JPH06178699A - 非天然型核酸プローブを用いた生個体の検出方法 - Google Patents
非天然型核酸プローブを用いた生個体の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生きた状態の標的固体の核酸レベルで検出あ
るいは識別したり、その個数を計測するための方法を提
供すること。 【構成】 細胞膜や核膜を通過できるように修飾された
非天然型核酸に標識を行ったプローブを、生細胞に取込
ませて、正細胞中に標的核酸が存在する場合に形成され
るプローブと標的核酸のハイブリッド体をプローブの有
する標識により検出する。
るいは識別したり、その個数を計測するための方法を提
供すること。 【構成】 細胞膜や核膜を通過できるように修飾された
非天然型核酸に標識を行ったプローブを、生細胞に取込
ませて、正細胞中に標的核酸が存在する場合に形成され
るプローブと標的核酸のハイブリッド体をプローブの有
する標識により検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非天然型核酸からなる
プローブを用いて、細胞や微生物を生きた状態で核酸レ
ベルで検出、判別あるいはその個体数の計測が可能な方
法に関する。
プローブを用いて、細胞や微生物を生きた状態で核酸レ
ベルで検出、判別あるいはその個体数の計測が可能な方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子の変異に基づく遺伝病の診
断、発癌遺伝子の発現による細胞の癌化の検出、研究レ
ベルでの遺伝子組換え体の検出等、遺伝子レベル、すな
わち核酸レベルで細胞や微生物等（以下標的個体とい
う）を特定、判別したり、検出あるいは標的個体数を計
測することの重要度が高まっている。
断、発癌遺伝子の発現による細胞の癌化の検出、研究レ
ベルでの遺伝子組換え体の検出等、遺伝子レベル、すな
わち核酸レベルで細胞や微生物等（以下標的個体とい
う）を特定、判別したり、検出あるいは標的個体数を計
測することの重要度が高まっている。
【０００３】従来、これら標的個体の検出や標的個体数
の計測には明視野顕微鏡観測法、位相差顕微鏡観測法あ
るいは微分干渉顕微鏡観測法等が用いられてきた。ま
た、これらの方法では標的個体が見えずらい場合や、よ
り効果的に、あるいはより高感度に検出するためにメチ
レンブルー、サフラニン等の色素や、オーラミン、フル
オレセイン等の蛍光色素で染色した後に、明視野顕微鏡
あるいは蛍光顕微鏡で観測する方法が一般的に行われて
きた。
の計測には明視野顕微鏡観測法、位相差顕微鏡観測法あ
るいは微分干渉顕微鏡観測法等が用いられてきた。ま
た、これらの方法では標的個体が見えずらい場合や、よ
り効果的に、あるいはより高感度に検出するためにメチ
レンブルー、サフラニン等の色素や、オーラミン、フル
オレセイン等の蛍光色素で染色した後に、明視野顕微鏡
あるいは蛍光顕微鏡で観測する方法が一般的に行われて
きた。
【０００４】これらの方法では、染色を行わない場合は
もちろんのこと、標的個体全体をあるいは部分的に染色
する染色法を併用する場合でも、標的個体を形態的に観
察、評価し、別種の個体と区別することはできても、形
態上の差のない同種の個体間における遺伝子の変異によ
る差異を区別することはできない。また、色素や蛍光色
素は、生きている状態の標的個体（生標的個体）の細胞
膜や核膜を透過しにくいので生標的個体を染色して検出
することは困難である。
もちろんのこと、標的個体全体をあるいは部分的に染色
する染色法を併用する場合でも、標的個体を形態的に観
察、評価し、別種の個体と区別することはできても、形
態上の差のない同種の個体間における遺伝子の変異によ
る差異を区別することはできない。また、色素や蛍光色
素は、生きている状態の標的個体（生標的個体）の細胞
膜や核膜を透過しにくいので生標的個体を染色して検出
することは困難である。
【０００５】一方、標的個体を遺伝子、核酸レベルで評
価する方法として、最近、標的個体から核酸を抽出して
その塩基配列を調べたり、あるいはその制限酵素切断の
パターンを調べることが行われるようになってきた。し
かし、このような方法によってもやはり標的個体を生き
ている状態で、かつ形態を保ったままで評価することは
できない。また、この標的個体からの核酸を扱う試験
は、一連の操作が煩雑で検出に長時間を必要とする等の
問題点も有している。
価する方法として、最近、標的個体から核酸を抽出して
その塩基配列を調べたり、あるいはその制限酵素切断の
パターンを調べることが行われるようになってきた。し
かし、このような方法によってもやはり標的個体を生き
ている状態で、かつ形態を保ったままで評価することは
できない。また、この標的個体からの核酸を扱う試験
は、一連の操作が煩雑で検出に長時間を必要とする等の
問題点も有している。
【０００６】このような従来からの一般的な方法におけ
る問題点を解決する方法の一つとして、近年、標的個体
を遺伝子レベルで評価するin situハイブリダイゼーシ
ョン法が研究され、一部実用化されてきている（例え
ば、Nucleic Acid Research, Vol. 20, No. 1, 83-88,
1991）。以下、in situハイブリダイゼーション法につ
いて簡単に説明する。 標的個体内の核酸に固有の塩基配列に相補的な塩基配
列を有する核酸プローブを用意する。なお、この核酸プ
ローブはなんらかの検出可能な部位（標識）を有してい
る。 標的個体をメタノール等で死滅、固定化する。 上記核酸プローブと固定化した標的個体の核酸を標的
個体内（in situ）でハイブリダイゼーションさせる。 ハイブリッド体を形成しなかったプローブを洗う。 標的個体内に形成されたハイブリッド体を前記標識を
利用して検出する。 このin situハイブリダイゼーション法によれば、標的
個体からの核酸の抽出工程を省略でき、その形態を保っ
たままで遺伝子や核酸レベルでの標的個体の検出やその
数の計測が可能となる。なお、この方法では、生標的個
体を死滅させることで、細胞膜や核膜を改変して核酸プ
ローブのこれらの膜の通過を容易にしている。
る問題点を解決する方法の一つとして、近年、標的個体
を遺伝子レベルで評価するin situハイブリダイゼーシ
ョン法が研究され、一部実用化されてきている（例え
ば、Nucleic Acid Research, Vol. 20, No. 1, 83-88,
1991）。以下、in situハイブリダイゼーション法につ
いて簡単に説明する。 標的個体内の核酸に固有の塩基配列に相補的な塩基配
列を有する核酸プローブを用意する。なお、この核酸プ
ローブはなんらかの検出可能な部位（標識）を有してい
る。 標的個体をメタノール等で死滅、固定化する。 上記核酸プローブと固定化した標的個体の核酸を標的
個体内（in situ）でハイブリダイゼーションさせる。 ハイブリッド体を形成しなかったプローブを洗う。 標的個体内に形成されたハイブリッド体を前記標識を
利用して検出する。 このin situハイブリダイゼーション法によれば、標的
個体からの核酸の抽出工程を省略でき、その形態を保っ
たままで遺伝子や核酸レベルでの標的個体の検出やその
数の計測が可能となる。なお、この方法では、生標的個
体を死滅させることで、細胞膜や核膜を改変して核酸プ
ローブのこれらの膜の通過を容易にしている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】前述のように、in sit
uハイブリダイゼーションによれば、それ以前の一般的
な方法では不可能であった形態を保ったままでの標的個
体の核酸レベルでの判別、検出、個体数の計測が可能で
ある。しかしながら、標的個体を生きた状態で検出でき
ないという問題点は依然として残されている。
uハイブリダイゼーションによれば、それ以前の一般的
な方法では不可能であった形態を保ったままでの標的個
体の核酸レベルでの判別、検出、個体数の計測が可能で
ある。しかしながら、標的個体を生きた状態で検出でき
ないという問題点は依然として残されている。
【０００８】従来のin situハイブリダイゼーション法
において生標的個体の検出が不可能であった理由を要約
すれば以下のとおりである。 核酸プローブの核酸部分は、天然なものでも、化学合
成されたものでも、天然型であるので、リン酸部分の親
水性が強いため生標的個体の細胞膜や核膜を通過しにく
い。 核酸プローブが、細胞膜や核膜を通過しても、生標的
個体内の一本鎖核酸分解酵素によって分解されてしまう
場合がある。この傾向は、核酸プローブの核酸部分がＤ
ＮＡであるよりもＲＮＡである場合の方が強い。 核酸プローブの核酸部分がＤＮＡである場合、核酸プ
ローブが生標的個体内の標的核酸とハイブリッド体を形
成したとしても生標的個体内の二本鎖核酸分解酵素によ
って分解されてしまう場合がある。 核酸プローブの標識部分として一般的に用いられてい
る蛍光色素のなかには生標的個体に対して毒性を示すも
のがあり、そうした色素を利用すると生標的個体が死滅
してしまう場合がある。
において生標的個体の検出が不可能であった理由を要約
すれば以下のとおりである。 核酸プローブの核酸部分は、天然なものでも、化学合
成されたものでも、天然型であるので、リン酸部分の親
水性が強いため生標的個体の細胞膜や核膜を通過しにく
い。 核酸プローブが、細胞膜や核膜を通過しても、生標的
個体内の一本鎖核酸分解酵素によって分解されてしまう
場合がある。この傾向は、核酸プローブの核酸部分がＤ
ＮＡであるよりもＲＮＡである場合の方が強い。 核酸プローブの核酸部分がＤＮＡである場合、核酸プ
ローブが生標的個体内の標的核酸とハイブリッド体を形
成したとしても生標的個体内の二本鎖核酸分解酵素によ
