JP2010246570A - シグナリングプローブを使用する方法および材料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、標的配列へのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じるシグナリングプローブを用いて細胞を単離し、または細胞株を作製する方法に関する。シグナリングプローブを利用する他の方法としては、RNA発現のレベルを定量化する方法、生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法、および単離された細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法が挙げられる。本発明はプロテアーゼプローブも提供する。ステム−ループ構造、3アーム接合構造、およびダンベル構造を形成するシグナリングプローブおよびプロテアーゼプローブを提供する。
【選択図】なし
Description
特異的核酸配列の存在を認識し、報告する核酸プローブは、主としてインビトロ反応において特異的核酸を検出するのに用いられてきた。例えば、特許文献1を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される。プローブの1つの型は、標的配列に相補的なヌクレオチドの中央ストレッチおよび短い互いに相補的な配列を含む末端と共に、ヘアピン形状の構造を有するように設計される。例えば、非特許文献1を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される。ステム−ループ形状のプローブの1つの末端は、フルオロフォアに共有結合しており、他の末端は消光部分に共有結合している。末端がハイブリダイズしたその天然状態にある場合、フルオロフォアおよびクエンチャーの近傍は、比較的ほとんど蛍光が生じないか、または本質的に全く蛍光が生じないようにされている。ステム−ループプローブは、フルオロフォアからの蛍光の生成に検出可能な変化を生じるその標的核酸へハイブリダイズする場合、立体配座の変化を受ける。研究者は、生きた細胞においてメッセンジャーRNAのイン−サイチュの可視化を行うためにヘアピン形状のプローブを用いてきた(非特許文献2)。
本発明は、1つ以上のRNAを発現する細胞を分析し、もしくは単離し、または1つ以上のRNAを発現する細胞株を作製するための新規なシグナリングプローブを含む方法および組成物を提供する。上記方法は、標的配列とのそのハイブリダイゼーションの際にプローブによって生じるシグナルの検出に基づく。上記RNAはDNA構築物を介して細胞に導入され得るか、または細胞は内因的にRNAを発現することが疑われ得る。上記DNA構築物は、さらに、タグ配列をコードし得、上記シグナリングプローブはタグ配列に対して相補的である。1つの実施形態において、単離された細胞、または作製された細胞株は発現に対して機能的にヌルであるか、または1つ以上の予め選択されたタンパク質またはRNAの発現が低下している。本発明はまた、記載された方法に従って単離された細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。
本発明は、1つ以上のRNA転写産物の発現レベルを定量化するための方法で用いられるシグナリングプローブを提供する。さらに、上記シグナリングプローブは、少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物またはRNA配列を同定するための方法で用いられる。別の実施形態において、上記シグナリングプローブは、生きた細胞における遺伝的組換え事象を同定するための方法で用いられる。上記シグナリングプローブはヌクレオチドの1つ以上の鎖を含み、ここで、上記シグナリングプローブは目的の標的核酸(例えば、RNA)に相補的なヌクレオチドを含み、そしてここで、上記シグナリングプローブは、さらに、2つの部分を含む相互作用する対を含む。上記シグナリングプローブの構造は、シグナリングプローブが標的配列にハイブリダイズしていない場合には、相互作用する対の2つの部分が、シグナルを生じないか、またはバックグラウンドシグナルが生じるように物理的に位置するようにされる。上記シグナリングプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、2つの部分は、シグナルが生じるようにされる。あるいは、シグナリングプローブの部分は、プローブが標的にハイブリダイズしない場合には、特定のシグナルが生じ、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に異なるシグナルが生じるようにされ得る。相互作用する対の2つの部分は、シグナリングプローブの1つ以上の鎖の1つ以上の末端に結合され得る。あるいは、上記部位は、シグナリングプローブの1つ以上の鎖の内部に組み込まれ得る。シグナリングプローブのヌクレオチドもまた修飾され得る。
また、本発明は、プロテアーゼプローブを提供する。1つの実施形態において、シグナリングまたはプロテアーゼプローブは、その1つ以上の部分が互いにアニーリングする核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含み、1つの鎖の少なくとも1つの末端は他の鎖の末端に隣接する。核酸はDNAまたはRNAであり得る。2つの別個の鎖を有するシグナリングプローブでは、1つの実施形態において、1つの鎖は1つの末端に少なくとも1つのクエンチャー部分を有し、他の鎖は隣接する末端に少なくとも1つのフルオロフォアを有する。プロテアーゼプローブでは、1つの実施形態において、1つの鎖は1つの末端に少なくとも1つのタンパク質分解酵素を有し、他の鎖は隣接する末端に少なくとも1つのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
1.少なくとも1つのRNAを発現する細胞を単離するための方法であって、以下:
a)少なくとも1つのRNAコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つのRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)第一のRNAをコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
b)少なくとも1つの第二のRNAをコードする少なくとも1つの第二のDNAを上記細胞に導入する工程;
c)上記細胞を、上記第一のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記少なくとも1つの第二のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
e)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する方法。
a)複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、上記細胞の少なくとも1つの部分は、少なくとも1つの異なるRNAをコードする少なくとも1つの異なるDNAが導入される、工程;
b)上記細胞を、複数のシグナリングプローブに連続してまたは同時に暴露する工程であって、上記シグナリングプローブは、上記複数のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;および
c)シグナルを生じる上記細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つのタグ配列をコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記タグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)第一のRNAおよび少なくとも1つの第一のタグ配列をコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
b)少なくとも1つのさらなるRNAおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードする少なくとも1つの第二のDNAを上記細胞に導入する工程であって、上記第二のタグ配列は上記第一のタグ配列と同一であるかまたは異なる、工程;
c)上記細胞を、上記第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
e)上記シグナリングプローブの、それらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する方法。
a)上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つの第一のタグ配列をコードする少なくとも1つの第一のDNA;および上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードする少なくとも1つの第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、第一および第二のDNA構築物の導入は、順次または同時に行われ、上記第一および第二のタグ配列は同一であるか、または異なる、工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つの第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに、および上記少なくとも1つの第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルのうちの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)複数のRNAおよび少なくとも1つのタグ配列をコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、上記細胞の少なくとも1つの部分は、少なくとも1つの異なるRNAをコードする少なくとも1つの異なるDNAに導入される、工程;
b)上記細胞を、上記タグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程、および、
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)少なくとも1つの第一のRNA発現ライブラリーおよび少なくとも1つの第一のタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程;
b)少なくとも1つの第二のRNA発現ライブラリーおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程であって、上記第二のタグ配列が上記第一のタグ配列と同一であるか、または異なる、工程;
c)上記細胞を、上記少なくとも1つの第一のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記少なくとも1つの第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程であって、ここで、上記第一のシグナリングプローブからの検出可能なシグナルは、上記第二のシグナリングプローブからの検出可能なシグナルと同一であるか、または異なる、工程;および
e)上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)上記少なくとも1つのRNAを潜在的に発現する細胞を提供する工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つのRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)上記細胞を、上記少なくとも1つのさらなるRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのさらなるシグナリングプローブに暴露する工程;および
b)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)上記少なくとも1つの外因性RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、上記細胞は少なくとも1つの内因性RNAを潜在的に発現する、工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つの外因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
c)上記細胞を、上記少なくとも1つの内因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
d)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)上記少なくとも1つの第一のタンパク質をコードする少なくとも1つのRNA、および少なくとも1つの第一のタグ配列をコードする少なくとも1つの第一のDNA;ならびに上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードする少なくとも1つの第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、上記第一および第二のタグ配列が異なる、工程;
b)上記少なくとも1つの第二のタンパク質のmRNA転写産物に結合し、またはそれに干渉する少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAをコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
c)上記細胞を、上記少なくとも1つの第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに、および上記少なくとも1つの第二のタグ配列とのハイブリダイゼ−ションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
e)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)構成的プロモーターの制御下で少なくとも1つの第一のRNA配列をコードし、かつ組織特異的プロモーターの制御下で少なくとも1つの第二のRNA配列をコードする少なくとも1つのDNA構築物を細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記第一のRNA配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)上記シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)段落62から単離された細胞に化合物を添加する工程;
