sau3A-Fragme.ite von 6 bis 15kb von DNA, die von 40 zufällig ausgewählten Personen gepoolt wurde, in den BamHI-Austauschvektor XL47.1 geklont (Loenen und Brammar [1980], „A bacteriophage lambda vector for cloning large DNA fragments made with several restrictions enzymes" (Ein Bakteriophag-Lambda-Vektor zum Klonen großer DNA-Fragmento, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen hergestellt wurden), Gene 20,249-259). Da Human-Minisatelliten beachtliche Allelschwankungen in der Länge aufweisen können, wie durch das Beispiel 1 demonstriert wurde, dürfte der Einsatz gepoolter Human-DNA zum Klonen von großen Sau 3 A-
Fragmenten die Zahl der klonierbaren, hypervariablen Loki maximieren, die große Sau3 A-AIIeIe haben. Aus einer Bibliothek von 2 000 Rekombinanten wurden 5 Phage durch Hybridisierung auf die Human-Minisatellitsonde 33.15 isoliert, und weitere 5 Phage wurden durch Sonde 33.6 entdeckt, um die MS-Serie von Rekombinanten herzustellen (siehe Tabelle 1).
| Klon | Entdeckt durch | Andere | Länge der | Variation | Heterozygo- | Allellängen- | Chromoso |
| Isolate | Sau SA-Einfü | festgestellt | sität | bereich, kb | menzuwei | ||
| gung, kb | mit | sung | |||||
| pAg3 | 33.15 | — | 7,1 | Hinfl | 97 | 1,5-22 | 7q31.3qter |
| AiVISI | 33.15 | — | 4,6 | Hinfl | 98 | 2,0-22 | Ip |
| AMS8 | 33.6 | MS 40, | 7,0 | Hinfl | 90 | 2,4-9,5 | 5 |
| MS 42 | |||||||
| MS 47 | |||||||
| AMS31 | 33.15 | — | 5,7 | Hinfl | 99 | 3,5-13 | 7pterq22 |
| AMS 32 | 33.15 | — | 5,9 | AIuI | 97 | 2,3-28 | 1q |
| AIvIS 43 | 33.6 | 8,3 | Hinfl | 94 | 3,5-16 | 12 |
Um festzustellen, ob das einzelne AMS-Rekombinant als lokusspezifische Sonde für einon hypervariablen Minisatelliten dienen könnte, wurde die Sau3 Α-Einfügung jedes Rekc mbinanten bei Vorhandensein von Human-Kompetitor-DNA auf Hinf I-Digests von drei zufällig ausgewählten Personen hybridisiert oder, für AMS 32, dessen Minisatellittandem-Wiederholungseinheiten eine Hinf I-Stelle enthalten (Abb. 5), auf AIu I-Digests. Acht von 10 der auf ein oder zwei große, variable DNA-Fragmente in jeder getesteten Human-DNA Rekombinanten hybridisierten. Vier der durch Sonde 33.6 (AMS8,40,42 und 47) entdeckten Rekombinanten hybridisierten zu demselben Schema der variablen DNA-Fragmente und werden daher von demselben hypervariablen Lokus abgeleitet (Abb. 5, Tabellen.
Abb. 5 zeigt ein Seispiel für die Sichtung von AMS-Rekombinanten nach lokusspezifischen, hypervariablen DNA-Sonden. 2Mg-Proben von DNA von drei nicht miteinander verwandten Personen wurden mit Hinfl digeriert, durch ein 0,8%iges Agarose-GeI elektrophoretisiert und mit 32P-markierten Sau3A-Einfügungen von pAg3 (Beispiel 1), AMS8 und AMS40 Southern-Blothybridisiert, wie das unter Materialien und Methoden beschrieben wurde. Die Filter wurden nach der Hybridisierung bei 650C in 0,1 x SSC gewaschen und bei Vorhandensein eines Verstärkungsschirmes einen Tag (linke Tafel) oder eine Woche (rechte Tafel) einer Autoradiographbehandlung unterzogen. Es ist zu beachten, daß AMS8 und AMS40 denselben hypervariablen Lokus feststellen und daß bei längerer Autoradiographie zusätzliche variable DNA-Fragmente festgestellt werden können. Die verbleibenden Rekombinanten AMS1,31,32 und 43 wurden von verschiedenen Loki abgeleitet, die nicht von vorher charakterisierten pAg3-Lokus einschlossen (siehe Beispiel 1 und Abb. 5). Obwohl keiner dieser AMS-Rekombinanten DNA-„Fingerabdrücke" von mehrfachen variablen Fragmenten erzeugte, konnte festgestellt werden, daß die meisten AMS-Sonden schwach auf zusätzliche polymorphe DNA-Fragmente bei längerer radiographischer Einwirkung querhybridisierten (Abb. 5). Zwei der AMS-Rekombinanten, die durch Sonde 33.15 festgestellt wurden, AMS3 und AMS 30, konnten keinen spezifischen Lokus in Human-DNA feststellen, die mit Ninf I oder Sau 3 A digeriert worden war, weder beim Vorhandensein noch beim Fehlen von Human-Kompetitor-DNA. Bei längerer Autoradiographbehandlung entdeckten beide Rekombinanten dasselbe blasse Schema von variablen DNA-Fragmenten (Daten nicht gezeigt). Die Autoren können dieses Fehlen von Lokusspezifität nicht erklären, und diese beiden AMS-Rekombinanten wurden nicht weiter charakterisiert.
