DE69332016T2 - Methode zum Nachweis von Bioindividuen mittels einer Nukleinsäureprobe nicht-natürlichen Typs und Probe zur Verwendung hierin - Google Patents

Methode zum Nachweis von Bioindividuen mittels einer Nukleinsäureprobe nicht-natürlichen Typs und Probe zur Verwendung hierin

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DE69332016T2
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Zielzellen oder Zielmikroorganismen in einem lebenden Zustand auf einer Nucleinsäureebene unter Verwendung einer Sonde, welche eine nicht-natürliche Einzelstrang-Nucleinsäure umfasst.
    • Verwandter Stand der Technik
  • In den letzten Jahren wurde es wichtig Zellen, Mikroorganismen oder Ähnliches (im Folgenden als "Zielindividuen" bezeichnet) auf einer genetischen Ebene zu bestimmen, zu unterscheiden, nachzuweisen oder zu zählen, d. h. auf einer Nucleinsäureebene zum Zwecke der Diagnose einer auf einer Variation eines Gens basierenden Erbkrankheit, des Nachweises von Krebszellen durch die Expression eines karzinogenen Genes, des Nachweises einer genetischen Rekombination in der Forschung.
  • Vordem wurden für den Nachweis der Zielindividuen und für das Zählen der Anzahl der Zielindividuen ein Hellfeld-Mikroskopiebeobachtungsverfahren, ein Differentialinterferenz-Mikroskopiebeobachtungsverfahren usw. verwendet. Um das Problem zu überwinden, dass die Zielindividuen schwer zu beobachten sind, oder um die Zielindividuen wirksamer oder empfindlicher nachzuweisen, wurden diese herkömmlicherweise mit einem Farbstoff wie etwa Methylenblau oder Safranin, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie etwa Auramin oder Fluorescein gefärbt und dann mit einem Hellfeldmikroskop oder einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
  • Überflüssig zu erwähnen, dass in dem Fall, dass die Zielindividuen nicht gefärbt werden und selbst in dem Fall, dass sie vollständig oder teilweise gefärbt werden, sie von anderen Sorten von Individuen unterscheiden vom Standpunkt der Morphologie beobachtet und bewertet werden können, aber ein Unterschied aufgrund genetischer Variation zwischen der selben Sorte von Individuen, die keinen Unterschied in der Morphologie haben, nicht festgestellt werden kann. Außerdem durchdringen die Farbstoffe und die Fluoreszenzfarbstoffe kaum die cytoplasmatische Membran und die Kernmembran der Zielindividuen in einem lebenden Zustand (lebende Zielindividuen), und so ist es schwierig, lebende Zielindividuen mit Hilfe von Färbung nachzuweisen.
  • Andererseits wurde als eine Technik zur Bewertung der Zielindividuen auf der genetischen Ebene oder auf der Nucleinsäureebene vor kurzem ein Verfahren eingeführt, bei dem die Nucleinsäure aus den Zielindividuen extrahiert und dann deren Basensequenz untersucht wird, oder die Muster untersucht werden, welche durch Schneiden der Nucleinsäure mit einem Restriktionsenzym erhalten werden. Jedoch ist es selbst gemäß eines derartigen Verfahrens weiterhin unmöglich, die Zielindividuen im lebenden Zustand zu bewerten, während die Morphologie erhalten bleibt. Ferner ist bei einem Test, bei dem die Nucleinsäure des Zielindividuums behandelt wird, die Abfolge der Vorgänge kompliziert, und es wird eine nicht zufriedenstellende lange Zeitdauer für den Nachweis in Anspruch genommen.
  • Als eine Technik für die Lösung der Probleme der gebräuchlichen herkömmlichen Verfahren, wurde in den letzten Jahren ein in situ-Hybridisierungsverfahren erforscht, bei dem die Zielindividuen auf genetischer Ebene bewertet werden können, und es wurde teilweise praktisch angewendet [z. B. Nucleic Acid Research Vol. 20, No. 1, pp. 83-88 (1991)]. Als Nächstes wird das in situ- Hybridisierungsverfahren kurz beschrieben.
  • (1) Eine Nucleinsäuresonde mit einer Basensequenz, welche komplementär zu einer Basensequenz einer Nucleinsäure in den Zielindividuen ist, wird hergestellt. Diese Nucleinsäuresonde hat einen bestimmten nachweisbaren Anteil (Markierung).
  • (2) Die Zielindividuen werden mit Methanol oder Ähnlichem getötet und dann fixiert.
  • (3) Die Nucleinsäuresonde wird mit der Nucleinsäure der fixierten Zielindividuen in den Zielindividuen hybridisiert (in situ).
  • (4) Die Sonde, welche kein Hybrid gebildete hat, wird weggewaschen.
  • (5) Das in den Zielindividuen gebildete Hybrid wird unter Nutzung der vorher erwähnten Markierung nachgewiesen.