b)選択マーカーによって細胞を同定する工程;
c)上記組織特異的プロモーターを活性化する化合物として上記化合物を同定する工程;
を包含する、方法。
a)構成的プロモーターの制御下にある少なくとも1つの試験RNA配列、同一または異なる第二の構成的プロモーターの制御下にある少なくとも1つの第二のRNA配列、および組織特異的プロモーターの制御下にある少なくとも1つの第三のRNA配列をコードする少なくとも1つのDNA構築物を細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記第二のRNA配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
a)選択マーカーによって段落67に記載の単離された細胞を同定する工程;
b)上記組織特異的プロモーターを活性化する試験RNA配列を同定する工程;
を包含する、方法。
i)上記単離された細胞を、各RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;
ii)上記単離された細胞が各RNAを発現するか否かを決定する工程;または上記シグナルのレベルを定量して、各RNAの発現のレベルを決定する工程;
を包含する、方法。
a)上記生物学的試料を、上記RNA転写産物とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
b)上記生物学的試料におけるシグナルのレベルを定量する工程;および
c)上記シグナルのレベルを上記少なくとも1つのmRNA転写産物のレベルに相関させる工程;
を包含する、方法。
a)上記予め選択されたRNAを外因的にまたは内因的に発現する細胞に化合物を添加する工程;
b)上記細胞を、少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;
c)上記細胞においてシグナルのレベルを定量する工程;
d)化合物を添加しない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程;および
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する工程;
を包含する、方法。
a)外因的または内因的に発現された少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を潜在的に調節する少なくとも1つの試験RNA配列を細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;
c)上記細胞におけるシグナルのレベルを定量する工程;
d)試験RNA配列を有さない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程;および
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する試験RNA配列を同定する工程;
を包含する、方法。
a)細胞を、組換えられた配列から転写されたもの、および非組換え配列から転写されたものからなる群より選択されるRNA配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;
b)上記RNA配列を発現する上記細胞を検出する工程;
を包含する、方法。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
(項目1)
RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
RNAを潜在的に発現する細胞を提供する工程;
該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目2)
RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
該RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程;
該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目3)
内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
内因性RNAの発現を生じるDNAを細胞に導入する工程;
該細胞を、該内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目4)
RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
該RNAをコードし、さらにタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程;
該細胞を、該タグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目5)
外因性RNAおよび内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
該外因性RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、該細胞が内因性RNAを潜在的に発現する、工程;
該細胞を、該外因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目6)
2つ以上の外因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
第一の内因性RNAの発現を生じるDNAを細胞に導入する工程であって、該細胞がさらなる内因性RNAを潜在的に発現する、工程;
該細胞を、該第一の内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該さらなる内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目7)
2つ以上の異なるRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
2つ以上の異なるRNAを潜在的に発現する細胞を提供する工程;
該細胞を、第一のRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、さらなるRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目8)
2つ以上の異なるRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
第一のRNAをコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
さらなるRNAをコードするさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
該細胞を、該第一のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該さらなるRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目9)
2つ以上の異なる内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
第一の内因性RNAの発現を生じる第一のDNAを細胞に導入する工程;
さらなる内因性RNAの発現を生じるさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
該細胞を、該第一の内因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該さらなる内因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目10)
2つ以上の異なるRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
第一のRNAをコードし、さらに第一のタグ配列をコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
さらなるRNAをコードし、さらにさらなるタグ配列をコードするさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
該細胞を、該第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該さらなるタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目11)
1つより多い外因性DNAのコピーを含む細胞を単離する方法であって、以下:
RNAをコードし、さらに第一のタグ配列をコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
該RNAをコードし、およびさらなるタグ配列をさらにコードするさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
該細胞を、該第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目12)
前記暴露工程を同時に行う、項目5〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記暴露工程を連続して行う、項目5〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
2つ以上のRNAまたは該2つ以上のRNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流に作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、同一複合体の成分であるRNAまたはタンパク質、および同一タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、項目5〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記第一のシグナリングプローブが、前記第二のシグナリングプローブによって生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる、項目5〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
条件プロモーターの制御下にあるRNAをコードするDNA構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下:
構成的プロモーターの制御下にある第一のRNAをコードするDNA構築物を細胞に導入する工程であって、該DNA構築物は、第二のRNAが発現しない条件下で、条件プロモーターの制御下にある第二のRNAをさらにコードする工程;
該細胞を、該第一のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目17)
前記DNA構築物が、さらに、試験RNAをコードする、項目12に記載の方法。
(項目18)
複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する方法であって、以下:
複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、該複数のRNAの少なくとも1つの部分集合が互いに異なる、工程;
該細胞を、複数の異なるシグナリングプローブに暴露する工程であって、該シグナリングプローブが、該複数のDNAによってコードされる1つ以上のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目19)
複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する方法であって、以下:
複数の内因性RNAの発現を生じる複数のDNAを細胞に導入する工程であって、該複数の内因性RNAの少なくとも1つの部分集合が互いに異なる、工程
該細胞を、複数の異なるシグナリングプローブに暴露する工程であって、該シグナリングプローブが、該複数の内因性RNAの1つ以上のRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目20)
複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の少なくとも1つの部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する方法であって、以下:
複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、各DNAはさらにタグ配列をコードする、工程;
該細胞を、該タグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目21)
前記複数のRNAが発現ライブラリーを形成する、項目18〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記複数のRNAまたは該複数のRNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流に作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、同一複合体の成分であるRNAまたはタンパク質、および同一タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、項目18〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記複数のDNAの少なくとも1つの部分集合が同一のタグ配列をコードする、項目20に記載の方法。
(項目24)
細胞の2つ以上のRNA発現ライブラリーを単離する方法であって、以下:
第一のRNA発現ライブラリーをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、各DNAが、さらに、第一のタグ配列をコードする、工程;
第二のRNA発現ライブラリーをコードする複数のDNAを該細胞に導入する工程であって、各DNAが、さらに、第二のタグ配列をコードする、工程;
該細胞を、該第一のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該細胞を、該第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目25)
