AT394578B - Verfahren zur herstellung von nucleinsaeure-reagenzien - Google Patents
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Description
AT 394 578 B
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Reagenzien, die mindestens eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, und Zusammenstellungen solcher verbesserter Reagenzien. Diese Verfahren sind gentechnologische Herstellungsverfahren der Nucleinsäure-Reagenzien, die mindestens eine Reihe von Klonen enthalten, und DNA-Rekombinationsverfahren zur Herstellung von Kombinationen solcher Nucleinsäure-Reagenzien. Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung der Nucleinsäure-Reagenzien im Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren durch Hybridisierung.
Verschiedene Hybridisierungs-Verfahren wurden bereits für die Identifizierung und die Untersuchung von Nucleinsäuren angewendeL Einige Beispiele sind die direkten Hybridisierungs-Verfahren, bei denen die die zu identifizierende Nucleinsäure enthaltende Probe entweder in einer Lösung (Bräutigam et al., J. Clin. Microbiol. 12,226 - 234 (1980) und GB-A 2 019 408) oder an einen festen Träger gebunden vorliegt (US-PS 4 139 346, 4 302 204,4 358 535, 4 395 486, GB-A 2 034 323, 2 095 833, EP-A-62 286, 62 237 und 61 740) und mit einem markierten Nucleinsäure-Reagens nachgewiesen wird, das mit der zu identifizierenden Nucleinsäure hybridisiert.
Zu weiteren bekannten Hybridisierungs-Verfahren gehören das zweistufige "Sandwich"-Hybridisierungs-Ver-fahren von Dünn und Hasseil (Cell 12,23 - 36 (1977)) und die einstufigen "Sandwich”-Hybridisierungs-Verfah-ren der EP-A-79 139. Bei der Identifizierung von Nucleinsäuren durch die "Sandwich"-Verfahren werden zwei getrennte Nucleinsäure-Reagenzien zum Nachweis der Nucleinsäuren in der Probenlösung benötigt Eines dieser Reagenzien ist an ein festes Trägermaterial gebunden, das andere ist markiert Sowohl die Nucleinsäure-Reagenzien, die an das feste Trägermaterial gebunden sind, als auch die, die markiert sind, sind dadurch gekennzeichnet, daß ihre Nucleotidsequenz komplementär oder nahezu komplementär zu der der zu identifizierenden Nucleinsäure ist d. h. sie ist homolog. Die verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien sind entweder natürliche Nucleinsäuren oder Fragmente von diesen. Die Fragmente werden beispielsweise mit Restriktionsenzymen hergestellt Nucleinsäure-Reagenzien wurden auch bereits synthetisch oder mit Hilfe von DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt
Auch natürliche Plasmide (US-PS 4 358 535), Nucleinsäuren aus Bakteriophagen (US-PS 4 543 535), Ribo-somale-RNA und Boten-RNA (US-PS 4 302 204) oder Nucleinsäuren aus verschiedenen Viren (Stälhandske et al., curr. top. Microbiol. Virol. 104 (1983)) wurden bereits als Nucleinsäure-Reagenzien verwendet Das gesamte Virus-Genom wurde beispielsweise bereits zur Identifizierung der Anteile verschiedener Viren in der mRNA eines Hybrid-Virus verwendet (Dünn und Hassell, Cell 12,23 - 36 (1977)). Ebenso wurden Nucleinsäure-Reagenzien bereits mit DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt (US-PS 4 395 486 und 4 395 535, EP-A-79 139 und GB-A 2 034 323 sowie EP-A-62 286). Mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellte Nucleinsäure-Reagenzien wurden entweder als definierte, aus dem Vektor herausgeschnittene und von dessen DNA abgetrennte DNA-Fragmente oder als rekombinante DNA-Moleküle, also verbunden mit verschiedenen Vektoren, hergestellt Die im Stand der Technik verwendeten, mit DNA-Rekombinationsverfahren hergestellten Nucleinsäure-Reagenzien bestehen aus einem kontinuierlichen, zur Identifizierung verwendeten Nucleinsäure-Fragment oder aus verschiedenen getrennten Klonen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Reagenzien ist dadurch gekennzeichnet daß man folgende Schritte durchführt: a) Isolierung einer ausgewählten Nucleinsäure mit geeigneter Länge, b) Klonierung der ausgewählten Nucleinsäure in einem geeigneten Vektor, c) Fragmentierung der Nucleinsäure mit Restriktions-Enzymen, d) Zuordnung von nicht miteinander hybridisierenden Fragmenten zu mindestens zwei, vorzugsweise jedoch mehreren Reihen von alternierenden Fragmenten, e) gegebenenfalls Zuordnung geeigneter Reihen von Fragmenten zu Serien, wobei die Reihen gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden; f) Subklonierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen, zu einer Reihe zugeordneten Fragmente, oder der miteinander verbundenen, zu einer Serie zugeordneten Reihen von Fragmenten, die verschiedenen Serien angehören, vorzugsweise in verschiedenen, nicht miteinander hybridisierenden Vektoren subkloniert weiden, g) gegebenenfalls Bindung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer Reihe oder Serie an ein festes Trägermaterial, und h) Markierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer anderen Reihe oder Serie.
Erfindungsgemäß werden neue, empfindlichere Nucleinsäure-Reagenzien erhalten, die mindestens eine "Reihe" von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, die aus der zu identifizierenden Nucleinsäure homologen DNA-Segmen-ten gewonnen werden. Aus verschiedenen zu der zu identifizierenden Nucleinsäure homologen DNA-Sequenzen gewonnene Reihen von Fragmenten können zu einer "Serie" zusammengestellt werden, wobei die einzelnen Fragmente ganz oder zum Teil miteinander verbunden werden können. Vorzugsweise enthält ein gemäß der Erfindung erhaltenes Nucleinsäure-Reagens mindestens zwei derartige Serien, wobei die Fragmente der Serien nicht miteinander hybridisieren.
Nucleinsäure-Reagenzien, die solche Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, sind bei "Sandwich"- -2-
AT 394 578 B
Hybridisierungs-Verfahren mindestens doppelt so empfindlich wie die im Stand der Technik verwendeten Nuclein-säure-Reagenzien.
Bei Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Nucleinsäure-Reagenzien oder ihrer Kombinationen ist es möglich, geringere Nucleinsäure-Mengen als früher nachzuweisen und sie sind besonders gut für "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren geeignet
Die höhere Empfindlichkeit der erfindungsgemäß erhaltenen Nucleinsäure-Reagenzien bei "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren beruht teilweise darauf, daß die Verwendung verschiedener Sondenmoleküle die Menge der markierten Hybride auf dem festen Trägermaterial erhöht Jedes hybridisierende Sondenmolekül kann auch vom Vektor abgeleitete markierte Nucleinsäure enthalten (Fig. 1 und 2). In Fig. 1 und 2 ist Vektor DNA mit (v) gekennzeichnet, die zu identifizierende Nucleinsäure mit (x), die markierte Probe mit (b), das an das feste Trägermaterial gebundene identifizierende Nucleinsäure-Reagens mit (a) und der Filter mit (F). Wenn mehrere Sondenmoleküle verwendet werden, steigt die Menge markierter, vom Vektor abgeleiteter Nucleinsäure-Anteile und mehr Markierung wird an die sich bildenden Hybride gebunden. Deshalb sind die Hybride leichter nachzuweisen.