  • Gemäß diesem in situ-Hybridisierungsverfahren kann ein Schritt zur Extraktion der Nucleinsäuren aus dem Zielindividuum weggelassen werden. Zusätzlich ist der Nachweis der Zielindividuen auf der genetischen Ebene oder der Nucleinsäureebene möglich, während die Morphologie erhalten bleibt, und die Anzahl der Zielindividuen kann ebenfalls gezählt werden. In diesem Verfahren werden die lebenden Zielindividuen getötet, wodurch die cytoplasmatische Membran und die Kernmembran verändert werden, um den Durchgang der Nucleinsäuresonde durch diese Membranen zu erleichtern.
  • Wie vorher beschrieben, können gemäß dieser in situ- Hybridisierung die Zielindividuen auf der Nucleinsäureebene unterschieden, nachgewiesen oder gezählt werden, wobei die Morphologie erhalten bleibt, was in den herkömmlichen Verfahren unmöglich war. Dennoch verbleibt das Problem, dass die Zielindividuen nicht im lebenden Zustand nachgewiesen werden können.
  • Die Gründe, warum die Zielindividuen durch die herkömmliche in situ-Hybridisierung nicht nachgewiesen werden können, können wie folgt zusammengefasst werden:
  • (1) Der Nucleinsäureanteil der Nucleinsäuresonde ist natürlich, unabhängig davon, ob er aus der Natur erhalten oder chemisch synthetisiert wurde, und so ist der hydrophile Charakter des Phosphoranteils hoch. Daher durchdringt die Sonde nur schwerlich die cytoplasmatische Membran und die Kernmembran der lebenden Zielindividuen.
  • (2) Selbst wenn die Nucleinsäuresonde die cytoplasmatische Membran und die Kernmembran durchdringt, wird sie durch ein Einzelstrang-Nucleinsäure abbauendes Enzym in den lebenden Zielzellen bei Gelegenheit abgebaut. Diese Tendenz ist stärker, wenn der Nucleinsäureanteil der Nucleinsäuresonde RNA ist, als wenn er DNA ist.
  • (3) In dem Fall, dass der Nucleinsäureanteil der Nucleinsäuresonde DNA ist, wird, selbst wenn die Nucleinsäuresonde ein Hybrid mit der Zielnucleinsäure in den lebenden Zielindividuen bildet, das Hybrid durch ein Doppelstrang-Nucleinsäure abbauendes Enzym in den lebenden Zielindividuen bei Gelegenheit abgebaut.
  • (4) Einige der Fluoreszenzfarbstoffe, welche üblicherweise als der markierende Anteil der Nucleinsäuresonde verwendet werden können, schädigen die lebenden Zielindividuen, und wenn derartige Farbstoffe verwendet werden, sterben die lebenden Zielindividuen bei Gelegenheit.
  • TIBS, Vol. 14, 3/1989, pp. 97-100, beschreibt die Verwendung von Phosphorthioaten in der Molekularbiologie. Beabsichtigte Verwendungen sind die ortsgerichtete Mutagenese und die DNA-Sequenzierung. Als Vorteile der Phosphorthioat-Oligonucleotide für die in situ- Hybridisierung in Gewebeschnitten wird die Kartierung der räumlichen Expression von Genen angegeben.
  • Biochemistry, Vol. 28, 1989, pp. 261-267 beschreibt die Möglichkeit DNA-Fragmente mit einer fluoreszierenden Markierung zu markieren, wobei die DNA-Fragmente Phosphorthioatdiester enthalten.
  • WO-A-92/03568 offenbart Oligonucleotide mit modifiziertem Zuckeranteil, welche eine erhöhte Stabilität der Bindung und eine höhere Spezifität im Vergleich zu Oligonucleotiden mit modifiziertem Phosphoranteil zeigen, wie z. B. etwa Phosphorthioate. Ferner wird ein Verfahren und eine Sonde zur Behandlung von Zielzellen offenbart, um spezifisch mRNA zu binden, welche für ein Protein codiert, dessen Herstellung inhibiert wird.
  • Weiterhin ist der Artikel in 'Antisense', Research & Developments, 2 (I), 1992, pp. 27-39 relevant. Dieser Artikel offenbart ein Antisense-Phosphorthioat- Oligonucleotid, welches durch eine Fluoresceinverbindung markiert wurde. Lebende Zellen wurden mit dem markierten Oligonucleotid behandelt, wobei die Oligonucleotidaufnahme in die Zellen beobachtet wurde. Die markierte Nucleinsäure absorbierte Strahlung bei 260 nm und wurde mit Licht von 488 nm angeregt, was in der Abstrahlung von Licht mit 520 nm resultierte.
  • US-A-4,544, 546 offenbart verschiedene biologische Färbemittel für die Fluoreszenzmikroskopie. Es werden Beispiele spezifischer oder unspezifischer Färbemittel für Gewebe und fixierte Zellen angegeben, welche bei der Anfärbung von DNA und RNA wirksam sind. Ferner werden Farbstoffe angegeben, welche die Zellmembran ohne Töten der Zellen durchdringen.