さらに、前記単離された細胞を培養する工程を包含する、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
さらに、前記単離された細胞を培養する工程によって、細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記タグ配列が複数の標的配列を含み、1つのシグナリングプローブが各標的配列にハイブリダイズする、項目4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記タグ配列が二次構造を有するRNAである、項目4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記タグ配列が、ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む3アーム接合構造を形成する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記DNAが複数のタグ配列をコードする、項目4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記タグ配列をコードするDNAが前記RNAをコードするDNAに対してフレーム内にある項目4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記タグ配列をコードするDNAが該RNAをコードするDNAに対してフレーム外にある項目4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
さらに、前記提供する工程または導入する工程の前に、前記RNA、さらなるRNAまたは複数のRNAの発現を調節する化合物を細胞に添加する工程を包含する、項目1〜16、18〜20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
タンパク質の低下した発現を有する細胞を単離する方法であって以下:
アンチセンスRNA、または該タンパク質の発現を低下させるshRNAをコードするDNAを細胞に導入する工程;
該細胞を、該アンチセンスRNAまたはshRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および、
シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
(項目35)
前記DNAが条件プロモーターに作動可能に連結される、項目2、4、5、8、10、11、18、20または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記RNAが細胞に対して致死的であるか、または損傷的である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記DNAが選択マーカーをさらにコードし、ここで、該方法が、該DNAを細胞に導入する工程の後であるが、該細胞を前記シグナリングプローブに暴露する前に、該選択マーカーを用いて該細胞を選択する工程をさらに包含する、項目2〜6、8〜11、16〜20、24または34のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
条件プロモーターを活性化する化合物を同定する方法であって、以下:
項目16に記載の方法によって単離された細胞に試験化合物を添加する工程;
該条件プロモーターの制御下で第二のRNAの存在に関してアッセイする工程;および
該細胞が該第二のRNAを発現する場合、組織特異的プロモーターを活性化する化合物として試験化合物を同定する工程;
を包含する、方法。
(項目39)
条件プロモーターを活性化するRNAを得る方法であって、以下:
項目17に記載の方法によって単離された細胞を得る工程;
条件プロモーターの制御下で第二のRNAの存在に関してアッセイする工程;および
該第二のRNAを発現する細胞を得る工程;
を包含する、方法。
(項目40)
生物学的試料中のRNAの発現レベルを定量化するための方法であって、以下:
該生物学的試料を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
該生物学的試料中のシグナルのレベルを定量する工程;および
該シグナルのレベルを該RNAの発現レベルと相関させる工程;
を包含する、方法。
(項目41)
RNAの発現を調節する化合物を同定する方法であって、以下:
該RNAを発現する細胞に試験化合物を添加する工程;
該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;
該試験化合物に暴露した細胞によって生じるシグナルを、該試験化合物に暴露しなかった細胞によって生じるシグナルと比較する工程;
を包含し、
ここで、該試験化合物に暴露しなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加または減少が、該化合物が該RNAの発現を調節する化合物であることを示す、方法。
(項目42)
前記RNAが、細胞に導入されるDNAによってコードされる、項目41に記載の方法。
(項目43)
RNAの発現を調節するRNAを同定する方法であって、以下:
試験RNAを細胞に導入する工程であって、該細胞がRNAを含む、工程;
該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
該試験RNAに暴露された細胞によって生じたシグナルを、該試験RNAに暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較する工程;
を包含し、
ここで、該試験RNAに暴露しなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験RNAに暴露された細胞によって生じたシグナルの増加または減少は、該試験RNAが該RNAの発現を調節することを示す、方法。
(項目44)
生きた細胞における遺伝的組換え事象を同定するための方法であって、以下
細胞を、組換え配列から転写されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程を包含し、
ここで、該シグナルを生じる細胞の検出は、該細胞が遺伝的組換え事象を含むことを示唆する、方法。
(項目45)
さらに、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する、項目44に記載の方法。
(項目46)
項目1〜24、34または45のいずれか1項に記載の方法によって得られた、細胞。
(項目47)
前記細胞が細胞ベースのアッセイで用いられる、項目46に記載の細胞。
(項目48)
前記細胞が動物に移植される、項目46に記載の細胞。
(項目49)
前記細胞が胚性幹細胞である、項目46に記載の細胞。
(項目50)
項目49に記載の胚性幹細胞を用いて、トランスジェニック動物またはキメラ動物を作製する工程を包含する、トランスジェニック動物をまたはキメラ動物を作製する、方法。
(項目51)
前記シグナリングプローブが、少なくとも1つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含む、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目52)
前記2つの別個の鎖が5’末端〜3’末端の連続する互いに相補的な領域を形成し、ここで、該2つの鎖は同じ数のヌクレオチドを有する、項目51に記載の方法。
(項目53)
互いに相補的な領域が前記2つの鎖の間で形成された後、1つの鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、該ずれは10までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記核酸がDNA、RNAまたはその両方である、項目51に記載の方法。
(項目55)
前記修飾された核酸が、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、化学的に修飾されたRNA、またはこれらの組合せを含む、項目51に記載の方法。
(項目56)
前記修飾された核酸が糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の1つ以上において化学的に修飾されている、項目51に記載の方法。
(項目57)
前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O − M + )(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−、−NHP(O) 2 O−、−OC(O) 2 O−、−OCH 2 C(O) 2 NH−、−OCH 2 C(O) 2 O−、−OP(CH 3 )(O)O−、−OP(CH 2 C 6 H 5 )(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O) 2 NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記ホスホジエステル結合が、−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、項目56に記載の方法。
(項目59)
化学的に修飾されたRNAの2’位が、C 1 −C 4 アルコキシ、OCH 2 −CH=CH 2 、OCH 2 −CH=CH−CH 3 、OCH 2 −CH=CH−(CH 2 ) n CH 3 (n=0,1...30)、ハロゲン、C 1 −C 6 アルキルおよびOCH 3 からなる群より選択される化学基を含む、項目56に記載の方法。
(項目60)
前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を含む、項目56に記載の方法。
(項目61)
前記シグナリングプローブが2つの化学基を含む相互作用する対を含み、ここで、1つの化学基が1つの鎖の1つの末端に存在し、ここで、該他の化学基が他の鎖の隣接末端に存在する、項目51に記載の方法。
(項目62)
前記シグナリングプローブが2つの相互作用する対を有し、ここで、該プローブの各末端が両方の鎖の隣接末端において1つの相互作用する対を有する、項目51に記載の方法。
(項目63)
前記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、FRETドナーおよびアクセプター、ハーベスターおよびエミッターフルオロフォア、ならびに酵素および該酵素のインヒビターまたは該酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、項目61に記載の方法。
(項目64)
前記シグナリングプローブがステム−ループ構造を含む、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目65)
前記シグナリングプローブが、2つのステム領域を含むダンベル構造を含む、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目66)
前記シグナリングプローブが、ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む3アーム接合構造を形成する一本鎖を含む、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目67)
前記構造の領域が前記ステム領域のそれぞれのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、項目65または66に記載の方法。
(項目68)
前記構造がDNA、RNA、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、RNA、またはこれらの組合せである、項目64〜66のいずれか1項に記載の方法。
(項目69)
前記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の1つ以上において化学的に修飾されている、項目64〜66のいずれか1項に記載の方法。
(項目70)
前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O − M + )(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−、−NHP(O) 2 O−、−OC(O) 2 O−、−OCH 2 C(O) 2 NH−、−OCH 2 C(O) 2 O−、−OP(CH 3 )(O)O−、−OP(CH 2 C 6 H 5 )(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O) 2 NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目69に記載の方法。
(項目71)
前記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、項目69に記載の方法。
(項目72)
前記化学的に修飾されたRNAの2’位が、C 1 −C 4 アルコキシ、OCH 2 −CH=CH 2 、OCH 2 −CH=CH−CH 3 、OCH 2 −CH=CH−(CH 2 ) n CH 3 (n=0,1...30)、ハロゲン、C 1 −C 6 アルキルおよびOCH 3 からなる群より選択される化学基を含む、項目69に記載の方法。
(項目73)
前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を有する、項目69に記載の方法。
(項目74)
前記相互作用する対が、フルオロフォアとクエンチャー、化学発光標識とクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマーとFRETドナーおよびアクセプター、ハーベスターとエミッターフルオロフォア、タンパク質分解酵素と該タンパク質分解酵素のインヒビターまたは該酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、項目64〜66のいずれか1項に記載の方法。
(項目75)
前記シグナリングプローブが、前記鎖の1つの末端に少なくとも2つのフルオロフォア、および該鎖の他の末端にクエンチャーを含み、ここで、該2つのフルオロフォアはFRETドナーおよびアクセプター対である項目64〜66のいずれか1項に記載の方法。
(項目76)
標的配列に相補的な配列および互いに相補的な配列、酵素および該酵素のインヒビターを含む核酸または修飾された核酸を含むプローブであって、ここで、該プローブは、該標的配列へのハイブリダイゼーションの際に酵素活性の検出可能な増加を生じる、プローブ。
(項目77)