So konnte trotz früher berichteter Schwierigkeiten beim Klonen von großen und instabilen menschlichen Minisatelliten (siehe beispielsweise Nicholls u.a. [1985], Nucleic Acids Res. 13, 7569-7573, und Wyman u.a. [19851, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 6754-6758) nachgewiesen werden, daß zumindest einige der größten und am stärksten variablen DNA-Fragmente, die in einem DNA-Fingerabdruck entdeckt werden, für das Klonen in Bakteriophag A geeignet sind, vorausgesetzt, daß die Einfügungen durch Übertragung von diesem Phag in eir.°n Wirt recBC E. coli stabilisiert werden.
b) Bestimmung der Wiederholungsfolgeeinheiten von geklonten Minisatelliten Zufällige Segmente der Einfügungs-DNA von jedem AMS-Rekombinanten wurden sequentiert, um festzustellen, ob jeder geklonte, hypervariable Lokus aus tandem-repetitiven Minisatelliten bestand (siehe Materialien und Methoden). Es wurde gezeigt, daß ulle AMS-Klone vorwiegend aus Tandem-Wiederholungseinheiten besteht, deren Länge zwischen 9 bp für AMS1 und 45bp für AMS43 beträgt (Abb.6).
Abb. 6 zeigt die Konsensus-Wiederholungsfolgeeinheiten der AMS-Serie von Minisatelliten. Zufällige Segmente jedes geklonten Minisatelliten wurden sequentiell, um die Konsensus-Wiederholungseinheit zu definieren. Variable Positionen in jedem Konsensus werden gezeigt al: R, r = A oder G; Y, y = C oder T: N, η = Jede Basis. Der Minisatellit in AMS8 besteht av. zwei ineinander eingefügten Wiederholungseinheiten von 29 und 30 bp Länge. Jede Wiederholungsfolge ist mit der Kernfolge ausgerichtet, wobei das durch Großbuchstaben veranschaulicht wird, eingeschlossen ist auch eine neue Kernfolge, die aus einem Vergleich des Kerns mit pAg3, AMS31 und AMS32 abgeleitet wird.
In keinem Minisatelliten sind die Wiederholungseinheiten vollkommen homogen, was mit der Variation zwischen den Wiederholungseinheiten konsistent ist, die man bei den vorher sequentiellen Minisatelliten beobachten konnte (siehe britische Patentpublikation Nr. 2166445 und vorliegendes Beispiel 1). Bemerkenswert ist auch, daß der Minisatellit in AMS 8 aus einer vermischten Anordnung von zwei <jng aufeinander bezogenen, aber unterschiedlichen Wiederholungseinheiten von 29 und 30bp Länge besteht (Ahb.6). Die Endpunkte der Minisatelliten in dan AMS-Rekombinanten wurden noch nicht bestimmt. Auf diese Weise wurden fünf neue hypervariable Loki isoliert, die jeweils vor allem aus einem tandem-repetitiven Minisatelliten bestehen. Die Tandem-Wioderholungseinheiten von pAg3, AMS1, AMS31 und AMS32 enthalten, wie erwartet, jeweils die Kernfolge (Abb. 6). Die Kopien der Kemfolge sind jedoch imperfekt und Vergleiche der Wiederholungsfolgen dieser Minisatelliten definieren nicht eindeutig eine neue Kernfolge, die vorzugsweise diesen großen und extrem variablen Loki zugeordnet ist. Es scheint vielmehr wahrscheinlich zu sein, daß diesen großen Minsatelliten ein breiter Bereich von Kernd Privaten zugeordnet werden kann. Bemerkenswerter aber 3t, daß die Minisatelliten AMS8 und AMS43, die durch Sonde 33.6 entdeckt wurden, welche aus Tandem-Wiederholungen einer divergierten Version der Kerpfolge besteht (siehe GBPS Nr. 2166445), stark divergierte Versionen der Kernfolge enthalten (Abb. 2). Erneut
weisen Vergleiche von AMS8, AMS43 und 33.6 nicht eindeutig eine neue spezifische Folge auf, die vorzugsweise diesen drei Loki zugeordnet ist (Daten nicht gezeigt). Es ist klar, daß eine detaillierte Suche nach weiteren Folgemotiven, die den variabelsten Minisatelliten zugeordnet sind, insbesondere den durch die Sonde 33.6 entdeckten, die Analyse eines viel größeren Spektrums von geklonten Minisatelliten verlangt.
