JP2007522818A - シグナリングプローブを使用する方法および材料 - Google Patents

シグナリングプローブを使用する方法および材料 Download PDF

Info

Publication number
JP2007522818A
JP2007522818A JP2006554209A JP2006554209A JP2007522818A JP 2007522818 A JP2007522818 A JP 2007522818A JP 2006554209 A JP2006554209 A JP 2006554209A JP 2006554209 A JP2006554209 A JP 2006554209A JP 2007522818 A JP2007522818 A JP 2007522818A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
cell
cells
sequence
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006554209A
Other languages
English (en)
Inventor
カムビズ シェクダー,
デニス ジェイ. ソウチュク,
ジェイソン エム. モンテズ,
Original Assignee
クロモセル コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by クロモセル コーポレイション filed Critical クロモセル コーポレイション
Publication of JP2007522818A publication Critical patent/JP2007522818A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6841In situ hybridisation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C40COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40BCOMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301Hairpin oligonucleotides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Variable-Direction Aerials And Aerial Arrays (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Ultrasonic Waves (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials Using Thermal Means (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本発明は、標的配列へのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じるシグナリングプローブを用いて細胞を単離し、または細胞株を作製する方法に関する。シグナリングプローブを利用する他の方法としては、RNA発現のレベルを定量化する方法、生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法、および単離された細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法が挙げられる。本発明はプロテアーゼプローブも提供する。ステム−ループ構造、3アーム接合構造、およびダンベル構造を形成するシグナリングプローブおよびプロテアーゼプローブを提供する。

Description

本出願は、2004年2月18日に出願された米国仮特許出願第60/546,075号の優先権を主張し、この開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
(発明の背景)
特異的核酸配列の存在を認識し、報告する核酸プローブは、主としてインビトロ反応において特異的核酸を検出するのに用いられてきた。例えば、特許文献1を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される。プローブの1つの型は、標的配列に相補的なヌクレオチドの中央ストレッチおよび短い互いに相補的な配列を含む末端と共に、ヘアピン形状の構造を有するように設計される。例えば、非特許文献1を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される。ステム−ループ形状のプローブの1つの末端は、フルオロフォアに共有結合しており、他の末端は消光部分に共有結合している。末端がハイブリダイズしたその天然状態にある場合、フルオロフォアおよびクエンチャーの近傍は、比較的ほとんど蛍光が生じないか、または本質的に全く蛍光が生じないようにされている。ステム−ループプローブは、フルオロフォアからの蛍光の生成に検出可能な変化を生じるその標的核酸へハイブリダイズする場合、立体配座の変化を受ける。研究者は、生きた細胞においてメッセンジャーRNAのイン−サイチュの可視化を行うためにヘアピン形状のプローブを用いてきた(非特許文献2)。
米国特許第5,925,517号明細書 TyagiおよびKramer、「Nature Biotechnology」、1996年、第14巻、p.303−308 Matsuo、「Biochim.Biophys.Acta」、1998年、第1379巻、p.178−184
(発明の要旨)
本発明は、1つ以上のRNAを発現する細胞を分析し、もしくは単離し、または1つ以上のRNAを発現する細胞株を作製するための新規なシグナリングプローブを含む方法および組成物を提供する。上記方法は、標的配列とのそのハイブリダイゼーションの際にプローブによって生じるシグナルの検出に基づく。上記RNAはDNA構築物を介して細胞に導入され得るか、または細胞は内因的にRNAを発現することが疑われ得る。上記DNA構築物は、さらに、タグ配列をコードし得、上記シグナリングプローブはタグ配列に対して相補的である。1つの実施形態において、単離された細胞、または作製された細胞株は発現に対して機能的にヌルであるか、または1つ以上の予め選択されたタンパク質またはRNAの発現が低下している。本発明はまた、記載された方法に従って単離された細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。