前記酵素がタンパク質分解酵素である、項目76に記載のプローブ。
(項目78)
前記プローブが、少なくとも1つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含む、項目76に記載のプローブ。
(項目79)
酵素が1つの鎖の1つの末端に存在し、該酵素のインヒビターが他の鎖の隣接する末端に存在する、項目76に記載のプローブ。
(項目80)
前記2つの別個の鎖が5’末端〜3’末端の連続する互いに相補的な領域を形成し、該2つの鎖は同じ数のヌクレオチドを有する、項目78に記載のプローブ。
(項目81)
互いに相補的な領域が2つの鎖の間で形成された後、1つの鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、該ずれは10までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、項目78に記載のプローブ。
(項目82)
前記核酸がDNA、RNA、またはその両方である、項目78に記載のプローブ。
(項目83)
前記修飾された核酸が、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNAもしくはRNA、またはこれらの組合せを含む、項目78に記載のプローブ。
(項目84)
前記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の1つ以上において化学的に修飾されている、項目78に記載のプローブ。
(項目85)
前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O − M + )(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−、−NHP(O) 2 O−、−OC(O) 2 O−、−OCH 2 C(O 2 )NH−、−OCH 2 C(O) 2 O−、−OP(CH 3 )(O)O−、−OP(CH 2 C 6 H 5 )(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O) 2 NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目84に記載のプローブ。
(項目86)
前記ホスホジエステル結合が、−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、項目84に記載のプローブ。
(項目87)
化学的に修飾されたRNAの2’位が、C 1 −C 4 アルコキシ、OCH 2 −CH=CH 2 、OCH 2 −CH=CH−CH 3 、OCH 2 −CH=CH−(CH 2 ) n CH 3 (n=0,1...30)、ハロゲン、C 1 −C 6 アルキルおよびOCH 3 からなる群より選択される化学基を含む、項目84に記載のプローブ。
(項目88)
前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を含む、項目84に記載のプローブ。
(項目89)
ステム−ループ構造を含む、項目76に記載のプローブ。
(項目90)
2つのステム領域を含むダンベル構造を含む、項目76に記載のプローブ。
(項目91)
ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む3アーム接合構造を含む、項目76に記載のプローブ。
(項目92)
前記構造の領域が前記ステム領域のそれぞれのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、項目90または91に記載のプローブ。
(項目93)
前記構造がDNA、RNA、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、RNA、またはこれらの組合せである項目90〜92のいずれか1項に記載のプローブ。
(項目94)
前記構造が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基の1つ以上において化学的に修飾されている、項目90〜92のいずれか1項に記載のプローブ。
(項目95)
前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O − M + )(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−、−NHP(O) 2 O−、−OC(O) 2 O−、−OCH 2 C(O 2 )NH−、−OCH 2 C(O) 2 O−、−OP(CH 3 )(O)O−、−OP(CH 2 C 6 H 5 )(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O) 2 NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目94に記載のプローブ。
(項目96)
前記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S − M + )(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、項目94に記載のプローブ。
(項目97)
前記化学的に修飾されたRNAの2’位がC 1 −C 4 アルコキシ、OCH 2 −CH=CH 2 、OCH 2 −CH=CH−CH 3 、OCH 2 −CH=CH−(CH 2 ) n CH 3 (n=0,1...30)、ハロゲン、C 1 −C 6 アルキルおよびOCH 3 からなる群より選択される化学基を含む、項目94に記載のプローブ。
(項目98)
前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を有する、項目94に記載のプローブ。
(項目99)
目的のRNAおよびタグ配列をコードするDNA配列を含む、DNA構築物。
(項目100)
項目99に記載のDNA構築物を含む、ベクター。
(項目101)
項目99に記載のDNA構築物を含む、細胞。
(項目102)
前記細胞が不死化された、初代幹細胞または生殖細胞である、項目101に記載の細胞。
(項目103)
それぞれが安定に組み込まれた発現された配列を含む少なくとも1,000個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
(項目104)
それぞれが少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも500個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
(項目105)
それぞれが少なくとも3つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも50個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
(項目106)
それぞれが少なくとも4つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも20個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
(項目107)
それぞれが少なくとも1つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも50個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーであって、該細胞株が、薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
(項目108)
それぞれが少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも20個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーであって、該細胞株が、薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
(項目109)
各細胞株が可変ライブラリー配列を含む、項目103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
(項目110)
前記発現ライブラリーの可変配列が、ゲノム配列、ゲノム非翻訳配列、ゲノム翻訳配列、遺伝子配列、cDNA配列、EST配列、オリゴ配列、ランダム配列、RNA配列、タンパク質配列、タンパク質ドメイン配列、ペプチド配列、イントロン配列、エクソン配列、タグ配列、もしくはリンカー配列、またはこれらの組合せ、またはこれらの組換え物、あるいは未修飾配列、突然変異誘発配列、ランダム化配列、シャッフルされた配列または組換え配列の1つ以上からなる群より選択される、項目109に記載のライブラリー。
(項目111)
前記ライブラリーが未知の配列同一性を有する複数の異なる配列を用いて作製される、項目103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
(項目112)
前記ライブラリーが複数の構築物を含み、各構築物が既知の配列同一性を有する配列を含む、項目103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
(項目113)
前記配列が共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、項目111または112に記載のライブラリー。
(項目114)
前記ライブラリーが細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いられる、項目103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
(項目115)
シグナリングプローブを用いる、細胞における標的の検出を増強する化合物を同定する方法であって、以下:
標的配列を含む細胞にシグナリングプローブを導入する工程であって、ここで、該シグナリングプローブは標的配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;
該細胞を試験化合物に暴露する工程;および
該細胞によって生じるシグナルを検出する工程;
を包含し、
ここで、該試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、該試験化合物が、シグナリングプローブを用いる細胞における標的の検出を増強させる化合物であることを示す、方法。
(項目116)
シグナリングプローブの細胞への導入を媒介し、または改良する化合物を同定する方法であって、以下:
試験化合物の存在下でシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、ここで、該細胞は標的配列を含み、該シグナリングプローブは該標的配列とのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じる、工程;および
該細胞によって生じたシグナルを検出する工程;
を包含し、
ここで、該試験化合物に暴露されなかった細胞と比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、該試験化合物が、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介し、または改良する化合物であることを示す、方法。
上記RNAを発現する細胞を提供する工程、上記細胞を、上記RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。1つの実施形態において、上記RNAは内因性RNAである。別の実施形態において、上記内因性RNAは、細胞に導入されるDNAの結果として発現され、例えば、そのDNAはエンハンサーまたはプロモーター、または内因性RNAの発現を誘導する他の配列を含む。例えば、DNAはタンパク質(例えば、RNAの発現を誘導する転写因子)をコードし得る。なお別の実施形態において、上記RNAは、細胞に導入される核酸によってコードされる。細胞に導入されるDNAは、さらに、タグ配列をコードし得、ここで、上記シグナリングプローブは、必要に応じて、タグ配列および/またはRNA配列に標的化され得る。上記タグ配列はRNAのオープンリーディングフレームのフレーム内またはフレーム外に存在し得る。1つの実施形態において、上記方法は、外因性または異種RNAおよび内因性RNAの両方の発現を検出する工程を包含する。これらの方法を行って、同時に複数のRNAおよび/またはタグを検出し得る。上記RNAは、同一または異なるRNAであり得る。上記方法を用いて、1を超えるシグナリングプローブを用いて1を超えるRNAを検出する実施形態において、異なるシグナリングプローブによって生じたシグナルは、互いに同一であっても異なっていてもよい。
本発明のこれらおよび他の局面は以下の詳細な説明から理解される。
他の定義がなされない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって共通に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の文献は、本明細書においてその全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。
(相互作用する対)