って分解されてしまう場合がある。 核酸プローブの標識部分として一般的に用いられてい
る蛍光色素のなかには生標的個体に対して毒性を示すも
のがあり、そうした色素を利用すると生標的個体が死滅
してしまう場合がある。
【０００９】本発明の目的は、生きた状態の標的個体の
核酸レベルで検出あるいは識別したり、その個体数を計
測するための方法を提供することにある。
核酸レベルで検出あるいは識別したり、その個体数を計
測するための方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の生個体の検出方
法は、検出すべき生標的個体中の標的核酸が有する塩基
配列に相補的な塩基配列を含み、該生標的個体が取込み
可能な非天然型核酸と、該核酸に結合した標識物質とを
有するプローブと、試料とを反応させる過程と、該試料
に前記生標的個体が存在する場合に、該生標的個体中に
取込まれて標的核酸とハイブリダイズしたプローブを該
プローブの有する標識物質を利用して検出する過程とを
有することを特徴とする。
法は、検出すべき生標的個体中の標的核酸が有する塩基
配列に相補的な塩基配列を含み、該生標的個体が取込み
可能な非天然型核酸と、該核酸に結合した標識物質とを
有するプローブと、試料とを反応させる過程と、該試料
に前記生標的個体が存在する場合に、該生標的個体中に
取込まれて標的核酸とハイブリダイズしたプローブを該
プローブの有する標識物質を利用して検出する過程とを
有することを特徴とする。
【００１１】本発明は、プローブの構造を用途に応じて
適宜選択することで、検出すべき生標的個体としての、
各種の細胞や、ウイルス、細菌、放線菌、酵母、かび、
きのこ、藻類及び原生動物などの各種微生物の検出に利
用できる。
適宜選択することで、検出すべき生標的個体としての、
各種の細胞や、ウイルス、細菌、放線菌、酵母、かび、
きのこ、藻類及び原生動物などの各種微生物の検出に利
用できる。
【００１２】本発明におけるプローブは、生標的個体が
取込み可能であり、かつ生標的個体内の分解酵素による
分解を受けにくい構造を有する非天然型核酸部分を有す
る。前述のようにプローブの核酸部分が天然型である
と、細胞膜や核膜を通過しにくくなり、また生標的個体
内での分解を受けやい。
取込み可能であり、かつ生標的個体内の分解酵素による
分解を受けにくい構造を有する非天然型核酸部分を有す
る。前述のようにプローブの核酸部分が天然型である
と、細胞膜や核膜を通過しにくくなり、また生標的個体
内での分解を受けやい。
【００１３】この非天然型の核酸は、プローブとして必
要な塩基配列を有する核酸を、上記の機能が付与される
ように適宜修飾して得ることができる。このような修飾
を行う方法としては、特に限定はないが、核酸のリン酸
部、糖部、塩基部等に目的に応じた修飾を行う方法が利
用できる。例えば、核酸の糖部を修飾する方法として
は、β−Ｄ−リボフラノシル環に代えて、アノマーやア
ラビノース環を導入する方法等が挙げられる。
要な塩基配列を有する核酸を、上記の機能が付与される
ように適宜修飾して得ることができる。このような修飾
を行う方法としては、特に限定はないが、核酸のリン酸
部、糖部、塩基部等に目的に応じた修飾を行う方法が利
用できる。例えば、核酸の糖部を修飾する方法として
は、β−Ｄ−リボフラノシル環に代えて、アノマーやア
ラビノース環を導入する方法等が挙げられる。
【００１４】この核酸の修飾にあたっては、核酸のプロ
ーブとしての機能、すなわち標的核酸とのハイブリッド
体の形成機能が損なわれないように注意する必要があ
る。具体的には、核酸部分の有する塩基部分の水素結合
部位を修飾することを避け、例えば、修飾を、ウラシル
の５位、β−Ｄ−リボフラノシル環の２’位あるいはリ
ン酸部分に行うようにすると良い。
ーブとしての機能、すなわち標的核酸とのハイブリッド
体の形成機能が損なわれないように注意する必要があ
る。具体的には、核酸部分の有する塩基部分の水素結合
部位を修飾することを避け、例えば、修飾を、ウラシル
の５位、β−Ｄ−リボフラノシル環の２’位あるいはリ
ン酸部分に行うようにすると良い。
【００１５】また、プローブの生標的個体との反応及び
生標的個体への取込み、及び生標的個体内での輸送の形
態を考慮して、その核酸部分の修飾を選択することも必
要である。例えば、適当な緩衝液中でプローブと生標的
個体を接触させるには、プローブが水溶性であることが
必要である。しかしながら、生標的個体への取込みとい
う観点からは、プローブの親水性は適度にコントロール
されていることが必要である。なぜならば、天然型の核
酸が細胞膜や核膜を通過しにくいのは、該核酸のリン酸
部分の親水性が強すぎて細胞膜や核膜の脂質二重膜の疎
水性構造部分を通過しにくいためである。一方、核酸を
疎水性とすると、この脂質二重膜の親水性構造部分の通
過が困難になるばかりではなく、水溶性が失われてしま
う。従って、プローブの核酸部分の親水性部分と疎水性
部分のバランスを目的に応じてコントロールすることが
必要となる。この親水性部分と疎水性部分のバランスの
コントロールは、リン酸部分の必要数を修飾して疎水性
にしたり、その他の部分に疎水性もしくは親水性の官能
基を導入する等の方法によって行うことができる。更
に、修飾後のプローブが生標的個体に対して無毒である
ように修飾を選択する必要もあり、例えば、ウラシルの
５位のフッ素での置換等の修飾は好ましくない。
生標的個体への取込み、及び生標的個体内での輸送の形
態を考慮して、その核酸部分の修飾を選択することも必
要である。例えば、適当な緩衝液中でプローブと生標的
個体を接触させるには、プローブが水溶性であることが
必要である。しかしながら、生標的個体への取込みとい
う観点からは、プローブの親水性は適度にコントロール
されていることが必要である。なぜならば、天然型の核
酸が細胞膜や核膜を通過しにくいのは、該核酸のリン酸
部分の親水性が強すぎて細胞膜や核膜の脂質二重膜の疎
水性構造部分を通過しにくいためである。一方、核酸を
疎水性とすると、この脂質二重膜の親水性構造部分の通
過が困難になるばかりではなく、水溶性が失われてしま
う。従って、プローブの核酸部分の親水性部分と疎水性
部分のバランスを目的に応じてコントロールすることが
必要となる。この親水性部分と疎水性部分のバランスの
コントロールは、リン酸部分の必要数を修飾して疎水性
にしたり、その他の部分に疎水性もしくは親水性の官能
基を導入する等の方法によって行うことができる。更
に、修飾後のプローブが生標的個体に対して無毒である
ように修飾を選択する必要もあり、例えば、ウラシルの
５位のフッ素での置換等の修飾は好ましくない。
【００１６】本発明におけるプローブの標識部分として
は、標的個体の生きた状態での検出を可能とするもので
あれば特に制限はないが、色素や蛍光色素を利用するこ
とができる。標識の選択に当っては、例えば、以下のよ
うな点を考慮すると良い。 Ａ）核酸部分と同様に、この標識部分もまた生標的個体
に対して無毒である必要があり、例えば、シアニン系色
素やアズレニン系色素で生体に対する毒性を示さないも
のが利用できる。 Ｂ）蛍光色素を利用する場合、生標的個体自体や検出系
に存在する物質による励起光の吸収や蛍光によるバック
グランドの上昇によって検出感度が低下することを避け
るために、標識以外の物質による励起光の吸収や蛍光の
検出への影響がない、あるいはそれが問題とならない励
起波長の蛍光色素を選択するのが好ましい。このような
蛍光色素としては、例えば、６００〜１０００ｎｍの近
赤外の波長領域に吸収、蛍光を有する蛍光色素を挙げる
ことができる。なお、１０００ｎｍを超える波長領域に
吸収を持つ色素を標識とした場合、吸収によって発熱を
おこす場合があるので好ましくない。前記シアニン系色
素やアズレニン系色素には、６００〜１０００ｎｍの波
長領域に吸収及び蛍光を有するものが多く、この意味で
もこれらの色素を用いることは有利である。
は、標的個体の生きた状態での検出を可能とするもので
あれば特に制限はないが、色素や蛍光色素を利用するこ
とができる。標識の選択に当っては、例えば、以下のよ
うな点を考慮すると良い。 Ａ）核酸部分と同様に、この標識部分もまた生標的個体
に対して無毒である必要があり、例えば、シアニン系色
素やアズレニン系色素で生体に対する毒性を示さないも
のが利用できる。 Ｂ）蛍光色素を利用する場合、生標的個体自体や検出系
に存在する物質による励起光の吸収や蛍光によるバック
グランドの上昇によって検出感度が低下することを避け
るために、標識以外の物質による励起光の吸収や蛍光の
検出への影響がない、あるいはそれが問題とならない励
起波長の蛍光色素を選択するのが好ましい。このような
蛍光色素としては、例えば、６００〜１０００ｎｍの近
赤外の波長領域に吸収、蛍光を有する蛍光色素を挙げる
ことができる。なお、１０００ｎｍを超える波長領域に
吸収を持つ色素を標識とした場合、吸収によって発熱を
おこす場合があるので好ましくない。前記シアニン系色
素やアズレニン系色素には、６００〜１０００ｎｍの波
長領域に吸収及び蛍光を有するものが多く、この意味で
もこれらの色素を用いることは有利である。
【００１７】本発明において、生標的個体中に取込まれ
て、標的核酸とハイブリッド体を形成しているプローブ
と未反応のプローブとの区別ができない場合には、いわ
ゆる洗いの操作が必要となる。この操作は、例えば、プ
ローブを含まない培地で６〜１２時間培養する操作を数
回繰り返すことにより行うことができる。
て、標的核酸とハイブリッド体を形成しているプローブ
と未反応のプローブとの区別ができない場合には、いわ
ゆる洗いの操作が必要となる。この操作は、例えば、プ
ローブを含まない培地で６〜１２時間培養する操作を数
回繰り返すことにより行うことができる。
【００１８】また、標識として、ハイブリッド体の２本