Wenn die Reihe der erfindungsgemäß erhaltenen Nucleinsäure-F bei "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren verwendet wird, werden mindestens zwei oder, wie in Fig. 1 abgebildet, drei identifizierende Nucleinsäure-Frag-mente an das feste Trägermaterial gebunden. Je nach Ausmaß der Reaktion können in diesem Fall verschiedene Bereiche des nachzuweisenden Nucleinsäure-Stranges (x) an die an das feste Trägermaterial gebundenen Nuclein-säure-Fragmente, beispielsweise (aj), und (83), an einem oder mehreren Stellen hybridisieren. Wenn die Reaktion ihr Endstadium erreicht, kann eine Situation, wie sie in Fig. 1 beschrieben ist, vorliegen. Dabei bildet der nachzuweisende Strang eine oder mehrere Schleifen an die ein oder mehrere Sondenmoleküle hybridisieren, in Fig. 1 sind dies beispielsweise (bj) und ^). Zu diesem Zeitpunkt nimmt die Entfernung von vom Vektor abgeleiteten Nucleinsäure-Bereichen vom Hybridisierungs-Verbindungs-Punkt (1) (Fig. 1) ab und das Hybrid ist stabiler als ein aus einem Reagens-Paar gebildetes (Stand der Technik, Fig. 2). Das einzelne Reagens-Paar-Hybrid hat dabei die gleiche Größe wie der Gesamtbereich der Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten. Die Vektorbereiche des aus einem Reagens-Paar gebildeten Hybrids werden beispielsweise durch mechanische Beanspruchung (z. B. Schütteln) leicht zerstört Dabei wird die bereits an das Hybrid gebundene Markierung fieigesetzt
Da die verbesserten erfindungsgemäß erhaltenen Nucleinsäure-Reagenzien empfindlicher sind als die im Stand der Technik verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien, sind sie zum Nachweis von Chromosomen-Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet
Die Beispiele und Zeichnungen erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden.
Fig. 2 zeigt ein "Sandwich'-Hybrid, das aus dem Stand der Technik bekannt ist,
Fig. 3 zeigt die Bereiche von alternierenden Abschnitten einer Nucleinsäure, die für die Herstellung von zwei Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (für zwei verschiedene Serien) ausgewählt wurde.
Fig. 4 zeigt die entsprechenden Bereiche von Abschnitten für die Herstellung von drei Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (für drei verschiedene Serien).
Fig. 5 zeigt die in Fig. 3 beschriebenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die getrennt (a), miteinander verbunden (b) und sowohl getrennt als auch miteinander (c) vorliegen.
Fig. 6 zeigt verschiedene Ausführungen von "Sandwich"-Hybriden.
Fig. 6a zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei der Verwendung getrennter b-Fragmente entsteht,
Fig. 6b zeigt ein "Sandwich'-Hybrid, das bei Verwendung verbundener b-Fragmente entsteht und
Fig. 6c zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung sowohl getrennter als auch verbundener b-Fragmente entsteht
Fig. 7 zeigt eine aus drei Reihen bestehende Serie von Nucleinsäure-Fragmenten zur Identifizierung ver schiedener Nucleinsäuren.
Fig. 8 zeigt "SandwidT-Hybride, die bei Verwendung der in Fig. 7 beschriebenen, verschiedene Nucleinsäuren identifizierenden Serie von Nucleinsäure-Fragmenten entstehen.
Fig. 9 zeigt Hybride, die bei direkter Hybridisierung entstehen.
Fig. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH1220.
Fig. 11 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten aus dem rekombinanten Plasmid pKTH1220 entsteht
Fig. 12 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH1271.
Fig. 13 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei der Verwendung ναι Nucleinsäure-Fragmenten des rekombinanten Plasmids pKTH1271 entsteht
Die Erfindung betrifft sonit ein Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Reagenzien, welche mindestens eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten. Vorzugsweise umfassen die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten mindestens zwei, vorzugsweise jedoch mehrere (bis zu zwanzig), alternierende Nucleinsäure-Fragmente, die sich von einer oder mehreren Nucleinsäuren ableiten, welche homolog genug zur zu identifizierenden Nuclein- -3-
AT 394 578 B säure sind. Dabei erhält man mindestens zwei Serien alternierender Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die nicht zueinander homolog sein dürfen.
Die Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien können synthetisch hergestellt werden, ln diesem Fall dürfen die Fragmente der beiden alternierenden Serien von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten nicht miteinander homolog sein. Sie müssen jedoch ausreichend homolog zu alternierenden Bereichen in den zu identifizierenden Nuclein-säuren sein. Diese Fragmente können leicht durch vollautomatische Maschinen nach der Charakterisierung der Nucleinsäure-Sequenz der zu identifizierenden Nucleinsäure hergestellt werden.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Nucleinsäure-Reagenzien setzen sich aus einzelnen oder miteinander verbundenen oder sowohl aus einzelnen und miteinander verbundenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammen. Die einzelnen oder miteinander verbundenen Nucleinsäure-Fragmente, die Reihen und/oder die Serien von Nucleinsäure-Fragmenten können in einen Vektor eingebaut sein, können Teile von Vektoren umfassen oder können ohne jegliche Vektor-Bereiche vorliegen.
Die verwendeten Nucleinsäure-Fragmente haben eine Mindestlänge von 15 Nucleotiden. Für die Länge gibt es keine obere Grenze, vorzugsweise werden jedoch Fragmente mit einer Länge von 20 bis 5000 Nucleotiden verwendet. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nucleinsäure-Fragmente werden entweder vom zu identifizierenden Genom oder von einem Teil des Genoms abgeleitet, beispielsweise von einem verhältnismäßig großen Klon, der einen gewissen Teil des Genoms repräsentiert. Die damit erhaltenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können somit aus verschiedenen unabhängigen genomischen Bereichen stammen, die nicht direkt benachbart sind. Die so hergestellten Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten werden kombiniert und für dasselbe Reagens verwendet Die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können ebenso aus DNA isoliert werden, die nicht identisch, jedoch ausreichend homolog mit der zu identifizierenden Nucleinäure ist, so daß stabile Hybride zwischen dem Reagens und der zu identifizierenden Nucleinsäure gebildet werden. Die Herstellung geeigneter Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten ist nicht auf die Isolierung geeigneter Nucleinsäure-Fragmente des Genoms beschränkt. Es gibt viele ebensogut geeignete Verfahren zur Herstellung solcher Reihen von Fragmenten. Der Durchschnittsfachmann kann Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten auch durch synthetische oder semisynthetische Verfahren gewinnen.
