JP2021193934A

JP2021193934A - 短鎖ヘアピンＤＮＡを用いた改良型ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応

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Publication number: JP2021193934A
Application number: JP2020102648A
Authority: JP
Inventors: 弘正船戸; Hiromasa Funato; 洋右恒岡; Yosuke Tsuneoka
Original assignee: Toho University
Current assignee: Toho University
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2021-12-27
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: JP7482506B2

Abstract

【課題】細胞や組織中のＲＮＡを可視化して検出できるＩｎｓｉｔｕＨＣＲ法において明確な生体内対象物質の蛍光化が望まれていた。【解決手段】ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において、標的分析物を含む試料を、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを用いることにより、生体組織中の標的分析物を同定する方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、生体内の標的分析物を特定する検査方法、検査試薬、検査キットおよび検査システムに関する。

ｉｎｓｉｔｕＨＣＲとは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲと言う）技術を応用して、組織や細胞中の特異的な物質を視覚化する方法であり、ＲＮＡプローブを使用して、ホールマウントのサンプル内の標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを可能にする配列およびＨＣＲのイニシエーター配列を含んでいる。更に蛍光ラベルＲＮＡヘアピンを備えたＨＣＲの使用がｉｎｓｉｔｕＨＣＲ技術を発展させた（非特許文献１）。これらのｉｎｓｉｔｕＨＣＲ技術は、非特異的結合に由来するバックグランドの高さや偽の陽性シグナルが問題であったが、スプリットプローブペアを用いた第３世代のＨＣＲは、非特異的結合を減少させている（非特許文献２）。

また、リンカーを用いたｉｎｓｉｔｕＨＣＲとして、（Ａ）分析対象物の入った試料を、リンカーに結合し、標的分析物の配列に相補的な配列を有するプローブと接触させることにより、特定のプローブが前記標的分析物に結合する工程、（Ｂ）得られた試料を、プローブとは独立しているがリンカーに結合することが可能なＨＣＲイニシエーターと接触させ、リンカーによりプローブとＨＣＲイニシエーターとが結合する工程、（Ｃ）前記試料を２つの準安定なＤＮＡヘアピンを含み検出可能な蛍光シグナルで標識かしたＨＣＲ増幅因子と接触させて、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、プローブに結合し、ＨＣＲモノマーを含む増幅産物を生成される工程、および（Ｄ）前記増幅産物を検出することで、分析対象物を同定する工程を含む、試料中の分析対象物を同定する方法（特許文献１）が知られている。

特表２０１９−５１８４３４号公報

ＣｈｏｉＨＭＴ、ｅｔａｌ．（チョイ他）、２０１０年、"ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｉｎｓｉｔｕａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｉｍａｇｉｎｇｏｆｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｍＲＮＡ発現の多重イメージングのためのプログラム可能なｉｎｓｉｔｕ増幅）"，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ネーチャーバイオテクノロジー）、２８巻，１２０８〜１２１２頁ＣｈｏｉＨＭＴ、ｅｔａｌ．（チョイ他）、"Ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＣｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｖｅｒｓａｌｉｔｅ，ｒｏｂｕｓｕｔ（第３世代ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションチェーンリークション：多重的、定量的、鋭敏、多用途、頑健）"、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（デベロップメント），２０１８年、６月１５日、１４５（１２）；ｄｅｖ１６５７５３

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲの重要な点は、生体組織における対象物質の分布を明確に目視できるようにすることであるが、より明確な生体内対象物質の蛍光化が望まれていた。

本発明は
〔１〕生体内の標的分析物を特定するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において、
（Ａ）標的分析物を含む試料を、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと結合させる工程、
（Ｂ）前記（Ａ）工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程；および
（Ｃ）前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする方法、
〔２〕Ｈ１配列を含む短鎖ヘアピンがイニシエーター配列も含む〔１〕記載の方法、
〔３〕短鎖ヘアピンが４２塩基からなるＤＮＡヘアピンである〔１〕または〔２〕記載の方法、
〔４〕短鎖ヘアピンのステム部位のグアニンおよびシトシンの割合に偏りがあることを特徴とする〔１〕から〔３〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔５〕短鎖ヘアピンのループ部位末端の１−２塩基が相補配列であることを特徴とする〔１〕から〔４〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔６〕短鎖ヘアピンのトーホールド部位が９塩基であることを特徴とする〔１〕から〔５〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔７〕プロテナーゼＫ処理を用いずに、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする〔１〕から〔６〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔８〕短鎖ヘアピンと蛍光標識体を結合させるアミノリンカーがｓｓＨであることを特徴とする〔１〕から〔７〕のいずれか一つに記載の方法、
〔９〕短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５またはＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６のいずれかひとつである〔１〕から〔８〕のいずれかひとつに記載の方法、
〔１０〕短鎖ヘアピンの蛍光標識体が、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｔｔｏ５５０またはＡｌｅｘａ６４７のいずれか一つである〔１〕から〔９〕記載のいずれかひとつに記載の方法、
〔１１〕互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアからなるハイブリダイゼーション連鎖反応用増幅剤、
〔１２〕Ｈ１配列を含む短鎖ヘアピンがイニシエーター配列も含む〔１１〕記載の増幅剤、
〔１３〕短鎖ヘアピンが４２塩基からなるＤＮＡヘアピンである〔１１〕または〔１２〕記載の増幅剤、
〔１４〕短鎖ヘアピンのステム部位のグアニンおよびシトシンの割合に偏りがあることを特徴とする〔１１〕から〔１３〕のいずれかひとつに記載の増幅剤、
〔１５〕短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５およびＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６の少なくともいずれか一つである〔１１〕から〔１４〕のいずれかひとつに記載の増幅剤、
〔１６〕生体内の標的分析物を特定するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において、
（Ａ）複数の異なる標的分析物を含む試料を、複数の異なる標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと結合させる工程、
（Ｂ）前記（Ａ）工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ複数の異なる短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程；および
（Ｃ）前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の異なる複数の標的分析物を同定することを特徴とする方法、
〔１７〕短鎖ヘアピンが４２塩基からなるＤＮＡヘアピンである〔１６〕記載の方法、および
〔１８〕複数の異なる短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５およびＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６の少なくともいずれか２つ以上の組合せである〔１６〕または〔１７〕に記載の方法に関する。

本発明の短鎖ヘアピンＤＮＡを用いた改良型ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション測定法の提供により、費用対効果に優れるとともに、感度に優れた生体内の核酸の目視観察方法が提供される。