  • Der Artikel in 'Gene', 72, 1988, pp. 333-341 ist ebenfalls für das Gebiet der vorliegenden Erfindung relevant. Dieses Dokument offenbart Phosphorthioat- Oligonucleotide, welche Homooligonucleotide von S-dT mit einer 5'-Acridin-Kopplung als Fluoreszenzmarkie rung. Es wird beschrieben, dass die Synthese einer derartigen 5'- Acridin-Kopplung nur auf Thymidin-Homooligonucleotide anwendbar ist. Die Sonden wurden bei 488 nm angeregt und die Absorption wurde bei 260 nm gemessen. Es wird ferner berichtet, dass die synthetisierten 5'-gekoppelten Acridine sehr schwach interkalierende Substanzen sind.
  • Der Artikel in Curr. Tob. Microbiol. Immunol., Vol. 141, 1988, pp. 282-289 offenbart ebenfalls ein mli Acridingekoppeltes Phosphorthioat, wobei das Oligonucleotid mit 2-Methoxy-6-chlor-9-(5-hydroxypentyl)aminoacridin modifiziert wurde. Es wurde von den Autoren dieses Dokuments bestätigt, dass die Aufnahme einer derartig markierten Sonde kaum nachweisbar war. Das Problem der Aufnahme von Acridin-markierten Phosphorthioat kann nur durch eine spezifische Lipofusion gelöst werden, wobei dieses Verfahren in dieser Veröffentlichung offenbart wird.
  • Schließlich offenbart Nucleosides and Nucleotides, Proceedings of the VIII. International Round Table Symposium, Vol. 8, No. 5 & 6, 1989, pp. 649-657, ein Acridin-markiertes Phosphorthioat, wobei das Oligonucleotid mit 5'-Acridinmaleimid markiert wurde. Der Artikel berichtet, dass das N-(9- acridinyl)maleimidphosphorthioat keine in die Basenpaare einer Doppelstrang-Nucleinsäure interkalierende Wirkung hatte. Ferner konnte das Verfahren gemäß dieses Artikels nicht das Problem der Toxizität lösen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Zielzellen oder Mikroorganismen in einem lebenden Zustand auf einer Nucleinsäureebene zur Verfügung zu stellen, welches die Zielnucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen nachweisen kann.
  • Die vorher angegebenen Aufgaben können durch die folgende vorliegende Erfindung erreicht werden.
  • Das heißt, der erste Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder Mikroorganismen, welches die Schritte nach Anspruch 1 umfasst.
  • Der zweite Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine markierte Sonde mit einer nichtnatürlichen Einzelstrang-Nucleinsäure und einer markierenden Substanz, welche ein mit der Nucleinsäure gekoppelter Cyaninfarbstoff ist, wie in Anspruch 8 definiert.
  • Im Folgenden umfasst der Ausdruck "Individuen" Zellen und/oder Mikroorganismen.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um verschiedene Arten von Mikroorganismen, wie etwa Zellen, Viren, Bakterien, Actinomyceten, Hefen, Schimmel, Pilze, Algen und Protisten als lebende Zielindividuen, durch die geeignete Auswahl der Struktur einer Sonde in Übereinstimmung mit ihrer Verwendung, nachzuweisen.
  • Die erfindungsgemäße Sonde weist einen nichtnatürlichen Nucleinsäureanteil mit einer Struktur auf, welche in die lebenden Zielindividuen aufgenommen werden kann und kaum von einem Abbauenzym in den lebenden Zielindividuen abgebaut wird. Wenn der Nucleinsäureanteil der Sonde natürlich ist, durchdringt die Sonde, wie vorher beschrieben, nur schwerlich die cytoplasmatische Membran und die Kernmembran, und neigt dazu, in den lebenden Zielindividuen abgebaut zu werden.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet im Falle der DNA natürliche Nucleinsäure, Nucleinsäure, in welcher 2'- Desoxyribonucleotide miteinander über eine 3'→5' Phosphodiesterbindung verbunden sind. Im Falle von RNA bedeutet es Nucleinsäure, in welcher Ribonucleotide miteinander über eine 3'→5' Phosphodiesterbindung verbunden sind.
  • In der vorliegenden Erfindung wird die Nucleinsäure mit einer anderen als der natürlichen Struktur grundsätzlich die nicht-natürliche Nucleinsäure genannt. In einem lebenden Körper ist die von der natürlichen Nucleinsäure abweichende Nucleinsäure in einer geringen Menge vorhanden und diese Art von Nucleinsäure wird als modifiziert bezeichnet und gehört zur Kategorie der nicht-natürlichen Nucleinsäuren.
  • Diese nicht-natürliche Nucleinsäure kann durch geeignete Modifikation der Nucleinsäure mit der für die Sonde notwendigen Basensequenz erhalten werden, so dass ihr die vorher erwähnte Funktion verliehen werden kann.
  • Die erfindungsgemäße Modifikation wird im Phosphorsäureanteil der Nucleinsäure durchgeführt, wodurch alle Phosphorsäureanteile in der Nucleinsäuresequenz zu Phosphorthioaten modifiziert werden.
  • Bei der Modifikation der Nucleinsäure sollte darauf geachtet werden, dass die Funktion als Sonde für die Nucleinsäure, d. h. die Funktion der Bildung eines Hybrids mit der Zielnucleinsäure, nicht verschlechtert wird. Konkret ist es bevorzugt, dass die Modifikation der wasserstoffbindenden Stelle des Basenanteils vermieden wird.
