JP4035589B2 - 修飾バックボーンを有するアンチセンスプローブと核酸の液中ハイブリッド形成 - Google Patents
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Description
発明の背景
1. 発明の分野
本発明は、アンチセンスプローブの結合特性を変更するように修飾されたバックボーンを有するアンチセンスプローブを用いて溶液中のヌクレオチドを配列決定するまたは検定する方法に関する。特に、本発明は、非修飾DNA/RNA(すなわち、純粋にホスホジエステル)プローブほどアニオンではない部分アニオンアンチセンスプローブを用いて、または非イオンアンチセンスプローブを用いて溶液中のヌクレオチドを配列決定するまたは検定する方法に関する。
【0002】
2. 関連技術の説明
修飾バックボーンを有するDNA/RNA類似体は、治療薬および診断薬を含めたいろいろな場合に用いられている。治療薬の場合、オリゴヌクレオチドの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を増大させ、それによって in vivo でのオリゴヌクレオチドの寿命を増加させる要求によって主に動機付けられている。これら修飾は、概して、糖−ホスフェートバックボーンのリン原子上で起こって、本来のホスホジエステルバックボーンを他の形に変換している。ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホルアミデートおよびホスホトリエステルは、様々なレベルのヌクレアーゼ耐性を与えると報告されているが、しかしながら、ホスフェート修飾オリゴヌクレオチドは、概して、下位ハイブリッド形成性(inferior hybridization properties)を欠点として持つということが報告されている。例えば、Cohen,J.S. 監修,Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression,(CRC Press, inc., Boca Raton Fla., 1989)および Cook らの米国特許第5,610,289号を参照されたい。
【0003】
下位ハイブリッド形成性のこのような報告にもかかわらず、ハイブリッド形成効率は、オリゴヌクレオチドプローブ上の陰電荷を除去し(または陽電荷プローブを与える追加の工程を行い)、それによってプローブと陰電荷標的との間の好ましくない電子相互作用をなくすことによって改善されうると理論付けられている。したがって、DNA/RNA類似体技術の多くは、非イオンおよび陽イオンの類似体を用いるハイブリッド形成に集中している。例えば、Teng らの米国特許第5,677,437号、Cook らの同第5,623,065号、Sanghvi らの同第5,618,704号、Mesmaeker らの同第5,602,240号、Cook らの同第5,587,469号、Cook らの同第5,541,307号、Summerton らの同第5,521,063号、Summerton らの同第5,470,974号、Summerton らの同第5,405,938号、Cook らの同第5,223,618号、Engels らの同第5,166,330号、Summerton らの同第5,166,315号、Summerton らの同第5,142,047号および Ts'o らの同第4,469,863号を参照されたい。
【0004】
ペプチド核酸(PNA)は、非イオンDNA/RNA類似体の一例である。例えば、Nielsen らの米国特許第5,539,082号を参照されたい。PNA配列を含むアンチセンスプローブは、標的ヌクレオチド配列を検出するのに用いられている。例えば、Cantor らの米国特許第5,503,980号には、二本鎖部分に隣接した一本鎖部分内に、無作為であるが決定可能な塩基配列を含有する一組のPNAプローブと核酸をハイブリッド形成させることによってその核酸を配列決定する方法でPNAプローブを用いることが示唆されており、この場合、その組の一本鎖部分は、好ましくは、所定の範囲にわたって可能な配列組合せを全て含む。ハイブリッド形成は、プローブの一本鎖部分と標的の一本鎖部分の相補性認識によって起こり、そのプローブの隣接二本鎖性の存在によって熱力学的に好ましい。
【0005】
しかしながら、Cantor らは、それら核酸はPNAでありうるということを開示しているが、固体支持体の不存在下におけるこのようなプローブの利用を開示してもいないし示唆してもいない。更に、本発明は、試験されるDNA材料の隣接構築物を必要としない。
【0006】
Cantor のような固体支持体の使用の教示の他に、Perry-O'Keefe ら,“Peptide Nucleic Acid Pre-Gel Hybridization: An Alternative to Southern Hybridization,”93 Pro.Natl.Acad.Sci. USA 14670(1996年12月)も、PNAが、概して、二本鎖DNA(dsDNA)に充分に結合しないことを教示している。Perry-O'Keefe らの14673頁脚注を参照されたい。更に、dsDNAを充分に結合することが判っているホモピリミジンPNA構築物は、プローブとして有用ではないと考えられる。出願人は、ホモピリミジンだけが鎖侵入(invasion)によってdsDNAと結合しうるということを示唆している条件は正しくないし、用いられるハイブリッド形成条件によるということを発見している。
【0007】
Smulevitch ら,“Enhancement of Strand Invasion by Oligonucleotides Through Manipulation of Backbone Charge,”14 Nature Biotechnology 1700(1996年12月)(Landsdorp,“Close Encounters of the PNA Kind,”14 Nature Biotechnology 1653(1996年12月)に開示される)は、dsDNAとハイブリッド形成するPNAプライマーの使用を開示している。しかしながら、Smulevitch らは、ハイブリッド形成を検出する場合のゲルの使用を教示しているが、蛍光標識の使用を示唆してはいない。
【0008】
試料分析の多くの種類は、標識の蛍光性に頼っている。蛍光は、一つの波長の光によって励起した分子が、より長い波長の光を発することによって、励起していない(基底)状態に戻る時に生じる。異なった波長による励起および発光は光学フィルター、カメラまたはCCDを用いて互いに分離することができる。蛍光は、長年の間、光学顕微鏡によっていくつかの分子(およびしたがって構造)を可視化するのに用いられているが、フローサイトメトリーのような他の分析技術においても用いられる。更に、異なった色を示す蛍光の発光は、目視、カメラ、電荷転送デバイス(CCD)または光電子増倍管によって検出することができる。
【0009】
例えば、Dykstra らの米国特許第5,594,138号には、核酸の蛍光検出法が開示されている。その方法は、ビスジカチオンアリールフラン化合物である蛍光標識と核酸を接触させ、その核酸を、蛍光標識の蛍光を生じさせる周波数で光に暴露することを含む。その蛍光標識は、ハイブリッド形成実験用のプローブとしてのヌクレオチド配列に結合することができるし、または in situ 標識実験の多数の試薬に結合することができる。ハイブリッド形成は、固体支持体上で起こる。
【0010】