c.) Mendelsche Vererbung und Variabilität der durch geklonte Minisatelliten entdeckten Loki Die fünf neuen isolierten Minisatelliten, AMS1,8,31,32 und 43, entdecken jeweils einen einzigen großen und variablen Lokus. Die Mendelsche Vererbung alle Loki wurde durch Analyse der Segregation in großen horizontalen Stammbäumen, wie sie durch das CEPH-Programm entwickelt wurden, bestätigt (Abb. 7).
Abb.? zeigt die Mendelscho Vererbung des durch AMS32 entdeckten hypervariablen Lokus. DNA-Proben zu 1 Mg aus dor CEPH-Familiei4i3wurdenmitAluldigeriert und auf die 32P-makierteSau3A-Einfügung von AMS31Southern-Blot-hybridisiert. Diese' Familie ist an diesem Lokus vollkommen informativ.
Das Ausmaß der allelischen Variabilität für jede Sonde wurde durch Analyse der Frequenz der Allelteilung zwischen zufällig ausgewählten englischen Personen bestimm: (Abb.8).
Abb. 8 vermittelt eine Schätzung der allelischen Variabilität am hypervariablen Lokus, der durch AMS43 entdeckt wurde. Proben zu 1 \ig von DNA von 20 zufällig ausgewählten Engländern wurden mit Hlnf I digeriert und auf AMS43 Southern-Blot-hybridisir .. Alle Personen sind heierozyg, was darauf hinweist, daß der Pegel der Heterozygosität an diesem hypervariablen Lokus hoch ist (H > 0,86, ρ > 0,95). Eine genauere Bestimmung der Hetarozygosität kann durch den Vergleich von Ailelc-n bei jeder einzelnen Personen mit Allelen bei der sechs nächstgelegenen Nachbarn auf dem Autoradiograph gemacht werden, um die Werte der Allelteilung zwischen den Personen zu bestimmen. Beispielsweise scheint das größere AlIeI in Person 5 bei 7, nicht aber bei 2,3, 4,6 und 8 vorhanden zu sein. Ebenso ist das kleinero AIIeI in 5 in 2-4 und 6-8 nicht vorhanden. Für alle untersuchten Personen s = 0,11, woraus die mittlere Allelfrequonzq mit q = 1 -(1 -s)"2 = 0,056 und die Heterözygosität mit (1 - q) = 94% geschätzt werden kann. Das ist eine Minimalschätzung der Heterozygcsität, die durch die gel-elektrophoretische Auflösung begrenzt wird.
Alle Loki sind stark variabel, wobei die Heterozygositäten zwischen 90% für AMS 8 und 99% für AMS 31 liegen (siehe vorstehende Tabelle 1). Das Ausmaß der Variation der allelischen Länge wurde weiter durch den Vergleich des Spektrums von Allelen analysiert, die in Pools von 15 und 150 Personen aufgelöst sind (Abb. 9). Abb. 9 zeigt eine Analyse der Variation der Allellänge an hypervariablen Loki in Pools von Human-DNA. Proben zu 10Mg der DNA von einer einzelnen Person (a), aus einem Pool von 15 Personen (b) und aus einem Pool von 150 Personen (c) wurden mit AIuI (bei AMS32) oder Hlnf I (bei allen übrigen Sonden) digeriert und mit den angegebenen lokusspezifischen, hypei variablen Sonden Southern-Bfot-hybridisiert. Alle Personen waren zufällig ausgewählte Nord9uropäor. Person a wurde in Pool b einbezogen, und alle Personen aus Pool b wurden in Pool c einbezogen. Es sollte beachtet werden, daß AMS43 einen zweiten variablen Bereich entdeckt, der durch die kurzen'Hinf I-Allele dargestellt wird, die mit 0 gekennzeichnet sind; dieser Bereich wird nicht weiter charakterisiert.