  • Ferner wurde die vollständige Phosphorthioat- Modifikation der Nucleinsäure unter Berücksichtigung der Reaktion der Sonde mit den lebenden Zielindividuen, der Aufnahme der Sonde in die lebenden Zielindividuen und der Transportweise der Sonde in den lebenden Zielindividuen ausgewählt. Zum Beispiel ist es erforderlich, um die Sonde in Kontakt mit den lebenden Zielindividuen in einer geeigneten Pufferlösung zu bringen, dass die. Sonde wasserlöslich ist. Der Tatsache nach zu urteilen, dass der Grund warum die natürliche Nucleinsäure kaum durch eine cytoplasmatische Membran und eine Kernmembran gehen kann der derartig starke hydrophile Charakter des Phosphorsäureanteils in der Nucleinsäure ist, so dass der Phosphorsäureanteil kaum durch den hydrophoben Strukturanteil der Lipiddoppelmembranen der cytoplasmatischen Membran und der Kernmembran gehen kann, muss jedoch im Hinblick auf die Aufnahme der Sonde in die lebenden Zielindividuen der hydrophile Charakter der Sonde geeignet gesteuert werden. Wenn hingegen die Nucleinsäure hydrophob gemacht wird, ist ihr Durchgang durch die hydrophilen Strukturanteile der vorher erwähnten Lipiddoppelmembranen schwierig und die Wasserlöslichkeit ist ebenfalls verloren. Daher ist es notwendig, das Gleichgewicht zwischen dem hydrophilen Anteil und dem hydrophoben Anteil in dem Nucleinsäureanteil der Sonde in Übereinstimmung mit dem Verwendungszweck zu steuern. Dieses Gleichgewicht zwischen dem hydrophilen Anteil und dem hydrophoben Anteil wird durch Modifikation des Phosphorsäureanteils zu einem vollständigen Phosphorthioat gesteuert, um es hydrophob zu machen. Wahlweise kann, wenn notwendig, eine hydrophile oder eine hydrophobe funktionelle Gruppe in einen anderen Anteil eingeführt werden.
  • Ferner wird die Modifikation so ausgewählt, dass die modifizierte Sonde harmlos für die lebenden Zielindividuen ist, und zum Beispiel eine Modifikation, wie die Substitution der 5'-Position von Uracil durch Fluor ist nicht bevorzugt.
  • In der vorliegenden Erfindung erlaubt die Markierung der Sonde den Nachweis der Zielindividuen im lebenden Zustand. Erfindungsgemäß wird ein fluoreszierender Cyaninfarbstoff verwendet. Bei der Auswahl der Markierung sollten z. B. die folgenden Punkte berücksichtigt werden:
  • (A) So wie beim Nucleinsäureanteil ist es erforderlich, dass der Markierungsanteil ebenfalls harmlos für die lebenden Zielindividuen ist, und es werden Cyaninfarbstoffe, welche harmlos für den lebenden Körper sind, verwendet.
  • (B) Falls der fluoreszierende Farbstoff verwendet wird, ist es bevorzugt, den fluoreszierenden Farbstoff mit einer Anregungswellenlänge auszuwählen, welche keinen Einfluss auf den Nachweis durch Absorption oder Fluoreszenz des Anregungslichtes durch eine andere Substanz als die Markierung hat oder nicht zu einem derartigen Problem führt, um die Verschlechterung der Nachweisempfindlichkeit aufgrund des Anstiegs des Hintergrundes zu verhindern, welche auf der Absorption oder Fluoreszenz des Anregungslichts durch die lebenden Zielindividuen selbst oder einer in dem Nachweissystem vorhandenen Substanz beruht. Der fluoreszierende Cyaninfarbstoff hat eine Absorption oder Fluoreszenz in einem nahen Infrarotwellenlängebereich von 600 bis 1.000 nm. In diesem Zusammenhang ist es nicht bevorzugt, einen Farbstoff als Markierung zu verwenden, der eine Absorption in einem Wellenlängebereich über 1.000 nm hat, da ein derartiger Farbstoff dazu neigt, Wärme bei der Absorption zu erzeugen. Die meisten der vorher erwähnten Cyaninfarbstoffe haben eine Absorption und Fluoreszenz im Wellenbereich von 600 bis 1.000 nm und dies ist der Grund dafür, warum die Anwendung dieser Farbstoffe vorteilhaft ist.
  • In der vorliegenden Erfindung ist, der sogenannte Waschvorgang notwendig, wenn die zur Bildung eines Hybdrids mit der Zielnucleinsäure in die lebenden Zielindividuen aufgenommene Sonde nicht von der überschüssigen Sonde unterschieden werden kann,. Dieser Vorgang kann durch mehrmals wiederholte Kultivierung in einem keine Sonde enthaltenden Kulturmedium über 6 bis 12 Stunden erreicht werden.
  • Wenn ferner eine Markierung verwendet wird, welche eine spezifische Wechselwirkung mit der Doppelstrang- Struktur des Hybrids durchführt und welche zum Zeitpunkt der Hybridbildung mit der Sonde nachweisbar wird, ist vorteilhafterweise der vorher erwähnte Waschvorgang nicht notwendig. Als eine derartige Markierung kann ein fluoreszierender Farbstoff verwendet werden, welcher eine Funktion als eine interkalierende Substanz in den Basen der Nucleinsäure hat, und welcher in der Doppelstrang- Struktur interkaliert, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen.