本発明は、1つ以上のRNA転写産物の発現レベルを定量化するための方法で用いられるシグナリングプローブを提供する。さらに、上記シグナリングプローブは、少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物またはRNA配列を同定するための方法で用いられる。別の実施形態において、上記シグナリングプローブは、生きた細胞における遺伝的組換え事象を同定するための方法で用いられる。上記シグナリングプローブはヌクレオチドの1つ以上の鎖を含み、ここで、上記シグナリングプローブは目的の標的核酸(例えば、RNA)に相補的なヌクレオチドを含み、そしてここで、上記シグナリングプローブは、さらに、2つの部分を含む相互作用する対を含む。上記シグナリングプローブの構造は、シグナリングプローブが標的配列にハイブリダイズしていない場合には、相互作用する対の2つの部分が、シグナルを生じないか、またはバックグラウンドシグナルが生じるように物理的に位置するようにされる。上記シグナリングプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、2つの部分は、シグナルが生じるようにされる。あるいは、シグナリングプローブの部分は、プローブが標的にハイブリダイズしない場合には、特定のシグナルが生じ、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に異なるシグナルが生じるようにされ得る。相互作用する対の2つの部分は、シグナリングプローブの1つ以上の鎖の1つ以上の末端に結合され得る。あるいは、上記部位は、シグナリングプローブの1つ以上の鎖の内部に組み込まれ得る。シグナリングプローブのヌクレオチドもまた修飾され得る。
また、本発明は、プロテアーゼプローブを提供する。1つの実施形態において、シグナリングまたはプロテアーゼプローブは、その1つ以上の部分が互いにアニーリングする核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含み、1つの鎖の少なくとも1つの末端は他の鎖の末端に隣接する。核酸はDNAまたはRNAであり得る。2つの別個の鎖を有するシグナリングプローブでは、1つの実施形態において、1つの鎖は1つの末端に少なくとも1つのクエンチャー部分を有し、他の鎖は隣接する末端に少なくとも1つのフルオロフォアを有する。プロテアーゼプローブでは、1つの実施形態において、1つの鎖は1つの末端に少なくとも1つのタンパク質分解酵素を有し、他の鎖は隣接する末端に少なくとも1つのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
別の実施形態においてシグナリングまたはプロテアーゼプローブは、少なくとも1つの互いに相補的な領域および少なくとも1つの非相補的領域を含むように設計される。1つの実施形態において、少なくとも1つの非相補的領域はループ領域を形成するように設計され得る。1つの実施形態において、上記プローブは少なくとも1つのステム−ループ構造を形成するように設計される。別の実施形態において、上記プローブはダンベル構造または3アーム接合構造を形成する。1つの実施形態において、シグナリングプローブは鎖の各末端において少なくとも1つのフルオロフォアおよび少なくとも1つのクエンチャー部分を有する。1つの実施形態において、プロテアーゼプローブは鎖の各末端においてタンパク質分解酵素およびタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
別の実施形態において、上記シグナリングまたはプロテアーゼプローブは化学的に修飾される。1つ以上の糖−ホスホジエステルタイプの骨格、2’OHおよびプリンまたはピリミジン塩基が修飾される。1つの実施形態において、デオキシリボース骨格はペプチド核酸によって置換される。
1つの実施形態において、タグ配列は構造RNAであり、すなわち、このRNAは二次構造、好ましくは、3アーム接合構造を有する。1つの実施形態において、タグ配列は図42A、BまたはCに従った構造または配列を含む。また、本発明は、少なくとも1つの目的のRNAをコードする少なくとも1つのDNAおよびタグ配列を含むDNA構築物を提供する。また、本発明は上記DNA構築物を含むベクターおよび細胞を提供する。
他の実施形態において、以下が提供される:
1.少なくとも1つのRNAを発現する細胞を単離するための方法であって、以下:
a)少なくとも1つのRNAコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つのRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
2.段落1に記載の方法であって、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも1つのRNAを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、方法。
3.2つ以上のRNAのうち少なくとも1つを発現する細胞を単離するための方法であって、以下:
a)第一のRNAをコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
b)少なくとも1つの第二のRNAをコードする少なくとも1つの第二のDNAを上記細胞に導入する工程;
c)上記細胞を、上記第一のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記少なくとも1つの第二のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
e)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する方法。
4.段落3に記載の方法であって、さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記2つ以上のRNAのうち少なくとも1つを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、方法。
5.複数の細胞を単離するための方法であって、ここで、上記細胞の少なくとも1つの部分は少なくとも1つの異なるRNAを発現し、以下:
a)複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、上記細胞の少なくとも1つの部分は、少なくとも1つの異なるRNAをコードする少なくとも1つの異なるDNAが導入される、工程;