Für den am wenigsten variablen Lokus, AMS8, gibt es zwei vorherrschende AIIeIe, die 5,3 und 7,2kb lang sind, und 7 AIIeIe mit niedriger Frequenz, die im Pool von 15 Personen auflösbarsind. Daß die Oeicten vorherrschenden AIIeIe nicht das Ergebnis eines Probenahmefehlers bei diesen 15 Personen sind, wird durch deren ähnliche Prädominanz im Pool von 150 Personen, zusammen mit einem größeren Spektrum von Niederfrequenzallelen, nachgewiesen. Ebenso weist AMS43 (94% Heterozygosität) 7 größere AIIeIe auf, die den Pools von 15 und 150 Personen gemeinsam sind, zusammen mit vielen kleineren Allelen. Im Gegensatz dazu weisen die am stärksten variablen Loki AMS1,31 und 32 und pAg3, mit Heterozygositäten zwischen 97 und 99% keine AIIeIe mit einer signifikanten Populationsfrequenz auf, die mit gleicher Intensität in beiden Pools von Personen vorhanden sind (mit Ausnahme des kürzesten AIIeIs von 1,6 kb von pAg 3, wie oben beschrieben), und damit ist die Anzahl der AIIeIe an dieson Loki wahrscheinlich sehr hoch. Beispielsweise können wenigstens 50 verschiedene AMS32-Allele im Pool von 150 Personen aufgelöst werden; das ist eine Minimalscnätzung der Gesamtzahl der AIIeIe, die durch die Gel-Elektrophoreseauflösung begrenzt ist. Die Längenstreuung der AIIeIe bei Kaukasiern schwankt auch zw> :chen diesen hypervariablen Loki (siehe AbD.9 ind Tabelle 1). Die meisten AIIeIe von AMS31 sind ziemlich gleichmäßig über einon verhältnismäßig schmalen Größenbereich ve η 5,5-9,3kb verteilt, während die AIIeIe von MS1 in der Größe zwischen 2 υ :d 2Ukb schwanken, in einigen Fällen gibt es Anzeigen für eine Uneinheitlichkeit der Alleilängenverteilung; insbesondere weist AMS43 zwei vorherrschende Allelgrößenklassen von 5-6kb und 8-14kb auf, und pAg3 zeigt drei Größenklassen von 1,6-1,7,2,8-3,6 und 5-15kb, wie das vorstehend im Beispiel 1 beschrieben wurde.
Wie oben bereits ausgeführt wurde, sind die festgestellten Loki extrem variabel und gehören tatsächlich zu den am stärksten polymorphen Loki, die bisher aus Human-DNA isoliert wurden.
d) Chromosomenzuweisen der hypervariablen Loki
Keine der hypervariablen, lokusspezifischen Sonden hybridisiert auf Nagetier-DNA, daher konnto die Segregation dieser Loki in somalischen Mensch-Nagetier-Zellhybriden verfolgt werden (siehe Abb. 10 und untenstehende Tabelle 2). Die sechs Loki wurden vier verschiedenen Autosomen zugewiesen, wobei die Chromosomen 1 und 7 jeweils zwei hypervariable Loki tragen. Abb. 10 zeigt die Segregation dos hypervariablen Lokus, der durch AMS32 entdeckt wurdo, in einer Tafel von somatischen Mensch-Nagetier-Zellhybrid-DNA, die mit AIu I digeriert wurden. Dieser Lokus konsegregiert mit Human-Chromosom 1 (siehe untenstehende Tabelle 2). Interessanterweise trug der Hybridzellstamm MOG 2C2 zwei AIIeIe sowohl von AMS32 als auch von AMS1 (Daten nicht gezeigt). Das läßt stark darauf schließen, daß in diesem Hybriden beide Stammkopien von Human-Chromosom 1 erhalten geblieben sind, und da alle anderen positiven Hybriden nur ein einzelnes Aliel an jedem dieser Loki enthielten, unte'stützt das stark die Annahme einer Resonanz von AMS1 und AMS32. Hybrid F4SC13c 112 enthält Chromosom 1 p, ist aber negativ tür AMo 32; folglich wird AMS 32 provisorisch zu Chromosom 1 q lokalisiert. In der Abb. 10 wird der folgende Kode verwendet:
1. Human
2. Hamster
3. Maus
4. FG10
5. PCT BA 6.19498
7. SIF 4 A 24 El 8.SIF15P5 9. CTP 34 B 10. TWIN 19 D12 11.TWIN19F9 12.TWIN19F6 13TWIN19C5 14.MOG2C2 15.MOG2E5
16. Human
17. Ratte
18. DUR
19. FIR 20.C4A 21.DUR4R3 22.3W4CI5
23. Klon
24. WILF1
25. F4 SC13 el 26.SIF4A31 27. FST 9/10 28.HORL411B6 29. HORP 9
Tabelle 2 zeigt die Chromosomenzuweisung der hypervariablen Loki bei somatischen Mensch-Nagetier-Zellhybriden. Tabelle 2: Chromosomenzuweisung der hypervariablen Loki in somatischen Mensch-Nagetier-Zellhybriden