Die Reagenzien werden so isoliert, daß mindestens zwei Serien alternierender Nucleinsäure-Fragmente erhalten werden, d. h. (aj, a2, a3) usw· unc* (1>χ» b2> ^3) usw· Nucleinsäure-Fragmente der Serie (aj, a2, a3) usw. bestehen aus Fragmenten, die sehr nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie (bj, b2, bj) usw. bestehen ebenfalls aus Nucleinsäure-Fragmenten, die nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie (aj, a2, a-j) usw. und die der Serie (bj, b2, b2) usw. dürfen nicht miteinander homolog sein. Vorzugsweise werden die Nuclein-säuren der Serie (aj, a2, a3) usw. und die der Serie (bj, b2, b3) usw. so isoliert, daß jedes zweite Fragment zur a-Serie und jedes zweite Fragment zur b-Serie gehört (s. Fig. 3). In Fig. 3 sind (aj, a2, a3) usw. und (bj, b2, b-j) usw. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die ausreichend homolog zur zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Wie in Fig. 4 dargestellt, ist es natürlich auch möglich, daß sogar eine dritte Nucleinsäure-Fragment-Serie, (cj, c2, c3) usw. aus der gleichen Nucleinsäure isoliert wird. Vorzugsweise folgen die alternierenden zwei Nucleinsäure-Reagenzien direkt aufeinander, jedoch ist dies erfindungsgemäß keine notwendige Voraussetzung.
Die vorstehend beschriebene Serie von Nucleinsäure-Fragmenten kann entweder als voneinander getrennte Fragmente (aj, a2, a3) usw. und (bj, b2, b3) usw. (Fig. 5a) oder als miteinander zu längeren Strängen verbundene Fragmente (aj-a2-a3), usw. und (bj-b2-bß), usw. (Fig. 5b) verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, alle Arten von Zwischenprodukten herzustellen, wie beispielsweise eine a-Serie, in welcher (aj) ein getrenntes Fragment ist und (a^a^) miteinander verbunden sind sowie solche der b-Serie, bei der beispielsweise (bj-b2) miteinander verbunden sind und (b3) getrennt vorliegt (Fig. 5c).
In Fig. 6 sind "Sandwich"-Hybride dargestellt, bei denen das Reagens aus zwei Serien mit je einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten besteht. Fig. 6a zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, bei dem die Fragmente in den Reihen getrennt vorliegen. Fig. 6b zeigt ein Hybrid, bei dem die Fragmente der markierten Reihe miteinander verbunden sind. In Fig. 6c ist ein Fall dargestellt, bei dem eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden sowohl aus miteinander verbundenen als auch aus voneinander getrennten markierten Fragmenten gebildet wird. In Fig. 6 ist die zu identifizierende Nucleinsäure; (bj, b2 und b3) sind das markierte Sondenmolekül und (aj, a2 und a-j) sind die an ein festes Trägermaterial gebundenen Fragmente.
Zur b-Serie gehörende Nucleinsäure-Fragmente können beispielsweise so markiert werden, daß ein Sondenmolekül (B) als markiertes Nucleinsäure-Reagens erhalten wird. Die Nucleinsäurereihe der a-Serie kann so an ein festes Trägermaterial gebunden werden, daß ein Nucleinsäure-Reagens (A) erhalten wird. Umgekehrt ist es natürlich auch möglich ein markiertes Nucleinsäure-Reagens (A) herzustellen und das entsprechende Nucleinsäure-Reagens (B) an ein festes Trägermaterial zu binden.
Solche Nucleinsäure-Paare (A) und (B) oder (B) und (A), die markiert und entsprechend an ein festes Träger- -4-
AT 394 578 B material gebunden sind, können für einige verschiedene zu identifizierende Nucleinsäuren hergestellt werden. Sie können in geeigneten Nucleinsäure-Reagens-Kombinationen miteinander kombiniert werden, die verschiedene Nucleinsäure-Reagens-Paare (Aj und Bj), (A2 und B2), (A3 und B3), usw. oder (Bj und Aj), (B2 und A2), (B3 und A3) usw. enthalten. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten-enthaltende Reagenzien zur Identifizierung verschiedener Nucleinsäuren können auch so kombiniert werden, daß ein Sondenmolekül (Ax-Ay-Az) erhalten wird, welches beispielsweise eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten ((aj-a2*a3)x- -(a^-a2-a3)y-(aj-a2-a3)z) enthalten (s. Fig. 7), in welcher (ajx, a2x) und (β3χ) Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (Αχ) sind, die die Nucleinsäure (x) identifizieren; (ajy, a2y) und (a3y) Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (Ay) sind, die die Nucleinsäure (Ay) identifizieren; (alz, a2z) und (a3z) Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (Az) sind, die die Nucleinsäure (Ay) identifizieren; (alz, a2z) und (a3z) Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (Az) sind, die die Nucleinsäure (z) identifizieren und in der (v) ein aus dem Vektor stammender Nucleinsäure-Bereich ist Miteinander verbundene Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können natürlich ebenso als getrennte Fragmente in geeigneten Gemischen verwendet werden.
Die in Fig. 8 abgebildeten ”Sandwich"-Hybride werden mit den in Fig. 7 abgebildeten Reagenzien erhalten. Wenn gleichzeitig die Identifizierung mehrerer verschiedener Nucleinsäuren beabsichtigt wird, ist es selbstverständlich erforderlich, wie in Fig. 8 abgebildet, verschiedene Filter zu verwenden. Fig. 8a zeigt ein festes Träger-material, das die Nucleinsäure (x) identifiziert, Fig. 8b ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure (y) identifiziert und Fig. 8c zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure (z) identifiziert. In den Fig. 8a, 8b und 8c sind (bjx, b2x) und 0>3X) eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure (x) identifiziert; (bjy, b2y) und (b3y) ist eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure (y) identifiziert; (blz, b2z) und 0>3Z) ist eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure z identifiziert und (x, y) und (z) sind die zu identifizierenden Nucleinsäuren. (Fx, Fy) und (Fz) sind die entsprechenden festen Trägermaterialien oder Filter, (Ax-Ay-Az) ist ein Sondenmolekül, das gleichzeitig alle drei Nucleinsäuren identifiziert, wenn verschiedene feste Trägermaterialien verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäure-Fragment-Reihen und -Serien, Reagenzien und Reagens-Kombinationen können durch an sich bekannte DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt werden. Eine Reihe unterschiedlich langer Nucleinsäure-Fragmente kann mit Restriktionsenzymen aus der zu identifizierenden Nucleinsäure oder aus einem sie repräsentierenden Bereich ausgeschnitten werden. Wenn die Restriktionskarte des zu identifizierenden Genoms bekannt ist, ist es möglich, aus dem Genom geeignete benachbarte Fragmente auszuwählen. Diese werden mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten, isoliert und mit DNA-Rekombinations-Verfah-ren vermehrt.