b)上記細胞を、複数のシグナリングプローブに連続してまたは同時に暴露する工程であって、上記シグナリングプローブは、上記複数のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;および
c)シグナルを生じる上記細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
6.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、少なくとも1つの異なるRNAを発現する複数の細胞株を作製する工程を包含する段落5に記載の方法。
7.少なくとも1つのRNAを発現する細胞を単離するための方法であって、以下:
a)上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つのタグ配列をコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記タグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
8.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも1つのRNAを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落7に記載の方法。
9.2つ以上のRNAのうちの少なくとも1つを発現する細胞を単離するための方法であって、以下:
a)第一のRNAおよび少なくとも1つの第一のタグ配列をコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
b)少なくとも1つのさらなるRNAおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードする少なくとも1つの第二のDNAを上記細胞に導入する工程であって、上記第二のタグ配列は上記第一のタグ配列と同一であるかまたは異なる、工程;
c)上記細胞を、上記第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
e)上記シグナリングプローブの、それらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する方法。
10.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記2つ以上のRNAのうちの少なくとも1つを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落9に記載の方法。
11.上記第一のRNAの上記工程が、上記少なくとも1つのさらなるRNAの対応する工程と同時に、または連続して行われる段落3または9に記載の方法。
12.2つ以上のRNAまたは上記2つ以上のRNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、複合体を形成するRNAまたはタンパク質、タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、段落3または9に記載の方法。
13.少なくとも1つのRNAを過剰発現する細胞を単離する方法であって、以下:
a)上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つの第一のタグ配列をコードする少なくとも1つの第一のDNA;および上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードする少なくとも1つの第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、第一および第二のDNA構築物の導入は、順次または同時に行われ、上記第一および第二のタグ配列は同一であるか、または異なる、工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つの第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに、および上記少なくとも1つの第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルのうちの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
14.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記RNAを過剰発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落13に記載の方法。
15.上記第一のシグナリングプローブが、上記第二のシグナリングプローブによって生じたシグナルとは異なるシグナルを生じる、段落3、9および13のいずれか1つに記載の方法。
16.上記第一のシグナリングプローブの上記工程が、上記第二のシグナリングプローブの対応する工程と同時または連続して行われる、段落13に記載の方法。
17.上記第一のDNAおよび上記第二のDNAが同一の構築物または異なる構築物上に存在する、段落3、9および13のいずれか1つに記載の方法。
18.複数の細胞を単離するための方法であって、ここで、上記細胞の少なくとも1つの部分は、少なくとも1つの異なるRNAを発現する方法であって、以下:
a)複数のRNAおよび少なくとも1つのタグ配列をコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、上記細胞の少なくとも1つの部分は、少なくとも1つの異なるRNAをコードする少なくとも1つの異なるDNAに導入される、工程;
b)上記細胞を、上記タグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程、および、
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
19.上記複数のRNAが少なくとも1つの発現ライブラリーを形成する、段落18に記載の方法。
20.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、少なくとも1つの異なるRNAを発現する複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落18に記載の方法。
21.細胞の2つ以上のRNA発現ライブラリーのうちの少なくとも1つを単離する方法であって、以下:
a)少なくとも1つの第一のRNA発現ライブラリーおよび少なくとも1つの第一のタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程;
b)少なくとも1つの第二のRNA発現ライブラリーおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程であって、上記第二のタグ配列が上記第一のタグ配列と同一であるか、または異なる、工程;
c)上記細胞を、上記少なくとも1つの第一のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記少なくとも1つの第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程であって、ここで、上記第一のシグナリングプローブからの検出可能なシグナルは、上記第二のシグナリングプローブからの検出可能なシグナルと同一であるか、または異なる、工程;および
e)上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
22.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記2つ以上のRNA発現ライブラリーのうちの少なくとも1つを作製する工程を包含する、段落21に記載の方法。
23.上記複数のRNA、または上記複数のRNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、複合体を形成するRNAまたはタンパク質、タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、段落5または18に記載の方法。
24.上記複数のDNAの少なくとも1つの部分が同一のタグ配列をコードする、段落18に記載の方法。
25.上記タグ配列が少なくとも1つのシグナリングプローブによって認識される複数の標的配列を含む、段落7、9,13、18または21に記載の方法。
26.上記タグ配列が構造RNAである、段落7、9、13,18および21のいずれか1つに記載の方法。
27.上記タグ配列が3アーム接合構造を形成する、段落25に記載の方法。
28.上記ステム領域が8〜9の塩基対を含み、上記第一のステム−ループ領域が4〜6の塩基対を含み、および上記第二のステム−ループ領域が13〜17の塩基対を含む、段落27に記載の方法。
29.上記3つのアームのステム領域が、さらに、非相補性領域を含む、段落27に記載の方法。
30.上記ステム領域および上記第一のステム−ループ領域が、共に、さらに、1つのミスマッチ領域を含み、そして上記第二のステム−ループ領域が、さらに、2〜7つのミスマッチ領域またはバルジ領域(bulge region)を含む、段落27に記載の方法。
31.上記ステム領域の間の結合が合計8〜12のヌクレオチドを有する段落27に記載の方法。
32.上記タグ配列が図42A、BおよびCに示された配列からなる群より選択される、段落26に記載の方法。
33.上記タグ配列が、図42A、BまたはCに示された配列によって予測される、よりエネルギー的に好都合な構造を形成する、段落32に記載の方法。
34.上記標的配列が、上記第一のステムループ領域と上記第二のステムループ領域との間の結合に対して、上記第二のステムループ領域のステムの5’側の全てまたは部分に対して、上記第一のステムループ領域のステムの3’側の全てまたは一部由来の領域である、段落27に記載の方法。
35.上記DNAの少なくとも1つの部分が複数の同一のタグ配列をコードする、段落7、9、13、18および21のいずれか1つに記載の方法。
36.上記DNAの少なくとも1つの部分が50までの同一のタグ配列をコードする、段落35に記載の方法。
37.上記タグ配列をコードするDNAが上記RNAをコードするDNAとともにフレーム内にある、段落7、9、13、18および21のいずれか1つに記載の方法。
38.上記タグ配列をコードするDNAが上記RNAをコードするDNAとともにフレーム外にある、段落7、9、13、18および21のいずれか1つに記載の方法。
39.少なくとも1つのRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
a)上記少なくとも1つのRNAを潜在的に発現する細胞を提供する工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つのRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
40.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも1つのRNAを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落39に記載の方法。
41.上記細胞が、さらに、1つ以上のさらなるRNAを潜在的に発現する段落39に記載の方法であって、さらに、以下:
a)上記細胞を、上記少なくとも1つのさらなるRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのさらなるシグナリングプローブに暴露する工程;および
b)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
42.さらに、上記単離された細胞を増殖することによって、上記少なくとも1つのRNAおよびさらなるRNAを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落41に記載の方法。
43.さらに、工程a)の前に、上記RNA、さらなるRNAまたは複数のRNAの発現を調節しまたは調整する化合物を細胞に添加する工程を包含する、段落1、3、5,7、9、13、18および21のいずれか1つに記載の方法。
44.上記化合物が上記RNA、さらなるRNAまたは複数のRNAの発現を誘導する、段落43に記載の方法。
45.上記複数のRNAの上記工程が同時にまたは連続して行われる、段落5または18に記載の方法。
46.少なくとも1つの外因性RNAおよび少なくとも1つの内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
a)上記少なくとも1つの外因性RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、上記細胞は少なくとも1つの内因性RNAを潜在的に発現する、工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つの外因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