Chromosom
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X pAg3 AMS1 AMS AMS AMS AMS
2 3 4 5 6
9 10 11 12
Hybrid-Nr
15 16 17 18 19 20 21
+ M
+ ι
N +
M -
T ~~ — — —
j_ ι
i „ I
- N
23
i +
+ N
4-
N N
Chr. 717/17 Chr. 1 22/22 Chr. 520/21 Chr. 7 20/20 Chr. 1 23/23 Chr. 1224/24
In der Tabelle 2 wurden folgende somatische Zellhybriden typisiert:
1, Dl IO4.3; 2, FIR5; 3, C4A; 4, DUR4R3; 5,3W4c15; 6, Klon 21; 7, WILM; 8, F4SC13 112; 9, SIF4A31; 10, FST9/10; 11, HORL411B6;12,HORP9.5;13,FG10;14,PCTBA18;15,1a949ß;16,SIF4/\2s..1;17,SiH5P5;18,CTP34B4;19,TWIN19D12; 20, TWIN 19F9;21,TWIN19F6; 22, TWIN 19C5;23,MOG2C"; 24, MOG2E5, und die Bedeutung derinderTabelle verwendeten
+ Chromosom oder hypervariabler Lokus vorhanden; — Chromosom oder Lokus nicht vorhanden; M Chromosom nur in einigen Zellen vorhanden oder Lokus durch Southern-Blot-Hybridisierung nur schwach festgestellt; N Chromosom nicht getestet oder zweideutiges Ergebnis, Lokus nicht getestet; P kurzer Arm vorhanden; D Chromosom 7 pter -> η 22 als 7/X-Transloziierung vorhanden. Die deduzierte Chromosomenzuweisung jeder lokusspezifischen, hypervariablen Sonde wird, zusammen mit d?r Fraktion von unzweideutig informativen Zellhybriden, die konkordant für das Vorhandensein oder Fehlen von intakten Zellchromosomen und hypervariablen Loki sind, gegeben. Für jede hypervaiiable Sonde wurden alle Chromosomen
mit Ausnahme von einem mehrfach durch diese Analyse ausgeschlossen.
Die Hybridisierung von AMS1 auf Hybrid 8 (F4SC 13d 12), welches Chromosom 1 ρ enthält, läßt vermuten, duß AMS1 sich auf 1 ρ befindet. PAg 3 hybridiert nicht auf Hybrid 2 (FIR 5),welches das Chromosom 7 pter-q 22 enthält. Außerdem sind die Hybriden JDA13.1 und JDA3, welche 7 pter-q 31.3 bzw. 7 q31.3-pter enthalten, für pAg 3 negativ bzw. positiv (Daten nicht gezeigt), wodurch pAg3 auf 7q31.3-qter lokalisiert wird. Umgekehrt hybridisiert AMS31 auf FIR 5 und JDA !3.1, rieht aber auf JDA3, was eine Lokalisierung boi 7 pter --»q 22 vermuten läßt. Diese fehlende Klusterbildung wurde durch Kopplungsanalyso in großen CEPH-
Verwandtschaften bestätigt, die keine signifikante Kopplung zwischen den Paaren von syntenischen Markern zeigte (z > -2 bei ^ >0,35 für jedes Paar, Daten nicht gezeigt).
Alle sechs geklönten Minisatelliten-Loki, einschließlich des in Beispiel 1 beschriebenen pAg3, sind autosomal und gestreut, von zwei festgestellten Paaren von syntenischen Paaren von Minisatelliten weisen keine eine signifikante paarweise Kopplung auf. Diese autosomale Lokalisierung und dio fehlende Klusterbildung stimmt vollkommen mit den früheren Ergebnissen der Segregtionsanalyse von DNA-Fingerabdrücken überein, die zeigte, daß die zahlreichen hy nervariablen DNA-Fragmente, die durch Polykernsonden festgestellt werden, von vielfachen und dispergieren autosomalen Loki abgeleitet werden, obwohl die Chromosomenlokalisierung der einzelnen Fragmente nicht von DNA-Fingerabdrucken abgeleitet werden konnte. Die bisher lokalisierten geklonten Minisatelliten tendieren dazu, von den größeren Human-Autosomen abgeleitet zu werden (Tabelle 1), wie erwartet wird, wenn sie zufällig über das Humangenom gestrout sind. Fehlt eine präzise regionale Lokalisierung, bleibt es möglich, daß diese Minisatelliien vorzugsweise an Zentromeren und Telomeren lokalisiert sind, welche reich an einfacher Folge-Satelliten-DNA sind. Die Segregationsanalyse von DNA-Fingerabdruckfragmenten bei rekombinanten Inzuchtstämmen von Mäusen hat gezeigt, daß Maus-Minisatelliten nicht vorzugsweise Zentromeren oder Telomeren zugeordnet sind, und es ist wahrscheinlich, daß die menschlichen Gegenstücke ähnlich gestreut sind.