Wenn ein unbekanntes Genom untersucht wird, kann ein Zwischenprodukt für die Herstellung der Reagenzien verwendet werden. In diesem Fall wird ein verhältnismäßig großes Restriktions-Fragment kloniert, dieses Fragment wird kartiert und die Reihen von Nucleinsäure-Fragment-Serien (a^, a2, 83) usw. und (bj, b2, 03) usw. werden auf Grundlage der so erhaltenen Information hergestellt.
Es ist natürlich möglich, Kombinationen der vorstehend genannten Methoden einzusetzen und mehrere große, voneinander getrennt klonierte Restriktions-Fragmente als Ausgangsmaterial zu verwenden sowie mehrere getrennte Serien herzustellen, die zu geeigneten Kombinationen zusammengestellt werden.
Erfindungsgemäß werden die Nucleinsäure-Fragment-Serien (aj, a2, 83) usw. und (bj, b2, b3) usw. vorzugsweise mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt. Dabei wird die Serie (a) in einem Vektor kloniert, beispielsweise im Plasmid pBR322. Die Serie (b) dagegen wird in einem anderen geeigneten Vektor kloniert, der keine zum vorstehenden Vektor homologen Sequenzen enthält. Der Bakteriophage M13 ist ein Beispiel eines solchen zweiten geeigneten Vektors. Die Fragmente, die zu dieser Serie gehören, können miteinander verbunden werden und die verbundene Serie kann in einem Vektor kloniert werden. Beispielsweise können (aj-a2) miteinander verbunden werden und als kontinuierliche Insertion im gleichen Vektor, nämlich in pBR322 kloniert werden. Entsprechend ist es möglich, eine Reagens-Serie (bj-b2) herzustellen. Bei der Klonierung werden vorzugsweise Vektoren verwendet, in die man große Fremd-DNA-Insertionen einsetzen kann. Beispielsweise sind für diese Zwecke der λ-Phage und Cosmid-Vektoren geeignet
Es werden also zwei Reagens-Paare, die eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, bei dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt, nämlich ein Reagens, das mit der zu identifizierenden Maikersubstanz markiert ist, d. h. ein Sondenmolekül und ein sogenanntes Filter-Reagens, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist
Meistens werden radioaktive Isotope zur Markierung der Sondenmoleküle verwendet. Beispielsweise werden in der GB-A 2 034 323, den US-PS 4 358 535 und 4 302 204 die folgenden Isotope verwendet; 32P, 125J, 131J und 3H. In der EP-A-79139 wird das Isotop 12^J verwendet Nucleinsäure-Sondenmoleküle wurden auch ander- -5-
AT 394 578 B weitig modifiziert und beispielsweise mit Fluoreszenz-Markierungen versehen (FR-A 2 518 755). Auch enzymatische oder enzymatisch meßbare Markierungen werden verwendet (GB-A 2 019 408, EP-A-63 879 und FR-A 2 519 005). Die EP-A-70 685 und 70 687 beschreiben eine Licht-emittierende Markierung und ein entsprechendes Markierungsverfahren. Die FR-A 2 518 755 beschreibt eine immunologisch meßbare Markierung. Auch Lanthanidchelate (US-PS 374 120), insbesondere Europium, können als Markersubstanzen verwendet werden. Ebenso ist die Biotin-Avidin-Markierung geeignet (Leary et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80,40454049 (1983)). Neben den vorstehend genannten, erfindungsgemäß verwendbaren Substanzen zur Markierung von Nucleinsäure-Reagenzien können selbstverständlich auch neu entwickelte, verbesserte Markersubstanzen verwendet werden, die ebenso für die erfindungsgemäße Markierung von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten geeignet sind. Als Trägermaterial für Filter-Reagenzien sind beispielsweise verschiedene Nitrocellulose-Filter geeignet (US-PS 4 358 535 und GB-A 2 095 833). In der DD-A 148 955 ist ein Verfahren zur chemischen Bindung von Nucleinsäuren an das Trägermaterial (Papier) beschrieben. In den US-PS 4 359 535 und 4 302 204 sind chemisch modifizierte Papierarten beschrieben, die als festes Trägermaterial verwendet werden können. Auch Nylonmembranen und modifizierte Nitrocellulose-Filter können verwendet werden. Natürlich können auch in Zukunft entwickelte Materialien, die noch besser als festes Trägermaterial geeignet sind, erfindungsgemäß verwendet werden. Auch andere feste Trägermaterialien, wie verschiedene Chromatographie-Matrizen (beispielsweise Triazin- oder Epoxy-aktivierte Cellulose) oder Latex können erfindungsgemäß verwendet werden. Außer den nachstehend beschriebenen Beschränkungen gibt es grundsätzlich keine weiteren Beschränkungen für die Auswahl des festen Trägermaterials. Es muß möglich sein, die Nucleinsäure in einzelstiängiger Form so an das feste Trägermaterial zu binden, daß diese einzelsträngigen Nucleinsäuren mit der komplementären Nucleinsäure hybridisieren können. Das feste Trägermaterial muß außerdem leicht aus der Hybridisierungslösung entfernt werden können oder die Hybridisierungslösung muß leicht vom festen Trägermaterial entfernt werden können. Schließlich darf das Sondenmolekül nicht am Trägermaterial selbst anhaften, so daß es nicht mehr abgewaschen werden kann.
Aus den vorstehend beschriebenen Kombinationen von Reihen von Nucleinsäure-Reagenz-Paaren (A) und (B) oder (B) und (A), entsprechend markiert und an ein festes Trägermaterial gebunden, und aus für die Identifizierung von verschiedenen Nucleinsäuren hergestellten Nucleinsäure-Paaren kann eine Kombination (Αχ) und (Βχ), (Ay) und (By), (Az) und (Bz) zusammengestellt werden. Diese Kombinationen können für die gleichzeitige Identifizierung der Nucleinsäuren (x, y) und (z) durch "SandwiclT-Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden.