鎖構造と特異的な相互作用を行い、プローブがハイブリ
ッド体を形成した状態で検出可能となるものを利用すれ
ば、上述の洗いの操作は不要となるので有利である。こ
のような標識としては、例えば、アクリジン等のよう
に、核酸塩基に対するインターカレーターとしての機能
を有し、２本鎖構造にインターカレイトして蛍光強度が
増大する蛍光色素を利用することができる。
鎖構造と特異的な相互作用を行い、プローブがハイブリ
ッド体を形成した状態で検出可能となるものを利用すれ
ば、上述の洗いの操作は不要となるので有利である。こ
のような標識としては、例えば、アクリジン等のよう
に、核酸塩基に対するインターカレーターとしての機能
を有し、２本鎖構造にインターカレイトして蛍光強度が
増大する蛍光色素を利用することができる。
【００１９】プローブと標的核酸とのハイブリッド体を
有する生標的個体を検出する方法は、プローブに結合さ
せた標識に応じて選択する。標識として蛍光色素を利用
した場合には、大量に存在する標的でない生個体から生
標的個体を効率良く区別できるという点からフローサイ
トメトリー法が有利である。この際、前述した６００〜
１０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する
色素を使用すればフローサイトメーター（ＦＣＭ）の光
源として半導体レーザー装置、Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
等の小型で安価なレーザー装置を利用できるという利点
もある。生標的個体をプローブで標識し、その検出にＦ
ＭＣを利用することにより、例えば、生体や土壌中等の
環境から抽出した生標的個体を速やかに検出し、その数
を計測することが可能となる。
有する生標的個体を検出する方法は、プローブに結合さ
せた標識に応じて選択する。標識として蛍光色素を利用
した場合には、大量に存在する標的でない生個体から生
標的個体を効率良く区別できるという点からフローサイ
トメトリー法が有利である。この際、前述した６００〜
１０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する
色素を使用すればフローサイトメーター（ＦＣＭ）の光
源として半導体レーザー装置、Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
等の小型で安価なレーザー装置を利用できるという利点
もある。生標的個体をプローブで標識し、その検出にＦ
ＭＣを利用することにより、例えば、生体や土壌中等の
環境から抽出した生標的個体を速やかに検出し、その数
を計測することが可能となる。
【００２０】生標的個体の標的核酸の選択には特に制限
はなく、検出目的に応じて適宜選択する。例えば、ゲノ
ムＤＮＡ、リボゾームＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が利用でき、一個
の生標的個体内に標的核酸がより多くのコピー数で存在
していればより高感度な測定が可能となるので、このよ
うな観点からは、リボゾームＲＮＡやメッセンジャーＲ
ＮＡが好ましく、また、生標的個体が細菌である場合に
は、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡが望ましい。な
お、生標的個体が外来遺伝子が導入された組換え体の場
合には、該外来遺伝子やそれに基づいて形成されたＲＮ
Ａ等を標的核酸とすれば、組換え体の検出を本発明の方
法で行うことができる。
はなく、検出目的に応じて適宜選択する。例えば、ゲノ
ムＤＮＡ、リボゾームＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が利用でき、一個
の生標的個体内に標的核酸がより多くのコピー数で存在
していればより高感度な測定が可能となるので、このよ
うな観点からは、リボゾームＲＮＡやメッセンジャーＲ
ＮＡが好ましく、また、生標的個体が細菌である場合に
は、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡが望ましい。な
お、生標的個体が外来遺伝子が導入された組換え体の場
合には、該外来遺伝子やそれに基づいて形成されたＲＮ
Ａ等を標的核酸とすれば、組換え体の検出を本発明の方
法で行うことができる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例に従って本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００２２】実施例１ （１）ホスホロチオエート型非天然型核酸（ＤＮＡ）の
合成 Ｈｅｌａ細胞のβ−アクチンｍＲＮＡの有する塩基配列
の一部に相補的な以下に示す塩基配列を有する２０量体
全ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社
製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。 ５’ＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣ ３’ （下線部は制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位であ
る。） （２）シアニン色素のスクシイミドエステル化 アルゴン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器にカル
ボキシル基を有するシアニン色素 ＮＫ−３６６９（日
本感光色素）０．５ｇを乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに溶解させ
た。これを−１０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジスクシ
イミジルカーボネート０．４ｇを添加した。同温度で５
時間反応させた後、クロロホルム１５０ｍｌに反応液を
注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗浄してから、水洗
後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム
で精製後、エタノール−イソプロピルエーテル中で結晶
させて、シアニン色素のスクシイミドエステルの結晶
０．２ｇを得た。 （３）非天然型オリゴヌクレオチドとシアニン色素の結
合 先の（１）で合成した全ホスホロチオエート型オリゴヌ
クレオチド０．１μｍｏｌを水７００μｌに溶解した。
この溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）
を加え、更に、（２）で合成したシアニン色素のスクシ
イミドエステル１ｍｇのＤＭＦ溶液２００μｌを攪拌下
徐々に加えた後、４０℃で２４時間反応させた。次に、
この反応液からゲル濾過カラムＮＡＰ−２５で過剰な色
素を除去し、ＲＰＬＣで精製して、７５ｎｍｏｌのシア
ニン色素結合ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド
を得た。このヌクレオチドをプローブ（Ｉ）として以下
の操作に用いた。 （４）酵素消化 プローブ（Ｉ）の１００ｐｍｏｌの所定のプロトコール
に従ったＳ１ヌクレアーゼでの１時間消化反応を行っ
た。反応液のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
の結果、プローブ（Ｉ）はＳ１ヌクレアーゼで消化され
ないことがわかった。次に、プローブ（Ｉ）と相補的な
天然型オリゴヌクレオチド（ｉ）をＡＢＩ社製３８１Ａ
ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、この天然型オリゴ
ヌクレオチド（ｉ）とプローブ（Ｉ）とをハイブリダイ
ズさせて得られたハイブリッド体に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖでの所定のプロトコールに従った１時間の消化反応を
行った。反応終了後、反応液のＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、このハイブリッド体はＥｃｏＲＶでは切断されない
ことがわかった。 （５）ハイブリダイゼーション ＨｅＬａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個
／枚となるようにディシュに蒔いた。３７℃で３６時間
培養した後、プローブ（Ｉ）を１０ｎＭの濃度で含むＭ
ＥＭ培地と交換し、引き続き２４時間培養した。つい
で、プローブ（Ｉ）を含まないＭＥＭ培地に交換して１
２時間培養する操作を２回繰り返した後、ＰＢＳ（−）
で二回洗浄してから、０．００１％トリプシン、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で更に処理した後、遠心
して細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ（−）に懸
濁して得た細胞懸濁液を以下の（６）のＦＣＭによる計
測に用いた。 （６）ＦＣＭ計測 用いたＦＣＭは光源を波長７８０ｎｍの半導体レーザー
仕様としたもので、蛍光の計測にはプローブ（Ｉ）の有
するシアニン色素標識の８３０ｎｍの蛍光波長を９０％
以上透過するフィルターを用いた。
合成 Ｈｅｌａ細胞のβ−アクチンｍＲＮＡの有する塩基配列
の一部に相補的な以下に示す塩基配列を有する２０量体
全ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社