シグナリングプローブは、1つより多くの相互作用する対を有し得るか、または異なる相互作用する対を有し得る。1つの実施形態において、シグナリングプローブは、蛍光原性プローブである。1つの実施形態において、蛍光原性プローブは、そのハイブリダイズしていない状態ではバックグラウンドレベルの蛍光を発しないが、その標的への結合に際してバックグラウンドレベルの蛍光、またはバックグラウンドレベルを超える蛍光を発する。複数のフルオロフォアを用いて、シグナルを増加させ得るか、または異なる色範囲で蛍光を提供し得る。複数のクエンチャーを用いて、標的配列の非存在下においてシグナルを減少させ得るか、または排除し得る。クエンチャーの例としては、DABCYL、EDAC、セシウム、臭化p−キシレン−ビス−ピリジニウム、タリウムおよび金ナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:スルホローダミン101、アクリジン、5−(2’−アミノエチル)アミノアフサリン(aminoaphthaline)−1−スルホン酸(EDANS)、テキサスレッド、エオシン、およびBodipyおよびAlexa Fluor350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor500、Alexa Fluor514、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750、アロフィコシアニン、アミノクマリン、Bodipy−FL、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、カルボキシフルオレセイン(FAM)、カスケードブルー、APC−Cy5、APC−Cy5.5、APC−Cy7、クマリン、ECD(Red613)、フルオレセイン(FITC)、ヘキサクロルフルオレセイン(HEX)、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンB(Lissamine Rhodamine B)、ルシファーイエロー、メトキシクマリン、オレゴングリーン488、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、PE−Cy7結合体、PerC、PerCP−Cy5.5、R−フィコエリトリン(PE)、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド−X、テトラクロロフルオレセイン(TET)、TRITC、テトラメチルローダミン、テキサスレッド−X、TRITC、XRITC、およびクアンタムドット(Quantum dots)。例えば、本明細書において参考として援用される、Tyagiら、Nature Biotechnology 16:49−53、(1998)およびDubertretら、Nature Biotechnology,19:365−370(2001)参照。
(二本鎖構造)
本発明は、相互に対してアニールするか、または少なくとも1つの相互に相補的な領域を形成するように設計された核酸の少なくとも2つの別々の鎖を含む、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブを提供する。1つの鎖の少なくとも1つの末端は、他の鎖の末端に隣接する(図1)。この核酸はDNA、RNA、または修飾されたDNAまたはRNAであり得る。2つの鎖は、自己ダイマーを形成する同一の鎖であり得る(図8B)。これらの鎖は、配列が同一でなくてもよい。
もう1つの実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、少なくとも1つの相互に相補的な領域と少なくとも1つの非相補的領域とを含む、核酸または修飾核酸の鎖である。1つの実施形態において、プローブは、ステム−ループ構造を形成する。ステム領域は、相互に相補的であり得るか、または相互に相補的な領域と非相補的領域とを含み得る(図4)。例えば、ステム領域は、塩基対形成していないバルジヌクレオチドを有することができる(図4)。また、ステム領域は、塩基対形成していない5’末端または3’末端において、突出ヌクレオチドを含むこともできる(図3Bおよび3C)。
もう1つの実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、3アーム接合構造を形成する核酸の鎖である(図6Aおよび6B)。この構造において、ステム領域および2つのステム−ループ領域は、連結されて、三方接合を形成する。ステム領域は、2〜5個、7〜9個、10〜12個の塩基対を含有することができる。ステム−ループ領域のループは、3〜7個、8〜10個、11〜13個のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含有することができる。
別の実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、ダンベル形状構造を形成する核酸の鎖である(図7または11)。この構造は、2つのステム領域の1つのアームを介して連結された2つのステム−ループ領域である。ステム領域は、3〜5個の、7〜9個の、10〜12個の塩基対を含むことができる。ステム−ループ領域のループは、5〜7個の、8〜10個の、11〜13個のヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、ダンベル構造は、3つの連続する塩基対である1つのステム領域、および4つの連続する塩基対である1つのステム領域を有する。1つの実施形態において、2つのステム領域は、1個または2個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される。もう1つの実施形態において、2つのステム領域は、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される。1つの実施形態において、ステム−ループ構造、ダンベル構造または3アーム接合構造は、30個を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する。
また、本発明は、化学的に修飾されるシグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブを提供する。糖−ホスホジエステル型の骨格、2’OH、塩基のうちの1つ以上が修飾され得る。ホスホジエステル結合の置換としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:−OP(OH)(O)O−、−OP(O−M+)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S−M+)(O)O−、−NHP(O)2O−、−OC(O)2O−、−OCH2C(O2)NH−、−OCH2C(O)2O−、−OP(CH3)(O)O−、−OP(CH2C6H5)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)2NH−。M+は無機カチオンまたは有機カチオンである。上記骨格はペプチド核酸でもあり得、ここで、デオキシリボースリン酸骨格は、偽(pseudo)ペプチド骨格によって置き換えられている。ペプチド核酸は、以下によって記載されているHyrupおよびNielsen,Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5−23、1996、ならびにHydig−HielsenおよびGodskesen,WO95/32305(これらの各々は、本明細書により、参考として本明細書において援用される)。
本発明の方法は、生きた細胞中の標的RNA配列へのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる、シグナリングプローブの能力に基づく。生じたシグナルは、コントロール細胞で生じたもの(例えば、バックグラウンド蛍光)よりも検出可能に高くあるべきである。したがって、コントロール細胞が全く蛍光を生じないことは、必要でない。1つの実施形態において、この方法は、RNAを検出または定量化するためのものである。1つの方法は、少なくとも1種のRNAを発現する細胞を単離するためのものか、またはそのような細胞株を作製するためのものである。細胞を単離することを含む本発明の方法のいずれかにおいて、細胞が培養され得るか、または、培養して、細胞株を作製し得る。RNAまたはRNAおよびタグ配列をコードするDNA構築物が細胞に導入される。DNA構築物は、細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれ得る。1つ以上の特異的遺伝子座における組込みも、また達成され得る。次いで、トランスフェクトされた細胞がシグナリングプローブに暴露され、これは、標的RNAまたはタグ配列への結合に際して検出可能なシグナルを生じる。検出可能なシグナルを生じる細胞が単離される。細胞は単離されて、当該分野におけるいずれかの方法によって培養され得る(例えば、細胞は個々に、またはまとめて(in batch)、単離し、平板培養することができる。細胞株は、単離された細胞を増殖することによって作製され得る。
細胞株を作製することに関与する最も退屈な工程のいくつかは、本明細書中に記載されるシグナリングプローブの適用によって排除される。1つの実施形態において、所望の遺伝子をコードするDNA構築物でのトランスフェクションに続いて、これらの細胞に、目的の遺伝子のメッセージを認識するように設計された蛍光原性プローブが導入される。この工程は、選択マーカーを用いる選択(例えば、薬物選択)に続いて行われ得る(但し、トランスフェクトされたDNA構築物もまた、薬物耐性をコードする)。遺伝子を転写する細胞は蛍光を発する。その後のFACS分析の結果、蛍光細胞の単離物が生じ、次いで、これが増殖させられて、目的の細胞を発現する細胞株を生じさせることができる。
タンパク質をコードするRNAではなく、遺伝子または遺伝子の一部のアンチセンスであるRNAを発現する細胞株の作製を記載する、いくつかの研究がある。そのような方法は、所与の細胞における特定のRNAまたはタンパク質の量を低下させることを目的とする。タンパク質発現細胞株の作製について上記した工程は、ここで等しく適用可能であり、この工程は、シグナリングプローブをアンチセンスRNAであるRNAを検出するように設計することを除いて、実質的に同一である。
免疫学者などは、長い間、細胞を分類するのにFACSを用いてきた。一般に、この方法は、差別的に標識されるプローブ(通常、フルオロフォア標識抗体プローブ)で、細胞表面局在タンパク質を標識することに基づく。例えば、細胞表面局在タンパク質の発現について陽性の細胞を調査することができる。この方法は、細胞の一体性を保存し、その生存性を維持するように設計された条件下で最も通常に用いられる。
もし細胞に導入される蛍光原性プローブの標的RNAが存在すれば、細胞は蛍光を発する。この情報は蛍光顕微鏡(共焦点顕微鏡、レーザー走査顕微鏡または他のタイプの顕微鏡を含む)またはFACSの使用によって定量的に評価することができ、それはこれらのいずれかによって定量可能でもある。例えば、イン・サイチュ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を組織のスライスに対して行って、特定のRNAについての発現のパターンを判定する代わりに、シグナリングプローブを用いて、同一実験を行う。さらに、各々が特異的RNAを標的化する、異なる蛍光性の発蛍光プローブの組合せを用い、1つの工程で目的の数個のRNAの存在または量につきアッセイする。(固定された試料中の)RNAの検出を経験的に決定された温度で行って、非標的特異的シグナル発生を制限することができる。核酸プローブを用いる場合、標的検出のための最適な温度条件を確立するのは通常の方法である(細胞および組織におけるRNAの検出と組み合わせ抗原の局在化)。
本発明の方法を用い、多数の選択薬剤の混合物の存在下で(または他の選択剤を用いて)これらの細胞を維持する必要性がなくとも、いずれかの数のRNAまたはタンパク質を発現する安定にトランスフェクトされた細胞株が非常に迅速に作製される。遺伝子トランスフェクション(および所望により、薬物−選択)に続いて、シグナリングプローブの組合せ(1つが各タンパク質についてのメッセージに対する)が細胞に導入される。遺伝子のうちの1つのみのmRNAに、またはメッセージが関連するタグ配列にハイブリダイズするように、各蛍光原性プローブの標的相補的配列を設計することによって、各シグナリングプローブは、遺伝子のうちの1つのみによってコードされるmRNAを認識するように設計される。1つの実施形態においては、次いで、細胞は、FACSによって分類される。1つまたは複数のシグナルについて選択することによって、種々の細胞株を単回の適用で作製する。
高度に過剰発現されるべき各遺伝子については、例えば、同一遺伝子についての2以上の配列を、まず、薬物耐性または他の選択マーカーを必要に応じてまた付与するDNA構築物中に、クローン化する。各遺伝子についての複数配列の各々を、異なるタグ配列をコードする配列を含むように設計する。1つの実施形態において、細胞へのDNA構築物のトランスフェクション、およびその後の選択に続き、その各々が1つのみのタグ配列に標的化され、差別的に蛍光的に標識される蛍光原性プローブが細胞に導入され、細胞ソーターを用いて、それらのシグナルにつき陽性である細胞が単離される。そのような細胞は、差別的にタグ化された配列の各々の少なくとも1つのコピーをそれらのゲノムに導入され、したがって、目的の配列の発現が、増大した数の、目的の配列の実質的に同一のコピーから生じる。目的の配列は細胞中のゲノムの種々の位置に一体化させることができる。この方法をFACSの使用と組み合わせて用いて、各フルオロフォアのシグナルについて最も強いスコアを示す細胞を拾い出す。上記種々のタグの一部または全ては、同一であり得、したがってこの共通配列に対する共通の1つのシグナリングプローブを用いて、細胞における種々のタグの全てを検出することができる。
複数のアンチセンスメッセージを生じる安定にトランスフェクトされた細胞株は以下のように作製される。このようなアンチセンスメッセージは、mRNAまたは他のRNAいずれかを標的とする。トランスフェクトされたアンチセンス配列のうちのいずれか1つを異なるレベルで発現する細胞を選択する。安定なトランスフェクションの反復されたラウンドを通じて、限定されない数のRNAのアンチセンスメッセージを発現する安定にトランスフェクトされた細胞株を生起する細胞が容易に選択される。
複数の細胞を、発現ライブラリーを形成するDNA構築物でトランスフェクトする。DNA配列の発現ライブラリーとしては、限定されるものではないが、例えば、全生物、組織、細胞もしくは細胞株から作製されたcDNAまたはESTライブラリーを含めた当該分野で公知の種類のいずれかまたはこれらの混合物、および限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、またはペプチドをコードする配列を含めた合成ライブラリーが挙げられ得る。同様に、発現ライブラリーとして特異的に設計されていないDNA構築物のライブラリーが使用され得る。例えば、DNA構築物ライブラリーは、プロモーター、リプレッサーまたはエンハンサーエレメントのような調節機能を有し得るDNAの配列を含み得、これらは構成的であっても、誘導的であっても、抑制的であってもよい。同様に、DNA構築物ライブラリーは、それから転写が起こり得る全遺伝子座もしくは部分的遺伝子座またはゲノムDNAのようなDNAの大きなセグメントを含み得る。DNA構築物のこれらの発現ライブラリーのいずれも、各々、全体的または部分的に、突然変異され、ランダム化され、組換えられ、シャッフルされ、改変され得るか、あるいはそのいずれかの組合せで処理され得る。加えて、これらの型のライブラリーのいずれも、さらに、発現され、そしてシグナリングプローブのための標的として使用され得る少なくとも1つのタグを含み得る。