c)上記細胞を、上記少なくとも1つの内因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
d)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
47.さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも1つの外因性RNA、または上記少なくとも1つの内因性RNA、または両方を発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落46に記載の方法。
48.上記外因性RNAの上記工程が、上記内因性RNAの対応する工程と同時にまたは連続して行われる、段落46に記載の方法。
49.上記第二のシグナリングプローブが、上記第一のシグナリングプローブによって生じたシグナルとは異なるシグナルを生じる、段落46に記載の方法。
50.上記内因性RNAおよび上記外因性RNA、または上記内因性RNAおよび外因性RNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、複合体を形成するRNAまたはタンパク質、タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、段落46に記載の方法。
51.上記RNAが、タンパク質をコードするメッセンジャーRNA、ペプチドをコードするRNA、アンチセンスRNA、siRNA、tRNA、構造RNA、リボソームRNA、hnRNAおよびsnRNAの1つ以上を含む、段落1、3、5、7、9、13、18、21および39のいずれか1つに記載の方法。
52.上記タンパク質が細胞表面局所化タンパク質、分泌されたタンパク質および細胞内タンパク質からなる群より選択される、段落51に記載の方法。
53.少なくとも1つの第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも1つの第二のタンパク質についての発現が機能的にヌルであるか、または少なくとも1つの第二のタンパク質についての発現が低下した細胞を単離する方法であって、以下:
a)上記少なくとも1つの第一のタンパク質をコードする少なくとも1つのRNA、および少なくとも1つの第一のタグ配列をコードする少なくとも1つの第一のDNA;ならびに上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つの第二のタグ配列をコードする少なくとも1つの第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここで、上記第一および第二のタグ配列が異なる、工程;
b)上記少なくとも1つの第二のタンパク質のmRNA転写産物に結合し、またはそれに干渉する少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAをコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
c)上記細胞を、上記少なくとも1つの第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第一のシグナリングプローブに、および上記少なくとも1つの第二のタグ配列とのハイブリダイゼ−ションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程;
d)上記細胞を、上記少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
e)上記シグナリングプローブのそれらの各RNAへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
54.さらに、少なくとも1つの第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも1つの第二のタンパク質についての発現が機能的にヌルであるか、または少なくとも1つの第二のタンパク質についての発現が低下した細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落53に記載の方法。
55.上記第一のタンパク質の上記工程が、上記第二のタンパク質の対応する工程と同時にまたは連続して行われる、段落53に記載の方法。
56.上記DNAが条件プロモーターに操作可能に連結される、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39、および53のいずれか1つに記載の方法。
57.上記プロモーターが誘導性または抑制性であって、工程(a)の前に、最少量のインデューサーまたは十分量のリプレッサーが細胞に添加される、段落56に記載の方法。
58.上記RNAがアンチセンスRNAまたはsiRNAである、段落57に記載の方法。
59.上記RNAが細胞にとって致死的であるか、または損傷的である、段落57に記載の方法。
60.さらに、上記DNAを細胞に導入する工程の後であるが、上記細胞を上記シグナリングプローブに暴露する前に、細胞を選択する工程を包含する、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つに記載の方法。
61.少なくとも1つのDNAが、さらに、少なくとも1つの薬物耐性マーカーをコードし、かつ上記方法が、さらに、上記マーカーが耐性を付与する少なくとも1つの薬物に対して耐性である細胞を選択する工程を包含する、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つに記載の方法。
62.組織特異的プロモーターの制御下にあるRNA配列をコードするDNA構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下:
a)構成的プロモーターの制御下で少なくとも1つの第一のRNA配列をコードし、かつ組織特異的プロモーターの制御下で少なくとも1つの第二のRNA配列をコードする少なくとも1つのDNA構築物を細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記第一のRNA配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)上記シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