製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。 ５’ＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣ ３’ （下線部は制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位であ
る。） （２）シアニン色素のスクシイミドエステル化 アルゴン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器にカル
ボキシル基を有するシアニン色素 ＮＫ−３６６９（日
本感光色素）０．５ｇを乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに溶解させ
た。これを−１０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジスクシ
イミジルカーボネート０．４ｇを添加した。同温度で５
時間反応させた後、クロロホルム１５０ｍｌに反応液を
注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗浄してから、水洗
後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム
で精製後、エタノール−イソプロピルエーテル中で結晶
させて、シアニン色素のスクシイミドエステルの結晶
０．２ｇを得た。 （３）非天然型オリゴヌクレオチドとシアニン色素の結
合 先の（１）で合成した全ホスホロチオエート型オリゴヌ
クレオチド０．１μｍｏｌを水７００μｌに溶解した。
この溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）
を加え、更に、（２）で合成したシアニン色素のスクシ
イミドエステル１ｍｇのＤＭＦ溶液２００μｌを攪拌下
徐々に加えた後、４０℃で２４時間反応させた。次に、
この反応液からゲル濾過カラムＮＡＰ−２５で過剰な色
素を除去し、ＲＰＬＣで精製して、７５ｎｍｏｌのシア
ニン色素結合ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド
を得た。このヌクレオチドをプローブ（Ｉ）として以下
の操作に用いた。 （４）酵素消化 プローブ（Ｉ）の１００ｐｍｏｌの所定のプロトコール
に従ったＳ１ヌクレアーゼでの１時間消化反応を行っ
た。反応液のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
の結果、プローブ（Ｉ）はＳ１ヌクレアーゼで消化され
ないことがわかった。次に、プローブ（Ｉ）と相補的な
天然型オリゴヌクレオチド（ｉ）をＡＢＩ社製３８１Ａ
ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、この天然型オリゴ
ヌクレオチド（ｉ）とプローブ（Ｉ）とをハイブリダイ
ズさせて得られたハイブリッド体に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖでの所定のプロトコールに従った１時間の消化反応を
行った。反応終了後、反応液のＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、このハイブリッド体はＥｃｏＲＶでは切断されない
ことがわかった。 （５）ハイブリダイゼーション ＨｅＬａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個
／枚となるようにディシュに蒔いた。３７℃で３６時間
培養した後、プローブ（Ｉ）を１０ｎＭの濃度で含むＭ
ＥＭ培地と交換し、引き続き２４時間培養した。つい
で、プローブ（Ｉ）を含まないＭＥＭ培地に交換して１
２時間培養する操作を２回繰り返した後、ＰＢＳ（−）
で二回洗浄してから、０．００１％トリプシン、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で更に処理した後、遠心
して細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ（−）に懸
濁して得た細胞懸濁液を以下の（６）のＦＣＭによる計
測に用いた。 （６）ＦＣＭ計測 用いたＦＣＭは光源を波長７８０ｎｍの半導体レーザー
仕様としたもので、蛍光の計測にはプローブ（Ｉ）の有
するシアニン色素標識の８３０ｎｍの蛍光波長を９０％
以上透過するフィルターを用いた。
【００２３】まず、あらかじめプローブ（Ｉ）で処理し
ていない未処理ＨｅＬａ細胞（未処理細胞）をＦＣＭで
計測し、前方散乱のパターンを調べた。また、蛍光の測
定においては未処理ＨｅＬａ細胞では、蛍光を有する細
胞は検出されなかった。
ていない未処理ＨｅＬａ細胞（未処理細胞）をＦＣＭで
計測し、前方散乱のパターンを調べた。また、蛍光の測
定においては未処理ＨｅＬａ細胞では、蛍光を有する細
胞は検出されなかった。
【００２４】ついで、先の（５）でプローブ（Ｉ）で処
理した細胞の懸濁液を用いて計測を行った。その結果得
られた前方散乱パターンは、上記の未処理細胞と同一で
あった。計測された前方散乱を有する微粒子（計測数５
０００個、細胞を含む）のうち約９５％が主ピークに集
中した。従って、残り５％は緩衝液中に含まれる塵等で
ある。この主ピークが示す細胞のうち約９０％が蛍光を
有していた。後述の比較例１及び２の結果と比較して、
この結果は、非天然型であるプローブ（Ｉ）がＨｅＬａ
細胞内の標的核酸と特異的にハイブリッド体を形成した
ことを示す。このように、生細胞が取り込み可能な構造
を有する非天然型核酸からなり、蛍光色素により標識さ
れたプローブを用いることで、細胞を生きている状態で
検出及びその個数を計測することが可能となる。
理した細胞の懸濁液を用いて計測を行った。その結果得
られた前方散乱パターンは、上記の未処理細胞と同一で
あった。計測された前方散乱を有する微粒子（計測数５
０００個、細胞を含む）のうち約９５％が主ピークに集
中した。従って、残り５％は緩衝液中に含まれる塵等で
ある。この主ピークが示す細胞のうち約９０％が蛍光を
有していた。後述の比較例１及び２の結果と比較して、
この結果は、非天然型であるプローブ（Ｉ）がＨｅＬａ
細胞内の標的核酸と特異的にハイブリッド体を形成した
ことを示す。このように、生細胞が取り込み可能な構造
を有する非天然型核酸からなり、蛍光色素により標識さ
れたプローブを用いることで、細胞を生きている状態で
検出及びその個数を計測することが可能となる。
【００２５】比較例１ 全ホスホロチオエート型の２０量体デオキシアデニル酸
ホモオリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成し、これに実施例１と同様にし
てシアニン色素を結合させ、プローブ（ＩＩ）を得た。
次に、このプローブ（ＩＩ）を用いて実施例１と同様に
して、ＨｅＬａ細胞の処理を行った後、ＦＣＭで計測し
たところ、実施例１で計測された蛍光の約１％にあたる
蛍光しか検出されなかった。
ホモオリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成し、これに実施例１と同様にし
てシアニン色素を結合させ、プローブ（ＩＩ）を得た。
次に、このプローブ（ＩＩ）を用いて実施例１と同様に
して、ＨｅＬａ細胞の処理を行った後、ＦＣＭで計測し
たところ、実施例１で計測された蛍光の約１％にあたる
蛍光しか検出されなかった。
【００２６】比較例２ 実施例１のプローブ（Ｉ）と同じ塩基配列を有する全リ
ン酸ジエステル（天然）型の２０量体オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成
し、これに実施例１と同様にしてシアニン色素を結合さ
せてプローブ（ＩＩＩ）とした。このプローブ（ＩＩ
Ｉ）を用いて実施例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞の処
理を行った後、ＦＣＭで計測したところ、蛍光は検出さ
れなかった。
ン酸ジエステル（天然）型の２０量体オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成
し、これに実施例１と同様にしてシアニン色素を結合さ
せてプローブ（ＩＩＩ）とした。このプローブ（ＩＩ
Ｉ）を用いて実施例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞の処
理を行った後、ＦＣＭで計測したところ、蛍光は検出さ
れなかった。
【００２７】実施例２ （１）核酸プローブの合成 実施例１のプローブ（Ｉ）と同じ塩基配列を有する全ホ
スホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合
成した後、その５’末端にチオールモディファイアー
（Ｃ６）（グレンリサーチ社製）を自動合成機で縮合さ
せた。ＣＰＧカラムからの切り出し、脱保護、脱トリチ
ル、ＲＰＬＣによる精製は所定のプロトコールに従って
行った。得られた５’末端にチオール基が結合したオリ
ゴヌクレオチドにＮ−（９−アクリジニル）マレイミド
（シグマ社製）を結合して、プローブ（ＩＶ）を得た。
その結合条件は、緩衝液を１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝７．０）とした以外は実施例１におけるシアニ
ン色素の結合と同様である。このプローブ（ＩＶ）の標
識部分であるアクリジン部分は２本鎖核酸の塩基対間に
対するインターカレーターである。
スホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合
成した後、その５’末端にチオールモディファイアー
（Ｃ６）（グレンリサーチ社製）を自動合成機で縮合さ