図１はＩｎｓｉｔｕＨＣＲと短鎖ヘアピンの原理である。Ａ：Ｈ１（ａ）のトーホールドドメインのシーケンスは、Ｈ２（ａ’）のル−プドメインのシークエンスと相補的であり、Ｈ１（ｃ）のループドメインのシーケンスは、Ｈ２（ｃ’）のトーホールドドメインのシーケンスと相補的である。イニシエーター（ａ’＋ｂ’）が存在する場合、イニシエーターは、Ｈ１のトーホールドとステムのドメイン（ａ、ｂ）。次に、Ｈ１の残りの部分（ｃ、ｂ’）、Ｈ２のトーホールドとステムのドメイン（Ｃ’、ｂ）とハイブリダイズする。その結果として、Ｈ１とＨ２相互にハイブリダイズし続ける。Ｂ：スプリットイニシエータープローブセット。１つのプローブには、シーケンスＡ’、シーケンスｂ’の最初の３ｎｔ、２ｎｔのスペーサーシーケンス、２５ｎｔのアンチセンスシーケンスが存在する。別のプローブには、２５ｎｔのアンチセンスシーケンス、２ｎｔのスペーサーシーケンス、最後の９ｎｔのシーケンスｂ’が存在する。Ｃ：スプリットイニシエータープローブを使用した＋ＨＣＲ。両方の分割イニシエーターがプローブはターゲットｍＲＮＡとハイブリダイズし、ＨＣＲはヘアピンＤＮＡ添加後に進行する。Ｄ：ショートヘアピンＤＮＡの設計デザイン。ル−プとステムドメイン間の遷移部位は、ヘアピンＤＮＡに応じて最大２ｎｔ異なる。矢印は、ＤＮＡおよびＲＮＡの３’末端を示す。具体例は図１０に示した。トーホールド長と蛍光分子のＨＣＲに与える影響。Ａ：ＨＣＲ効率に及ぼすヘアピンＤＮＡのトーホールド長さの影響。実施例３に従い、すべての反応混合物は０．５μＭのヘアピンＤＮＡと４つの濃度のイニシエーターＤＮＡ（０、０．００２５、０．０１，０．０５ μＭ）を含む。ＨＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動後に可視化された。ヘアピンＤＮＡＳ４、Ｓ８、Ｓ４１、およびＳ９には、６、８、９、および１０ｎｔのトーホールド配列がある。Ｂ：ＨＣＲ効率に対する蛍光化合物の影響。Ｃ−Ｋ：ヘアピンＤＮＡに結合させた様々な蛍光色素の化学構造。ヘアピンＤＮＡＳ４１とＡｔｔｏ３９０（Ｃ）、ＦＡＭ（Ｄ）、Ａｌｅｘａ４８８（Ｅ）、Ａｔｔｏ４８８（Ｆ）、Ａｔｔｏ５５０（Ｇ）、Ａｔｔｏ５６５（Ｈ）、Ａｔｔｏ５６８（Ｉ）、またはＡｌｅｘａ６４７（Ｊ）のいずれかを結合して使用した。（Ｋ）は、ＳＳＨリンカーの構造を示した。各画像は適切なフィルターセットで撮影され、読み込み位置に基づいて配置されている。破線は、１０ｋｂのＤｓＤＮＡのバンドサイズを示している。短鎖ヘアピンを用いたＩｎｓｉｔｕＨＣＲの蛍光の経時的な増加。実施例４に従い、マウス線条体のペンクｍＲＮＡ発現は、Ａｌｅｘａ６４７で標識したヘアピンＤＮＡ（Ｓ４１）および対応するプローブセットにより検出された。バックグラウンドシグナルは差し引かれていない。Ａ−Ｃ：組織切片は、スプリットイニシエータープローブのハイブリダイズの後にＨＣＲ増幅を行なった。Ｄ−Ｆ：組織切片はプローブなしで処理され、その後ＨＣＲ増幅を行なった。Ｇ−Ｉ：組織切片はプローブのハイブリダイズの後に、Ｈ１ヘアピンＤＮＡのみのハイブリダイゼーションを行なった。Ａ、Ｄ、Ｇ：ヘアピンＤＮＡとの４５分間のインキュベーション。Ｂ、Ｅ、Ｈ：ヘアピンＤＮＡとの２時間のインキュベーション。Ｃ、Ｆ、Ｉ：ヘアピンを使用した１夜のインキュベーション。スケールバー：０．２ｍｍ。ヘアピンＤＮＡに結合した蛍光色素による強度の違い。実施例５に従い、マウス線条体のペンクｍＲＮＡ発現は、様々な蛍光色素で標識したヘアピンＤＮＡ（Ｓ４１）および対応するプローブセットにより検出された。Ｓ４１ヘアピンＤＮＡを使用したマウス線条体のＰｅｎｋｍＲＮＡのｉｎｓｉｔｕＨＣＲ。すべての組織切片は同じマウスから調製している。バックグラウンドシグナルは差し引かれていない。スケールバー：１００μｍ。改良型ＩｎｓｉｔｕＨＣＲを用いた低含量ｍＲＮＡの測定。Ａ，Ｄ：実施例６に従い、Ａｔｔｏ５５０結合ヘアピンＤＮＡ（Ｓ２３）を使用したＩｎｓｉｔｕＨＣＲによるマウスの脳でのＯｘｔｒｍＲＮＡの検出を行った。ＨＣＲ増幅は一夜行った。Ｂ，Ｅ：実施例６に従い、ＯｘｔｒｍＲＮＡに対するチラミドシグナル増幅を伴う蛍光ＩＳＨ。ＯｘｔｒｍＲＮＡは、ＤＩＧ標識プローブ、ペルオキシダーゼ標識抗ＤＩＧ抗体、Ａｌｅｘａ５６８チラミドの組み合わせによって可視化された。Ｃ，Ｆ：実施例６に従い、ＤＩＧ標識プローブ、アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体およびＢＣＩＰ／ＮＢＴの組み合わせによるＯｘｔｒｍＲＮＡの検出。発色は３日間行なった。中段の図Ｄ−Ｆはそれぞれ対応する上段の図Ａ−Ｃの破線の四角印に示した部分を拡大したものである。下段の図Ｇ−Ｉはそれぞれ対応する中断の図Ｄ−Ｆの破線の四角印に示した部分を拡大したものである。スケールバーは、４００μｍ（Ａ），１００μｍ（Ｄ），１０μｍ（Ｇ）である。プロテナーゼＫ処理によるｉｎｓｉｔｕＨＣＲの陰性効果。実施例７に従い、Ｖｇｌｕ２ｍＲＮＡはマウス内側視索前野（Ａ、Ｃ、Ｅ）および視床室傍核（Ｂ、Ｄ、Ｆ）でＡｌｅｘａ６４７結合ヘアピンＤＮＡ（Ｓ４１）を使用して検出された。増幅は２時間行った。なお、ＡおよびＢ：セクションはプロテナーゼＫで前処理された検体，ＣおよびＤ：セクションはプロテナーゼＫ未処理の検体を示す。母性行動で誘発されたｃ−Ｆｏｓ免疫反応活性はハイブリダイゼーション前のプロテナーゼＫ処理によって低下した。ＥとＦは、それぞれ対応するＣとＤの破線領域を拡大したものである。矢印は、ｃ−Ｆｏｓタンパク質とＶｇｌｕ２ｍＲＮＡの二重陽性細胞を示している。スケールバー：２００μｍ（Ａ、Ｃ）、１００μｍ（Ｂ、Ｄ）、４０μｍ（Ｅ、Ｆ）図７マウス線条体におけるｉｎｓｉｔｕＨＣＲの多重染色。実施例８に従い、Ｄｒｄ２、Ｐｅｎｋ、Ｄｒｄ１のｍＲＮＡは、異なるプローブ−ヘアピンのペアを使用した２時間のＨＣＲによって検出された。Ｄｒｄ２の検出にはＡｌｅｘａ４８８標識ヘアピンＤＮＡ（Ｓ２３）とそのプローブのペアを、Ｐｅｎｋの検出にはＳ１０−Ａｔｔｏ５６５標識ヘアピンＤＮＡ（Ｓ１０）とそのプローブのペアを、Ｄｒｄ１の検出にはＡｌｅｘａ６４７標識ヘアピンＤＮＡ（Ｓ２５）とそのプローブのペアを用いた。それぞれに用いたプローブは別表（現状のＴａｂｌｅＳ２）にまとめた。上段のパネルではバックグラウンド信号は差し引かれていない。Ｄｒｄ２陽性細胞はＰｅｎｋ陽性でもあった（矢頭印）。スケールバー：１００μｍ（上段）および１０μｍ（下段）。異なるプローブを使用したＭｏｘｄ１ｍＲＮＡの冗長検出。実施例９に従い、Ｍｏｘｄ１ｍＲＮＡを検出した。Ａ、Ｂ：Ｍｏｘｄ１ｍＲＮＡの異なる領域用に設計された異なるプローブヘアピンペアを使用したｉｎｓｉｔｕＨＣＲ。４５分間のＨＣＲにより、分界条床核にＭｏｘｄ１ｍＲＮＡが検出された。５つのプローブペアが各チャネルに使用された。Ｃｈ１およびＣｈ２の蛍光シグナルは、それぞれＡｔｔｏ５５０標識ヘアピンＤＮＡ（Ｓ４１）およびＡｌｅｘａ６４７標識ヘアピンＤＮＡ（Ｓ２５）を使用して検出された。Ｂ：細胞内レベルでの分子の分布を示す代表的な顕微鏡写真。点線の円は両方のチャネルで検出された顆粒を示し、矢印は単一のチャネルでのみ検出された顆粒を示す。スケールバー：２０μｍ（Ａ）および２μｍ（Ｂ）。ｉｎｓｉｔｕＨＣＲにおける短鎖ヘアピンと長鎖ヘアピンの感度比較。実施例１０に従い、短鎖ヘアピンと長鎖ヘアピンによるＨＣＲ反応の蛍光強度比較を行った。Ａ−Ｆ：それぞれ、ＰｅｎｋｍＲＮＡに対するプローブをＡｔｔｏ５５０標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ（Ａ）、Ａｔｔｏ５５０標識Ｓ１０ヘアピンＤＮＡ（Ｂ）Ａｔｔｏ５５０標識Ｂ１ヘアピンＤＮＡ（Ｃ）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ（Ｄ）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｓ１０ヘアピンＤＮＡ（Ｅ）Ａｌｅｘａ６４７標識Ｂ１ヘアピンＤＮＡ（Ｆ）にて検出した。Ｇ−Ｌ：それぞれ、Ｖｇｌｕｔ２ｍＲＮＡに対するプローブをＡｔｔｏ５５０標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ（Ｇ）、Ａｔｔｏ５５０標識Ｂ１ヘアピンＤＮＡ（Ｈ）、Ａｔｔｏ５５０標識Ｂ２ヘアピンＤＮＡ（Ｉ）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ（Ｊ）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｂ１ヘアピンＤＮＡ（Ｋ）Ａｌｅｘａ６４７標識Ｂ２ヘアピンＤＮＡ（Ｌ）にて検出した。Ｍ−Ｒ：それぞれ、ＮｔｓｍＲＮＡに対するプローブをＡｔｔｏ５５０標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ（Ｍ）、Ａｔｔｏ５５０標識Ｂ１ヘアピンＤＮＡ（Ｎ）、Ａｔｔｏ５５０標識Ｂ２ヘアピンＤＮＡ（Ｏ）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ（Ｐ）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｂ１ヘアピンＤＮＡ（Ｑ）Ａｌｅｘａ６４７標識Ｂ２ヘアピンＤＮＡ（Ｒ）にて検出した。Ａ：ヘアピンＤＮＡペアのＨ１およびＨ２のシーケンスと構造（４１）および対応イニシエーターシーケンス。Ｂ：イニシエーターは、Ｈ１のトーホールドおよびステムドメイン（ａ、ｂ）とハイブリダイズし、次に、イニシエーターであるＨ１複合体は、Ｈ２のトーホールドおよびステムドメイン（ｃ’、ｂ）とハイブリダイズする。Ｃ：Ｈ１とＨ２は相互連続的にハイブリダイズする。Ｄ：スプリットイニシエータープローブ（黄色）は、Ｍｏｘｄ１ｍＲＮＡにハイブリダイズしたシーケンス、イニシエーターシーケンスの半分、および２ｎｔスペーサーシーケンスを備えている。スプリットプローブセットをＭｏｘｄ１ｍＲＮＡに結合すると、蛍光標識体で標識されたヘアピンＤＮＡ、Ｈ１およびＨ２のＨＣＲがトリガーされる。