本発明の方法は、培養細胞において機能的ノックアウトを調製する手段を提供する。複数の遺伝子座から、ユニークなRNA配列に対するRNA干渉活性を有する実質的に同一のアンチセンスRNAまたはsiRNAを発現する細胞を作製することによって、目的のいずれか1つのタンパク質の機能的ノックアウトである細胞株が作製される。siRNAを用いる本発明の方法の任意のものがまた、shRNAを用いて実施され得る。例えば、その各々が、特定遺伝子に対するアンチセンスRNA、または上記遺伝子に対するRNA干渉活性を有するsiRNA、あるいは双方のいずれかをコードする複数の構築物を細胞にトランスフェクトする。ここに、各アンチセンスRNA配列は、各々がユニークなタグ配列のヌクレオチド配列をタグとして付された点でのみ異なる。異なってタグに付されたアンチセンスRNAの1つまたは複数または全てを発現する細胞が選択される。同様に、RNA干渉活性を持つ各siRNAまたはshRNAの存在は、各siRNAまたはshRNAが関連するタグの検出によって測定される。FACSを用いて先に記載されたように蛍光を定量化するので、この特徴により、アンチセンス配列のいずれか1つまたは複数を最も強く発現する細胞について選択するのが可能となる。所望の発現レベルの標的化されたRNAを呈するか、あるいは標的化されたRNAの発現レベルを増大させるように作用する、発現されたRNAのいずれかの数または組合せの発現に起因してその発現をほとんどまたは全く呈しない細胞を単離することが可能である。
単一遺伝子の異なってスプライシングされたバージョンは、しばしば、異なる機能を持つタンパク質に翻訳される。本発明の方法を用い、1以上のタンパク質の選択された交互にスプライシングされた形態のみが機能的ノックアウトされたか、または発現レベルが低下した細胞株を作製する。例えば、細胞から排除したい遺伝子のメッセンジャーRNAの交互にスプライシングされたバージョンのみを標的とするアンチセンスまたはsiRNAを設計することによって、目的の遺伝子の交互にスプライシングされたRNAの全てを機能的にノックアウトするか、あるいは目的の交互にスプライシングされたメッセージ以外を、その発現レベルを所望のレベルまで十分に低下させる。
例えば、相互に相互作用すると考えられるタンパク質の所定の群に対して、目的のタンパク質の1以上が機能的にノックアウトされたか、あるいは低下した発現レベルを有する安定にトランスフェクトされた細胞株を、アンチセンスまたはsiRNA(またはshRNA)の細胞の発現によって作製することによって、それらの相互作用を研究することができる。次いで、細胞における目的の残りのタンパク質の機能を調べることができるが、おそらくはより興味深いことには、それが次に1以上の目的の残りのタンパク質を過剰発現するように、それをさらに操作することによって、そのような細胞をさらに改変し得る。加えて、細胞中でのさらなるタンパク質の発現を、過剰発現させても、排除しても、低下させてもよい。再度、ある種のタンパク質またはある種のタンパク質の機能的ノックアウトの過剰発現は細胞にとって致死的であり得る可能性がある。これは、以下に取り組む問題である。
いくつかの目的に対して、培養物中の細胞の研究は十分ではない。しかしながら、上記した方法は、胚性幹細胞の操作に向けてそれ自体も役に立つ。上記した手順に従い、複数のRNAまたはタンパク質を発現するか、あるいは複数のタンパク質、または複数のタンパク質の交互にスプライシングされた形態の部分集合の機能的ノックアウトとして働くかのいずれかである胚性幹細胞を得ることができる。次いで、そのような胚性幹細胞は、トランスジェニック動物の作製のための基礎として使用される。
細胞における特定のタンパク質もしくはRNAの過剰発現または発現の欠如は、致死的、または損傷を与えかねない。しかし、毒性タンパク質またはRNAを過剰発現する細胞、あるいはそれがなければ細胞が生存できないタンパク質またはRNAの機能的ノックアウトである細胞を研究することは、非常に重要である。この目的で、細胞に対してそのような有害効果を有する選択されたRNAが誘導性または条件プロモーターの制御下にある、安定にトランスフェクトされた細胞を作製する。そのような細胞株を単離するためには、1つの実施形態において、トランスフェクトされ、必要に応じて薬物選択された細胞が、まず、誘導性遺伝子の転写に影響するよう最小限に誘導され、次いで、適当なRNAを認識するように設計されたシグナリングプローブのそれへのトランスフェクションに続いて、細胞がFACS分析に供される。得られた細胞は、必要な場合のみ、毒性RNAが誘導され、転写されるように維持される。
ある種の安定な細胞株に関与する組換え事象を受けた細胞を検出するためのシグナリングプローブの使用と平行して、生きた細胞の混合物から、他の特異的組換え事象を受けた細胞を検出し、単離するためのシグナリングプローブを使用する。同一の原理を用いて、例えば、VDJ組換え、トランスロケーション、およびウイルスゲノム組込みに対してアッセイし得る。
本明細書中に記載したシグナリングプローブの使用は、内部に局所化されたタンパク質、細胞表面に局所化されたタンパク質、または分泌されたタンパク質をコードするRNAの発現に基づき、ならびに細胞に存在し得る他のRNAについて細胞が分類されるのを可能とする。例えば、細胞の混合された集団から出発し、これらのタンパク質を生じるmRNAを認識するシグナリングプローブを設計することによって、目的の内部に局所化されたタンパク質を発現する細胞を単離する。これらのシグナリングプローブは、細胞の混合物にトランスフェクトされ、FACSを用いて、適切にはそれらを分類し得る。複数ラウンドのソーティングが実施され得る。
本発明は、シグナリングプローブとは対照的に、その標的核酸への結合に際してタンパク質分解活性を呈するプロテアーゼプローブの新規な形態にも指向される。そのようなタンパク質分解活性は、標的核酸が細胞に存在する場合、検出目的で、また、細胞において特定のタンパク質配列を分解させるのに用いることができる。例えば、特異的にウイルスタンパク質を切断するプロテアーゼは、潜伏感染におけるように、ウイルス配列の転写が活性化される場合に、そして例えば、プロテアーゼプローブがウイルスメッセージに対して向けられる場合に、活性化され得る。
a)少なくとも1つのRNAをコードするDNAを細胞に導入する工程;
b)上記少なくとも1つのRNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;および
c)上記シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
a)少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つのタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程;
b)タグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;および
c)シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
a)RNAおよび第一のタグ配列をコードする第一のDNA;および上記RNAおよび第二のタグ配列をコードする少なくとも第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここに、上記第一のタグ配列と第二のタグ配列とは異なる、工程;
b)上記第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションに対して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブ、および上記第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに対して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;ならびに
c)上記シグナリングプローブの少なくとも1つのシグナルを呈する細胞を単離する工程、
を包含する。
a)少なくとも1つのRNAを発現することが疑われる細胞を提供する工程;
b)少なくとも1つのRNAとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
a)少なくとも1つの外因性RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、ここに、上記細胞は潜在的に少なくとも1つの内因性RNAを発現する、工程;
b)上記少なくとも1つの外因性RNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第一のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)上記少なくとも1つの内因性RNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程であって、ここに、上記第二のシグナリングプローブは第一のシグナリングプローブのシグナルとは異なるシグナルを生じる、工程;ならびに
d)それらの各RNAへの上記シグナリングプローブのハイブリダイゼーションに際して上記シグナルの少なくとも1つを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
a)RNA転写産物とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに生物学的試料を暴露する工程;
b)生物学的試料におけるシグナルのレベルを定量する工程;および
c)少なくとも1つのmRNA転写産物の上記レベルとシグナルのレベルとを相関させる工程、
を包含する。
a)少なくとも第一のタンパク質をコードする少なくとも1つのRNA、および少なくとも第一のタグ配列をコードする少なくとも第一のDNA;および上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも第二のタグ配列をコードする少なくとも第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここに、上記第一のタグ配列と第二のタグ配列は異なる、工程;
b)上記少なくとも第二のタンパク質のmRNA転写産物に結合し、またはそれに干渉する少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAをコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
c)上記少なくとも第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第一のシグナリングプローブ、および上記少なくとも第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
d)上記少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;ならびに
e)それらの各RNAへの上記シグナリングプローブのハイブリダイゼーションに際して上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程、
を包含する、少なくとも第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも第二のタンパク質につき機能的にヌルであるものを発現するか、または発現が低下した細胞を単離するための方法を提供する。
a)個々の化合物または化合物のセットを細胞に加える工程;
b)少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)上記細胞においてシグナルのレベルを定量する工程;
d)化合物を加えない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程;ならびに、必要に応じて、
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する工程、
を包含する、少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する方法を提供する。
a)少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を潜在的に調節する試験RNA配列をコードする少なくとも1つの構築物を細胞に導入する工程;
b)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)上記細胞におけるシグナルのレベルを定量する工程;
d)試験RNA配列無しの細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を選択する工程;ならびに、必要に応じて、
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する試験RNA配列を同定する工程、
を包含する、少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節するRNA配列を同定する方法を提供する。
a)組換え配列から転写されたもの、および非組換え配列から転写されたものからなる群から選択されるRNA配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程;および
b)上記RNA配列を発現する上記細胞を検出する工程、
を包含する、生きた細胞において遺伝子的組換え事象を同定するための方法も、本明細書において提供される。
シグナリングプローブを細胞に導入するのに使用され得る試薬は、限定されるものではないが、タンパク質、脂質、ポリマー、抽出物またはこれらの化合物もしくは混合物を含めた種々の化学物質を試験することによって同定され得る。化学物質は、気体、液体、または固体の形態であってよい。これは、限定されるものではないが、有機溶媒および水性溶媒、緩衝化溶液または培地またはこれらの任意の組合せを含めた種々の溶媒において、1:1,000,000,000〜1,000,000,000:1の範囲の種々の比率で化学物質をシグナリングプローブと混合することによってなされ得る。ここで、上記混合物は、1分〜48時間の範囲の種々の時間の間インキュベートされ、そして上記インキュベーションは、何も行わないか、ないし温和な振盪、または揺動ないしボルテックス、または一定のピペッティングの種々の程度の攪拌または混合を行いつつ、0℃未満〜100℃を超える範囲の種々の温度条件下で行われ、そして、上記インキュベーションは明所または暗所にて、あるいは種々の他の環境条件下で行われる。次に、混合物は、細胞に適用され、プローブの送達は、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー技術を使用するか、あるいはFACSまたは他の蛍光検出方法によってアッセイされる。これは、例えば、引き続いての高スループット分析に適合可能な、96ウェルプレート、384ウェルプレートもしくは1536ウェルプレートにて、またはビーズにて行われ得る。ビーズを用いる場合、FACSを用いて、ビーズは分析または単離され得、それらがさらにコードされる場合、単離されたビーズを用いて、それらが処理された混合物の同一性を決定し得ることに注意されたい。