Tchen の米国特許第4,963,477号には、特異的抗体によって認識されうる修飾核酸を含有する高感受性のプローブが開示されている。
【0011】
蛍光 in situ ハイブリッド形成法(FISH)は、スライドガラスのような固体支持体にDNAを結合することによってヒト染色体に結合する蛍光プローブを検出することを含む技法である。例えば、K.H.Andy Choo, 監修,“In Situ Hybridization Protocols,”第2および4章(Humana Press, Totowa, NJ,1994)を参照されたい。プローブとのハイブリッド形成を含む全ての他の慣用的な検出法と同様に、この方法は、DNAの二つの相補鎖を別々に保持する固体支持体に頼るが、そのプローブは、それら鎖の一方とハイブリッド形成する。更に、FISHは、複雑な緩衝液および温度制御プロトコールを一晩インキュベーションと共に必要とする。
【0012】
Livak らの米国特許第5,538,848号および Maggio の同第4,220,450号には、溶液中でオリゴヌクレオチドプローブを用いる蛍光に基づいたヌクレオチド配列検出が開示されているが、しかしながら、これら特許は、ハイブリッド形成したプローブによって生じるシグナルとハイブリッド形成していないプローブによって生じるシグナルとを区別するように、レポーティング剤と組み合わせた消光剤の使用を必要とする。Livak らは、その開示された方法において、酵素の使用も必要とする。消光剤および酵素は、それら方法の複雑さおよび費用を大きくする。
【0013】
Kidwell の米国特許第5,332,659号には、少なくとも二つの発蛍光団残基を含むプローブを用いて溶液中でヌクレオチド配列を検出する方法が開示されている。それら発蛍光団は、それらのスペクトルの波長依存状態を変化させるように充分に接近した場合に、互いに電子相互作用するように選択されるべきである。標的配列にハイブリッド形成していないプローブは、ハイブリッド形成したプローブよりもはるかに柔軟性であり、結果として、それぞれのプローブ上の二つの発蛍光団残基は、そのプローブがハイブリッド形成しない場合、プローブがハイブリッド形成する場合よりも互いに接近していると考えられる。したがって、フリーのプローブと相関する発光波長の変化は、試料中のフリーのプローブの量の指標として監視することができる。
【0014】
Zarling らの米国特許第5,674,698号には、励起周波数より高い周波数でおよび励起波長より低い波長で蛍光を発する“アップコンバーティング(up-converting)”標識の使用を含む蛍光検定法が開示されている。Zarling らは、不充分なシグナル−ノイズ比のために、ダウンコンバーティング(down-converting)標識(すなわち、励起周波数より低い周波数でおよび励起波長より高い波長で蛍光を発する標識)を用いる検定とは別に、強く教示している。
【0015】
本発明までは、しかしながら、試料を破壊しない、放射線に基づいた検定よりも実験者への危険が少ない、ハイブリッド形成複合体からハイブリッド形成していないプローブを分離する費用および遅れを必要としない、消光剤の用意を必要としない、酵素の用意を必要としない、それぞれのプローブ上のまたはその付近の多数の相互作用性レポーティング残基の用意を必要としない、アップコンバーティング標識の用意を必要としない、そして容易に自動化される方法を用いて溶液中のヌクレオチドの存在について迅速に試験することは不可能であった。突然変異遺伝子配列の時間および原価効率の良い検出は、突然変異体遺伝子型を変化した表現型と相関させる場合の律速段階となっている。慣用的なDNA配列決定法は、突然変異を識別する最も正確な手段であると考えられているが、これら方法は、比較的遅く且つ労力を要しており、医学的診断、ゲノムの配列決定および地図作製を含めた目的のために、ゲノムDNAの多数の試料を迅速にスクリーニングするのに特に充分に適するわけではない。
【0016】
本明細書中に引用される参考文献および先行特許出願はいずれも、本明細書中にそのまま援用される。
【0017】
(発明の概要)
本発明は、流体媒質中の少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸塩基含有ターゲット配列の検出方法であって、
前記流体媒質に前記少なくとも1つのターゲット配列とハイブリダイゼーション複合体(hybridization complex)を形成することができるアンチセンス・プローブを加える工程であって、前記アンチセンス・プローブが匹敵するホスホジエステル・バックボーンよりも小さい陰性である電荷を有するバックボーンを含む前記工程と;
前記ハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないアンチセンス・プローブを分離して、試験媒質を形成する工程と;
前記試験媒質に、前記ハイブリダイゼーション複合体中の蛍光マーカーを励起させて、前記蛍光マーカーに蛍光を放出させる波長を有するレーザー・ビームを照射する工程と;
前記放出蛍光の強度を測定する工程と;
前記測定強度を基準強度と比較して、前記流体媒質が前記少なくとも1つのターゲット配列を含有するかどうかを検出する工程と
を含み、
前記測定強度が前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数に、0塩基ミスマッチ(0を含む)から少なくとも3塩基ミスマッチまでの範囲にわたって逆比例し、前記分離工程以外の前記方法が前記アンチセンス・プローブ、前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列又は前記ハイブリダイゼーション複合体のいずれも固体サポート又はゲルに結合させることなく完全に行われる前記方法を提供する。
【0018】
さらに、流体媒質中の少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸塩基含有ターゲット配列の検出方法であって、
前記流体媒質に前記少なくとも1つのターゲット配列とハイブリダイゼーション複合体を形成することができるアンチセンス・プローブを加える工程であって、前記アンチセンス・プローブが匹敵するホスホジエステル・バックボーンよりも小さい陰性である電荷を有するバックボーンを含む前記工程と;
前記流体媒質に、前記ハイブリダイゼーション複合体中の蛍光マーカーを励起させて、前記蛍光マーカーに蛍光を放出させる波長を有するレーザー・ビームを照射する工程と;
前記放出蛍光の強度を測定する工程と;
前記測定強度を基準強度と比較して、前記流体媒質が前記少なくとも1つのターゲット配列を含有するかどうかを検出する工程と
を含み、
前記測定強度が前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数に、0塩基ミスマッチ(0を含む)から少なくとも3塩基ミスマッチまでの範囲にわたって比例し、前記方法が前記シグナル検出の前にハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないプローブを分離せずに、及び前記アンチセンス・プローブに又は前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列にシグナル消光剤(signal quenching agent)を供給せずに行われる前記方法を提供する。
【0019】