本発明における生体内の標的分析物とは、生体中の細胞、組織等に分布する遺伝子発現の第一段階であるｍＲＮＡを示し、生体内の標的分析物を特定するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法とは、標的分析物であるｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションを可能にする塩基配列とイニシエーターとして機能する配列を持つＲＮＡプローブを使用して、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）技術を細胞、組織の特定のヌクレオチドの可視化を可能にする方法を示す。

本発明において、工程（Ａ）の標的分析物を含む試料を、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと結合させる工程とは、標的分析物であるｍＲＮＡを含む細胞または組織切片等を、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアとを、ハイブリダイゼーションバッファー等の反応溶媒中、３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で６〜１８、好ましくは１０〜１４時間反応させることにより、両者をハイブリダイゼーションさせる工程を示す。

標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアとは、一つのプローブペアは３９塩基長のＤＮＡ（２５塩基の結合配列、２塩基のスペーサー、１２塩基のイニシエーター分割配列）と３６塩基長のＤＮＡ（２５塩基の結合配列、２塩基のスペーサー、９塩基のイニシエーター分割配列）を示し、３９塩基のＤＮＡプローブが持つ１２塩基のイニシエーター分割配列は９塩基のトーホールド配列とヘアピンＤＮＡの最初の３塩基のステム配列を持ち、３６塩基のＤＮＡプローブが持つ９塩基のイニシエーター分割配列はヘアピンＤＮＡの後半の９塩基のステム配列を持ち（図１参照）、相補的に結合し得るプローブのペアを示す。

具体的には表３に作成されたスプリット−イニシエータープローブペアが記載されている。

これらのスプリット−イニシエータープローブペアは、本発明の生体内の標的分析物を特定するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法に用いることができるとともに、後述する互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアと共にｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応を利用した生体内標的分析物質の検出用キット等にも用いることができる。

なお、標的分析物を含む試料として組織切片を用いる場合は、常法によりホルムアルデヒド等で固定し、スクロース溶液で浸透させることによって凍結防止処理を行い、容器に封入した後に使用まで冷凍保管し、その後凍結切片として作成したものを用いても良い。得られた切片はリン酸緩衝液等により洗浄した後、必要にプロテナーゼＫ処理を行い、ホルムアルデヒド、メタノール後等で固定後、ハイブリダイゼーションバッファーで５〜３０分間２０〜４０℃でハイブリダイゼーション前処理を行いハイブリダイゼーションに用いることができる。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、３ＭＮａＣｌ含有０．３Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液（ＰＨ７．０：以下、２０ＸＳＳＣ緩衝液という）、３ＭＮａＣｌ含有０．０２ＭＥＤＴＡ含有０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７．４）、デンハルト溶液等、通常ＤＮＡやＲＮＡのハイブリダイゼーションに用いる緩衝液を、単独または組み合わせて用いる。ハイブリダイゼーション反応の温度は２５℃〜４０℃、好ましくは３７℃であり、反応時間は２〜１８時間、好ましくは８〜１２時間である。

本発明における、（Ｂ）工程の前記（Ａ）工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程とは前記（Ａ）工程で試料中の標的分析物とハイブリダイズした標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアに対して蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを反応させて、ハイブリダイゼーション連鎖反応を進行させることによりプローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程を示す。

互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアとは、３６−４４の塩基長、好ましくは４２〜４４の塩基長、とりわけ好ましくは４２塩基長を持ち、かつ１２−１４塩基のステム配列を持つヘアピンＤＮＡを示す。

本発明において、Ｈ１配列を含む短鎖ヘアピンはイニシエーター配列も含み、短鎖ヘアピンのループ部位末端の１−２塩基が相補配列であり、短鎖ヘアピンのトーホールド部位が９塩基である。また、トーホールドのＧＣ含量は４０％以下であり、ステムのＧＣ含量は６０％以上である。また、短鎖ヘアピンのグアニンおよびシトシンの割合には偏りがある。
表１にステム部位におけるＧとＣの塩基数の違いとリーク産物が生成される頻度を示した。

本発明における具体的な互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアは、後述する表２に記載されている。

表２の短鎖ヘアピンの中で特に好適な組み合わせとしては、短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５、Ｈ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６が挙げられる。

これらの互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアは、通常は一つのペアが用いられるが、必要によりこれらの短鎖ヘアピンペアを組み合わせて用いても良い。

更に、互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアは、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応を利用した生体内の標的分析物質の検出用キット等にも用いることができる。

蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアとは、相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアと蛍光標識体が結合している状態を示し、蛍光標識体としては、蛍光標識体はフルオレスセイン（以下ＦＡＭという：フナコシ株式会社製）、Ａｔｔｏ３９０（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ４８８（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ５５０（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ５６５（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｌｅｘａ４８８（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ５６８（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ６４７（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の蛍光標識体が挙げられる。各蛍光標識体の化学構造式を図２に示した。