せた。ＣＰＧカラムからの切り出し、脱保護、脱トリチ
ル、ＲＰＬＣによる精製は所定のプロトコールに従って
行った。得られた５’末端にチオール基が結合したオリ
ゴヌクレオチドにＮ−（９−アクリジニル）マレイミド
（シグマ社製）を結合して、プローブ（ＩＶ）を得た。
その結合条件は、緩衝液を１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝７．０）とした以外は実施例１におけるシアニ
ン色素の結合と同様である。このプローブ（ＩＶ）の標
識部分であるアクリジン部分は２本鎖核酸の塩基対間に
対するインターカレーターである。
【００２８】これとは別に、上記と同様の方法によっ
て、全ホスホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌ
クレオチドの５’末端にヘキサノールアミンリンカーを
介してＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、
Sigma 社製）を結合させてプローブ（Ｖ）を得た。な
お、このＦＩＴＣは核酸塩基対間に対するインターカレ
ーターではない。 （２）酵素消化 実施例１と同様の方法で、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）
がＳ１ヌクレアーゼで消化されるかどうか試験したとこ
ろ、消化されないことがわかった。更に、実施例１と同
様にして、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）と相補的な塩基
配列を有する天然型オリゴヌクレオチド（ｉｉ）を合成
して、プローブ（ＩＶ）とオリゴヌクレオチド（ｉｉ）
とのハイブリッド体と、プローブ（Ｖ）とオリゴヌクレ
オチド（ｉｉ）とのハイブリッド体をそれぞれ個々に形
成し、これらがＥｃｏＲＶで切断されるかどうか試験し
たところ、これらは切断されないことがわかった。 （３）ハイブリダイゼーション プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）を個々に用いて、実施例１
と同様にしてＨｅＬａ細胞のハイブリダイゼーション処
理を行った。ただし、プローブを含まない培地での最終
培養時間が、０時間、１２時間及び２４時間のサンプル
をそれぞれ用意した。 （４）ＦＣＭ計測 ＦＣＭとしてアルゴンレーザー仕様のものを用いた。ま
た、各計測は５０００個のＨｅＬａ細胞について行っ
た。表１にプローブ（ＩＶ）および（Ｖ）でそれぞれ処
理したＨｅＬａ細胞のＦＣＭでの蛍光計測で得られた蛍
光強度比（プローブを含まない培地での最終培養の培養
時間が０時間のものの蛍光強度に対する比で、この０時
間の蛍光強度を１．０として算出）の該最終培養の培養
時間に応じた変化を示した。
て、全ホスホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌ
クレオチドの５’末端にヘキサノールアミンリンカーを
介してＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、
Sigma 社製）を結合させてプローブ（Ｖ）を得た。な
お、このＦＩＴＣは核酸塩基対間に対するインターカレ
ーターではない。 （２）酵素消化 実施例１と同様の方法で、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）
がＳ１ヌクレアーゼで消化されるかどうか試験したとこ
ろ、消化されないことがわかった。更に、実施例１と同
様にして、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）と相補的な塩基
配列を有する天然型オリゴヌクレオチド（ｉｉ）を合成
して、プローブ（ＩＶ）とオリゴヌクレオチド（ｉｉ）
とのハイブリッド体と、プローブ（Ｖ）とオリゴヌクレ
オチド（ｉｉ）とのハイブリッド体をそれぞれ個々に形
成し、これらがＥｃｏＲＶで切断されるかどうか試験し
たところ、これらは切断されないことがわかった。 （３）ハイブリダイゼーション プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）を個々に用いて、実施例１
と同様にしてＨｅＬａ細胞のハイブリダイゼーション処
理を行った。ただし、プローブを含まない培地での最終
培養時間が、０時間、１２時間及び２４時間のサンプル
をそれぞれ用意した。 （４）ＦＣＭ計測 ＦＣＭとしてアルゴンレーザー仕様のものを用いた。ま
た、各計測は５０００個のＨｅＬａ細胞について行っ
た。表１にプローブ（ＩＶ）および（Ｖ）でそれぞれ処
理したＨｅＬａ細胞のＦＣＭでの蛍光計測で得られた蛍
光強度比（プローブを含まない培地での最終培養の培養
時間が０時間のものの蛍光強度に対する比で、この０時
間の蛍光強度を１．０として算出）の該最終培養の培養
時間に応じた変化を示した。
【００２９】
【表１】 表１の結果から、インターカレーターとしての蛍光色素
であるアクリジンを標識として用いた場合の方が、細胞
中で標的核酸とプローブとのハイブリッド体が安定に維
持されるので、安定した測定が行えることがわかった。
であるアクリジンを標識として用いた場合の方が、細胞
中で標的核酸とプローブとのハイブリッド体が安定に維
持されるので、安定した測定が行えることがわかった。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、非天然型核酸からなる
プローブを用いることで、標的個体の生きた状態での核
酸レベルでの検出、判別あるいはその数の計測が可能と
なった。更に、プローブに結合する標識として核酸塩基
対間に対するインターカレーターとして機能するものを
用いることで、安定した測定が可能となる。
プローブを用いることで、標的個体の生きた状態での核
酸レベルでの検出、判別あるいはその数の計測が可能と
なった。更に、プローブに結合する標識として核酸塩基
対間に対するインターカレーターとして機能するものを
用いることで、安定した測定が可能となる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】本発明におけるプローブは、生標的個体が
取込み可能であり、かつ生標的個体内の分解酵素による
分解を受けにくい構造を有する非天然型核酸部分を有す
る。前述のようにプローブの核酸部分が天然型である
と、細胞膜や核膜を通過しにくくなり、また生標的個体
内での分解を受けやい。本発明において、天然型核酸と
は、ＤＮＡの場合、２’−デオキシリボヌクレオチドが
３’→５’リン酸ジエステル結合を介して結合している
ものをいう。ＲＮＡの場合は、リボヌクレオチドが３’
→５’リン酸ジエステル結合を介して結合しているもの
をいう。これら天然型の核酸以外の構造を有する核酸を
本発明では基本的に非天然型核酸と言う。生体内におい
ても微量ではあるが、天然型以外の核酸が存在し、これ
らの核酸は修飾型と呼ばれ非天然型核酸に分類される。
取込み可能であり、かつ生標的個体内の分解酵素による
分解を受けにくい構造を有する非天然型核酸部分を有す
る。前述のようにプローブの核酸部分が天然型である
と、細胞膜や核膜を通過しにくくなり、また生標的個体
内での分解を受けやい。本発明において、天然型核酸と
は、ＤＮＡの場合、２’−デオキシリボヌクレオチドが
３’→５’リン酸ジエステル結合を介して結合している
ものをいう。ＲＮＡの場合は、リボヌクレオチドが３’
→５’リン酸ジエステル結合を介して結合しているもの
をいう。これら天然型の核酸以外の構造を有する核酸を
本発明では基本的に非天然型核酸と言う。生体内におい
ても微量ではあるが、天然型以外の核酸が存在し、これ
らの核酸は修飾型と呼ばれ非天然型核酸に分類される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】本発明におけるプローブの標識部分として
は、標的個体の生きた状態での検出を可能とするもので
あれば特に制限はないが、色素や蛍光色素を利用するこ
とができる。標識の選択に当っては、例えば、以下のよ
うな点を考慮すると良い。 Ａ）核酸部分と同様に、この標識部分もまた生標的個体
に対して無毒である必要があり、例えば、シアニン系色
素やアズレン系色素あるいはピリリウム系色素で生体に
対する毒性を示さないものが利用できる。 Ｂ）蛍光色素を利用する場合、生標的個体自体や検出系
に存在する物質による励起光の吸収や蛍光によるバック
グランドの上昇によって検出感度が低下することを避け
るために、標識以外の物質による励起光の吸収や蛍光の
検出への影響がない、あるいはそれが問題とならない励
起波長の蛍光色素を選択するのが好ましい。このような
蛍光色素としては、例えば、６００〜１０００ｎｍの近
赤外の波長領域に吸収、蛍光を有する蛍光色素を挙げる
ことができる。なお、１０００ｎｍを超える波長領域に
吸収を持つ色素を標識とした場合、吸収によって発熱を
おこす場合があるので好ましくない。前記シアニン系色
素やアズレン系色素あるいはピリリウム系色素には、６
００〜１０００ｎｍの波長領域に吸収及び蛍光を有する
ものが多く、この意味でもこれらの色素を用いることは
有利である。
は、標的個体の生きた状態での検出を可能とするもので
あれば特に制限はないが、色素や蛍光色素を利用するこ
とができる。標識の選択に当っては、例えば、以下のよ
うな点を考慮すると良い。 Ａ）核酸部分と同様に、この標識部分もまた生標的個体
に対して無毒である必要があり、例えば、シアニン系色
素やアズレン系色素あるいはピリリウム系色素で生体に
対する毒性を示さないものが利用できる。 Ｂ）蛍光色素を利用する場合、生標的個体自体や検出系
に存在する物質による励起光の吸収や蛍光によるバック