したがって、本発明は、アンチセンス・プローブのレーザー誘導蛍光を用いて、流体媒質中の核酸塩基含有配列を迅速に、経済的にかつ効率的に配列決定し、分析するための方法であって、それを用いて、ターゲット核酸塩基含有配列を検出し、折りたたみ核酸塩基含有配列中のアクセス可能な領域を同定し、ハイブリダイゼーション複合体中のミスマッチ対の数を測定し、複数のプローブによってゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってゲノム・マッピングすることができる前記方法を提供する。
【0020】
これらの方法は、シグナル検出の前にハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないプローブを分離せずに、プローブ若しくは核酸塩基含有配列上に若しくはその近くにシグナル消光剤を供給せずに、酵素を用いずに又はアップ−コンバーティング・ラベルを用いずに行うことができる。
【0021】
(定義)
本明細書に用いた用語は一般に慣用的使用に従うものであるが、本発明の範囲の定義を助けるために用いた特定の用語の意味に関する何らかの疑いを除去するために、下記定義を提供する。
【0022】
本明細書で用いる“核酸塩基含有配列”なる用語は、例えばDNA、RNA、修飾核酸配列及びPNAを包含する。この用語はDNA及び/又はRNAの相補的(又は部分的相補的)セグメントに対する塩基対合を介して特異的にハイブリダイズすることができる、あらゆる分子を包含するように意図される。
【0023】
本明細書で用いる“アンチセンス・プローブ”なる用語は、該プローブの塩基配列に相補的な塩基配列を有する他の核酸塩基含有配列に特異的に結合することができる、任意の核酸塩基含有配列を包含する。本発明のアンチセンス・プローブは例えばdsDNAのいずれかの鎖に相補的でありうる。
【0024】
ホスホジエステル・バックボーンを有する非修飾ヌクレオチド配列は修飾バックボーンを有する核酸塩基含有配列に、両方の配列が同じ塩基配列(base sequencing)を有するならば、“比較可能”である。したがって、このような配列のバックボーンも比較可能である。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、好ましくは、陰性電荷が減少している陰イオン性アンチセンスプローブを利用し、試料中の核酸塩基含有配列を検出しおよび/または性質決定する。
【0025】
本発明の陰イオン性プローブは、少なくとも1つの、そして好ましくはすべてより少ない、プローブの陰性荷電ホスフェート基を中性基で置換することにより、陰性電荷が減少している。好ましくは、プローブのホスフェート基の約半数が中性基で置換されており、より好ましくは、プローブのホスフェート基の約4分の1が中性基で置換されている。
【0026】
天然ホスフェート基に対し置換される中性基は、メチルホスホネート基であることが好ましい;しかし、他の置換基も本発明の範囲内であり、アミノエチルホスホネート類、ヒドロキシメチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、s−メチルホスホロチオエート類、ホスホロアミダイト類、およびそれらに匹敵するものが含まれる。こうしたバックボーン置換を行うのに適した方法が当業に知られる。
【0027】
プローブは、中性基で、均質にまたは不均質に置換されていてもよい。均質置換計画では、プローブに対し1種類のバックボーン修飾のみが行われるであろう。例えば、均質置換では、プローブに対する唯一の修飾は、ホスフェート基に対するメチルホスホネート基の置換である可能性がある一方、不均質置換では、プローブは、メチルホスホネート化DNAのセグメントに連結しているPNAのセグメントを含む可能性がある。
【0028】
8ないし20塩基のいかなる長さでもよい長さを有するプローブ配列が好ましい。これは、この長さが、原核生物および真核生物の最小の特有DNA/RNA配列が見られる範囲であるためである。少なくとも18塩基のプローブが特に好ましい。これは、この長さが、ヒトゲノムにおける最小の特有配列の長さであるためである。しかし、合わせて核酸塩基含有配列を特異的に同定する、複数の非特有ターゲット配列を有する核酸塩基含有配列を検出するのに、複数のより短いプローブを用いてもよい。
【0029】
少なくとも、PNAを含む本発明のプローブは、dsDNAと三重鎖複合体を、そしてRNAまたはssDNAと二重鎖複合体を形成することが可能である。こうしたプローブはまた、第一のプローブがRNAまたはssDNAと結合し、そして第二のssDNA鎖が、生じた二重鎖複合体と結合する、三重鎖複合体を形成することも可能である。例えばEgholmら, “PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson−Crick Hydrogen−Bonding Rules,” 365 Nature 566(1993)、およびTomacら, “Ionic Effects on the Stability and Conformation of Peptide Nucleic Acid Complexes,” 118 J. Am. Chem. Soc. 5544(1996)を参照されたい。
【0030】
本発明のプローブにおいて、バックボーンに結合している塩基は、主に、プローブ製造に必要な位で結合している天然発生核酸塩基である。あるいは、該塩基は非天然発生核酸塩基(核酸塩基類似体(analog))、他の塩基結合部分、芳香族部分、(C1−C4)アルカノイル類、水酸基または水素であってもよい。核酸塩基という用語は、除去可能な保護基を持つ核酸塩基を含むことが理解されるであろう。さらに、バックボーン上の少なくとも1つの塩基は、DNA挿入剤(intercalator)、レポーターリガンド、例えばフルオロフォア、放射標識、スピン標識、ハプテン、またはタンパク質認識リガンド、例えばビオチンで、置き換えられ、または置換されていてもよい。好ましい検出可能標識には、放射性同位体、安定同位体、酵素、蛍光化学薬品、発光化学薬品、発色化学薬品、金属、電荷、または空間構造が含まれる。
【0031】
特に好ましい態様において、プローブは、レーザー照射された際、蛍光を発する蛍光マーカーに共有結合しているアンチセンス配列を含む。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミンおよびフルオレセインが含まれる。
【0032】
ハイブリダイズしていないプローブを、プローブ/ターゲットハイブリダイゼーション複合体から分離する、本発明の態様において、ハイブリダイゼーション溶液の蛍光強度は、好ましくは0塩基ミスマッチ(0を含む)から少なくとも3塩基ミスマッチの範囲に渡り、プローブおよびターゲットの間のミスマッチ数に反比例する。
【0033】
蛍光を測定する前に、ハイブリダイズしていないプローブを、ハイブリダイゼーション複合体から分離しない、本発明の態様において、蛍光強度は、溶液中の遊離プローブの量に、そしてプローブおよびターゲットの間のミスマッチ数に比例し、そして溶液中のハイブリダイズしているプローブの量に反比例する。すなわち、プローブおよびターゲット配列のハイブリダイゼーションに関連する消光効果がある。消光効果は、選択したマーカーで異なる。この効果により、本発明の方法が、例えばLivakらおよびMaggio、上記に必要とされるような、プローブ上の(ハイブリダイズしていないプローブのシグナルを消光する)、またはターゲット配列上の(ハイブリダイズしているプローブのシグナルを消光する)消光剤を使用することなく、ハイブリダイゼーションを検出することが可能になる。
【0034】