  • Ein Verfahren zum Nachweis der lebenden Zielindividuen mit dem Hybrid der Sonde und der Zielnucleinsäure, kann in Abhängigkeit der mit der Sonde gekoppelten Markierung ausgewählt werden. Falls ein fluoreszierender Farbstoff als die Markierung verwendet wird, ist ein Durchflusscytometrieverfahren vorteilhaft, da dieses Verfahren wirkungsvoll die lebenden Zielindividuen von einer großen Menge von lebenden Individuen, welche nicht die Ziele sind, unterscheiden kann. In diesem Fall, wenn ein Farbstoff mit einer Absorption und Fluoreszenz in einem nahen Infrarotwellenlängenbereich von 600 bis 1.000 nm verwendet wird, kann vorteilhafterweise eine kleine preiswerte Laservorrichtung, wie etwa eine Halbleiterlaservorrichtung oder eine He-Ne- Laservorrichtung als eine Lichtquelle für ein Druchflusscytometer (FCM) verwendet werden. Die lebenden Zielindividuen können mit der Sonde markiert werden und ein FCM kann für ihren Nachweis verwendet werden, wobei z. B. die lebenden Zielindividuen, extrahiert aus einem lebenden Körper oder einer Umgebung wie etwa einem Boden, schnell nachgewiesen und ihre Anzahl gezählt werden kann.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung bei der Auswahl der Zielnucleinsäure der Zielindividuen und so kann die Zielnucleinsäure geeigneterweise in Übereinstimmung mit dem Nachweisvorhaben ausgewählt werden. Beispiele für nutzbare Zielnucleinsäuren enthalten genomische DNA, ribosomale DNA, Messenger-RNA, Plasmid-DNA und Phagen- DNA. Wenn die Zielnucleinsäure in einer hohen Kopienzahl in einem lebenden Zielindividuum vorhanden ist, kann die Messung mit einer höheren Empfindlichkeit durchgeführt werden. Daher wird von diesem Standpunkt aus ribosomale RNA und Messenger-RNA bevorzugt. Wenn die lebenden Zielindividuen Bakterien sind, wird Plasmid-DNA oder Phagen-DNA bevorzugt. In dem Fall, dass die lebenden Zielindividuen Rekombinaten sind, in welche ein Fremdgen eingeführt worden ist, kann das Fremdgen, daraus gebildete RNA oder Ähnliches als die Zielnucleinsäure genutzt werden, so dass der Nachweis der Rekombinanten durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann.
  • Als Nächstes wird die vorliegende Erfindung detailliert mit Bezugnahme auf Beispiele beschrieben werden, aber der Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung sollte nicht auf diese Beispiele begrenzt werden.
    • Beispiel 1
  • (1) Synthese der nicht-natürlichen Phosphorthioat- Nucleinsäure (DNA)
  • Durch die Verwendung eines automatischen DNA- Synthesegeräts (Handelsname 381A, hergestellt durch ABI Co., Ltd.), wurde ein 20 Basen umfassendes vollständig durch Phosphorthioat-modifiziertes Oligonucleotid mit folgender Basensequenz synthetisiert, welches komplementär zu einem Abschnitt der Basensequenz von β- Actin mRNA von HeLa-Zellen war:
  • wobei der unterstrichene Abschnitt eine Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRV ist. Dann wurden Amino- Modifikatoren (C6) (hergestellt durch Gren Research Co., Ltd.) an das 5'-Ende dieses Oligonucleotids durch das automatische Synthesegerät gekoppelt.
  • (2) Succinimido-Veresterung des Cyaninfarbstoffs Unter einem Argon-Gasstrom wurden 0,5 g eines Cyaninfarbstoffs (Handelsname NK-3669, hergestellt von Nippon Kanko Shikiso Co., Ltd.) mit einer Carboxylgruppe in 30 ml trockenem DMF in einem verdunkelten 100 ml- Reaktor gelöst. Danach wurde die Lösung auf -10ºC abgekühlt und dann wurde 0,4 g N,N'- Disuccinimidylcarbonat dazugegeben. Als Nächstes wurde die Reaktion bei der gleichen Temperatur für 5 Stunden durchgeführt und dann wurde die Reaktionslösung in 150 ml Chloroform gegossen, dreimal mit 200 ml einer Natriumchloridlösung gewaschen und dann mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde das verwendete Lösungsmittel herausdestilliert. Der verbleibende Rest wurde über eine Silicagel-Säule gereinigt und dann in Ethanol-Isopropylether kristallisiert, um 0,2 g eines kristallinen Succinimidoesters des Cyaninfarbstoffs zu erhalten.