相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアと蛍光標識体の結合様式としてはどのようなものでも良いが、予めヘアピンＤＮＡに、その５’末端をｓｓＨアミノリンカーによって標識したものを合成し、ｓｓＨアミノリンカーを介してサクシニミジルエステルを持つ様々な蛍光標識物質と結合させつことが好ましい。ｓｓＨ標識ＤＮＡ溶液に対して蛍光標識サクシニミジルエステル溶液１／３量を混合し、３〜６時間、好ましくは４時間反応させると所望の蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアが合成される。

蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアは、単独または、前記スプリット−イニシエータープローブペアと組み合わせてｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応を利用した生体内標的分析物質の検出用キット等にも用いることができる。

前記（Ａ）工程で得た試料中の標的分析物とハイブリダイズした標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアに対して、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを、スプリット−イニシエータープローブペアを１〜５μＭ、好ましくは３μＭの濃度をスナップクールを行なった後添加し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、７５０ｍＭＮａＣｌ含有７５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２：以下５ＸＳＳＣＴと言う。）等の増幅緩衝液中で、３０分〜１８時間、好ましくは４５分〜２時間、２０〜３０℃、好ましくは２５℃の温度でインキュベーションを行ない、増幅反応を進行させる。反応終了後、試料切片を増幅緩衝液等で十分に洗浄する工程を示す。

本発明における工程（Ｃ）の前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の標的分析物を同定する方法とは、蛍光染色した切片を目視観察する方法であればどのような物でも良いが、顕微鏡に固定した切片を顕微鏡に装着したカメラ等で測定することにより、標的分析物を同定することができる。

本発明の、互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアからなるハイブリダイゼーション連鎖反応用増幅剤は、常法により、固相法で製造することができる。また本発明の短鎖ヘアピンペアは、３６〜４４塩基長と短いポリヌクレオチドのため、自動合成装置で合成することが可能である。同方法により合成した互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアは表２に示されている。

本発明において、互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンは、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰａｃｋａｇｅ（商品名、ＮＵＰＡＣＫ）のソフトウエアを用いたシミュレーションにより、その構造がデザインされたが、トーホールドのＧＣ含量は４０％以下であり、ステムのＧＣ含量は６０％以上となる。また、ヘアピンＤＮＡは蛍光標識体との結合のため、その５‘末端をｓｓＨアミノリンカーによって標識したものを用いている。

更に、Ｈ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアは、３６−４４の塩基長、好ましくは４２〜４４の塩基長、とりわけ好ましくは４２塩基長を持つ。

本発明において、（Ａ）複数の異なる標的分析物を含む試料を、複数の異なる標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと結合させる工程、とは、一つの試料が２つ以上のの異なる標的分析物を含む場合に、それに適応した2つ以上のの標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアを、前記試料中の２つ以上のの異なる標的分析物と結合させる工程を示す。ハイブリダイゼーション反応の温度は２５℃〜４０℃、好ましくは３７℃であり、反応時間は２〜１８時間、好ましくは８〜１２時間である。

また、前記複数のプローブを用いる場合の工程（Ｂ）、前記（Ａ）工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ複数の異なる短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程とは、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアに対応した配列を持ち、各々が異なる蛍光標識体と結合した２つ以上のの蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ複数の異なる短鎖ヘアピンペアを添加して、ハイブリダイゼーション連鎖反応を進行させることによりプローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程を示す。増幅反応は３０分〜１８時間、好ましくは４５分〜２時間、２０〜３０℃、好ましくは２５℃の温度でインキュベーションを行ない、増幅反応を進行させる。

具体的には、表２において複数の異なる短鎖ヘアピンペアが、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５およびＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６の少なくともいずれか２つ以上を組み合わせて用いれば良い。組み合わせの上限に関しては、肉眼で認識できる蛍光標識体の色差により決定され、２〜１０個、好ましくは２〜７個、とりわけ好ましくは２〜５個の組み合わせを用いることができる。

（Ｃ）工程の前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の異なる複数の標的分析物を同定することを特徴とする方法は、蛍光染色した切片を目視観察する方法であればどのような物でも良いが、顕微鏡に固定した切片中で異なる蛍光発色をしている標的物質を顕微鏡に装着したカメラ等で測定することにより、複数の標的分析物を同定することができる。

実施例１．オリゴヌクレオチドの合成とＤＮＡプローブのデザインと合成
表２、表３に示す全ての無標識オリゴＤＮＡは常法（岡本晃充、化学と教育、（２００９年）５７巻、７号、３４６―３４７頁）に従い自動合成装置を用いた固相合成法により合成した（スタンダード脱塩グレードでインテグレーテッドＤＮＡテクノロジー株式会社に外注し合成した）。

表３に示すスプリットイニシエーターＤＮＡプローブは非特許文献２に従い以下の通り設計した。

ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ナショナルセンターフォーバイオテクノォジーインフォメーション）のｂｌａｓｔサーチによりオフターゲットへの結合を最小にするようなｍＲＮＡ結合配列の中で、４５−５５％のＧＣ含量となるものとした。一つのスプリットイニシエータープローブペアは３９塩基長のＤＮＡ（２５塩基の結合配列、２塩基のスペーサー、１２塩基のイニシエーター分割配列）と３６塩基長のＤＮＡ（２５塩基の結合配列、２塩基のスペーサー、９塩基のイニシエーター分割配列）とした。３９塩基のＤＮＡプローブが持つ１２塩基のイニシエーター分割配列は９塩基のトーホールド配列とヘアピンＤＮＡの最初の３塩基のステム配列である。また、３６塩基のスプリットイニシエータープローブが持つ９塩基のイニシエーター分割配列はヘアピンＤＮＡの後半の９塩基のステム配列である（図１）。一つのｍＲＮＡに対して、このようなスプリットイニシエータープローブペアを５つもしくは１０個設計した。全てのスプリットイニシエータープローブセットは遺伝子ごとに混合し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％，１：４０のゲル）によって精製し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に２μＭの濃度で保存した。合成・精製したスプリットイニシエータープローブＤＮＡを表３に示した。

実施例２．ＤＮＡヘアピン増幅剤のデザインと合成
ＨＣＲ反応を誘導できて効率的に増幅するために最も短いヘアピンＤＮＡ配列を見出すために、表２に示す３６−４４塩基長で１２−１４塩基のステム配列を持つヘアピンＤＮＡについて検討した。ヘアピンＤＮＡはＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰａｃｋａｇｅ（商品名，ＮＵＰＡＣＫ）のソフトウエアを用いたシミュレーションにより、目的の二次構造（図１）を生成するようにデザインを行った。ＮＵＰＡＣＫシミュレーションによってランダム精製されたＤＮＡ配列は先行研究のルールに従いマニュアルで編集した。この場合、トーホールドのＧＣ含量は４０％以下であり、ステムのＧＣ含量は６０％以上となる。マニュアルで配列編集したヘアピンＤＮＡ配列は、編集後に目的の二次構造を取るかどうかについて改めてＮＵＰＡＣＫシミュレーションを行い、確認した。