Kidwell、上記と異なり、本発明は、各プローブ上に電子的に相互作用する複数のフルオロフォアを必要としない。これは本発明により検出される蛍光強度消光効果が、隣接フルオロフォアの間の分子内エキシマー形成により引き起こされる、Kidwellで検出される、発光波長シフトと同じではないためである。本発明の消光効果は、プローブ当たり1つのみのフルオロフォアで明らかである(しかし、プローブ当たり複数のフルオロフォアが、特定の態様には意図される)。
【0035】
特定の態様では、蛍光マーカーは、プローブとの相互作用を最小にする短いリンカーで、プローブの5’末端に提供される。しかし、プローブ内のマーカーの位置は、特に重要ではないようである。
【0036】
2つの配列が単一の塩基ほどわずかに異なる場合、突然変異ヌクレオチド配列を、参照(reference)ヌクレオチド配列と区別するため、突然変異ヌクレオチドの突然変異部分が、プローブの中央に対応するように、プローブを設計するのが好ましい。この設計により、ヌクレオチドの突然変異部分がプローブの末端に対応する場合より高いハイブリダイゼーション収量および安定したハイブリッドを生じる。これは、プローブおよびヌクレオチドの間の結合ミスマッチがプローブ内の中央に位置するためである。
【0037】
プローブを、少なくとも1つのヌクレオチド配列、および/または少なくとも1つの配列の突然変異型を含むと疑われる流体媒体に添加する。該流体媒体は、ヌクレオチドまたは他の核酸塩基含有配列を保存するのに適していると知られる、いかなる慣用的な媒体であってもよい。例えば、Sambrookら, “Molecular Cloning: A Lab Manual,” 第二版(1989)を参照されたい。例えば、流体媒体は、ヌクレオチド、水、緩衝剤および界面活性剤を含む液体型であってもよい。
【0038】
流体媒体中のヌクレオチドは、自動化法を含む、いかなる慣用的な方法により、臨床試料から得てもよい。こうした方法の例は、例えばSambrookら, Vol.2, pp.9.16−9.19および7.6ないし7.7に要約されている。自動化核酸精製装置の例は、Quiagen(米国カリフォルニア州チャツワース)により製造されるBioRobot 9600である。
【0039】
例えば、多様な疾患が、個体ゲノムにおける突然変異DNAの存在と関連していることが知られる。野生型DNAおよび突然変異DNAの配列が知られている場合、慣用的な技術を用い、臨床試料からこれらのヌクレオチド配列を単離することが可能である。PCRは、臨床試料からヌクレオチドを増幅する、好ましい方法である。PCRは、野生型DNAおよび突然変異DNAを増幅することが可能なプライマーを用い、行う。
【0040】
核酸塩基含有配列を、既知の濃度で、流体媒体に添加する。これは、濃度が、本発明の方法の続く段階で生じるシグナル(例えば蛍光強度)の大きさに影響を及ぼす可能性があるためである。核酸塩基含有配列濃度は、例えば260 nmでUV吸収を測定することにより、測定してもよい。
【0041】
単離核酸塩基含有配列を流体媒体に添加し、そして検出前に変性させる。好ましくは、変性は、約90℃ないし約100℃で、約30秒ないし約5時間、アンチセンスプローブの存在下で行う。
【0042】
好ましくは、プローブを、検出しようとする核酸塩基含有配列の濃度の0.05ないし100倍の濃度で、流体媒体に添加する。
【0043】
相補塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電強度、および緩衝剤組成の変動を有する多様な条件下で起こる。これらの条件およびそれらを適用するための方法の例は、当業に知られる。例えば、Perry−O’Keefeら、Egholmら、Tomacら、Sambrookら, Vol.2, pp.9.47−9.55およびPerSeptive Biosystems MagazineのVol.4, No.3に解説されるプレゲルハイブリダイゼーション技術を参照されたい。
【0044】
ハイブリダイゼーション複合体が、約4℃ないし約75℃の温度で、約2分ないし約24時間形成されることが好ましい。プローブの存在下で、60分間以内で変性を行い、その後、急冷せず、温度を受動的に室温に冷却することが、特に好ましい。
【0045】
特定の試薬を用いることにより、溶液中のハイブリダイゼーションを容易にすることが可能である。これらの試薬の好ましい例には、一本鎖結合タンパク質、例えばRec Aタンパク質、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌(E. coli)一本鎖結合タンパク質、核酸主溝および副溝結合タンパク質、二価イオン、多価イオン、および挿入物質、例えばエチジウムブロミド、アクチノマイシンD、ソラレン、およびアンジェリシン(angelicin)が含まれる。
【0046】
本発明で使用するのに好ましいマーカーはフルオロフォアである。当業者に認識されるであろうように、蛍光マーカーの蛍光を誘導するために好ましく選択される波長は、当業に、「励起最大」として知られ、すなわち分子に吸収され、そしてより高い電子状態にその分子を励起する波長である。マーカー分子がより高い電子状態からより低い電子状態に通過する際、分子は、「発光最大」と称される波長で、一種の可視放射、すなわち蛍光を発する。本発明で検出されるのは、少なくともこの蛍光である。化合物により発せられる検出可能シグナルは、当業に知られる技術を用い、例えばヒトの眼での観察により、生じた波長を検出するための電子的手段(例えばカメラおよびCCD)を用い、およびそれらに匹敵するものにより、検出することが可能である。好都合には、蛍光の波長は、励起光のものから十分に移動しており、光学フィルターにより、2つの波長をよく分離するのを可能にする。Zarlingら、上記の解説と対照的に、本発明は、下方変換(down−converting)標識を用い、優れた蛍光データを得るのに十分に感度が高い。
【0047】
使用されているマーカーに対するこの励起最大に対応する、励起波長が選択され(日常的な実験および/または慣用的な知識による)、そして好ましくは200ないし1000 nmである。例えば、マーカーがフルオレセインである場合、励起の好ましい波長は、約488 nmである。蛍光色素は、好ましくは200ないし1000 nmの発光波長を有するよう、選択される。
【0048】
好ましい態様において、アルゴンイオンレーザーを用い、マーカーに、400ないし520 nmの範囲の波長を有する光を照射し、そして蛍光発光を500ないし750 nmの範囲で検出する。
【0049】
本発明の方法を実行するための装置は、流体媒体を含むための流体媒体容器;核酸塩基含有配列に照射するためのレーザー;レーザーにより誘導された蛍光を検出するためのCCD蛍光検出装置および/または光電子増倍管;蛍光検出装置により生成されたデータを解析するためのデータ解析装置;およびデータ解析装置により生成されたデータ解析を報告する出力装置を含んでもよい。
【0050】
特定の先行技術の方法とは異なり、本方法の特定の態様では、ハイブリダイゼーション複合体を非複合体化プローブから分離する必要がない。特定の先行技術の方法では、ハイブリダイズしていないプローブおよびハイブリダイズしているプローブは、シグナル対ノイズ比(すなわちハイブリダイズしていないプローブのシグナルまたはノイズに対するハイブリダイゼーション複合体シグナルの比)を亢進し、ハイブリダイゼーションの検出を可能にするため、分離しなければならない。この分離を伴わない方法では、ハイブリダイズしているプローブおよびハイブリダイズしていないプローブを分離する、付加的なやっかいな段階なしに、総シグナルの変化をモニターする。本発明者らは、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション効率の関数である、総シグナル強度の変化をモニターすることにより、ヌクレオチド配列情報を決定することが可能であることを発見してきている。