Sensitlvität der Minisatellitensonde und yerichtsmedizinische Anwendungen ,
Die tandem-repetiuven Minisatellitensonden, die getestet wurden, sind sehr sensitiv, besonders im Ergebnis des repetitiven Charakters sowohl der Hybridisinrungssonde als auch der Zielminisatelliten-DNA. Das autoradiographische Southern-Blot-Signal, das nach einer Hybridisierung über Nacht gewonnen wird, ist bei Sonden-DNA-Konzentrationen von > 0,1 ng/ml gesättigt (Daten nicht gezeigt), und es können leicht Signale von 60g oder weniger von mensi blicher Genom-DNA gewonnen werden (siehe Abb. 11 A). Ebenso können diese Sonden, in Abhängigkeit von den Genotypen der getesteten Personen, eine Beimischung von 2% oder weniger der DNA einer Person zu einer anderen feststellen (siehe Abb. 11 B). Die Sensitivität und Variabilität dieser lokusspezifischon Minisatellitensonden macht sie in der Gerichtsmedizin b iers nützlich. Abb. 11C zeigt eine Analyse von Spermaflecken von zwei Opfern, die sexuell angegriffen und ermordet wuiden, wobei die Ermittlung von DNA vom zweiten Opfer für eine herkömmliche DNA-Fingerabdruckanalyse nicht ausreichend war, bei der wenigsten 0,5 μg DNA je Test gebraucht werden (siehe GB-PS Nr. 2166445).
So zeigt die Abb. 11 eine Einschätzung der Sensitivität der lokusspezifischen Sonden und deren Anwendung bei der gerichtsmedizinischen Analyse eines Falles von Doppelvergewaltigung und Doppelmord. In der Abb. 11A wurden abnehmende Mengen von Human-DNA, die mit Hinf I digoriort war, mit 32P-markierter Einfügungs-DNA von AMS1 Southern-Bloi-hy bridisiert. Die Filter wurden bei Vorhandensein eines Verstärkungsscliirmes eine Woche lang einer Autoradiographbehandlung unterzogen. In der Abb. 11B werden abnehmende Mengen der DNA von Person A mit 4 pg DNA der Person B in den angegebenen Verhältnissen gemischt u-d wie in Abb. 11A mit MS1 Southern-Blot-hybridisiert. In der Abb. 11 c sind die Opfer X und Y sexuell mißbraucht und ermordet worden. Ein Verdächtiger Z war des Mordes an Y angeklagt worden, und gerichtsmedizinische Hinweise sprachen dafür, daß sowohl X als auch Y von derselben Person ermordet wurden. DNA von den folgenden forensischen Spezimen wurde isoliert und analysiert: a. Haar von X, das zwei Tage nach dem Tod entnommen wurde; b. ein Gemisch von Sperma und Vaginalflüssigkeit, das vom Schamhaar von χ gewonnen wurde; c. frisches Blut des Verdächtigen Z; d. Herzblut, das einen Tag nach dem Tod von Y entnommen wurde; e. . 'nalabstrich von Y mit Sperma, Blut und Vaginalmaterial; f. ein Fleck aus dem Rock von Y mit Sperma und Blut. Die Proben a ui κ - waren bei 4°C trocken 3 Jahre gelagert worden, die Proben d und e bei 4=C zwei Monate und die Probe f trocken bei 4°C für die Dauer von 2 Monaten.
DNA wurde nach den Verfahren von Gill, Jeffreys und Werrett (1985), Nature 318,577-579, extrahiert, mit Hinf I digeriert und auf eine 32P-markierte AMS1 -Einfügung Southern-Blot-hybridisiert. In jeder Probe wurden 0,8 pg DNA analysiert, ausgenommen bei Probe e (0,1 μg DNA) und Probe f (0,04Mg DNA). Die Autoradiographie erfolgte über eine Woche bei Vorhandensein eines Verstärkungsschirmes. Es ist zu beachten, daß die Spermaflecken b, e und f jeweils zwei hybridisierende DNA-Fragmente enthalten, die nicht auf das Opfer zurückzuführen sind. Außerdem enthält Probe b die AIIeIe des Opfers, die von Vaginai-DNA abgeleitet wurden. Die Sparmaallele in b, e und f sind nicht unterscheidbar, was vermuten läßt, daß die Opfer X und Y tatsächlich durch denselben Mann vergewaltigt wurden. Die AIIeIe des Verdächtigen Z passen nicht zu denen der Spermaflecken. Diese Ergebnisse wurden durch Hybridisierung mit MS31 (Daten nicht gezeigt) und durch DNA-Fingerabdruckanalyse von größeren Mengen an gerichtsmedizinischem Material bestätigt. Angesichts dieser Hinweise, wurde die Anklage gegen den Verdächtigen durch den Kronanwalt fallen gelassen.