Die Probe wird so behandelt, daß die Nucleinsäuren in die Hybridisierungs-Lösung abgegeben werden und daß diese in einzelsträngiger Form vorliegen. Die Hybridisierung wird in einer Hybridisierungslösung durchgeführt, zu der sowohl die an ein festes Trägermaterial gebundenen Nucleinsäure-Reagenzien als auch die markierten Nucleinsäure-Reagenzien zugegeben werden. Falls Filter als festes Trägermaterial verwendet wurden, werden diese nach der Hybridisierung aus der Hybridisierungslösung entnommen. Wenn Chromatographie-Matrizen, Latex oder ein vergleichbares Material verwendet wurde, wird die Hybridisierungslösung entnommen. Die festen Trägermaterialien werden mit einer geeigneten Waschlösung abgespült. Die Reihen gebildeter "Sandwich"-Hybride (Fig. 8a, 8b, 8c) werden in an sich bekannter Weise nachgewiesen. Beispielsweise wird die radioaktive Markierung durch Autoradiographie, mit einem Szintillations-Zähler oder einem Gamma-Zähler bestimmt. Eine Enzym-Markierung kann beispielsweise nach einer Farbreaktion, photometrisch oder durch Bestimmung eines Niederschlags gemessen werden. Lanthanid-Chelate können mit dem sogenannten "time resolved fluorescence"-Verfahren nachgewiesen werden. Eine immunologische Markierung wird mit geeigneten immunologischen Methoden nachgewiesen.
Einige verschiedene Gemische können als Hybridisierungs-Lösung verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise die in der EP-A-79 139 und in der US-PS 4 302 204 genannten. Selbstverständlich können auch andere Hybridisierungs-Gemische verwendet werden. Die Hybridisierung wird bei 0° bis 80 °C durchgeführt, günstig ist eine Temperatur von 65 °C. Eine ausreichende Hybridisierung kann schon nach einer sehr kurzen Zeitspanne vorliegen, günstig ist jedoch eine Hybridisierungs-Zeit von etwa 12 bis 20 Stunden.
Das zweistufige "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren wird an sich genauso durchgeführt, jedoch wird dabei das an das feste Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagens zuerst zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben. Wenn die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird das feste Trägermaterial gewaschen und eine zweite Hybridisierung wird durchgeführt, bei der das markierte Nucleinsäure-Reagens verwendet wird.
Die vorstehend beschriebenen markierten Nucleinsäure-Reagenzien oder Reagens-Kombinationen (Αχ, Ay, Az) usw. und (Βχ, By, Bz) usw. können natürlich auch für direkte Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden. Dabei muß die in einer Lösung vorliegende Nucleinsäure-Probe für jede zu identifizierende Nucleinsäure (x, y) und (z) geteilt werden. Wenn die Probe an ein festes Trägermaterial gebunden ist, muß für jede Probe eine getrennte, an ein Trägermaterial gebundene Probe hergestellt werden. Die gebildete Reihe von Hybriden (Fig. 9) wird mit an sich bekannten Verfahren nachgewiesen. In Fig. 9 ist (F) das feste Trägermaterial, d. h. der Filter, (x) die zu identifizierende Nucleinsäure und (v) kennzeichnet die vom Vektor abgeleiteten Bereiche. Die verwendeten, markierten Sondenmoleküle (aj, 82) und (a-j) (Fig. 9a), (bj und 62) (Fig. 9b) und (aj, bj, a2, b2; a3) (Fig. 9c). -6-
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Wie bereits vorstehend beschrieben wurde, können erfindungsgemäß verschiedene Kombinationen von Nu-cleinsäure-Reagenzien aus den Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden. Mit diesen Kombinationen ist es möglich, einige verschiedene Nucleinsäuren gleichzeitig zu identifizieren. Die zu den verschiedenen zu identifizierenden Nucleinsäuren homologen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können in den Gemischen als getrennte Fragmente oder als miteinander verbundene Fragmente so verwendet werden, daß ein Sondenmolekül erhalten wird, mit dem einige verschiedene Nucleinsäuren identifiziert werden können. Natürlich müssen an ein festes Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenzien für eine erfolgreiche Identifizierung getrennt aufbewahrt werden.
Die Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten kann für die Identifizierung verschiedener menschlicher, tierischer oder pflanzlicher pathogener Mikroorganismen verwendet werden. Durch das Verfahren ist es möglich, Nahrungsmittelvergiftungen-hervorrufende Mikroorganismen in Nahrungsmitteln nachzuweisen, beispielsweise Clostridien, Salmonellen oder Staphylococcen. Das Verfahren ist auch für die Identifizierung von Kontaminationen in Wasser, beispielsweise durch Enterobakterien oder Enteroviren, geeignet.
Da der "Sandwich"-Hybridisierungs-Test mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten ein quantitatives Verfahren ist, kann es beispielsweise auch für die Bestimmung und die Messung von Genamplifikationen verwendet werden. Dieses Meikmal ist beispielsweise für den Nachweis und die Behandlung von Krebs von Bedeutung. Zur Bildung einer stabilen Reihe von Hybriden sollten die homologen Sequenzen des Sondenmolekül-Reagens und des Filter-Reagens im Proben-Strang mäßig voneinander entfernt sein, vorzugsweise weniger als 5 kb (Kiloba-sen). Zwischen diesen beiden Bereichen auftietende Entfemungsveränderungen sind mit diesem Verfahren deutlich zu beobachten. Deshalb ist das Verfahren ebenso für den Nachweis veränderter mRNA, von chromosomalen Umlagerungen, von bei Immunglobulin-Genen für die Expression ablaufenden Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet. Es ist also möglich, verschiedene Reagens-Kombinationen aus den Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zu konstruieren. Beispielsweise können für die Identifizierung von Geschlechtskrankheiten-verur-sachenden Stoffen Analysebestecke hergestellt werden, die ein Sondenmolekül mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, mit denen Gonorrhöe, Syphüis, Heipes und Chlamydien nachgewiesen werden können. In diesem Fall ist die Identifizierung durch Verwendung getrennter Filter für Gonorrhöe, Syphilis, Herpes und Chlamydien möglich.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die in den rekombinanten Plasmiden pKTH1220 und pKTH1271 enthalten sind. Das rekombinante Plasmid pKTH1220 besteht aus dem Plasmid-Vektor pBR322 und aus DNA von Chlamydia trachomatis L2, die für die Chlamydien spezifisch ist Dieses rekombinante Plasmid wird in Escherichia coli K12 HB 101 cloniert. Das rekombinante Plasmid 1271 enthält im Plasmid-Vektor pBR 325 DNA aus dem Cytomegalovirus AD 169. Dieses rekombinante Plasmid wird im Wirt Escherichia coli K12 HB 101 cloniert. Die die rekombinanten Plasmide pKTH1220 und pKTH1271 enthaltenden Wirte wurden bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, D-3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt. Die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH1220 ist DSM 2825 und die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH1271 ist DSM2826.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die Struktur der Nucleinsäuren von Eucaryoten und Procaryoten (DNA und RNA) ist ähnlich. Deshalb sind die nachstehenden Beispiele auch mit Nucleinsäuren von Tieren (dazu gehest in diesem Zusammenhang auch der Mensch), Pflanzen, Mikroorganismen oder Viren ausführbar. Die erfindungsgemäß erhaltenen Reagenzien können also zum Nachweis von Nucleinsäuren des Menschen, von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Viren verwendet werden. Die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können auch synthetisch hergestellt werden. Die zu identifizierende Nucleinsäure-Sequenz kann bestimmt werden, und homologe Reihen von Fragmenten können mit geeigneten Maschinen automatisch hergestellt werden.