グランドの上昇によって検出感度が低下することを避け
るために、標識以外の物質による励起光の吸収や蛍光の
検出への影響がない、あるいはそれが問題とならない励
起波長の蛍光色素を選択するのが好ましい。このような
蛍光色素としては、例えば、６００〜１０００ｎｍの近
赤外の波長領域に吸収、蛍光を有する蛍光色素を挙げる
ことができる。なお、１０００ｎｍを超える波長領域に
吸収を持つ色素を標識とした場合、吸収によって発熱を
おこす場合があるので好ましくない。前記シアニン系色
素やアズレン系色素あるいはピリリウム系色素には、６
００〜１０００ｎｍの波長領域に吸収及び蛍光を有する
ものが多く、この意味でもこれらの色素を用いることは
有利である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】プローブと標的核酸とのハイブリッド体を
有する生標的個体を検出する方法は、プローブに結合さ
せた標識に応じて選択する。標識として蛍光色素を利用
した場合には、大量に存在する標的でない生個体から生
標的個体を効率良く区別できるという点からフローサイ
トメトリー法が有利である。この際、前述した６００〜
１０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する
色素を使用すればフローサイトメーター（ＦＣＭ）の光
源として半導体レーザー装置、Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
等の小型で安価なレーザー装置を利用できるという利点
もある。生標的個体をプローブで標識し、その検出にＦ
ＣＭを利用することにより、例えば、生体や土壌中等の
環境から抽出した生標的個体を速やかに検出し、その数
を計測することが可能となる。
有する生標的個体を検出する方法は、プローブに結合さ
せた標識に応じて選択する。標識として蛍光色素を利用
した場合には、大量に存在する標的でない生個体から生
標的個体を効率良く区別できるという点からフローサイ
トメトリー法が有利である。この際、前述した６００〜
１０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する
色素を使用すればフローサイトメーター（ＦＣＭ）の光
源として半導体レーザー装置、Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
等の小型で安価なレーザー装置を利用できるという利点
もある。生標的個体をプローブで標識し、その検出にＦ
ＣＭを利用することにより、例えば、生体や土壌中等の
環境から抽出した生標的個体を速やかに検出し、その数
を計測することが可能となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】実施例１ （１）ホスホロチオエート型非天然型核酸（ＤＮＡ）の
合成 Ｈｅｌａ細胞のβ−アクチンｍＲＮＡの有する塩基配列
の一部に相補的な以下に示す塩基配列を有する２０量体
全ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社
製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。更に
このオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノモディファ
イアー（Ｃ６）（グレン・リサーチ社製）を自動合成機
上で結合した。 ５’ＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣ ３’ （下線部は制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位であ
る。） （２）シアニン色素のスクシイミドエステル化 アルゴン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器にカル
ボキシル基を有するシアニン色素 ＮＫ−３６６９（日
本感光色素）０．５ｇを乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに溶解させ
た。これを−１０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジスクシ
イミジルカーボネート０．４ｇを添加した。同温度で５
時間反応させた後、クロロホルム１５０ｍｌに反応液を
注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗浄してから、水洗
後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム
で精製後、エタノール−イソプロピルエーテル中で結晶
させて、シアニン色素のスクシイミドエステルの結晶
０．２ｇを得た。 （３）非天然型オリゴヌクレオチドとシアニン色素の結
合 先の（１）で合成した全ホスホロチオエート型オリゴヌ
クレオチド０．１μｍｏｌを水７００μｌに溶解した。
この溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）
を加え、更に、（２）で合成したシアニン色素のスクシ
イミドエステル１ｍｇのＤＭＦ溶液２００μｌを攪拌下
徐々に加えた後、４０℃で２４時間反応させた。次に、
この反応液からゲル濾過カラムＮＡＰ−２５で過剰な色
素を除去し、ＲＰＬＣで精製して、７５ｎｍｏｌのシア
ニン色素結合ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド
を得た。このヌクレオチドをプローブ（Ｉ）として以下
の操作に用いた。 （４）酵素消化 プローブ（Ｉ）の１００ｐｍｏｌの所定のプロトコール
に従ったＳ１ヌクレアーゼでの１時間消化反応を行っ
た。反応液のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
の結果、プローブ（Ｉ）はＳ１ヌクレアーゼで消化され
ないことがわかった。次に、プローブ（Ｉ）と相補的な
天然型オリゴヌクレオチド（ｉ）をＡＢＩ社製３８１Ａ
ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、この天然型オリゴ
ヌクレオチド（ｉ）とプローブ（Ｉ）とをハイブリダイ
ズさせて得られたハイブリッド体に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖでの所定のプロトコールに従った１時間の消化反応を
行った。反応終了後、反応液のＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、このハイブリッド体はＥｃｏＲＶでは切断されない
ことがわかった。 （５）ハイブリダイゼーション ＨｅＬａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個
／枚となるようにディシュに蒔いた。３７℃で３６時間
培養した後、プローブ（Ｉ）を１０ｎＭの濃度で含むＭ
ＥＭ培地と交換し、引き続き２４時間培養した。つい
で、プローブ（Ｉ）を含まないＭＥＭ培地に交換して１
２時間培養する操作を２回繰り返した後、ＰＢＳ（−）
で二回洗浄してから、０．００１％トリプシン、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で更に処理した後、遠心
して細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ（−）に懸
濁して得た細胞懸濁液を以下の（６）のＦＣＭによる計
測に用いた。 （６）ＦＣＭ計測 用いたＦＣＭは光源を波長７８０ｎｍの半導体レーザー
仕様としたもので、蛍光の計測にはプローブ（Ｉ）の有
するシアニン色素標識の８３０ｎｍの蛍光波長を９０％
以上透過するフィルターを用いた。
合成 Ｈｅｌａ細胞のβ−アクチンｍＲＮＡの有する塩基配列
の一部に相補的な以下に示す塩基配列を有する２０量体
全ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社
製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。更に
このオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノモディファ
イアー（Ｃ６）（グレン・リサーチ社製）を自動合成機
上で結合した。 ５’ＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣ ３’ （下線部は制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位であ
る。） （２）シアニン色素のスクシイミドエステル化 アルゴン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器にカル
ボキシル基を有するシアニン色素 ＮＫ−３６６９（日
本感光色素）０．５ｇを乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに溶解させ
た。これを−１０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジスクシ
イミジルカーボネート０．４ｇを添加した。同温度で５
時間反応させた後、クロロホルム１５０ｍｌに反応液を
注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗浄してから、水洗
後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラム
で精製後、エタノール−イソプロピルエーテル中で結晶