  • (3) Koppeln des nicht-natürlichen Oligonucleotids mit dem Cyaninfarbstoff
  • 0,1 um des in dem vorhergehenden Abschnitt (I) synthetisierten vollständigen Phosphorthioat- Oligonucleotids, wurde in 700 ul Wasser gelöst. Als Nächstes wurde 1 M Natriumcarbonat-Pufferlösung (pH = 9,0) zu der Lösung hinzugegeben und 200 ul einer DMF- Lösung, welche 1 mg des Succinimidoesters des in dem vorhergehenden Abschnitt (2) hergestellten Cyaninfarbstoffs enthält, wurde dann langsam unter Rühren zu der Lösung gegeben. Danach wurde die Reaktion für 24 Stunden bei 40ºC durchgeführt. Als Nächstes wurde der überschüssige Farbstoff aus der resultierenden Reaktionslösung mittels einer Gelfiltrationssäule NAP-25 entfernt, gefolgt von der Reinigung mit RPLC, um 75 nmol eines mit dem Cyaninfarbstoff gekoppelten Phosphorthioat- Oligonucleotids, zu erhalten. Dieses Nucleotid wurde als eine Sonde (I) im nachfolgenden Vorgang verwendet.
    • (4) Enzymverdau
  • 100 umol der Sonde (I) wurde gemäß eines vorher bestimmten Protokolls für 1 Stunde einem Verdau mit S1- Nuclease unterzogen. Als Ergebnis einer Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) der Reaktionslösung war es offensichtlich, dass die Sonde (I) nicht von der S1-Nuclease verdaut wurde. Als Nächstes wurde ein natürliches Oligonucleotid (i), welches komplementär zu der Sonde (I) war, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Handelsname 381A, hergestellt durch ABI Co., Ltd.) synthetisiert und das auf diese Weise synthetisierte natürliche Oligonucleotid (i) wurde mit der Sonde (I) hybridisiert, um ein Hybrid zu erhalten. Anschließend wurde dieses Hybrid für 1 Stunde einem Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRV, nach einem vorbestimmten Protokoll, unterworfen. Nach Abschluss dieser Reaktion wurde eine PAGE der Reaktionslösung durchgeführt, und im Ergebnis war es offensichtlich, dass dieses Hybrid nicht mit EcoRV geschnitten werden konnte.
    • (5) Hybridisierung
  • Nachdem die HeLa-Zellen in einem MEM-Kulturmedium suspendiert waren, wurden 2,5 · 105 Zellen/Platte auf Platten ausgesät. Diese Zellen wurden bei 37ºC für 36 Stunden kultiviert, weiter nacheinander für 24 Stunden in einem MEM-Kulturmedium, welches die Sonde (I) in einer Konzentration von 10 nM enthält und dann für 12 Stunden zweimal in einem MEM-Kulturmedium, welches keine Sonde (I) enthält, kultiviert. Das erhaltene Kulturmedium wurde mit PBS (-) zweimal gewaschen, mit PBS (-)behandelt, welches 0,001% Trypsin und 1 mM EDTA enthält, und dann mit einer Zentrifuge abgetrennt, um die Zellen zu sammeln. Die auf diese Weise gesammelten Zellen wurden in PBS (-) suspendiert, und die resultierende Zellsuspension wurde für eine Messung im FCM im folgenden Abschnitt (6) verwendet.
    • (6) Messung mit dem FCM
  • Das FCM, welches hier verwendet wurde, war mit einem Halbleiterlaser mit einer Wellenlänge von 780 nm als eine Lichtquelle ausgestattet, und bei der Messung der Fluoreszenz wurde ein Filter verwendet, welches 90% oder mehr einer Fluoreszenzwellenlänge von 830 nm der Cyaninfarbstoff-Markierung in der Sonde (I) durchließ.
  • Vorher wurden als Erstes unbehandelte HeLa-Zellen (unbehandelte Zellen), welche nicht mit der Sonde (I) behandelt wurden, mit dem FCM gemessen, um das Muster der Vorwärtsstreuung zu untersuchen. Gemäß der Messung der Fluoreszenz konnten keine unbehandelten HeLa-Zellen, welche die Fluoreszenz aufwiesen, nachgewiesen werden.
  • Als Nächstes wurde die in dem vorhergehenden Abschnitt (5) mit der Sonde (I) behandelte Zellsuspension der Messung unterzogen. Im Ergebnis war das gemessene Muster der Vorwärtsstreuung das gleiche wie in den vorher erwähnten unbehandelten Zellen. Etwa 95% der feinen Partikel (die Anzahl der gemessenen Partikel einschließlich der Zellen = 5.000), welche die gemessene Vorwärtsstreuung aufwiesen, waren in dem Höchstwert versammelt. Daher waren die restlichen 5% umfassenden feinen Partikel in der Pufferlösung enthaltener Staub oder Ähnliches. Etwa 90% der Zellen, welche den Höchstwert bildeten, wiesen die Fluoreszenz auf. Nach den Ergebnissen der im Folgenden erwähnten Vergleichsbeispiele 1 und 2 zu urteilen, zeigt dieses Ergebnis an, dass die nicht-natürliche Sonde (I) spezifisch ein Hybrid mit der markierten Nucleinsäure in den HeLa-Zellen bildet. Wie aus dem Vorhergehenden offensichtlich, konnten durch Anwendung der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde, wobei diese Sonde die nicht-natürliche Nucleinsäure mit einer Struktur umfasst, welche in lebende Zellen aufgenommen wird, die Zellen in einem lebenden Zustand nachgewiesen werden und die Anzahl der Zellen konnte ebenfalls gezählt werden.