【0051】
特に、本発明者らは、シグナル消光効果がプローブ・ヌクレオチドハイブリダイゼーションに関連する、ここで未結合プローブのレーザー誘導蛍光の強度は、ヌクレオチド配列に結合している同じプローブのものを上回る、ことを発見してきている。したがって、プローブに対するいかなるターゲット配列も欠く溶液は、ターゲット配列、そしてしたがってプローブ・ヌクレオチドハイブリダイゼーション複合体を含む以外は同一の溶液より強く蛍光を発するであろう。
【0052】
さらに、本発明の分離を伴わない態様では、ハイブリダイズしているプローブのレーザー誘導蛍光の強度は、ターゲット配列に対するプローブのハイブリダイゼーション効率に反比例する。したがって、プローブに対し、不完全に相補的なターゲット配列を含む溶液は、完全に相補的なターゲット配列を含む以外は同一の溶液より強く蛍光を発するであろう。プローブのn塩基とミスマッチするターゲット配列を含む溶液は、プローブのn未満の塩基とミスマッチするターゲット配列を含む以外は同一の溶液より強く蛍光を発するであろう。したがって、3ミスマッチ溶液は、2ミスマッチ溶液より強く蛍光を発し、2ミスマッチ溶液は、1ミスマッチ溶液より強く蛍光を発し、1ミスマッチ溶液は0ミスマッチ(完全に相補的な)溶液より強く蛍光を発する。
【0053】
本発明を用い、多様な方法でヌクレオチド配列情報を得ることが可能である。
【0054】
態様において、あらかじめ決められた量の少なくとも1つのプローブを、あらかじめ決められた量の、少なくとも1つの検出しようとする核酸塩基含有配列を含む、あらかじめ決められた量の溶液に添加してもよい。試料をハイブリダイゼーション条件に供した後、試料のレーザー誘導蛍光強度を測定してもよい。試料中の少なくとも1つの核酸塩基含有配列に関する配列情報は、装置および方法が較正されている、少なくとも1つの既知の試料の強度と、該強度を比較することにより、決定することが可能である。したがって、例えば(a)試料DNAおよび野生型DNAの配列にハイブリダイズ可能なプローブを含む試料が、(b)野生型DNAの同じ配列に完全に相補的なプローブを含む標準試料より有意に強く蛍光を発する場合、ターゲット配列の突然変異型が検出されている。
【0055】
同様に、試料が、ターゲット配列の突然変異型を含む標準試料より有意に弱い蛍光を発しない場合、ターゲット配列の突然変異型が検出される。
【0056】
本目的に関し、強度の有意差は、単なる実験上の変動に起因するのではない相違として定義される。いくつかの消光効果解析では、完全にマッチしたプローブおよびターゲット配列の強度は、不完全にマッチしたプローブおよび同一配列の(同じ波長での)強度より、少なくとも約40%低かった。この値は、既定の場合のハイブリダイゼーション効率と共に変化するであろう。しかし、一般の当業者は、解析されるいかなる場合に関しても、実際の値は、不必要な実験なしに、経験的に(empirically)得ることが可能であることを、容易に認識するであろう。
【0057】
本発明の感度は、電荷が減少している陰イオン性バックボーンを有するDNA/RNAプローブ、例えばメチルホスホネートオリゴヌクレオチドで、最も顕著であるようである。非荷電(すなわち中性または非イオン性)バックボーンを有するプローブ、例えばPNAおよびメチレンメチルアミノオリゴヌクレオチドもまた、天然(すなわちホスホジエステル)オリゴヌクレオチドより、プローブとして優れているようである。
【0058】
本発明の別の態様は、試料を等しい部分に分け、そして各部分を、異なるプローブを各部分に添加する以外は、上に論じられるように、別個の試料として処理する。該部分の強度を比較し、とりわけ、どのプローブが最も相補的であり、そしてしたがってどのターゲット配列が元来の試料にあるかを決定する。本方法の本態様は、既知の試料に対し、系を較正する必要がない点で、好都合である。
【0059】
固体支持体およびゲルは、本発明を実施するのに必要ではないが、蛍光を測定する前にハイブリダイズしていないプローブからハイブリダイズしているプローブを分離するのに、または他の目的に、本発明の態様でこうした支持体を用いてもよい。例えば、1つの塩基が異なる2つの同様の種類のプローブを、容器の相対する内部表面に固定してもよく、該容器に試料を添加する。試料をハイブリダイゼーション条件および蛍光誘導照射に供した後、容器の相対する表面から発する蛍光の強度を比較し、試料が、表面に固定されたプローブのどちらかまたは両方の種類に完全に相補的な核酸塩基含有配列を含むかどうか決定してもよい。
【0060】
複数のプローブを同時に使用し、多様な効果を達成してもよい。単一のターゲット配列の異なる部分にターゲッティングされているいくつかのプローブを使用し、検出法の信頼性を高めてもよい。同様に、1つのプローブをdsDNAの1つの鎖にターゲッティングしてもよく、一方、別のプローブをdsDNAの相補鎖にターゲッティングしてもよい。
【0061】
DNAが突然変異型かまたは対応する野生型かを検出する好ましい方法は、(a)野生型および突然変異型DNAの両方で発生するが、そうでなければ特有である配列にターゲッティングされている、第一の種類のプローブ、および(b)突然変異型DNAに特有の配列にターゲッティングされている、第二の種類のプローブを同時に使用することを含み、ここで第一および第二の種類のプローブは、区別可能なシグナルを生じる異なるマーカーを有する。したがって、第一のプローブのシグナルの検出は、試験が適切に行われたことを示し(すなわち第一のプローブは陽性コントロールとして機能する)、そして第二のプローブのシグナルの検出は、突然変異型DNAが存在することを示す。例えば、1つのプローブは、525 nmで蛍光発光強度ピークを示すフルオレセインマーカーを有してもよく、一方、他のプローブは、580 nmで蛍光発光強度ピークを示すローダミンマーカーを有してもよい。
【0062】
本発明が配列データを生じることが可能な速度、正確さ、および効率を、プローブのレーザー誘導蛍光が、より長い配列内の配列部分を突き止める能力と組み合わせると、本発明を、ゲノムをマッピングするためのFISH法の代替法とすることが可能である(例えばHeppell−Parton, “Gene Mapping by Fluorescence in Situ Hybridization,” p.350−54, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference(Myers監修, 1995)中、と比較されたい)。
【0063】