Gepoolte Minisatellitsonden
Die Sensitivität dieser Minisatolliten bei Southern-Blot-Hybridisationen ermöglicht es, Pools von Sonden zu verwenden, um variable DNA-Fragmente von verschiedenen Loki gleichzeitig zu entdecken, wie das für einen Pool von 5 Sonden (pAg3, AMS1, AMS 8, AMS31 und AMS43) in der Abb. 10 gezeigt wird, in der Theorie ist die Anzahl der verschiedenen DNA-Fragmente, die
5 durch 5 Sonden feststellbar ist, gleich £ (1 + Hj), wobei H, die Heterozygosität der i :en Sonde ist. Für diese 5 Sonden sollten
durchschnittlich 9,78 Fragmente je.Person festgestellt werden. In der Praxis werden 8,4 ±1,2 (S. D.) Bänder > 2 kb aufgelöst (40 zufällig ausgewählte Personen getestet). Dieser Verlust an auflösbaren Bändern ist teilweise auf die Ausschließung des kleinen (1,6kb) und relativ gemeinsamen pAg3-Allels (Beispiel 1, mittlerer Verlust je Person = 0,33 Band) zurückzufünren, ist aber vor allem das Ergebnis der elektrophoretischen Komigration v" «'or.-.chiedenen Minisatellitenallelen.
Die Multiiokus-Southern-Blot-Schemata sind stark individuell-spezifisch bei nur 18% (S. D. ± 11 %) der DNA-Fragmente, die zwischen Paaren von zufällig ausgewählten Nordeuropäern (4w getestete Paare) gemeinsam sind. Bei Sippen steigt der Pegel der Fragmentteilung wie erwartet auf -57% (10 getestete Sippenpaare).
-18- 263 7S2
Bei Vater-Mutter-Kind-Trios können alle Nachkommensfragmente auf die Eltern zurückverfolgt werden (Abb. 12). Jeder Nachkömmling enthält 3,4 ± 0,5 (S. D.) DNA-Fragmente, die spezifisch für den väterlichen Ursprung sind, und eine gleiche Anzahl von mütterlich-spezifischsn DNA-Fragmenten (10 Va'.er-Mutter-Kind-Trios wurden getestet).
So zeigt, wie angegeben, die Abb. 12 die Feststellung von mehrfachen hypervariablen Loki in Human-DNA durch Hybridisierung mit gepoolten Minisatellitsonden. DNA-Proben zu 4pg von einer zufälligen Auswahl britischer Menschen (1-6), von Sippenpaaren (7,8 und 9,10) und von Vater-Kind-Mutter-Familiengruppen (11,12,13 und 14,15,16) wurden mit Hinf I digeriert und durch ein 0,8%iges Agarose-Gel elektrophoretisiert, bis alle kleineren Fragmente als 2kb aus dem Gel elektrophoretisiert waren. Die Auszüge wurden mit 2ng der Einfügungs-DNA von jeweils pXg3, XMS1, XMS8, XMS31 und XMS43 Southern-Blothybridisiert; die Einfügungen wurden vor der Kennzeichnung mit 32P durch zufällige Oligonukleotidvorbereitung gepoolt. Schwankungen in der Intensität der Bandmarkierung ergeben sich vermutlich aus der Variabilität in der Effektivität der Markierung und Hybridisierung der einzelnen Sonden.
Claims (9)
- Patentansprüche: !1. Verfahren zur Kennzeichnung einer Testprobe genomer DNS durch Vergleich mit einem oder mehreren Vergleichsmaterialien, gekennzeichnet dadurch, daß es in der Fragmentierung der DNS-Probe mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen besteht, welche nicht in merklichem Umfang eine Sequenz spalten, die einerTandem-Wiederholung entspricht, Sondierung der DNS-Fragmonte mit einem Polynucleotid oder einer Polynucleotidsonde, die eine Nucleotidsequenz enthält, welche spezifisch für einen einzelnen Minisattelitenbereich oder ei. .an hypervariablen Lokus ist und damit homolog ist bis zu einem Grade, der die Hybridisierung der Nucleotidsequenz zu einem entsprechenden DNS- Fragment ermöglicht, welches einen Minisatelliten aus der genannten einzelnen Minisatelli'^n-egion oder dem hypervariablen Lokus enthält, Nachweis der hybridisierten DNS-Fragmente und Verc·' Jf^ der hybridisierten Fragmente mit einem genannten Vergleichsmateriu! oder Vergleichsmaterialien, worin1) die genannte Minisatellitregion oder der hypervariable Lokus eine allelische Variation von mindestens 3(100) oder einen Polymorphiegrad von mindestens 3 hat und2) die genannte Region oder der Lokus mit einer Polynucleotidsonde nachweisbar ist, welche geeignet ist, die DNA durch Bezugnahme auf mehr als eine polymorphe Minisattelitregion oder hypervariablen Lokus zu differenzieren.