    • Vergleichsbeispiel 1
  • Ein 20 Basen umfassendes, vollständig Phosphorthioat-modifiziertes Desoxyadenyl- Homooligonucleotid (welches ein nicht-natürliches war und in der Basensequenz unterschiedlich von der Sonde (I) des Beispiels 1 war) wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Handelsname 381A, hergestellt durch ABI Co., Ltd.) synthetisiert, und dieses Desoxyadenyl-Homooligonucleotid wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 mit einem Cyaninfarbstoff gekoppelt, um die Sonde (II) zu erhalten. Als Nächstes wurde die Behandlung der HeLa-Zellen in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung dieser Sonde (II) durchgeführt und die Messungen erfolgten mit dem FCM. Im Ergebnis wurde nur etwa 1% der in Beispiel 1 gemessenen Fluoreszenz nachgewiesen.
    • Vergleichsbeispiel 2
  • Ein 20 Basen umfassendes (natürliches) Phosphordiester-Oligonucleotid mit der gleichen Basensequenz wie die Sonde (I) des Beispiels 1 wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes (Handelsname 381A, hergestellt durch ABI Co., Ltd.) synthetisiert und dieses Oligonucleotid wurde dann durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 mit einem Cyaninfarbstoff gekoppelt, um eine Sonde (III) zu erhalten. Als Nächstes wurde die Behandlung der HeLa- Zellen in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung dieser Sonde (III) durchgeführt, und die Messung erfolgte im FCM. Im Ergebnis konnte keine Fluoreszenz nachgewiesen werden.
    • Bezugsbeispiel 2 [Dieses Bezugsbeispiel ist nützlich für das Verständnis der vorliegenden Erfindung, ist aber außerhalb ihres Umfangs.] (1) Synthese der Nucleinsäuresonde
  • Ein 20 Basen umfassendes, nicht-natürliches, vollständig Phosphorthioat- modifiziertes Oligonucleotid mit der gleichen Basensequenz wie die Sonde (I) des Beispiels 1 wurde unter Verwendung eines automatischen DNA- Synthesegeräts (Handelsname 381A, hergestellt durch ABI Co., Ltd.) synthetisiert und ein Thiol-Modifikator (C6) (hergestellt durch Gren Research Co., Ltd.) wurde dann durch das automatische Synthesegerät an das 5'-Ende des Oligonucleotids kondensiert. Die Abtrennung von einer CPG-Säule, die Entfernung einer Schutzgruppe, die Entfernung von Trityl und die Reinigung durch RPLC wurden nach einem vorbestimmten Protokolls durchgeführt. Als Nächstes wurde N-(9-Acridinyl)maleimid (hergestellt von Sigma Co., Ltd.) an das resultierende Oligonucleotid gekoppelt, in welchem die Thiolgruppe an das 5"-Ende gebunden war, wobei die Sonde (IV) erhalten wurde. Die Koppelungsbedingungen waren die gleichen wie in dem Fall der Verbindung eines Cyaninfarbstoffs in Beispiel 1, außer dass eine 1 M Natriumphosphatpufferlösung (pH = 7,0) verwendet wurde. Der Acridin-Anteil, welcher der Markierungsanteil dieser Sonde (IV) war, ist eine in den Basenpaaren einer Doppelstrang-Nucleinsäure interkalierende Substanz.
  • Zusätzlich zu der vorher erwähnten Sonde (IV) wurde FITC (Fluoresceinisothiocyanat, hergestellt von Sigma Co., Ltd.) an das 5'-Ende des vollständigen, 20 Basen umfassenden, nicht-natürlichen vollständig Phosphorthioat-modifizierten Oligonucleotids über einen Hexanolamin-Linker in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gebunden, um eine Sonde(V) zu erhalten. Nebenbei bemerkt, ist dieses FITC keine in den Basenpaaren einer Nucleinsäure interkalierende Substanz.
    • (2) Enzymverdau
  • Es wurde untersucht, ob die Sonden (IV) und (V) in dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durch S1- Nuclease verdaut werden, und im Ergebnis war es offensichtlich, dass sie nicht verdaut wurden. Ferner wurde ein natürliches Oligonucleotid (ii) mit einer zu den Sonden (IV) und (V) komplementären Basensequenz, durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 synthetisiert und ein Hybrid der Sonde (IV) und des Oligonucleotids (ii) wie auch ein Hybrid der Sonde (V) und des Oligonucleotids (ii) wurden getrennt gebildet. Als Nächstes wurde untersucht, ob diese Sonden (IV) und (V) durch EcoRV verdaut werden oder nicht, und im Ergebnis war es offensichtlich, dass sie nicht verdaut wurden.
    • (3) Hybridisierung
  • Eine Hybridisierungsbehandlung von HeLa-Zellen wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel I unter Verwendung jede der Sonden (IV) und (V) durchgeführt. In diesem Fall wurde die letzte Kultivierungsdauer in dem Kulturmedium, welches keine Sonde enthält, auf 0 Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden festgesetzt, um Proben mit unterschiedlicher Kultivierungsdauer zu erzeugen.