Beispiel 1 a) Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis und ihre Herstellung Für die Diagnose der Chlamydia trachomatis-Gruppe wurden geeignete DNA-Fragmente aus der DNA von Chlamydia trachomatis Serotyp L2 hergestellt. Die DNA wurde isoliert, in an sich bekannter Weise fragmentiert, die resultierenden DNA-Fragmente wurden im Plasmid pBR322 kloniert und in an sich bekannter Weise in den Wirtsorganismus Escherichia coli K12 HB101 eingebracht. Das Ergebnis dieses Klonierungsvorgangs war eine Genbank des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2, d. h. eine große Anzahl rekombinanter Plasmide, die jeweils ein bestimmtes BamHI-Restriktions-Fragment der Chlamydia-DNA tragen. Zur Reagens-Herstellung wurden aus der Chlamydia-Genbank rekombinante Plasmide mit größtmöglichen DNA-Insertionen ausgewählt. Eines dieser Plasmide wurde pKTH1220 genannt. Es wurde bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 2825 hinterlegt Durch einen direkten Hybridisierungs-Test wurde gezeigt daß dieses Plasmid als Reagens geeignet ist In diesem Test identifizierte pKTH1220 alle aus Chlamydia trachomatis-Serotypen gewonnenen Nucleinsäuren, jedoch keine anderen Nucleinsäuren.
Die verwendbaren Fragmente wurden aus dem Plasmid pKTH1220 mit verschiedenen Restriktions-Enzymen gewonnen. Einige dieser Fragmente wurden im Plasmid pAT153 subkloniert (Maniatis et al., Molecular Clo- -7-
AT 394 578 B ning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, S. 6,1982). Andere Fragmente wurden im Phagen M13 subkloniert. Fig. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH1220, das eine Länge von 14 kb hat. In Fig. 10 sind BamHI, Sali und Clal die verwendeten Restriktions-Enzyme, und (a j, a2j b2) unc* (^3) kennzeichnen die Größe und die relative Lage zueinander der mit den vorstehend genannten Restriktions-Enzymen gewonnenen Fragmente. Die Fragmente der Serie b sind markierte Sondenmoleküle. In Tabelle 1 sind die Größen der Fragmente und die für die Subclonierung verwendeten Vektoren die Namen der rekombinanten Plasmide und ihre Anwendung zusammengefaßt.
Tabelle 1
Fragment Größe Vektor Rekombinantes Plasmid Verwendung al Clal-Sall 3.0 kb pAT153 pKTH1252 Füter a2 Sall-Clal 2.9 kb pAT153 pKTH1250 Filter bl Sall-BamHI 0.7 kb M13mp8 mKTH1242 Markiertes Sondenmolekül b2 BamHI-Sall 1.4 kb M13mp8 mKTH1239 u b3 Clal-Clal 1.7 kb M13mp8 mKTH1248 M brb2 BamHI-BamHI 2.1 kb M13mp8 mKTH1245 It
Die in Tabelle 1 aufgeführten Fragmente wurden durch Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert und in an sich bekannter Weise in mit geeigneten Restriktions-Enzymen gespaltenen und in Tabelle 1 aufgeführten Vektoren subkloniert.
Das 2,1 kb-BamHI-BamHI-Fragment wurde folgendermaßen hergestellt: Das 1,4 kb-BamHI-Sall-Fragment und das 0,7 kb-Sall-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pKTH1220 wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt und anschließend aus dem Gel isoliert. Die gereinigten Fragmente wurden mit T4-Ligase miteinander verbunden. Von den dabei gebildeten 2,1 kb-langen DNA-Fragmenten wurden die mit freien BamHI-Enden in die BamHI-Restriktions-Spaltstelle doppelsträngiger DNA des Phagen M13mp8 eingebaut. Die auf diese Weise hergestellte rekombinante Phagen-DNA (mKTH1245) enthält also zwei verschiedene DNA-Frag-mente von Chlamydia trachomatis, die in dessen Genom nicht benachbart sind. Sie liegen jedoch im Chlamydia trachomatis Genom benachbart zu den DNA-Reagenzien pKTH1250 und pKTH1252, die an den Filter gebunden werden (Fig. 11). Fig. 11 zeigt eine Reihe von "Sandwiclf-Hybriden, die entstehen, wenn die in Tabelle 1 aufgeführten rekombinanten Plasmide und rekombinanten Phagen als Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien verwendet werden. b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis unter Verwendung des "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahrens
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien, verglichen mit einem einzelnen kontinuierlichen Reagens-Paar, wurde mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren untersucht. Der Test wurde mit Filtern durchgeführt, die jeweils 10^ Moleküle sowohl von pKTH1250 (82)- als auch von pKTH1252 (a^)-Einzel- strang-DNA enthielten. Die zu untersuchende Probe war das Plasmid pKTH1220, welches für den Test durch 5minütiges Erhitzen in 0,17 M NaOH, anschließendes Abschrecken bei 0 °C und durch Neutralisierung mit einer
IOC äquimolaren Menge Essigsäure in die Emzelstrangform überführt wurde. Die folgenden mit J markierten und in Tabelle 1 aufgeführten Sondenmoleküle wurden bei den Tests verwendet: mKTH1242(b1), mKTH1239(b2), mKTH1248(b3) und mKTH1245(brb2).