63.さらに、組織特異的プロモーターの制御下にあるRNA配列をコードするDNA構築物を含む細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落62に記載の方法。
64.上記組織特異的プロモーターが選択マーカー遺伝子の発現を制御する、段落62に記載の方法。
65.上記選択マーカー遺伝子が薬物耐性遺伝子または検出可能タンパク質遺伝子である、段落62に記載の方法。
66.組織特異的プロモーターを活性化する化合物を同定する方法であって、以下:
a)段落62から単離された細胞に化合物を添加する工程;
b)選択マーカーによって細胞を同定する工程;
c)上記組織特異的プロモーターを活性化する化合物として上記化合物を同定する工程;
を包含する、方法。
67.少なくとも1つの試験RNA配列、および組織特異的プロモーターの制御下にあるRNA配列をコードするDNA構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下:
a)構成的プロモーターの制御下にある少なくとも1つの試験RNA配列、同一または異なる第二の構成的プロモーターの制御下にある少なくとも1つの第二のRNA配列、および組織特異的プロモーターの制御下にある少なくとも1つの第三のRNA配列をコードする少なくとも1つのDNA構築物を細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記第二のRNA配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;および
c)シグナルを生じる細胞を単離する工程;
を包含する、方法。
68.さらに、少なくとも1つの試験RNA配列、および組織特異的プロモーターの制御下にあるRNA配列をコードするDNA構築物を含む細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落67に記載の方法。
69.上記試験RNA配列が発現ライブラリー由来である、段落67に記載の方法。
70.上記組織特異的プロモーターが選択マーカー遺伝子の発現を制御する、段落67に記載の方法。
71、上記選択マーカー遺伝子が薬物耐性遺伝子または検出可能タンパク質遺伝子である、段落67に記載の方法。
72.組織特異的プロモーターを活性化する試験RNA配列を同定する方法であって、以下:
a)選択マーカーによって段落67に記載の単離された細胞を同定する工程;
b)上記組織特異的プロモーターを活性化する試験RNA配列を同定する工程;
を包含する、方法。
73.段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つに記載の方法であって、さらに以下:
i)上記単離された細胞を、各RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;
ii)上記単離された細胞が各RNAを発現するか否かを決定する工程;または上記シグナルのレベルを定量して、各RNAの発現のレベルを決定する工程;
を包含する、方法。
74.上記細胞が細胞ベースのアッセイにおいて適用される、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つに記載の方法から得られた単離された細胞。
75.上記細胞が動物に移植可能である、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つの方法から得られた単離された細胞。
76.胚性幹細胞または動物に移植され得る細胞を利用して段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つに記載の工程を行う工程、上記幹細胞または細胞の生存度を決定する工程、および、上記生きた胚性幹細胞または細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する工程を包含する、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39および53のいずれか1つに記載のRNAを発現するトランスジェニック動物を作製する方法。
77.上記RNAがアンチセンスRNAまたはsiRNAであって、上記単離された細胞における少なくとも1つの予め選択されたタンパク質が、アンチセンスRNAの結合、または上記少なくとも1つの予め選択されたタンパク質のmRNA転写産物に対するsiRNAの干渉の結果として、機能的にヌルであるか、または低下した発現レベルを有する、段落1、3、5、7、9、13、18、21および39に記載の方法。
78.上記予め選択されたタンパク質が遺伝子産物の別のスプライシングされた形態である、段落77に記載の方法。
79.トランスジェニック動物を作製する方法であって、少なくとも1つの予め選択されたタンパク質が発現に対して機能的にヌルであるか、または発現が低下している方法であって、以下、段落77に記載の工程を実施する工程、胚性幹細胞または動物に移植可能な細胞を利用する工程、上記幹細胞の生存度を決定する工程、および上記生きた胚性幹細胞または上記トランスジェニック動物を作製するための細胞を使用する工程を包含する、方法。
80.生物学的試料における少なくとも1つのRNA転写産物発現のレベルを定量化する方法であって、以下:
a)上記生物学的試料を、上記RNA転写産物とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
b)上記生物学的試料におけるシグナルのレベルを定量する工程;および
c)上記シグナルのレベルを上記少なくとも1つのmRNA転写産物のレベルに相関させる工程;
を包含する、方法。
81.上記生物学的試料が細胞試料、組織試料またはこれらに由来する調製物である、段落80に記載の方法。
82.上記RNA転写産物が、タンパク質をコードする1つ以上のメッセンジャーRNA、ペプチドをコードするRNA、アンチセンスRNA、siRNA、tRNA、構造RNA、リボソームRNA、hnRNAおよびsnRNAである、段落80に記載の方法。
83.上記生物学的試料が固定されている、段落80に記載の方法。
84.少なくとも1つの第二のRNA転写産物発現のレベルが、上記第二のRNA転写産物へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブを用いて上記生物学的試料において定量される、段落80に記載の方法。
85.少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する方法であって、以下:
a)上記予め選択されたRNAを外因的にまたは内因的に発現する細胞に化合物を添加する工程;
b)上記細胞を、少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;
c)上記細胞においてシグナルのレベルを定量する工程;
d)化合物を添加しない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程;および
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する工程;
を包含する、方法。
86.上記予め選択されたRNAを外因的に発現する細胞が、段落1または7の方法に従って単離された、段落85に記載の方法。
87.上記DNA構築物がプロモーターまたはオペレーターを含み、かつリプレッサー、エンハンサー、または転写を調節する配列をコードする、段落85に記載の方法。
88.少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節するRNA配列を同定する方法であって、以下:
a)外因的または内因的に発現された少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を潜在的に調節する少なくとも1つの試験RNA配列を細胞に導入する工程;
b)上記細胞を、上記少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに暴露する工程;
c)上記細胞におけるシグナルのレベルを定量する工程;
d)試験RNA配列を有さない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程;および
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する試験RNA配列を同定する工程;
を包含する、方法。
89.上記予め選択されたRNAを外因的に発現する細胞が段落1または7に記載の方法に従って単離された、段落88に記載の方法。
90.RNAの発現ライブラリーが試験RNA配列として用いられる、段落88に記載の方法。
91.生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法であって、以下:
a)細胞を、組換えられた配列から転写されたもの、および非組換え配列から転写されたものからなる群より選択されるRNA配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;
b)上記RNA配列を発現する上記細胞を検出する工程;
を包含する、方法。
92.上記シグナリングプローブが、少なくとも1つの互いに相補的な領域を形成する、核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含む、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73、80、85、88、および91のいずれか1つに記載の方法。
93.上記2つの別個の鎖が5’〜3’末端に連続した互いに相補的な領域を形成し、かつ上記2つの鎖は同一数のヌクレオチドを有する、段落92に記載の方法。
94.互いに相補的な領域が上記2つの鎖の間で形成された後、1方の鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、上記ずれは10までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、段落92に記載の方法。
95.上記2つの鎖が各末端において5または6つの連続する塩基対の互いに相補的な領域を形成する、段落92に記載の方法。
96.2つの鎖の配列が同一ではない、段落92に記載の方法。
97.上記鎖が30を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落92に記載の方法。
98.上記核酸がDNA、RNA、または両方である、段落92に記載の方法。
99.上記修飾された核酸がペプチド核酸、化学的に修飾されたDNAもしくはRNA、またはこれらの組合せを含む、段落92に記載の方法。
100.上記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の1つ以上において化学的に修飾されている、段落92に記載の方法。
101.上記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落100に記載の方法。
102.上記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、段落101に記載の方法。
103.上記化学的に修飾されたRNAの2’位が、C−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、段落100に記載の方法。
104.上記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換基を含む、段落100に記載の方法。
105.上記シグナリングプローブが、2つの化学基を含む少なくとも1つの相互作用する対を含み、1方の化学基が1つの鎖の1つの末端に存在し、他の化学基が他の鎖の隣接末端に存在する、段落92に記載の方法。
106.上記シグナリングプローブが2つの相互作用する対を有し、ここで、上記プローブの各末端が両方の鎖の隣接末端において1つの相互作用する対を有する、段落92に記載の方法。
107.上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、FRETドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落92に記載の方法。
108.上記相互作用する対がフルオロフォアおよびクエンチャーであって、蛍光を発する細胞が単離される、段落92に記載の方法。
109.上記シグナリングプローブが同一または異なる少なくとも2つのフルオロフォアを含む、段落92に記載の方法。
110.上記シグナリングプローブが、FRETドナーおよびアクセプター対、またはハーベスターおよびエミッターフルオロフォアである少なくとも2つのフルオロフォアを含む、段落109に記載の方法。
111.蛍光細胞分析分離装置、蛍光顕微鏡または蛍光計を用いて、蛍光を発する上記細胞を単離する工程を行う、段落108に記載の方法。
112.上記シグナリングプローブがステム−ループ構造を含む、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73,80、85、88および91のいずれか1つに記載の方法。