- 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Polynucleotid oder die Polynucleotidsonde in isolierter oder Monierter Form vorliegt und eine Nucleotidsequenz enthält, welche für eine einzelne Minisatellitenregion oder einen hypervariablen Lokus spezifisch ist und damit homolog ist bis zu einem Grade, der die Hybridisierung der Nucleotidsequenz zu einem entsprechenden DNS-Fragment ermöglicht, welches erhalten wird durch Fragmentierung von genomen DNS-Proben mit einer Restriktions-Endonuclease, welches genannte DNS-Fragment einen Minisatelliten aus der genannten Minisatellitregion oder dem hypervariablen Lokus enthält, worin1) die genannte Region oder der Lokus eine allelische Variation (wie hier definiert) von mindestens 3(100) oder einen Polymorphiegrad von mindestens 3 hat und2) die genannte Region oder der Lokus durch eine Polynucleotidsonde nachweisbar ist, welche mindestens drei Tandemwiederholungen der Sequenz (einschließlich komplementärer Sequenzen)(A)AGGGCTGGAGG 1 ((worin T gleich T oder U ist und (A) vorhanden sein oder fehlen kann) oder der Sequenz (einschließlich komplementärer Sequenzen)AGAGGTGGGCAGGTGG 2(worin T gleich T oder U ist) enthält.
- 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die DNS-Fragmente mit einem Polynucleotid oder einer Polynucleotidsonde sondiert werden, welche eine Nucleotidsequenz enthält, die in einem Grade, der die Hybridisierung mit einer Minisatellitregion oder einem hypervariablen Lokus ermöglicht, homolog ist, welche Region oder Lokus spezifisch identifizierbar ist durch eine Polynucleotidsonde, welche eine der folgenden Sequenzen enthält:AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCAGGGAGRGGC 3GTGGAYAGG 4TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCm 6GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG 7AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC 8TGTGTGTAATGGGTATAGGGAGGGCCCCGGGAAGGGGGTGTGGYX 9 ,(worin Y gleich C, T oder U ist, X gleich G oder C ist, R gleich A oder G ist und T gleich T oder U ist) oder Tandem-Wiederholungen davon.
- 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Polynucleotid ein Polynucleotid ist, oder die Polynucleotidsonde ein solches enthält, welches geeignet ist, zu einem DNS-Fragmentzu hybridisieren, welches einen Minisatelliten enthält, welcher spezifisch ist für eine spezielle Region oder einen Lokus in dem Genom, wobei die genannte Region oder der Lokus eine allelische Variation (wie hier definiert) von mindestens 3(100) oder einen Polymorphiegrad von mindestens 3 hat und das Polynucleotid dargestellt wird nach einem Verfahren, bestehend in Klonierung eines DNS-Fragments, identifiziert durch Hybridisierung von Fragmenten genomischer DNS mit einer Polynucleotidsonde, welche in eier Lage ist, DNS durch Bezugnahme auf mehr als eine polymorphe Minisatellitenregion oder hypervariablen Lokus zu differenzieren, und Herstellung eines Polynucleotide daraus, welches in der Lage ist, zu einem DNS-Fragment zu hybridisieren, welches einen Minisatelliten enthält, der spezifisch für eine bestimmte Region oder Lokus des Genoms ist, welche Region oder Lokus eine allelische Variation (wie hier definiert) von mindestens 3(100) oder einen Polymorphiegrad von mindestens 3 hat.
- 5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß die DNS-Probe humane DNS ist.
- 6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß zur Feststellung der Identität oder Nichtidentität des Spenders der Testprobe mit einem oder mehreren Spendern von Vergleichsproben, bei dem die Vergleichsprobe(n) in gleicher Weise fragmentiert werden und ein Vergleich der hybridisierten Fragmente aus den jeweiligen Proben durchgeführt wird.
- 7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß zur Feststellung von Familienbeziehungen zwischen dem Spender der Testprobe und den Spendern von einer oder mehreren Vergleichsproben, bei dem die Vergleichsprobe(n) in gleicherweise fragmentiert werden und ein Vergleich der hybridisierten Fragmente aus den jeweiligen Proben durchgeführt wird.
- 8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß die Sondierung mit mindestens zwei Polynucleotidsonden gemäß Definition in einem der Ansprüche 1-4 durchgeführt wird, entweder in einer Testfolge oder in einem Einzeltest mit einem Gemisch der genannten Sonden.
- 9. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Diagnose einer ererbten Krankheit, Abnormität oder Eigenschaft, gekennzeichnet dadurch, daß es in Sondierung der Testprobe mit mindestens einer Polynucleotidsonde gemäß Definition in einem der Ansprüche 1-4 besteht, wobei die genannte Sonde, die nicht notwendig eine markierte oder Markerkomponente enthalten muß, einer bestimmten ererbten Krankheit, Abnormität oder Eigenschaft zugeordnet wird.
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