Die Hybridisierung wurde 17 Stunden bei +65 °C in einer Hybridisierungs-Lösung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt: 4 x SSC, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,2 % SDS und 200 μg/ml Hering-Spermien DNA. Die Filter wurden 2 Stunden bei 50 °C mit einer Waschlösung der folgenden Zusammensetzung gewaschen: 0,1 x SSC, 0,2 % SDS. Anschließend wurden sie in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt und sind jeweils der Mittelwert von fünf Parallelversuchen. -8-
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Tabelle 2
Probe Moleküle/Test Hybridisierte Radioaktivität mit (b) als Sondenmolekül bl b2 b3 bl» b2 (bi-b2) (brb2)> bß 0 37 37 33 49 39 52 106 48 44 48 93 68 140 10’ 226 236 232 396 416 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580 bl 380,000 cpm/Test; 5 x 107 cpm^g DNA b2 340,000 cpm/Test; 4 x 107 cpm^g DNA b3 350,000 cpm/Test; 5 x 107 cpm/μg DNA Vh 310,000 cpm/Test; 7 x 107 cpm/μg DNA bl,b2 700,000 cpm/Test; (brb2)> ^3 700,000 cpm/Test;
Bei der statistischen Berechnung wurden 95 % der ohne Probe durchgeführten Tests (= negative Kontrollen) als untere Grenze für eine positive Reaktion gewatet Diese Werte waren 52-54 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj, b2) oder (b-j) war, 58 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj) oder (b2) war, 56 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj-b2) war und 65 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj-b2, b2) war. c) Diagnose ναι Chlamydia durch "SandwiclT-Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäuie-Fragmenten Von drei an Urethritis leidenden Männern sowie von drei an Cervicitis leidenden Frauen wurden Proben für den Test genommen. Aus Urethra der Männer und Cervix der Frauen wurde Chlamydia trachomatis isoliert. Zusätzlich wurde eine Reihe von ähnlichen Proben aus Patienten untersucht, aus denen Chlamydia nicht isoliert wurde. Die zu untersuchenden Proben wurden mit Wattestäbchen genommen, die in einen Chlamydia-Proben-aufnahme-Puffer eingetaucht waren, der 0,2 M Saccharose, 20 mM Phosphatpuffer, 3 % fötales Kälberserum, 10 pg/ml Gentamicin, 100 pg/ml Vancomycin und 25 IU/ml Nystatin enthielt
Aus den Proben wurde Chlamydia gezüchtet Die ursprünglichen Proben wurden außerdem durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten untersucht Die Proben wurden mit 2-Butanol konzentriert. Dabei wurde soviel Flüssigkeit entfernt, daß das Endvolumen 80 μΐ betrug und die Proben damit drei- bis siebenfach konzentriert waren. Danach wurde den Proben 70 mM EDTA, 0,7 % SDS, 200 pg/ml Proteinase K zugesetzt und sie wurden 15 Minuten bei 55 °C und 45 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden dann 5 Minuten in 0,175 M NaOH gekocht Die gekochten Proben wurden bei 0 °C abgeschreckt, mit einer äquimolaien Menge Essigsäure neutralisiert und getestet. Die in Beispiel lb) beschriebenen Filter und Hybridisierungs-Bedingungen wurden bei diesem Test verwendet. Das bei der Hybridisierungs-Reaktion verwendete Sondenmolekül war mKTH1245 (bj-b2) mit einer Radioaktivität von 300.000 cpm/400 μΐ. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. -9-
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Tabelle 3
Probe Hybridisierte Radioaktivität Ergebnis der Chlamydia-Kultur Männl. Probant 1. 151 + 2. 164 + 3. 154 + 4. 61 - 5. 76 - 6. 55 - Weibl. Probant 1. 343 + 2. 509 + 3. 362 + 4. 57 - 5. 58 - 6. 81 - Puffer, X4 30-55 Chi, trachomatis L2 Bakterium, 10° 419 +
Die Grenze für die positive Beurteilung des Tests war 104 cpm.
Die Ergebnisse aus Tabelle 3 zeigen, daß die "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten für die Diagnose von Geschlechtskrankheiten geeignet ist. Proben mit negativem Ergebnis beim Kultur-Test zeigten auch bei der "Sandwich"-Hybridisierung ein negatives Ergebnis.
Beispiel 2 a) Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus und ihre Herstellung Für die Diagnose des Cytomegalovirus geeignete DNA-Fragmente wurden aus dem Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV) hergestellt. Die DNA wurde isoliert und in an sich bekannter Weise fragmentiert Das etwa 9 kb lange EcoRI-Fragment I (definiert von Spector et al., J. Virol. 42, 558-582 (1982)) wurde nach der Größentrennung der EcoRI-Restriktions-Fragmente auf einem Agarosegel durch Elektroelution isoliert. Die eluierte DNA wurde mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol gefällt. Die so gereinigte DNA wurde mit T4-Ligase in mit dem Enzym EcoRI-gespaltene DNA des Plasmids pBR325 ligiert. Die erhaltene rekombinante DNA wurde in E.coli K12 HB101 überführt. Aus den Ampicillin- und Tetracyclin-resistenten, jedoch Chloramphenicol-sensitiven Klonen wurde ein Klon mit einer Cytomegalovirus-DNA-Insertion der richtigen Größe ausgewählt. Die Identität aer Cytomegalovirus-DNA wurde durch einen Southern blot bestätigt. Der Test zeigte, daß das beschriebene 9 kb EcoRI-Fragment aus dem HindHI-D-Fragment der Cytomegalovirus-DNA stammt (Oram et al., J. Gen. Virol. 59, 111-129 (1982)). Das genannte rekombinante Plasmid wurde als pKTH1271 bezeichnet und bei der deutsche Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 2826 hinterlegt. Das rekombinante Plasmid wurde in an sich bekannter Weise vermehrt und gereinigt.
Weitere Klonierungsschritte wurden in an sich bekannter Weise unter Verwendung des Plasmids pBR322 und der Phagen M13mp7 und M13mp8 durchgeführt. Fig. 12 zeigt das hybride Plasmid pKTH1271 mit einer Länge von etwa 9 kb. Die in Fig. 12 gezeigte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, Clal und Pstl hergesiellt. Fig. 12 zeigt die mit Restriktions-Enzymen erhaltenen Fragmente und ihre relative Lage und Größe. In Tabelle 4 sind die Größen der in Frage kommenden Fragmente und die für ihre Subklonierung verwendeten Vektoren, die Bezeichnung der so erhaltenen Plasmide und ihre Verwendung entweder als Filter-Reagenzien oder als markierte Sondenmoleküle aufgeführt. Fig. 13 zeigt eine Reihe von " Sandwich"-Hybriden, die gebildet wird, wenn die in Tabelle 4 aufgeführte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten verwendet wird. -10-
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Tabelle 4
Restriktions-Fragment Vektor Bezeichnung Verwendung al EcoRI-Pstl (3.3 kb) pBR322 ΡΚΊΉ1273 Filter a2 Clal-BamHI (3.0 kb) pBR322 pKTF1274 Filter bl Pstl-Pstl (0.6 kb) M13mp7 mKTH1277 Markiertes Sondenmolekül b2 Psd-Clal (1.0 kb) M13mp8 mKTH1278 tt tt b3 BamHI-EcoRI (1.0 kb) M13mp8 mKTH1279 tt 1» b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien im Verhältnis zur Empfindlichkeit eines Paares kontinuierlicher Reagenzien wurde mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren untersucht. Die Proben bei den Tests waren CMV-DNA, die in 0,17 M NaOH 5 Minuten gekocht wurde und anschließend gemäß Beispiel 1 b) neutralisiert wurde. Die Filter enthielten alle 10^ Moleküle sowohl von pKTH1273 (a^)-DNA als auch von pKTH1274 (a2)-DNA, die in die einzelsträngige Form überführt worden war. Die folgenden mit markierten, in Tabelle 4 aufgeführten Sondenmoleküle wurden verwendet: mKTH1277(b j), mKTH1278(b2) und mKTH1279(b3). Die Proben enthielten jeweils 10^ cpm^g DNA. Die Hybridisierung wurde wie in Beispiel 1 b) beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5 bl 310.000 cpm/Test b2 320.000 cpm/Test b3 300.000 cpm/Test bl>b2 300.000 cpm bei jedem Test bi» b2> b3 300.000 cpm bei jedem Test
Proben Hybridisierte Radioaktivität (b)
Moleküle/Test »1 b2 b3 bi» b2 bi» b2, b3 0 35 33 38 45 53 106 38 44 46 95 125 4xl06 85 135 142 205 292 1.6xl07 203 254 265 415 645 -11-
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Die untere Grenze für eine positive Beurteilung des Testergebnisses waren 51-55 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj, b2) oder (bg) war, 59 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj) oder (b2) war und 63 cpm, wenn das Sondenmolekül (bj, b2) oder (bg) war.