ヘアピンＤＮＡは固相合成法によりその５‘末端をｓｓＨアミノリンカーによって標識したものを合成した（株式会社ファスマックに外注し合成した）。ｓｓＨアミノリンカーはサクシニミジルエステルを持つ様々な蛍光標識物質と反応し、ＤＮＡに蛍光標識することが可能となる。蛍光標識体はフルオロセリン（商品名ＦＡＭ：フナコシ株式会社製）、Ａｔｔｏ３９０（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ４８８（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ５５０（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ５６５（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｌｅｘａ４８８（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ５６８（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ６４７（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。クロロフォルム精製とＭｇＣ１_２を用いたエタノール沈殿により精製し、得られたｓｓＨ標識ＤＮＡを１ｍＭの濃度でｐＨ９．０の０．１Ｍホウ酸バッファーに溶解した。蛍光標識サクシニミジルエステルは１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルホルムアミドに溶解し、ＤＮＡ溶液に対して１／３量となるようにしてＤＮＡ溶液と混合し、４時間室温で反応させることで蛍光標識ＤＮＡを得た。蛍光標識ＤＮＡは２０％ゲルを用いた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって未反応の蛍光物質と合成不純物である短いＤＮＡを取り除いた。電気泳動後の蛍光バンドはＬＥＤイルミネーターとフィルターによって可視化することでバンドを目視し、切り出した。ＬＥＤイルミネーターを用いたのは、従来用いられているＵＶランプがＤＮＡへのダメージを持つことが知られており、これを避けるための操作である。切り出したゲルは潰してＥＤＴＡ含有トリス塩酸緩衝液（ＰＨ８．０：以下ＴＥと言う。）に４℃で一晩浸すことでＤＮＡを抽出し、上記と同様のエタノール沈殿によりＤＮＡのみを回収し、最終的な蛍光標識ＤＮＡは１５０ｍＭＮａＣｌを含むＴＥ緩衝液に３μＭの濃度で保存した。ＤＮＡ濃度の計測は２６０ｎｍの吸光度に基づいて一本鎖ＤＮＡを想定して行ったが、蛍光標識やヘアピンＤＮＡの構造のために多少上下する可能性があることに留意すべである。合成・精製したヘアピンＤＮＡを表２に示した。

更に表２に示した全ての短鎖ヘアピンペアに対して、常法によりリーク産物の有無と反応効率を測定した。

以下の実施例３に用いた無標識のヘアピンＤＮＡは標識ＤＮＡと同様にポリアクリルアミド電気泳動等の操作によって精製したが、蛍光を持たないため、ポリアクリルアミド電気泳動の際にはＧｅｌＧｒｅｅｎ（商品名：Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を用いてＤＮＡを可視化した。

実施例３．マイクロチューブにおけるヘアピンＤＮＡによるＨＣＲ反応の検討
表２に示す４１種類全てのヘアピンＤＮＡはスナップ−冷却（９５℃で２分間加熱した後３０分間室温まで冷却した）により使用前にヘアピン構造を形成させた。ＨＣＲ反応は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）溶液（以下、５ｘＳＳＣＴと言う）内で行った。それぞれのマイクロチューブは３μＭのヘアピンＤＮＡをそれぞれ２μｌずつ、０，０．００５，０．０２，０．１μＭのイニシエーターＤＮＡを６μｌずつ加え、最後に３Ｍ塩化ナトリウム＋０．３Ｍクエン酸ナトリウム（以下，２０ｘＳＳＣと言う。）と１０％Ｔｗｅｅｎを適量加えることによって５ｘＳＳＣＴ溶液になるように調整し、合計量を１２μｌとして準備した。ＤＮＡを混ぜた２時間後に、サンプルを着色マーカーのローディング色素（Ｂｉｏ−ｃｒａｆｔ社製）を混ぜてから１％のアガロースゲル電気泳動を行った。泳動条件は３５ｍＭホウ酸と１０ｍＭ塩化ナトリウム（以下、ＳＢバッファーと言う。）を用い１３５Ｖで３０分間で行なった。それぞれの電気泳動バンドは画像データをＩｍａｇｅＪにより産物の量を定量した。

電気泳動により、１／２００（０．００５μＭ）のイニシエーター：ヘアピンＤＮＡ比において１０ｋｂ以上の増幅が見られた場合に強い増幅があると判断した。また、イニシエーターＤＮＡを入れない条件で非常に少ないＨＣＲ産物が見られた場合にリーク（非特異的増幅）が少ないと判断した。また、反応効率は未反応のヘアピン量の検討によって判断した（以上、図２）。

実施例４．組織におけるＨＣＲ反応誘導の検討
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２０−３０週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製）に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

切片はＴｗｅｅｎ２０含有リン酸生理食塩水緩衝液（以下、ＰＢＳＴと言う。）にて洗浄した後に１０ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ処理１０分間処理し、１０分間の４％ホルムアルデヒド後固定、メタノール後固定を３７℃で行った。その後、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエタノールアミンと０．２５％無水酢酸によってアセチル化を２０分行った。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸に０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム（以下、５ｘＳＳＣと言う。）、１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０μｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行い、その後、表３に示す１ｎＭのＰｅｎｋ−Ｓ４１スプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートした。比較対象としてスプリットイニシエータープローブを含まないハイブリダイゼーションバッファーも用意した。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのＡｌｅｘａ６４７標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ溶液をスナップクールしてから用いた。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに６０ｎＭのヘアピンＤＮＡ濃度となるように調整した溶液内で４５分、２時間、一晩で２５℃でインキュベートした。比較対象として、ペアとなるＳ４１ヘアピンＤＮＡの片方のみを入れたものも用意した。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。

染色した組織切片の蛍光写真はＡ１Ｒ共焦点検出系を備えたＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｅＮｉ顕微鏡によって２０，４０倍の対物レンズ下で撮影した。蛍光写真の定量は同じ閾値とコントラスト調整によって行った。

上述の手順により、ＰｅｎｋｍＲＮＡ陽性細胞はＨＣＲ増幅反応後に線条体で豊富に検出された（図３）。Ａｌｅｘａ６４７標識ヘアピンＤＮＡの反応時間を４５分からオーバーナイトまで延長することでＰｅｎｋｍＲＮＡの蛍光シグナルは増加した（図３，Ａ，Ｂ，Ｃ）。ヘアピンＤＮＡの片方（Ｈ１）とスプリットプローブの組み合わせ（図３，Ｄ，Ｅ，Ｆ）や、スプリットプローブを抜いたＨ１とＨ２との組み合わせ（図３，Ｇ，Ｈ，Ｉ）ではシグナルは見られなかったことから、Ｐｅｎｋ陽性細胞特異的なｉｎｓｉｔｕＨＣＲが起こっていると考えられる。プローブが無い場合にはバックグラウンドシグナルが徐々に増加した。

実施例５．組織におけるＨＣＲ反応と標識蛍光色素との関係性
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２０−３０週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製）に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

切片はリン酸緩衝液ＰＢＳＴにて洗浄した後に１０ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ処理１０分間処理し、１０分間の４％ホルムアルデヒド後固定、メタノール後固定を３７℃で行った。その後、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエタノールアミンと０．２５％無水酢酸によってアセチル化を２０分行った。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５ＸＳＳＣ、１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０ｕｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行った。

その後、表３に示す１ｎＭのＰｅｎｋ−Ｓ４１スプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのＡｔｔｏ３９０（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、フルオロセリン（商品名ＦＡＭ：フナコシ株式会社製）。Ａｔｔｏ４８８（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ５５０（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｔｔｏ５６５（商品名：ＡＴＴＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ａｌｅｘａ４８８（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ５６８（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ６４７（商品名：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のいずれかで標識したＳ４１ヘアピンＤＮＡ（表２）溶液をスナップクールしてから用いた。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに６０ｎＭのヘアピンＤＮＡ濃度となるように調整した溶液内で４５分、２時間、一晩で２５℃でインキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。

染色した組織切片の蛍光写真はＡ１Ｒ共焦点検出系を備えたＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｅＮｉ顕微鏡によって２０，４０倍の対物レンズ下で撮影した。画像はＩｍａｇｅＪによって解析した。蛍光写真の定量は同じ閾値とコントラスト調整によって行った。

実施例３で行ったマイクロチューブにおけるＨＣＲ反応では蛍光色素の種類が反応効率に影響を与えたため、上述の手順に従いＰｅｎｋｍＲＮＡ検出における蛍光色素の影響について検討した。自家蛍光や検出条件は蛍光色素が持つ色波長によって変わるものの、Ｐｅｎｋ陽性細胞はＡｔｔｏ３９０，ａｌｅｘａ４８８，Ａｔｔｏ４８８，Ａｔｔｏ５５０，Ａｔｔｏ５６５，ａｌｅｘａ６４７で標識したヘアピンＤＮＡによって検出することが出来た（図４）。最も明るいシグナルはａｌｅｘａ４８８，Ａｔｔｏ５５０，ａｌｅｘａ６４７の組み合わせの時に得られ、これらの結果はマイクロチューブにおけるＨＣＲ反応系の結果と一致した。プローブのＰＡＧＥ精製によって、未精製のプローブを用いた場合よりも蛍光強度は上昇した。