させて、シアニン色素のスクシイミドエステルの結晶
０．２ｇを得た。 （３）非天然型オリゴヌクレオチドとシアニン色素の結
合 先の（１）で合成した全ホスホロチオエート型オリゴヌ
クレオチド０．１μｍｏｌを水７００μｌに溶解した。
この溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）
を加え、更に、（２）で合成したシアニン色素のスクシ
イミドエステル１ｍｇのＤＭＦ溶液２００μｌを攪拌下
徐々に加えた後、４０℃で２４時間反応させた。次に、
この反応液からゲル濾過カラムＮＡＰ−２５で過剰な色
素を除去し、ＲＰＬＣで精製して、７５ｎｍｏｌのシア
ニン色素結合ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド
を得た。このヌクレオチドをプローブ（Ｉ）として以下
の操作に用いた。 （４）酵素消化 プローブ（Ｉ）の１００ｐｍｏｌの所定のプロトコール
に従ったＳ１ヌクレアーゼでの１時間消化反応を行っ
た。反応液のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
の結果、プローブ（Ｉ）はＳ１ヌクレアーゼで消化され
ないことがわかった。次に、プローブ（Ｉ）と相補的な
天然型オリゴヌクレオチド（ｉ）をＡＢＩ社製３８１Ａ
ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、この天然型オリゴ
ヌクレオチド（ｉ）とプローブ（Ｉ）とをハイブリダイ
ズさせて得られたハイブリッド体に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖでの所定のプロトコールに従った１時間の消化反応を
行った。反応終了後、反応液のＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、このハイブリッド体はＥｃｏＲＶでは切断されない
ことがわかった。 （５）ハイブリダイゼーション ＨｅＬａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個
／枚となるようにディシュに蒔いた。３７℃で３６時間
培養した後、プローブ（Ｉ）を１０ｎＭの濃度で含むＭ
ＥＭ培地と交換し、引き続き２４時間培養した。つい
で、プローブ（Ｉ）を含まないＭＥＭ培地に交換して１
２時間培養する操作を２回繰り返した後、ＰＢＳ（−）
で二回洗浄してから、０．００１％トリプシン、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で更に処理した後、遠心
して細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ（−）に懸
濁して得た細胞懸濁液を以下の（６）のＦＣＭによる計
測に用いた。 （６）ＦＣＭ計測 用いたＦＣＭは光源を波長７８０ｎｍの半導体レーザー
仕様としたもので、蛍光の計測にはプローブ（Ｉ）の有
するシアニン色素標識の８３０ｎｍの蛍光波長を９０％
以上透過するフィルターを用いた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】
【表１】 表１の結果から、インターカレーターとしての蛍光色素
であるアクリジンを標識として用いた場合の方が、細胞
中で標的核酸とプローブとのハイブリッド体が安定に維
持されるので、安定した測定が行えることがわかった。
であるアクリジンを標識として用いた場合の方が、細胞
中で標的核酸とプローブとのハイブリッド体が安定に維
持されるので、安定した測定が行えることがわかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 富田 佳紀 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内
Claims (28)
- 【請求項１】 検出すべき生標的個体中の標的核酸が有
する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、該生標的個体
が取込み可能な非天然型核酸と、該核酸に結合した標識
物質とを有するプローブと、試料とを反応させる過程
と、該試料に前記生標的個体が存在する場合に、該生標
的個体中に取込まれて標的核酸とハイブリダイズしたプ
ローブを該プローブの有する標識物質を利用して検出す
る過程とを有することを特徴とする生個体の検出方法。 - 【請求項２】 生個体が、生細胞または生微生物である
請求項１に記載の検出方法。 - 【請求項３】 プローブが水溶性である請求項１または
２に記載の検出方法。 - 【請求項４】 プローブが細胞膜あるいは核膜を容易に
通過できる構造を有する請求項１または２に記載の検出
方法。 - 【請求項５】 プローブが核酸分解酵素により分解され
ない構造を有する請求項１〜４のいずれかに記載の検出
方法。 - 【請求項６】 プローブが生個体に対する毒性を持たな
いものである請求項１〜５のいずれかに記載の検出方
法。 - 【請求項７】 標識物質が色素である請求項１〜６のい
ずれかに記載の検出方法。 - 【請求項８】 色素が蛍光色素である請求項７に記載の
検出方法。 - 【請求項９】 蛍光色素が６００ｎｍ以上、１０００ｎ
ｍ以下の近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する請求項
８に記載の検出方法。 - 【請求項１０】 蛍光色素が核酸塩基対間に対するイン
ターカレーターである請求項１〜９のいずれかに記載の
検出方法。 - 【請求項１１】 蛍光色素の検出をフローサイトメトリ
ーにより行う請求項８〜１０のいずれかに記載の検出方
法。 - 【請求項１２】 標的核酸がゲノムＤＮＡである請求項
１〜１１のいずれかに記載の検出方法。 - 【請求項１３】 標的核酸がリボゾームＲＮＡである請
求項１〜１２のいずれかに記載の検出方法。 - 【請求項１４】 標的核酸がメッセンジャーＲＮＡであ
る請求項１〜１３のいずれかに記載の検出方法。 - 【請求項１５】 検出すべき生標的個体中の標的核酸が
有する塩基配列に相補的な塩基配列を含み、該生標的個
体が取込み可能な非天然型核酸と、該核酸に結合した標
識物質とを有することを特徴とする標的核酸を有する生
個体検出用のプローブ。 - 【請求項１６】 生個体が、生細胞、生微生物または生
ウイルスである請求項１５に記載のプローブ。 - 【請求項１７】 水溶性である請求項１または２に記載
のプローブ。 - 【請求項１８】 生細胞または生微生物における細胞膜
あるいは核膜を容易に通過できる構造を有する請求項１
５または１６に記載のプローブ。 - 【請求項１９】 核酸分解酵素により分解されない構造
を有する請求項１５〜１８のいずれかに記載のプロー
ブ。 - 【請求項２０】 生個体に対する毒性を持たないもので
ある請求項１５〜１９のいずれかに記載のプローブ。 - 【請求項２１】 標識物質が色素である請求項１５〜２
１のいずれかに記載のプローブ。 - 【請求項２２】 色素が蛍光色素である請求項２１に記
載のプローブ。 - 【請求項２３】 蛍光色素が６００ｎｍ以上、１０００
ｎｍ以下の近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する請求
項２２に記載のプローブ。 - 【請求項２４】 蛍光色素が核酸塩基対間に対するイン
ターカレーターである請求項１５〜２３のいずれかに記
載のプローブ。 - 【請求項２５】 蛍光色素の検出をフローサイトメトリ
ーにより行う請求項２２〜２４のいずれかに記載のプロ
ーブ。 - 【請求項２６】 標的核酸がゲノムＤＮＡである請求項
１５〜２５のいずれかに記載のプローブ。 - 【請求項２７】 標的核酸がリボゾームＲＮＡである請
求項１５〜２６のいずれかに記載のプローブ。 - 【請求項２８】 標的核酸がメッセンジャーＲＮＡであ
る請求項１５〜２７のいずれかに記載のプローブ。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33186292A JP3495752B2 (ja) | 1992-12-11 | 1992-12-11 | 生標的個体の検出方法およびプローブ |
| US08/163,725 US5545521A (en) | 1992-12-11 | 1993-12-09 | Method for detecting bioindividuals by use of nonnatural type nucleic acid probe |
| DE69332016T DE69332016T2 (de) | 1992-12-11 | 1993-12-10 | Methode zum Nachweis von Bioindividuen mittels einer Nukleinsäureprobe nicht-natürlichen Typs und Probe zur Verwendung hierin |
| AT93119998T ATE219148T1 (de) | 1992-12-11 | 1993-12-10 | Methode zum nachweis von bioindividuen mittels einer nukleinsäureprobe nicht-natürlichen typs und probe zur verwendung hierin |