    • (4) Messung mit dem FCM
  • Das hierbei verwendete FCM war mit einem Argon-Laser ausgestattet. Ferner wurde jede Messung mit 5.000 HeLa- Zellen vorgenommen. Tabelle 1 zeigt die Unterschiede in den Fluoreszenzintensitätsverhältnissen der mit den Sonden (IV) bzw. (V) behandelten HeLa-Zellen entsprechend den Kultivierungsdauern in der letzten Kultur, welche durch Fluoreszenzmessung mit dem FCM erhalten wurden (jedes dieser Verhältnisse war ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität jeder Sonde zu dem einer Standardprobe, in welcher die letzte Kulturdauer in dem keine Sonde enthaltenden Kulturmedium, 0 Stunden war und in diesem Fall die Fluoreszenzintensität der Standardprobe als 1,0 betrachtet wurde). Tabelle 1
  • Es kann aus den Ergebnissen aus Tabelle 1 verstanden werden, dass, wenn der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff Acridin für die Markierung verwendet wurde, das Hybrid der Zielnucleinsäure und der Sonde stabiler erhalten werden kann und so eine stabilere Messung erfolgen kann.
  • Erfindungsgemäß wird eine Sonde verwendet, welche eine nicht-natürliche Einzelstrang-Nucleinsäure umfasst, wodurch die Zielindividuen in einem lebenden Zustand auf einer Nucleinsäureebene nachgewiesen werden können.
  • Zusätzlich wird eine an die Sonde gebundene fluoreszierende Cyaninmarkierung verwendet, welche als eine interkalierende Substanz in den Basenpaaren der Nucleinsäure funktioniert, wodurch eine stabilere Messung möglich ist.

Claims (8)

1. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen die Schritte umfassend:
Zur Verfügung stellen einer Sonde, welche eine nicht-natürliche Einzelstrang-Nucleinsäure umfasst, an der eine markierende Substanz gekoppelt ist, wobei die nicht-natürliche Einzelstrang-Nucleinsäure eine zu einer Basensequenz einer Einzelstrang-Nucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen komplementäre Basensequenz hat, welche spezifisch für die Zellen oder Mikroorganismen ist, und wobei alle Phosphorsäureanteile in der Basensequenz der nicht-natürlichen Nucleinsäure zu Phosphorthioat modifiziert sind und die Markierung ein aus Cyaninfarbstoffen ausgewählter fluoreszierender Farbstoff ist, wobei die Farbstoffe eine Absorption und Fluoreszenz in einem nahen Infrarotwellenlängenbereich von 600 bis 1.000 nm haben und die markierte Sonde für die Zellen oder Mikroorganismen harmlos ist;
Zugabe der markierten Sonde zu einer Probe, welche die Zellen oder Mikroorganismen enthält und Aufnahme der markierten Sonde in die Zellen oder Mikroorganismen durch eine cytoplasmatische Membran und eine Kernmembran der Zellen oder Mikroorganismen, um die markierte Sonde an die Einzelstrang-Nucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen zu binden;
Bestrahlen der Probe mit Licht einer Wellenlänge von 600 nm bis 1.000 nm; und
Nachweis der Zellen oder Mikroorganismen, welche in den Zellen oder Mikroorganismen die an die Einzelstrang- Nucleinsäure gebundene markierte Sonde enthalten, durch Messen der Fluoreszenz der markierenden Substanz der markierten Sonde.
2. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen nach Anspruch 1, wobei die Sonde wasserlöslich ist.
3. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen nach Anspruch 1, wobei der Fluoreszenzfarbstoff eine in den Basenpaaren der Nucleinsäure interkalierende Substanz ist.
4. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Nachweis des Fluoreszenzfarbstoffs mithilfe einer Durchflusscytometrie durchgeführt wird.
5. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Einzelstrang-Nucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen eine genomische DNA ist.
6. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Einzelstrang-Nucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen eine ribosomale RNA ist.
7. Verfahren zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Einzelstrang-Nucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen eine Messenger-RNA ist.
8. Markierte Sonde zum Nachweis lebender Zielzellen oder lebender Zielmikroorganismen, welche eine nichtnatürliche Einzelstrang-Nucleinsäure umfasst, an welche eine markierende Substanz gekoppelt ist, wobei die nichtnatürliche Einzelstrang-Nucleinsäure eine Basensequenz hat, die komplementär zu einer für die Zellen oder Mikroorganismen spezifischen Basensequenz einer Einzelstrang-Nucleinsäure in den Zellen oder Mikroorganismen ist, und wobei die Phosphorsäureanteile in der Basensequenz der nicht-natürlichen Einzelstrang- Nucleinsäure zu Phosphorthioat modifiziert sind, und die markierende Substanz ein aus Cyaninfarbstoffen ausgewählter fluoreszierender Farbstoff ist, wobei die Farbstoffe eine Absorption und Fluoreszenz in einem nahen der Infrarotwellenlängenbereich von 600 bis 1.000 nm haben und die markierte Sonde harmlos für die Zellen oder Mikroorganismen ist.
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