実施例６．希少なｍＲＮＡ検出におけるＨＣＲ反応の感度
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２０−３０週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製）に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５ＸＳＳＣ、１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０ｕｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行い、その後、表３に示す１ｎＭのＯｘｔｒ−Ｓ２３スプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのＡｔｔｏ５５０標識Ｓ２３ヘアピンＤＮＡ溶液をスナップクールしてから用いた。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに６０ｎＭのヘアピンＤＮＡ濃度となるように調整した溶液内で一晩２５℃でインキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ法と従来の酵素ベースのＩＳＨ法を比較するため、酵素ベースＩＳＨ法についても二種類検討した。ｏｘｔｒ遺伝子のｃＤＮＡ断片を大腸菌にクローニングし、ｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法にてＳＰ６プロモーター領域と共に増幅した後にｉｎｖｉｖｏ転写によってジコキシゲニン（以下、ＤＩＧと言う）標識ＵＴＰと共にＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによってＤＩＧ標識したＲＮＡプローブを得た。ＲＮＡプローブは塩化リチウム沈殿法により精製した。プローブはアルカリ加水分解法によって平均５００塩基長に分解した。このプローブを１μｇ／ｍｌで用い、５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．２ｍｇ／ｍｌｙｅａｓｔｔＲＮＡ，０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０，０．２％ドデシル硫酸ナトリウム，１０％デキストラン硫酸，０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを含むハイブリダイゼーションバッファー内で５７℃で一晩反応させた。切片は２ＸＳＳＣ／５０％ホルムアミドで５７℃で１０分２回洗浄し、ＲＮＡｓｅＡ酵素処理（２０ｕｇ／ｍｌ）を３７℃３０分、２ＸＳＳＣおよび０．２ＸＳＳＣによる洗浄を１０分ずつ２回３７℃で洗浄した。その後、アルカリフォスファターゼ標識ＤＩＧ抗体またはペルオキシダーゼ標識ＤＩＧ抗体（それぞれ５０００，１００００倍希釈）で２時間室温で反応させた。アルカリフォスファターゼ標識した切片はＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液で３日間室温で発色させた。ペルオキシダーゼ標識した切片はＡｌｅｘａ５６８チラミドを用いて３０分発色させた。

染色した組織切片の蛍光写真はＡ１Ｒ共焦点検出系を備えたＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｅＮｉ顕微鏡によって２０，４０倍の対物レンズ下で撮影した。明視野標本の撮影はＳｏｎｙａ７ｓカメラによってＮｉｋｏｎＡＺ−１００顕微鏡によって取得した。画像はＩｍａｇｅＪによって解析した。蛍光写真の定量は同じ閾値とコントラスト調整によって行った。

上述の手順により、ＩｎｓｉｔｕＨＣＲではＯｘｔｒｍＲＮＡのシグナルをＢＮＳＴｒｈやＭＮで検出でき、また弱いながらもＢＮＳＴｐｒやＭＰＯＡでも検出できた（図５Ａ，Ｄ）。チラミド増感法ではＢＮＳＴにおける検出は出来ず（図５Ｂ，Ｅ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴによる検出ではｉｎｓｉｔｕＨＣＲ法と同様なＯｘｔｒ陽性細胞の分布を確認できたが、シグナルは弱く細胞内局在は不正確であった（図５Ｃ，Ｆ）。ほとんどのＨＣＲシグナルは細胞の核周辺で観察され（図５Ｇ）、チラミド増感においてはＢＮＳＴにおいては非常に低いシグナルノイズ比となった（図５Ｈ）。

実施例７．ｉｎｓｉｔｕＨＣＲと免疫染色の二重染色
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２２０−３０週齢の雌マウスをｃ−Ｆｏｓ免疫染色実験のため仔マウス提示の２時間後に脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製）に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

切片はリン酸緩衝液ＰＢＳＴにて洗浄した後に１０ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ処理１０分間もしくは無処理し、１０分間の４％ホルムアルデヒド後固定、メタノール後固定を３７℃で行った。その後、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエタノールアミンと０．２５％無水酢酸によってアセチル化を２０分行った。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５ＸＳＳＣ、１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０ｕｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行い、その後、表３に示す１ｎＭのＶｇｌｕｔ２−Ｓ４１スプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で２時間インキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのＡｌｅｘａ６４７標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ溶液をスナップクールしてから用いた。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに６０ｎＭのヘアピンＤＮＡ濃度となるように調整した溶液内で４５分、２時間、一晩で２５℃でインキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。ＨＣＲ反応の後に０．８％ＢｌｏｃｋＡｃｅ／ＰＢＳＴによってブロッキング処理を行い、０．４％ＢｌｏｃｋＡｃｅ入りの２５００倍希釈の抗ｃ−Ｆｏｓ抗体によって４℃で一晩反応させた。３回のＰＢＳＴ洗浄後にＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギ抗体によって１時間発色させた。切片はスライドガラスにマウントし、退色防止剤とともにカバーガラスをかけた。

プロテナーゼＫ処理はＩＳＨやｉｎｓｉｔｕＨＣＲにおいて用いられてきており、タンパク質を壊すことでＲＮＡやＤＮＡプローブ、ヘアピンＤＮＡの浸透を改善することができる。しかし、プロテナーゼＫ処理はｃ−Ｆｏｓのような内在性の蛋白質も壊してしまう。ｃ−Ｆｏｓは神経活動のマーカーとして共通に用いられてきており、ＩＳＨと免疫染色を組み合わせる際の制限となってきた。我々のｉｎｓｉｔｕＨＣＲではこれまでのＤＮＡよりも短いヘアピンＤＮＡを用いているため、プロテナーゼＫ処理は不要であると予想された。上述の手順に従い、４２塩基のヘアピンＤＮＡを用いた場合にはプロテナーゼＫ処理をしなくてもプロテナーゼＫ処理をした場合と同様にＶｇｌｕｔ２ｍＲＮＡをＭＰＯＡやＰＶＴにおいて検出することが出来た（図６Ｄ）。

ｃ−Ｆｏｓタンパクの発現は雌マウスが養育行動を行う際にＭＰＯＡにおいて観察することが出来る。プロテナーゼＫ処理をしなかった場合、ＭＰＯＡやＰＶＴにおいて豊富にｃ−Ｆｏｓ陽性細胞を検出することが出来たが、プロテナーゼＫ処理によってｃ−Ｆｏｓ陽性細胞は劇的に減少した（図６ＡＢ）。Ｖｇｌｕｔ２ｍＲＮＡ陽性細胞はＭＰＯＡにバラバラに分布していたが、多くのＶｇｌｕｔ２陽性細胞はｃ−Ｆｏｓ陽性ではなかった。

実施例８．複数の標的ｍＲＮＡを同時に検出するｉｎｓｉｔｕＨＣＲ法
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２０−３０週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製）に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

切片はリン酸緩衝液ＰＢＳＴにて洗浄した後に１０分間の４％ホルムアルデヒド後固定、メタノール後固定を３７℃で行った。その後、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエタノールアミンと０．２５％無水酢酸によってアセチル化を２０分行った。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５ＸＳＳＣ、，１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０ｕｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行い、その後、表３に示す１ｎＭのＰｅｎｋ−Ｓ１０，Ｄｒｄ１−Ｓ２５，Ｄｒｄ２−Ｓ２３全てのスプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのＡｌｅｘａ４８８標識Ｓ２３ヘアピンＤＮＡ，Ａｔｔｏ５６５標識Ｓ１０ヘアピンＤＮＡ，Ａｌｅｘａ６４７標識Ｓ２５ヘアピンＤＮＡ溶液をスナップクールしてから用いた。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに各ヘアピンＤＮＡが６０ｎＭとなるように全てを混ぜた溶液内で２時間２５℃でインキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。