本発明は、ヌクレオチドコンホメーションを解析するための効率的な方法を提供し、該方法は、アンチセンス薬剤を設計するのに特に有用である。アンチセンス薬剤は、典型的には、mRNAが望ましくないタンパク質に翻訳されるのを妨げるように、アンチセンス配列でのハイブリダイゼーションのため、mRNAをターゲッティングする。不運なことに、mRNAのin situフォールディングは、いくつかの配列部分が、その長さに沿って、アンチセンス配列に接近可能となるのを妨げる。現在まで、薬剤設計者は、ターゲットmRNAの異なる部分に相補的な、一連のアンチセンスヌクレオチドをmRNAと合わせ、そして最もよく結合するアンチセンスヌクレオチド、おそらくmRNAの最も接近可能な部分に対応するものを、少なくとも約45日かかる可能性がある、遅々としたそして困難な組織培養実験を通じ同定する方法により、接近可能な配列を突き止めてきていた。例えばRawls, “Optimistic About Antisense,” 75(22) Chem. Eng. News 35, 39(1997年6月2日)を参照されたい。mRNAの接近可能部分は、組織培養実験なしに、本発明を用い、同定することが可能である。これは、レーザー誘導蛍光強度が、ハイブリダイゼーション効率に反比例するためである。最低の強度を発する配列は、ターゲットmRNAとの最高のハイブリダイゼーション効率を有し、そしておそらく、mRNAのin situフォールディングにより妨害されない部分に相補的である。
【0064】
プローブは、マーク付けされているアンチセンス薬剤であってもよくおよび/またはその類似体であってもよい。例えば、フルオロフォアでマーク付けされているこうした配列を用い、または同様にマーク付けされているPNAプローブを用い、レーザー誘導蛍光研究を行うことにより、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドアンチセンス配列を設計するのが好都合である可能性がある。
【0065】
さらに、本発明は、アンチセンス薬剤の長さおよび他の特徴を、ハイブリダイゼーション効率を最適にするため、容易に完全に調整することを可能にする。
【0066】
先行技術のヌクレオチド配列検出法と対照的に、本発明は、特定の態様において、流体媒体(すなわち解析しようとする試料)の総量を約5マイクロリットルに制限することを可能にする。典型的には、総量は約5マイクロリットルないし約2000マイクロリットルである。
【0067】
少なくとも本発明のPNA含有プローブを用い、dsDNAに関し試験する際、疑問が残る結果が得られた場合、DNAの相補鎖を試験する、相補的PNA含有プローブを添加することにより、試料に対し、さらなる試験をすぐ行ってもよい。あるいは、まずそして同時に、変性DNA鎖の各々にハイブリダイズする、プローブおよび相補的プローブ両方を用い、試験を行ってもよい。
【0068】
法廷適用には、試料を、少なくともPNA含有プローブで、試験し、保存し、そしてその後再試験してもよい。これはPNAが数日に渡り、ハイブリダイゼーションから放出され、そしてDNAが時間に渡り再結合し、そしてこの過程により分解しないためである。したがって、試験後に凍結させた試料は、何回か、同一試験管中で続いて再試験することが可能である。
【0069】
臨床試料は、慣用的な方法で典型的であるよりも、少なくとも2000倍少ない化学薬品またはゲノム成分(5マイクロリットル対10ミリリットル)を用い、試験することが可能である。したがって、慣用的に用いるプローブ濃度の10または20倍高い濃度を使用してさえ、試験は、わずか1/5ないし1/10の量のプローブしか消費せず、非常に決定的な結果が得られる。
【0070】
本発明は、以下の実施例に関し、より詳細に例示されるであろうが、本発明は、それに限定されると考えられると理解してはならない。
(実施例)
DNA合成
試薬及び合成装置の製造者によって指定された慣用的試薬及びプロトコールを用いて、DNA合成装置(Expedite8909,PerSeptive Biosystems)によって、下記40bpターゲットDNAオリゴヌクレオチドを合成した。(SEQ ID NOは配列番号を意味する)
【0071】
【化1】
【0072】
GeneAmp2400PCR系(Perkin Elmer)によって、下記dsDNAsを製造した。
【0073】
【化2】
【0074】
(メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドの合成)
合成に用いたDNA合成装置(Expedite 8909)の製造によって指定された慣用的プロトコールに従って、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを合成した。メチルホスホンアミダイト(methyl phosphonamidite)のカップリング時間は6分間であった。メチルホスホンアミダイト(bz−dA−Me,ibu−dC−Me,ibu−dG−Me及びdT−Meホスホンアミダイト)と蛍光ホスホルアミダイト(fluorescent phosphoramidite)とはGlen Research(Sterling,VA)から購入した。ホスホルアミダイトと、合成試薬とはPerSeptive Biosystemsから購入した。エチレンジアミン(EDA)、アセトニトリル(ACN)、水酸化アンモニウム及びエチルアルコール(EtOH)はSigma−Aldrichから購入した。
【0075】
脱保護方法はR.Hogrefe等,Nucleic Acids Research,1993,21巻,2031〜2039によって開示されたワン−ポット方法に基づいて行った。
【0076】
CPGカラムに合成されたヌクレオチドと共にEtOH/ACN/水/水酸化アンモニウム(40/40/10/10(V/V%))の混合物 1mlを加え、注射器を用いて、この混合物をカラムに通して前後に5回駆動することによって、部分的メチルホスホネート化(partially phosphonated)オリゴヌクレオチドを脱保護し、開裂させた。室温における30分間後に、1mlのEDAをカラムに加え、カラムに通して前後に5回駆動してから、室温に6時間維持した。次に、得られた溶液をカラムから回収した。次に、カラムをACNと水との1:1混合物 1mlによって2回洗浄し、溶出液を回収して、カラムの洗浄前にカラムから回収した溶液に加えた。この結合した溶液を次に6N HClを用いて氷浴中でpH7に中和した。
【0077】
CPGカラムに合成されたヌクレオチドと共にEtOH/ACN/水酸化アンモニウム(45/45/10(V/V%))の混合物 1mlを加え、注射器を用いて、この混合物をカラムに通して前後に5回駆動することによって、完全にメチルホスホネート化したオリゴヌクレオチドを脱保護して、開裂させた。室温における30分間後に、1mlのEDAをカラムに加え、カラムに通して前後に5回駆動してから、室温に6時間維持した。次に、得られた溶液をカラムから回収した。次に、カラムをACNと水との1:1混合物 1mlによって2回洗浄し、溶出液を回収して、カラムの洗浄前にカラムから回収した溶液に加えた。この一緒にした溶液を次に、10%アセトニトリル(V/V%)を含有する6N HClを用いて氷浴中でpH7に中和した。
【0078】
脱保護後に、オリゴヌクレオチドを、7.8x300mm Delta Pak C18カラム(Waters,Milford,MA)を用いる逆相HPLCによって精製した。溶媒は0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)、pH7と、ACNと水(95:5(V:V))の混合物であった。勾配は30分間にわたって10〜40%(容量%TEAA、ACN/水中)であった。流量は4ml/分であった。
【0079】
所望の純度を有する回収画分をプールし、ACN/水(1:1)によって3回凍結乾燥させて、TEAAを除去した。得られた乾燥ペレットは水に可溶性であった(部分的メチルホスホネート化の場合)又はACN/水の20/80%混合物中に可溶性であった(完全メチルホスホネート化の場合)。
【0080】
下記メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド・プローブを合成して、精製した:
(1)プローブ1は、4メチル化基を含むアニオン18マー修飾バックボーンDNAプローブであった;
5’Fluo−C CTmC ATTm CAG CmTC TCmG GA3’(配列番号:10)
(2)プローブ2は、1/2メチル化されたアニオン18マーDNAプローブであった;
5’Fluo−Cm CTmC AmTTm CAmG CmTCm TCmG GmA3’(配列番号:11)
(3)プローブ3は、完全メチル化された非イオン15マーDNAプローブであった;
5’CmTmCm AmTmTm CmAmGm CmTmCm TmCmGm−Fluo3’(配列番号:12)
ハイブリダイゼーション
実施例1A〜1E
実施例1A〜1Eの各々では、40pmolの40マー合成dsDNAを100pmolのメチルホスホネート・オリゴヌクレオチド プローブ1(配列番号:10)に加えて、80μlの0.5xTBE緩衝液(pH6.5)中で混合した。実施例において用いた40マーdsDNAsは次の通りであった:
実施例 dsDNA
1A 配列番号:1
1B 配列番号:2
1C 配列番号:3
1D 配列番号:4
1E 配列番号:5
各サンプルを95℃において5分間加熱した。次に、サンプルを室温において20分間ハイブリダイズさせた。各サンプルをG50スピンカラム(spin column)(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)によって950rpmにおいて3分間 回転させることによって分離させた。ハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液をカラムに通し、本出願人の以前の米国特許5,846,729号及び第6,060,242号に開示されたプロトコールを用いた蛍光検出のためにキュベットに移した。図1に示した検出結果は、蛍光強度がプローブとターゲットとの間のミスマッチの数に逆比例したことを示す。したがって、実施例1Aの完全にマッチしたターゲットとプローブが実施例1Bの1塩基ミスマッチ対よりも大きい強度で蛍光を発し、実施例1Bの1塩基ミスマッチ対は実施例1Cの2塩基ミスマッチ対よりも大きい強度で蛍光を発し、実施例1Cの2塩基ミスマッチ対は実施例1Dの3塩基ミスマッチ対よりも大きい強度で蛍光を発し、実施例1Dの3塩基ミスマッチ対は実施例1Eの非ターゲットDNA/プローブ対合よりも大きい強度で蛍光を発した。800ms積分時間(integrating time)に蛍光スペクトルを記録した。
【0081】
実施例2A〜2E
実施例2A〜2Eの各々では、40pmolの40マー合成dsDNAを50pmolのメチルホスホネート・オリゴヌクレオチド プローブ1(配列番号:10)に加えて、80μlの0.5xTBE緩衝液(pH6.5)中で混合した。実施例において用いた40マーdsDNAsは次の通りであった:
実施例 dsDNA
2A 配列番号:1
2B 配列番号:2
2C 配列番号:3
2D 配列番号:4
2E 配列番号:5
各サンプルを95℃において5分間加熱した。次に、サンプルを室温において20分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液を、ハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないプローブを分離せずに、蛍光検出のためにキュベットに移した。
【0082】
得られた蛍光強度消光スペクトル(resulting fluorescent intensity quenching spectra)を図2に示す。非ターゲット(untargeted)DNAの蛍光スペクトル(実施例2E)をバックグラウンド又は基底スペクトルとして用いて、全てのスペクトルから控除した。図2は、消光効果の強度が、ターゲットとプローブとの間のミスマッチの数に逆比例することを示す。200ms積分時間に蛍光スペクトルを記録した。
【0083】
実施例3A〜3D
実施例3A〜3Dの各々では、8pmolの150マーPCR dsDNAを100pmolのメチルホスホネート・オリゴヌクレオチド プローブ1(配列番号:10)に加えて、80μlの0.5xTBE緩衝液(pH6.5)中で混合した。実施例において用いた150マーdsDNAsは次の通りであった:
実施例 dsDNA
3A 配列番号:6
3B 配列番号:7
3C 配列番号:8
3D 配列番号:9
各サンプルを95℃において8分間加熱した。次に、サンプルを室温において20分間ハイブリダイズさせた。各サンプルをG50スピンカラムによって、950rpmにおいて3分間回転させて、分離した。ハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液をカラムに通し、蛍光検出のためにキュベットに移した。
【0084】
実施例3Dの蛍光スペクトルをバックグラウンド・スペクトルとして用いて、全てのスペクトルを記録して、バックグラウンドを控除した。図3は、蛍光効果の強度がプローブとターゲットとの間のミスマッチの数に逆比例したことを示す。最大強度は完全マッチした150bp PCR生成物と1/4長さのメチル化DNAプローブ(実施例3A)とからの溶液から得られ、最低強度は非ターゲットDNAサンプル(実施例3D)から得られた。2048ms積分時間に蛍光スペクトルを記録した。
【0085】
実施例4A〜4D
実施例4A〜4Dの各々では、8pmolの150マーPCR dsDNAを100pmolのメチルホスホネート・オリゴヌクレオチド プローブ2(配列番号:11)に加えて、80μlの0.5xTBE緩衝液(pH6.5)中で混合した。実施例において用いた150マーdsDNAsは次の通りであった:
実施例 dsDNA
4A 配列番号:6
4B 配列番号:7
4C 配列番号:8
4D 配列番号:9
各サンプルを95℃において8分間加熱した。次に、サンプルを室温において20分間ハイブリダイズさせた。各サンプルをG50スピンカラムによって、950rpmにおいて3分間回転させて、分離した。ハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液をカラムに通し、蛍光検出のためにキュベットに移した。
【0086】
実施例4Dの蛍光スペクトルをバックグラウンド・スペクトルとして用いて、全てのスペクトルを記録して、バックグラウンドを控除した。図4は、蛍光強度がプローブとターゲットとの間のミスマッチの数に逆比例したことを示す。最大強度は完全マッチした150bp PCR生成物と1/2長さのメチル化DNAプローブ(実施例4A)とからの溶液から得られ、最低強度は非ターゲットDNAサンプル(実施例4D)から得られた。2048ms積分時間に蛍光スペクトルを記録した。
【0087】
実施例5A〜5D
実施例5A〜5Dの各々では、8pmolの150マーPCR dsDNAを100pmolのメチルホスホネート・オリゴヌクレオチド プローブ3(配列番号:12)に加えて、80μlの0.5xTBE緩衝液(pH6.5)中で混合した。実施例において用いた150マーdsDNAsは次の通りであった:
実施例 dsDNA
5A 配列番号:6
5B 配列番号:7
5C 配列番号:8
5D 配列番号:9
各サンプルを95℃において8分間加熱した。次に、サンプルを室温において20分間ハイブリダイズさせた。各サンプルをG50スピンカラムによって、950rpmにおいて3分間回転させて、分離した。ハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液をカラムに通し、蛍光検出のためにキュベットに移した。