一般的プロトコル。出発材料;シグナリングプローブは、DNA構築物からいずれのRNAも発現していない細胞に導入することができるか、あるいはそれらを用いて、DNA構築物からコードされたRNAメッセージを検出することができる。シグナリングプローブをこれらの2つの型の細胞のいずれかに導入する方法は同一である。以下のプロトコルは、分析すべき細胞が相互から分離可能であって、かつFACS分析に使用できることのみを必要とする。
1)シグナリングプローブの細胞へのトランスフェクション:シグナリングプローブは、RNAにおいて内因的な配列へハイブリダイズすること、または天然RNA配列に付加したタグへハイブリダイズすることのいずれかによって、所望のRNAを認識するように設計されなければならない。シグナリングプローブの設計は、本発明の説明おいて詳しく述べる。
(1以上のRNAを発現する細胞株の作製)
FACS選択に続き、陽性スコアリング細胞を、発明の説明においてより詳細に記載したように適当な培地中に維持することができる。これらの細胞は、目的のRNAを発現する細胞株を生じる。
(シグナリングプローブへの細胞の暴露)
限定されるものではないが、マイクロインジェクション、渦巻または混合のような機械的剪断力、ニードルの通過、または掻き落としを含めた細胞負荷技術、特定の抗生物質もしくは洗剤または試薬もしくは溶媒の組合せのような試薬を用いる浸透化のような当該分野で公知の方法を含めた、分子を細胞に導入する種々の方法を用いるか、あるいは種々の化学的特性(例えば、リポソームベース、化学物質、またはタンパク質ベース)を有する種々のトランスフェクション試薬の使用を通じて、またはこれらの方法のいずれか1以上の組合せを通じて、表面または溶液中に付着した細胞、部分的に付着した細胞、または沈降した細胞をFPに暴露することができる。
FPへの暴露の前(細胞プレーティング方法1)またはそれと同日に細胞を組織培養のウェルにプレートするか(細胞プレーティング方法2)、あるいは細胞をFPへの暴露同日にミクロ遠心機チューブに移した(細胞プレーティング方法3)。
商業的に入手可能なトランスフェクション試薬を用い、かつ製造者によって記載された以下のプロトコルに従い、FPを細胞調製への添加のために調製した。製造者のプロトコルは、複数パラメーターは、いずれの細胞型を用いるか、いずれのコンフルエンスまたは濃度にて細胞を処理すべきか、いずれの特定の分子を導入すべきか、いずれの割合および絶対量にて種々の試薬を組み合わせるべきか、そしていずれの間種々の工程を行い、またはインキュベートすべきか、いずれの工程を省略できるか、および他の変数を含めた複数の変数に対して経験的に決定される必要があることを指示する。製造者のプロトコルにおいて、特定の範囲が提供されているが、上記プロトコルはまた、これらは超過されなければならない可能性があり、あるいは他のパラメーターはそれらの試薬の首尾のよい使用のために最適化されなければならない可能性があることも示唆する。一般には、細胞のFPへの暴露は、製造者のプロトコルによる予備的範囲として提案された範囲内にあるこれらの条件のためのパラメーターを用いて行った。
24ウェルプレートのウェル当たりほぼ1×105細胞/mLかつ0.5mLにおいて、FPへの暴露の前日に細胞をプレートした。用いた細胞を薬物でトランスフェクトし、r−vavをコードする発現構築物について選択した。
上記したように細胞をFPに暴露し、次いで、処理して、それらが付着している場合それらを表面から脱着させ、(例えば、(他の酵素または非酵素手順を用いることができるが)トリプシンを用いることによって)それらを相互から分離し、次いで、それらをFACSに適用する。
細胞中の1以上の遺伝子の発現レベルを経時的にモニターすることができる。例えば、配列を認識するように設計されたFPを用いる配列の発現について陽性として単離された細胞に由来する細胞株を考慮すると、細胞およびコントロール細胞をFPに暴露することができ、そしてFPによって発せられたシグナルについての2つの細胞型の蛍光強度の比率を測定することができる。この手法は経時的に反復することができ、比率の変化はFPによって検出されるべき配列についての発現の相対的レベルの変化を反映する。この手順は複数FPを用いて行うことができる。
タグ1についての配列を用いて、シグナリングプローブの標的配列が同様に結合につき示されるように、シグナリングプローブの結合に最も直接的に関与する構造の領域に特に関与して同一または同様な予測される構造を有する配列を作製する意図をもって、配列の各々をユニークなシグナリングプローブによって認識できるように、2つのさらなる異なる配列を作製した。作製された2つの異なるタグ配列(タグ2およびタグ3)の各々については、タグ1についての元の配列内の標的化配列をまず変化させ、これらの同一位置での相互作用を維持する努力において変化した配列と相互作用することが予測されたいくつかのさらなる塩基に対して、補償変化を行った(図43および44)。新しい配列の予測された配列を得、もしそれがタグ1の予測された構造に密接にマッチしないならば、上記構造を用いて、いずれのさらなる変化が必要であるかを予測した。これは、タグ1の構造と同様な予測された構造を有する新規な配列が得られるまで行った反復プロセスである。これらの配列に対してなされた変化は、塩基の置換、欠失および付加を含む。
FP17は、相互作用対に隣接する7塩基対の相互に相補的な領域を形成すると予測される。コントロールオリゴと比較して、標的オリゴの存在下でインキュベートした場合、より強い蛍光シグナルをFP17が与えるため上昇した温度が必要であった。例えば、これはそれらを90〜95℃の熱水中に軽く入れることによる。ここで用いるチューブは、ほぼ2.34mMの最終マグネシウム濃度を有する、5uLの20uM FPストック、1.5uLの25mM MgCl2、8uLの20uMオリゴ、および1.5uLの水よりなる合計16uLを含有した。用いた標的オリゴはTO−FP1であり、用いたコントロールオリゴは上記したようなTO−FP18であった。
FP1プローブ配列に基づく15の異なる化学的に改変したプローブを合成した。これらのプローブの全ては同一配列を有し、同一標的配列に対して向けられる。プローブを293T細胞に導入した。これらの細胞はFP1の標的配列を含むタグ配列を発現する。FACSを用いて、これらの細胞からの蛍光を分析した。15の異なるプローブを以下に記載する。FACS分析の結果を図46〜60に示す。結果は、15個の全てのプローブは、標的配列を発現する細胞を検出することができることを示す。プローブの全ては、化学的改変を除いて、濃度、送達の方法、フルオロフォア、クエンチャーおよび配列に関して同一であった。
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WO2008066909A1 (en) * | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Chromocell Corporation | Optimized host cells for protein production |
MX2009008470A (es) | 2007-02-09 | 2009-11-26 | Univ Northwestern | Particulas para detectar objetivos intracelulares. |
JP5126877B2 (ja) * | 2007-06-26 | 2013-01-23 | 独立行政法人理化学研究所 | 一塩基変異体の検出方法 |
US20100311610A1 (en) | 2008-02-01 | 2010-12-09 | Chromocell Corporation | CELL LINES AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM (As Amended) |
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WO2010099662A1 (zh) * | 2009-03-05 | 2010-09-10 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种用于核酸实时检测的探针 |
US8945848B2 (en) | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Chromocell Corporation | Methods and compositions for identifying and validating modulators of cell fate |
BR112012002454A2 (pt) | 2009-08-05 | 2017-07-04 | Chromocell Corp | plantas, micróbios e organismos melhorados |
US9139860B2 (en) * | 2011-04-11 | 2015-09-22 | Korea University Research And Business Foundation | Signal-amplifying folded oligonucleotide |
EP2755692B1 (en) | 2011-09-14 | 2020-11-25 | Northwestern University | Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier |
US9347934B2 (en) | 2011-10-20 | 2016-05-24 | Chromocell Corporation | Assays for identifying compounds that modulate bitter taste |
EP2980225B1 (en) * | 2012-04-20 | 2017-11-08 | Alacris Theranostics GmbH | Cdr sequence-specific enrichment of live immune cells |
EP2970971B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-02 | Kambiz Shekdar | Genome editing using effector oligonucleotides for therapeutic treatment |
WO2014144991A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Chromocell Corporation | Methods and materials using signaling probes |
AU2014257086A1 (en) | 2013-04-24 | 2015-11-12 | Chromocell Corporation | Assays for identifying compounds that modulate bitter taste |
CA2968531A1 (en) | 2014-11-21 | 2016-05-26 | Northwestern University | The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates |
US11364304B2 (en) | 2016-08-25 | 2022-06-21 | Northwestern University | Crosslinked micellar spherical nucleic acids |
US20210293783A1 (en) | 2017-04-18 | 2021-09-23 | The General Hospital Corporation | Compositions for detecting secretion and methods of use |
KR102182575B1 (ko) * | 2017-10-23 | 2020-11-26 | 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 | 스펙트럼 산란 유세포 분석을 위한 광학적 구성 방법 |
CN108531566A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-09-14 | 厦门基科生物科技有限公司 | 基于复合编码探针杂交的dna检测方法及复合编码探针 |
US20210147831A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-05-20 | The Broad Institute, Inc. | Sequencing-based proteomics |
CN117467751B (zh) * | 2023-12-27 | 2024-03-29 | 北京百力格生物科技有限公司 | 靶向目的基因fish荧光探针及其自组装放大探针系统 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003054223A2 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Mcmaster University | Tripartite molecular beacons |
US20040005595A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-01-08 | Browne Kenneth A. | Inversion probes |
US6692965B1 (en) * | 1999-11-23 | 2004-02-17 | Chromocell Corporation | Isolation of living cells and preparation of cell lines based on detection and quantification of preselected cellular ribonucleic acid sequences |
Family Cites Families (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU658132B2 (en) | 1989-11-13 | 1995-04-06 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA |
AU669353B2 (en) | 1991-12-24 | 1996-06-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5629147A (en) | 1992-07-17 | 1997-05-13 | Aprogenex, Inc. | Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization |
BR9306867A (pt) | 1992-07-17 | 1998-12-08 | Aprogenex Inc | Enriquecimento e identificação de células fetais do sangue materno para a hibridização in situ |
JPH08503957A (ja) | 1993-02-19 | 1996-04-30 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | シクロブチルアンチセンスオリゴヌクレオチド、その作成および使用方法 |
US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
EP0760008A1 (en) | 1994-05-19 | 1997-03-05 | Dako A/S | Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis |
US5641675A (en) | 1994-10-07 | 1997-06-24 | University Of Massachusetts Medical Center | Cis-acting sequences for intracellular localization of RNA |
JPH10509586A (ja) | 1994-10-14 | 1998-09-22 | ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト | 機能的に破壊されたインターロイキン−1β変換酵素遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物 |
US5783683A (en) | 1995-01-10 | 1998-07-21 | Genta Inc. | Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene |
US5741657A (en) | 1995-03-20 | 1998-04-21 | The Regents Of The University Of California | Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use |
US5731148A (en) | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
US6057103A (en) | 1995-07-18 | 2000-05-02 | Diversa Corporation | Screening for novel bioactivities |
US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
US20030215798A1 (en) * | 1997-06-16 | 2003-11-20 | Diversa Corporation | High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes |
US5866336A (en) * | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
US6361944B1 (en) | 1996-07-29 | 2002-03-26 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US7098320B1 (en) | 1996-07-29 | 2006-08-29 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
GB9701492D0 (en) | 1997-01-24 | 1997-03-12 | Univ Edinburgh | Transfection of embryonic stem cells |
US6416959B1 (en) | 1997-02-27 | 2002-07-09 | Kenneth Giuliano | System for cell-based screening |
US6750052B1 (en) | 1997-07-23 | 2004-06-15 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lens epithelial cell derived growth factor |
AU9220498A (en) | 1997-09-04 | 1999-03-22 | Bayer Corporation | Oligonucleotide probes bearing quenchable fluorescent labels, and methods of usethereof |
US6485901B1 (en) * | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
EP1049803A4 (en) * | 1997-12-15 | 2002-08-21 | Nexstar Pharmaceuticals Inc | HOMOGENEOUS DETECTION OF TARGET MOLECULES BY LIGAND NUCLEIC ACID AND LIGAND BEACON INTERACTION |
DE1051515T1 (de) | 1998-01-27 | 2001-04-19 | Cytocell Ltd., Banbury | Modifizierte nuklein-säure sonden und dessen verwendungen |
KR20010042167A (ko) * | 1998-03-24 | 2001-05-25 | 보스턴 프로브스, 인코포레이티드 | 검출 복합체에 관한 방법, 키트 및 조성물 |
US6461864B1 (en) | 1998-04-15 | 2002-10-08 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and vector constructs for making non-human animals which ubiquitously express a heterologous gene |
DE69941333D1 (de) * | 1998-07-02 | 2009-10-08 | Gen Probe Inc | Molekulare fackeln |
US6037130A (en) | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
US6203986B1 (en) | 1998-10-22 | 2001-03-20 | Robert H. Singer | Visualization of RNA in living cells |
WO2000031302A1 (en) | 1998-11-25 | 2000-06-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | In situ binary synthesis of biologically effective molecules |
EP1151139A2 (en) | 1999-01-25 | 2001-11-07 | UT-Battelle, LLC | Multifunctional and multispectral biosensor devices and methods of use |
EP1175616A4 (en) | 1999-04-13 | 2003-08-13 | Northwest Biotherapeutics Inc | METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING METASTATIC PROSTATE TUMORS |
GB2355791B (en) | 1999-10-28 | 2004-10-20 | Molecular Light Tech Res Ltd | Detection of mRNA expression using chemiluminescent labelled probes |
CN1180091C (zh) * | 1999-12-08 | 2004-12-15 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一种复合基因探针的结构和用途 |
JP3460673B2 (ja) | 2000-02-04 | 2003-10-27 | 浜松ホトニクス株式会社 | 特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法 |
EP1172445A1 (en) | 2000-07-14 | 2002-01-16 | Praenadia GmbH | A method for direct genetic analysis of target cells by using fluorescence probes |
WO2002018951A2 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-07 | The Rockefeller University | Methods employing fluorescence quenching by metal surfaces |
AU2002213096B2 (en) | 2000-10-06 | 2007-03-29 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences |
US6350580B1 (en) | 2000-10-11 | 2002-02-26 | Stratagene | Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure |
WO2002061133A2 (en) | 2000-11-09 | 2002-08-08 | Yale University | Nucleic acid detection using structured probes |
JP2004516834A (ja) | 2000-12-22 | 2004-06-10 | ユニヴァーシティー オブ エディンバラ | 胸腺上皮前駆細胞およびその使用 |
US20020090614A1 (en) | 2001-01-09 | 2002-07-11 | Jia Zhang | Direct measurement method for gene expression using single chain antisense array |
EP1409735A4 (en) * | 2001-06-25 | 2005-10-05 | Georgia Tech Res Inst | DOUBLE-RESONANCE ENERGY TRANSFER NUCLEIC PROBES |
EP1373473A4 (en) | 2001-12-04 | 2005-02-16 | Genome Biosciences Llc | METHOD AND VECTORS FOR GENE TARGETING |
EP1405908A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-04-07 | ProBioGen AG | Creation of high yield heterologous expression cell lines |
CN1206368C (zh) * | 2003-03-05 | 2005-06-15 | 东南大学 | 固相化核酸检测探针及其制备方法 |
MX2009008470A (es) | 2007-02-09 | 2009-11-26 | Univ Northwestern | Particulas para detectar objetivos intracelulares. |
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Patent Citations (3)
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---|---|---|---|---|
US6692965B1 (en) * | 1999-11-23 | 2004-02-17 | Chromocell Corporation | Isolation of living cells and preparation of cell lines based on detection and quantification of preselected cellular ribonucleic acid sequences |
US20040005595A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-01-08 | Browne Kenneth A. | Inversion probes |
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Non-Patent Citations (4)
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JPN6010025416; Antisense Nucleic Acid Drug Develop. Vol.12, 2002, p.225-233 * |
JPN6011028130; Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.91, 1994, p.12549-12553 * |
JPN6011028133; Human Mol.Genet. Vol.8, No.10, 1999, p.1925-1938 * |
JPN6011028136; J.Cell.Biochem. Vol.80, 2000, p.156-168 * |
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