| EP93119998A EP0601606B1 (en) | 1992-12-11 | 1993-12-10 | Method for detecting bioindividuals by use of nonnatural type nucleic acid probe, and probe for use in it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33186292A JP3495752B2 (ja) | 1992-12-11 | 1992-12-11 | 生標的個体の検出方法およびプローブ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06178699A true JPH06178699A (ja) | 1994-06-28 |
| JP3495752B2 JP3495752B2 (ja) | 2004-02-09 |
Family
ID=18248484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33186292A Expired - Fee Related JP3495752B2 (ja) | 1992-12-11 | 1992-12-11 | 生標的個体の検出方法およびプローブ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5545521A (ja) |
| EP (1) | EP0601606B1 (ja) |
| JP (1) | JP3495752B2 (ja) |
| AT (1) | ATE219148T1 (ja) |
| DE (1) | DE69332016T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017101975A (ja) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | シスメックス株式会社 | 細胞選択方法、細胞検出方法、細胞選択装置、および細胞検出装置 |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0837141B1 (en) | 1996-10-03 | 2003-01-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for detecting target nucleic acid, process for quantifying the same, and pyrylium compound for chemiluminescence analysis |
| US5804448A (en) * | 1996-10-29 | 1998-09-08 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Method of staining cellular material and analyzing the same |
| AU2003225763A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-29 | Visen Medical, Inc. | Optical imaging probes |
| US20070105100A1 (en) * | 2003-04-28 | 2007-05-10 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for assay of nucleic acids by competitive hybridization using a dna microarray |
| JP4458327B2 (ja) * | 2003-08-28 | 2010-04-28 | キヤノン株式会社 | 標的物質の定量方法および該方法に用いるプローブ担体 |
| JP4541731B2 (ja) * | 2004-03-12 | 2010-09-08 | キヤノン株式会社 | 核酸検出方法 |
| JP2006094760A (ja) * | 2004-09-29 | 2006-04-13 | Canon Inc | 細胞のスクリーニング方法および口腔癌細胞検出方法 |
| JP4385938B2 (ja) * | 2004-12-15 | 2009-12-16 | セイコーエプソン株式会社 | アクチュエータ |
| US8535914B2 (en) * | 2005-01-21 | 2013-09-17 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set and information acquisition method using the same |
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| US7642086B2 (en) * | 2005-08-09 | 2010-01-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Labeled probe bound object, method for producing the same and method for using the same |
| US20090011413A1 (en) * | 2005-12-14 | 2009-01-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for screening colon cancer cells and gene set used for examination of colon cancer |
| WO2007114517A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
| US8133668B2 (en) * | 2006-03-31 | 2012-03-13 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method |
| WO2010006616A2 (en) | 2008-07-14 | 2010-01-21 | Chemometec A/S | Method and kit for examination of cells using n-(9-acridinyl)maleimide (nam) or using 7-diethylamino-3-((4'-(iodoacetyl)amino)phenyl)-4-methylcoumarin (cpi) |
| EP2312943B1 (en) | 2008-07-14 | 2019-11-06 | Chemometec A/S | Method for assessing viable cells and the use of n-(7-dimethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)-maleimide (dacm) or n-(9-acridinyl)maleimide (nam) for assessment of apoptosis. |
| JP5729904B2 (ja) | 2009-06-02 | 2015-06-03 | キヤノン株式会社 | 細胞から蛋白質、ｄｎａ、ｒｎａを調製する方法 |
| CN108061794B (zh) * | 2017-12-25 | 2020-03-27 | 苏州大学 | 一种无染色、无探针、无损检测细胞或类细胞结构微生物的类型及其周期的方法 |
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| US4336029A (en) * | 1980-08-15 | 1982-06-22 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood |
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-
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- 1992-12-11 JP JP33186292A patent/JP3495752B2/ja not_active Expired - Fee Related
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1993
- 1993-12-09 US US08/163,725 patent/US5545521A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-10 DE DE69332016T patent/DE69332016T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-10 EP EP93119998A patent/EP0601606B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-10 AT AT93119998T patent/ATE219148T1/de not_active IP Right Cessation
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| US5545521A (en) | 1996-08-13 |
| EP0601606A1 (en) | 1994-06-15 |
| JP3495752B2 (ja) | 2004-02-09 |
| DE69332016T2 (de) | 2002-11-21 |
| ATE219148T1 (de) | 2002-06-15 |
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