【0088】
実施例5Dの蛍光スペクトルをバックグラウンド・スペクトルとして用いて、全てのスペクトルを記録して、バックグラウンドを控除した。図5は、蛍光強度がプローブとターゲットとの間のミスマッチの数に逆比例したことを示す。最大強度は完全マッチした150bp PCR生成物と全長メチル化DNAプローブ(実施例5A)とからの溶液から得られ、最低強度は非ターゲットDNAサンプル(実施例5D)から得られた。2048ms積分時間に蛍光スペクトルを記録した。
【0089】
本発明を詳細に、その特定の実施例を参照しながら説明したが、本明細書において種々な変化及び変更が本発明の要旨及び範囲から逸脱せずになされうることは当業者に明らかであろう。
【0090】
本発明を次に図面に関連して、説明するが、図面において同様な参照数字は同様な要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 25%メチル化DNAプローブによる、幾つかの異なるターゲット及び非ターゲットの分析から得られた蛍光スペクトルを示す。
【図2】 25%メチル化DNAプローブによる、幾つかの異なるターゲット及び非ターゲットの分析から得られた蛍光消光効果スペクトルを示す。
【図3】 25%メチル化DNAプローブによる、幾つかの異なるターゲット及び非ターゲットの分析から得られた蛍光スペクトルを示す。
【図4】 50%メチル化DNAプローブによる、幾つかの異なるターゲット及び非ターゲットの分析から得られた蛍光スペクトルを示す。
【図5】 完全メチル化非イオン性DNAプローブによる、幾つかの異なるターゲット及び非ターゲットの分析から得られた蛍光スペクトルを示す。
【配列表】
Claims (14)
- 流体媒質中の少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸塩基含有ターゲット配列の検出方法であって、
前記流体媒質に前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列とハイブリダイゼーション複合体を形成することができる蛍光標識されたアンチセンス・プローブを加える工程であって、前記アンチセンス・プローブが匹敵するホスホジエステル・バックボーンよりも小さい陰性である電荷を有するバックボーンを含む前記工程と;
前記ハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないアンチセンス・プローブを分離して、試験媒質を形成する工程と;
前記試験媒質に、前記ハイブリダイゼーション複合体中の蛍光マーカーを励起させて、前記蛍光マーカーに蛍光を放出させる波長を有するレーザー・ビームを照射する工程と;
前記放出蛍光の強度を測定する工程と;
前記測定強度を基準強度と比較して、前記流体媒質が前記少なくとも1つのターゲット配列を含有するかどうかを検出する工程と
を含み、
前記測定強度が前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数に、0塩基ミスマッチ(0を含む)から少なくとも3塩基ミスマッチまでの範囲にわたって逆比例し、前記分離工程以外の前記方法が前記アンチセンス・プローブ、前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列又は前記ハイブリダイゼーション複合体のいずれも固体サポート又はゲルに結合させることなく完全に行われる前記方法。 - 流体媒質中の少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸塩基含有ターゲット配列の検出方法であって、
前記流体媒質に前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列とハイブリダイゼーション複合体を形成することができる蛍光標識されたアンチセンス・プローブを加える工程であって、前記アンチセンス・プローブが匹敵するホスホジエステル・バックボーンよりも小さい陰性である電荷を有するバックボーンを含む前記工程と;
前記流体媒質に、前記ハイブリダイゼーション複合体中の蛍光マーカーを励起させて、前記蛍光マーカーに蛍光を放出させる波長を有するレーザー・ビームを照射する工程と;
前記放出蛍光の強度を測定する工程と;
前記測定強度を基準強度と比較して、前記流体媒質が前記少なくとも1つのターゲット配列を含有するかどうかを検出する工程と
を含み、
前記測定強度が前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数に、0塩基ミスマッチ(0を含む)から少なくとも3塩基ミスマッチまでの範囲にわたって比例し、前記方法が前記シグナル検出の前にハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないプローブを分離せずに、及び前記アンチセンス・プローブに又は前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列にシグナル消光剤を供給せずに行われる前記方法。 - 前記測定強度が前記流体媒質中のハイブリダイゼーション複合体の量に逆比例し、前記流体媒質中のハイブリダイズされない前記アンチセンス・プローブの量に比例する、請求項2記載の方法。
- 前記バックボーンが隣接糖の5’炭素と3’炭素との間に少なくとも1つの非イオン性連結基を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの非イオン性連結基がメチルホスホネート基である、請求項4記載の方法。
- 前記バックボーンがそのホスフェート基の少なくとも10%が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記バックボーンがそのホスフェート基の少なくとも20%かつ8 0%以下が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記バックボーンがそのホスフェート基の25%が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記バックボーンがそのホスフェート基の50%が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記非イオン性基がメチルホスホネート基である、請求項6、7、8及び9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バックボーンが少なくとも1つのペプチド・セグメントと、少なくとも1つのホスホジエステル・セグメントとを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記バックボーンが少なくとも1つのペプチド・セグメントと、少なくとも1つのメチルホスホネート・セグメントとを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列が折りたたみヌクレオチド配列内の第1セグメントであり、前記測定強度を前記折りたたみヌクレオチド配列内の第2セグメントの第2測定強度と比較して、前記折りたたみヌクレオチド配列内の、アンチセンス・プローブがアクセス可能な領域を同定する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数を測定する、請求項1または2に記載の方法。
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