Die in Tabelle 5 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß bei einer "Sandwich"-Hybridisierung mit einem einzelnen Sondenmolekül-Reagens (bj, b2) oder (bg) jeweils 4 x 106 CMV-DNA-Moleküle nachgewiesen werden. Andererseits werden bei einer Hybridisierung mit einem Reagens aus (bj, b2) oder (bj, b2, bg) nur 106 Moleküle CMV-DNA nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien viermal empfindlicher ist als ein einzelnes Nucleinsäure-Reagens. c) CMV-Diagnose durch ”Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien
Klinische Proben wurden durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Reagenzien untersucht. Zu diesen Proben gehören auch zwei Urinproben von Kindern mit einem Alter von weniger als einem Jahr. Es wurde angenommen, daß diese Kinder an der congenitalen Cytomegalovirus-Erkrankung leiden. Eine Lungenbiopsie-Probe aus einem Patienten mit einer CMV-Pulmonar-Infektion wurde ebenso mit der "Sandwiclf-Hybridisierung untersucht. Sowohl Cytomegalovirus-infizierte als auch nicht-infizierte fötale menschliche Zellen wurden als Proben beim Test verwendet
Zu 10 ml einer Urin-Probe wurde eine Lösung mit 1 % Sarcosyl und 5 mM EDTA sowie 200 μg Kalbs-thymus-DNA zugegeben. Dadurch wird die Virus-DNA freigesetzt Durch Zugabe von 10 ml Isopropanol bei Raumtemperatur wird die DNA zusammen mit dem "carrier” (Kalbsthymus-DNA) ausgefällt. Der DNA-Nieder-schlag wurde in 200 μΐ TE-Puffer gelöst. Die DNA wurde dann durch 5minütiges Kochen und Abschrecken bei 0 °C in die Einzelstrangform überführt und zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben.
Die Lungenbiopsie-Probe (einige mm ) wurde mit einem Messer zerkleinert und 200 μΐ TE-Puffer mit 1 % SDS und 1 mg/ml Proteinase K wurden zugegeben. Bei +37 °C wurde der Abbau 1 Stunde durchgeführt und die Probe wurde anschließend zweimal in eine Injektions-Spritze mit einer dünnen Hypodermis-Nadel aufgezogen. Die so homogenisierte Probe wurde gekocht und anschließend zur Test-Lösung zugegeben.
Die mit Cytomegalovirus infizierten Zellen und die nichtinfizierten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben durch SDS, Proteinase K-Behandlung, Homogenisierung und Kochen aufgeschlossen.
Als Filter-Reagenzien wurden beim Hybridisierungs-Test pKTH1273(aj) und pKTH1274(a2) und als Sondenmoleküle mKTH1277(bj), mKTH1278(b2) und mKTH1279(bg) mit jeweils 200.000 cpm/Reaktion verwendet. Ansonsten wurde die Hybridisierung, das Waschen der Filter und das Auswerten der Ergebnisse wie vorstehend in Beispiel 1 b) beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse der vorliegenden Hybridisierung sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Hybridisierte Virus-Isolat
Probe Radioaktivität
Infizierte (10^) 3521 nicht ermittelt Zellen Urin 1 (10 ml) 243 CMV Urin 2 (10 ml) 3215 CMV Urin einer gesunden Testperson (10 ml) 52 nicht ermittelt Lungenbiopsie-Probe 535 CMV Kontrollzellen (10^) 68 nicht ermittelt Keine Probe 65 nicht ermittelt -12-
Claims (7)
- AT 394 578 B Die in Tabelle 6 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, mit einer Reihe von Nucleinsäure-Rea-genzien CMV in verschiedenen klinischen Proben, wie Urin, Lungenbiopsie-Proben und in Zellen nachzuweisen. Der Test ist für Cytomegalovirus spezifisch. Er identifiziert keine menschliche DNA, d. h. der Test zeigt keine Interferenzen mit der in der Probe vorhandenen menschlichen DNA. Die Art der Probe spielt überhaupt keine Rolle für die Spezifität des Tests. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Reagenzien, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt: a) Isolierung einer ausgewählten Nucleinsäure mit geeigneter Länge, b) Klonierung der ausgewählten Nucleinsäure in einem geeigneten Vektor, c) Fragmentierung der Nucleinsäure mit Restriktions-Enzymen, d) Zuordnung von nicht miteinander hybridisierenden Fragmenten zu mindestens zwei, vorzugsweise jedoch mehreren Reihen von alternierenden Fragmenten, e) gegebenenfalls Zuordnung geeigneter Reihen von Fragmenten zu Serien, wobei die Reihen gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden, f) Subklonierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen, zu einer Reihe zugeordneten Fragmente, oder der miteinander verbundenen, zu einer Serie zugeordneten Reihen von Fragmenten in geeigneten Vektoren, wobei Fragmente oder Reihen von Fragmenten, die verschiedenen Serien angehören, vorzugsweise in verschiedenen, nicht miteinander hybridisierenden Vektoren subkloniert werden, g) gegebenenfalls Bindung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer Reihe oder Serie an ein festes Trägermaterial, und h) Markierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer anderen Reihe oder Serie.
- 2. Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren nach einer diagnostischen Hybridisierungs-Methode, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nucleinsäure-Reagens nach Anspruch 1 einsetzt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Identifizierung mehrerer verschiedener Nucleinsäuren geeignete Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden, die ausreichend homolog zu diesen verschiedenen Nucleinsäuren sind.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung als diagnostisches "Sandwieh"-Hybridisierungs-Verfahren durchgeführt wird.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nucleinsäure-Reagens das rekombinante Plasmid pKTH1220 oder Derivate davon enthält, welches DNA das Bakterium Chlamydia trachomatis L2 enthält
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nucleinsäure-Reagens das rekombinante Plasmid pKTH1271 oder Derivate davon enthält, welches DNA des Cytomegalovirus AD169 enthält. Hiezu
- 7 Blatt Zeichnungen -13-
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
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