上述の手順により、２時間のＨＣＲ増幅反応後に、Ｄｒｄ１，Ｄｒｄ２，ＰｅｎｋｍＲＮＡを異なる蛍光色素によって標識したヘアピンＤＮＡと対応するプローブによってマウス線条体において同時に検出することが出来た（図７）。Ｄｒｄ１とＤｒｄ２ｍＲＮＡは豊富に線条体に発現していたが、Ｄｒｄ１とＤｒｄ２の両方を発現している細胞はほとんど見つからなかった。対照的にほとんどのＤｒｄ２陽性細胞はＰｅｎｋ陽性でもあった。高解像度で観察した際にＤｒｄ２の蛍光シグナルはＰｅｎｋの蛍光シグナルとは細胞内分布が異なっていた。

実施例９．同一の標的ｍＲＮＡを異なるヘアピンＤＮＡで異なる色素で検出するｉｎｓｉｔｕＨＣＲ法
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアはから購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２０−３０週齢の雄マウス脳をサンプリングした。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製）に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５ＸＳＳＣ、１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０ｕｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行い、その後、表３に示す１ｎＭのＭｏｘｄ１−Ｓ４１とＭｏｘｄ１−Ｓ２５の二つのスプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのＡｔｔｏ５５０標識Ｓ４１ヘアピンＤＮＡ，Ａｌｅｘａ６４７標識Ｓ２５ヘアピンＤＮＡ溶液をスナップクールしてから用いた。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに各ヘアピンＤＮＡが６０ｎＭとなるように全てを混ぜた溶液内で４５分間２５℃でインキュベートした。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。

染色した組織切片の蛍光写真はＡ１Ｒ共焦点検出系を備えたＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｅＮｉ顕微鏡によって１００倍の対物レンズ下で撮影した。明視野標本の撮影はＳｏｎｙａ７ｓカメラによってＮｉｋｏｎＡＺ−１００顕微鏡によって取得した。画像はＩｍａｇｅＪによって解析した。蛍光写真の定量は同じ閾値とコントラスト調整によって行った。

上述の手順により、Ｓ４１とＳ２５双方のヘアピンＤＮＡはＭｏｘｄ１陽性細胞を検出することが出来、その分布は先行研究にも一致していた。高倍率像で観察した際に、ほとんどのＡｔｔｏ５５０とａｌｅｘａ６４７のシグナルは細胞内で一致しており、顆粒状に観察された（図８）。７６．９％のＡｔｔｏ５５０の顆粒はａｌｅｘａ６４７のシグナルが重なり、同様に７４．８％のａｌｅｘａ６４７顆粒はＡｔｔｏ５５０のシグナルと重なっていた（それぞれ、合計で２４７，２５４個の顆粒について検討した）。

実施例１０．短鎖ヘアピンＤＮＡと長鎖ヘアピンＤＮＡのＨＣＲ反応誘導の比較
全ての動物実験は東邦大学実験動物委員会のガイドラインに従って行い、東邦大学実験動物委員会によって手順が承認されたものである（承認番号１９−５１−４０５）。Ｃ５７／ＢＬ６系統マウスの交配ペアは日本エスエルシー株式会社及び日本クレア株式会社から購入した。マウスは大学内の繁殖コロニー内で１２時間の明暗サイクルと２３±２℃、５５％プラスマイナス５％湿度の制御条件下で飼育した。２０−３０週齢の雄マウスを用いた。再現性を確認するために、それぞれの実験で３匹ずつのマウスを用いた。マウスは５０ｍｇ／ｍｌペントバルビタールナトリウム腹腔内投与によって深麻酔し、経心的に４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーによって灌流固定した。取り出した脳は４％ホルムアルデヒドで４℃で一晩後固定し、３０％スクロース溶液に二日間浸透させることによって凍結防止処理を行い、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ（商品名：ライカバイオシステム社製に封入した後に使用まで−８０℃で保管した。脳切片は４０μＭの厚みで凍結切片を作製した。

洗浄後に切片は３０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５ＸＳＳＣ、１０ｍＭクエン酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５０ｕｇ／ｍｌヘパリン、１ｘデンハート溶液を含むハイブリダイゼーションバッファーで１０分間３７℃でハイブリダイゼーション前処理を行い、その後、短鎖ヘアピン用のプローブとして表３に示すＰｅｎｋ−Ｓ４１、Ｖｇｌｕｔ２−Ｓ４１、Ｎｔｓ−Ｓ４１、Ｐｅｎｋ−Ｓ１０いずれかの１ｎＭのスプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートした。また、長鎖ヘアピン用のプローブとして表４に示すＰｅｎｋ−Ｂ１，Ｖｇｌｕｔ２−Ｂ１，Ｎｔｓ−Ｂ１，Ｖｇｌｕｔ２−Ｂ２，Ｎｔｓ−Ｂ２（非特許文献２）いずれかの１ｎＭのスプリットイニシエータープローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに移して３７℃で一晩インキュベートするものも用意した。その後、切片は５ＸＳＳＣＴ／３０％ホルムアミドで１０分間３回洗浄し、さらに５ＸＳＳＣＴで１０分間３回洗浄した。

ＩｎｓｉｔｕＨＣＲ反応では３μＭのヘアピンＤＮＡ溶液をスナップクールしてから用いた。用いたヘアピンＤＮＡは短鎖ヘアピンＤＮＡとしてＳ４１とＳ１０であり、それぞれＡｔｔｏ５５０またはＡｌｅｘａ６４７で標識してある。長鎖ヘアピンＤＮＡとしてＢ１とＢ２であり（非特許文献２）、同様にＡｔｔｏ５５０またはＡｌｅｘａ６４７で標識してある。切片は１０％デキストラン硫酸を含む５ｘＳＳＣＴ増幅バッファーに６０ｎＭのヘアピンＤＮＡ濃度となるように調整した溶液内で２時間２５℃でインキュベートした。複数の標的がある場合には全てのヘアピンＤＮＡを同時に加えた。その後、切片は５ＸＳＳＣＴとＰＢＳＴによって３回洗浄した。

本発明で用いた４２塩基長のＤＮＡ（Ｓ４１およびＳ１０）と非特許文献２で用いられている７２塩基長のＤＮＡ（Ｂ１およびＢ２）によるＰｅｎｋ，Ｖｇｌｕｔ２，ＮｔｓｍＲＮＡの検出感度比較を上述の通り行った。全てのヘアピンＤＮＡはＡｔｔｏ５５０もしくはＡｌｅｘａ６４７で標識した。その結果、どちらの長さのヘアピンＤＮＡで検出した場合でも細胞の分布パターンに変化はなかったが、４２塩基長のヘアピンＤＮＡはいずれの条件でも７２塩基長のヘアピンＤＮＡよりも強い蛍光シグナルが観察された（図９）。以上から、４２塩基長のヘアピンＤＮＡは非特許文献２で用いられている既存の７２塩基長のヘアピンＤＮＡによる増幅効果を大きく上回るものと考えられる。

試験例１４２塩基ＤＮＡヘアピンによる効率的なＨＣＲ反応
ＨＣＲ反応を効率的に誘導する最も短いＤＮＡヘアピンの配列を見つけるために、我々は１０ｋｂ以上のＨＣＲ産物の有無に基づいて系統的に異なった長さのヘアピンＤＮＡについて実施例３に従って検討した。これまで共通に用いられてきたＤＮＡヘアピンは７２塩基で、そのうち１２塩基のトーホールド、２４塩基のステム、１２塩基のループ部位を含んでいるため、我々は最初に６塩基のトーホールド、１２塩基のステム、６塩基のループ部位を含む表２に示す３６塩基のＤＮＡを７セット試した。イニシエーターＤＮＡが高濃度の場合でも２時間の反応では１０ｋｂ以上の産物は生成されず、多くの未反応ヘアピンＤＮＡが残った（図２Ａ）。そのため、３６塩基のヘアピンＤＮＡはＨＣＲ反応を起こすには短すぎる。

次に我々は８，９，１０塩基いずれかのトーホールドとループ部位と１２塩基のステムを持つ表２に示すヘアピンＤＮＡについて検討した。９もしくは１０塩基のトーホールド／ループ部位によって１０ｋｂ以上の産物が生成され、未反応ヘアピンＤＮＡは非常に少なかった（図２Ａ）。２時間の反応では９塩基と１０塩基のトーホールド／ループ部位の間には明らかな反応の差異は認められなかったことから、９塩基のトーホールド／ループが効率的なＨＣＲの誘導に十分であると示唆された。この結果はＮＵＰＡＣＫによるシミュレーション結果と一致する。以上より、我々は以後４２塩基のＤＮＡヘアピンを用いることにした。

試験例２ステム配列とステムからループへの移行がヘアピンの安定性に影響する
４２塩基のヘアピンＤＮＡの安定性はステムの配列とその長さに大きく影響する。表１は異なるＧＣ含量における、イニシエーターＤＮＡ無しでＨＣＲ産物ができる量（リーク産物量、非特異的反応）を示す。ステム部位の片側における合計ＧＣ含量ではなくＧもしくはＣの塩基数の偏りはリーク産物量を減らし、一方で偏りの少ないＧＣではリーク産物量が増えた。このようなＧとＣの塩基数の差は電気泳動のバンドの強さで判定したリーク産物量と有意に相関していた（表１）。

加えて、ステムとループの移行部位の１−２塩基のずれがリーク産物量を減らすことがあった（図１Ｄを参照）。例えば、１塩基のズレの場合はトーホールドは９塩基でステムは１３塩基、ループは７塩基となる。これは本来９塩基であったループ部位の両端の１塩基が相補結合することで二本鎖であるステム部位が延長したとみなせる。一方、このようなズレはヘアピンの過剰な安定性を招くこともあり、反応効率が落ちる場合もあった。このため、本研究で用いた４２塩基のヘアピンＤＮＡは全てが同じステムやループ長を持つわけではなく、ヘアピンＤＮＡによって異なっている。

試験例３標識する蛍光色素がＨＣＲ反応効率に影響する
我々は蛍光色素がマイクロチューブにおけるＨＣＲ反応効率に影響するかについて実施例３に従って検討した。ＦＡＭ，Ａｔｔｏ３９０，Ａｔｔｏ４８８，Ａｔｔｏ５５０，Ａｌｅｘａ４８８，Ａｌｅｘａ６４７をヘアピンＤＮＡに標識した場合にはＨＣＲ反応を阻害しなかったが、Ａｔｔｏ５６５やａｌｅｘａ５６８の標識によって反応効率が減少した（図２ｂ）。Ａｔｔｏ５６５やＡｌｅｘａ５６８標識ヘアピンＤＮＡは１：２００比のイニシエーター：ヘアピンＤＮＡ反応系においてごくわずかな量の１０ｋｂ産物しか見られず、多量のヘアピンＤＮＡが未反応であった（図２Ｂ）。また、標識に用いるアミノリンカーの種類が蛍光標識後のＨＣＲ反応効率に影響するかについても検討した。その結果、Ａｔｔｏ５５０でＤＮＡを標識した場合に６原子長のアミノリンカーでは反応が阻害されたが、ｓｓＨリンカーを用いた場合には反応阻害は見られなかった。

本発明により、優れた感度を持ったＩｎｓｉｔｕＨＣＲ、当該方法に用いる増感剤が提供される。

ＢＮＳＴ：分界条床核
ＢＮＳＴｐｒ：ＢＮＳＴの主核
ＢＮＳＴｒｈ：ＢＮＳＴの菱形核
ＬＯＰＡ：外側視索前野
ＭＮ：大細胞核
ＭＰＯＡ：内側視索前野
ＬＰＯＡ：外側視索前野
ＰＮ：視床傍紐核
ＰＶＴ：視床室傍核

Claims

生体内の標的分析物を特定するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において、
（Ａ）標的分析物を含む試料を、標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと結合させる工程、
（Ｂ）前記（Ａ）工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程；および
（Ｃ）前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする方法。
Ｈ１配列を含む短鎖ヘアピンがイニシエーター配列も含む請求項１記載の方法。
短鎖ヘアピンが４２塩基からなるＤＮＡヘアピンである請求項１または請求項２記載の方法。
短鎖ヘアピンのステム部位のグアニンおよびシトシンの割合に偏りがあることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項記載の方法。
短鎖ヘアピンのループ部位末端の１−２塩基が相補配列であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項記載の方法。
短鎖ヘアピンのトーホールド部位が９塩基であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項記載の方法。
プロテナーゼＫ処理を用いずに、生体組織中の標的分析物を同定することを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項記載の方法。
短鎖ヘアピンと蛍光標識体を結合させるアミノリンカーがｓｓＨであることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項記載の方法。
短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５またはＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６のいずれか一つである請求項１から請求項８のいずれか１項記載の方法。
短鎖ヘアピンの蛍光標識体が、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｔｔｏ５５０またはＡｌｅｘａ６４７のいずれか一つである請求項１から請求項９記載のいずれか１項記載の方法。
互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ短鎖ヘアピンペアからなるハイブリダイゼーション連鎖反応用増幅剤。
Ｈ１配列を含む短鎖ヘアピンがイニシエーター配列も含む請求項１１記載の増幅剤。
短鎖ヘアピンが４２塩基からなるＤＮＡヘアピンである請求項１１または請求項１２記載の増幅剤。
短鎖ヘアピンのステム部位のグアニンおよびシトシンの割合に偏りがあることを特徴とする請求項１１から請求項１３のいずれか１項記載の増幅剤。
短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５およびＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６の少なくともいずれか一つである請求項１１から１４のいずれか１項記載の増幅剤。
生体内の標的分析物を特定するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法において、
（Ａ）複数の異なる標的分析物を含む試料を、複数の異なる標的分析物の配列に相補的な配列を有するスプリット−イニシエータープローブペアと結合させる工程、
（Ｂ）前記（Ａ）工程の生成物に、蛍光標識体を含み互いに相補的なＨ１配列またはＨ２配列を持つ複数の異なる短鎖ヘアピンペアを添加し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させることにより、前記プローブに結合した短鎖ヘアピンの増幅産物を生成させる工程；および
（Ｃ）前記増幅産物の蛍光標識体を検出することにより、生体組織中の異なる複数の標的分析物を同定することを特徴とする方法。
短鎖ヘアピンが４２塩基からなるＤＮＡヘアピンである請求項１６記載の方法。
複数の異なる短鎖ヘアピンペアの塩基配列が、Ｈ１が配列番号１でＨ２が配列番号２であるＳ１０、Ｈ１が配列番号３でＨ２が配列番号４であるＳ２３、Ｈ１が配列番号５でＨ２が配列番号６であるＳ２５、Ｈ１が配列番号７でＨ２が配列番号８であるＳ３８、Ｈ１が配列番号９でＨ２が配列番号１０であるＳ４０、Ｈ１が配列番号１１でＨ２が配列番号１２であるＳ４１、Ｈ１が配列番号１３でＨ２が配列番号１４であるＳ４５、Ｈ１が配列番号１５でＨ２が配列番号１６であるＳ４６、Ｈ１が配列番号１７でＨ２が配列番号１８であるＳ６２、Ｈ１が配列番号１９でＨ２が配列番号２０であるＳ６８、Ｈ１が配列番号２１でＨ２が配列番号２２であるＳ７１、Ｈ１が配列番号２３でＨ２が配列番号２４であるＳ７２、Ｈ１が配列番号２５でＨ２が配列番号２６であるＳ７３、Ｈ１が配列番号２７でＨ２が配列番号２８であるＳ７４、Ｈ１が配列番号２９でＨ２が配列番号３０であるＳ７６、Ｈ１が配列番号３１でＨ２が配列番号３２であるＳ７８、Ｈ１が配列番号３３でＨ２が配列番号３４であるＳ８１、Ｈ１が配列番号３５でＨ２が配列番号３６であるＳ８３、Ｈ１が配列番号３７でＨ２が配列番号３８であるＳ８５およびＨ１が配列番号３９でＨ２が配列番号４０であるＳ８６の少なくともいずれか２つ以上の組み合わせである請求項１６または請求項１７に記載の方法。