113.上記ステム領域が4〜6つの連続塩基対を形成する段落112に記載の方法。
114.上記ステム−ループ構造が、2つの化学基を含む少なくとも1つの相互作用する対を含み、1つの化学基は鎖の各末端に存在し、ここで、上記ステム領域は非相補的領域を介して連結された2つの互いに相補的な領域を含み、上記相互作用する対に隣接する互いに相補的な領域は5〜6の塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する互いに相補的な領域は4〜5の塩基対を形成する、段落112に記載の方法。
115.上記非相補的領域が一本鎖ループ領域またはミスマッチ領域である、段落114に記載の方法。
116.上記ステム−ループ構造が2つの化学基を含む少なくとも1つの相互作用する対を含み、かつ1つの化学基は鎖の各末端に存在し、ここで、上記ステム領域は2つの非相補的領域を介して連結された3つの互いに相補的な領域を含み、上記相互作用する対に隣接する第一の互いに相補的な領域は4〜5の塩基対を形成し、第二の互いに相補的な領域は2〜3の塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する第三の互いに相補的な領域は2〜3の塩基対を形成する、段落112に記載の方法。
117.上記非相補的領域が一本鎖ループ領域およびミスマッチ領域の1つ以上である、段落116に記載の方法。
118.上記シグナリングプローブがダンベル構造を含む、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73、80、85、88および91のいずれか1つに記載の方法。
119.上記ダンベル構造が4連続塩基対の1つのステム領域、および3の連続塩基対の1つのステム領域を含む、段落118に記載の方法。
120.上記2つのステム領域が、上記ステム領域の1つのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される、段落118に記載の方法。
121.上記2つのステム領域が上記ステム領域の1つのアームを介して1もしくは2個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される、段落118に記載の方法。
122.上記シグナリングプローブが3アーム接合構造を含む、段落1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62,67、73、80、85,88および91のいずれか1つに記載の方法。
123.上記3アーム接合構造が2つの化学基を含む少なくとも1つの相互作用する対を含み、かつ1つの化学基が鎖の各末端に存在し、ここで、上記相互作用する対に隣接するステム領域が3〜4の連続塩基対を形成し、上記第一のステム−ループ構造のステム領域が4〜5の連続塩基対を形成し、かつ上記第二のステム−ループ構造のステム領域が2〜3の連続塩基対を形成する、段落122に記載の方法。
124.上記3つの領域が、ステム領域のアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される、段落122に記載の方法。
125.上記3つの領域が、ステム領域のアームを介して、1もしくは2個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される、段落122に記載の方法。
126.上記ステム−ループ構造、ダンベル構造または3アーム接合構造が30を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落112、118および122のいずれか1つに記載の方法。
127.上記構造がDNA、RNA、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、RNA、またはこれらの組合せである、段落112、118および122のいずれか1つに記載の方法。
128.上記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の1つ以上において化学的に修飾される、段落112、118および122のいずれか1つに記載の方法。
129.上記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落128に記載の方法。
130.上記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換される、段落129に記載の方法。
131.上記化学的に修飾されるRNAの2’位が、C−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、段落128に記載の方法。
132.上記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を有する、段落128に記載の方法。
133.上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、FRETドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落112、118および122のいずれか1つに記載の方法。
134.上記相互作用する対がフルオロフォアおよびクエンチャーであって、蛍光を発する細胞が単離される、段落133に記載の方法。
135.蛍光を発する上記細胞を単離する工程が、蛍光細胞分析分離装置、蛍光顕微鏡または蛍光計を用いて行われる、段落134に記載の方法。
136.上記シグナリングプローブが、上記鎖の1つの末端に少なくとも2つのフルオロフォア、および上記鎖の他の末端にクエンチャーを含み、ここで、2つのフルオロフォアはFRETドナーおよびアクセプター対である、段落112、118および122のいずれか1つに記載の方法。
137.標的配列および互いに相補的な配列、および少なくとも1つのタンパク質分解酵素および少なくとも1つの上記タンパク質分解酵素のインヒビターに相補的な配列を含む核酸または修飾された核酸を含むプローブであって、ここで、上記プローブは、上記標的配列の非存在下におけるアッセイ条件下で、そのレベルが上記タンパク質分解酵素およびそのインヒビターの相互作用の程度の関数である特徴的タンパク質分解活性を有し、そしてここで、過剰の上記標的配列の存在下での条件下で、標的相補体配列の標的配列へのハイブリダイゼーションは上記特徴的タンパク質分解活性レベルを増加させる、プローブ。
138.上記タンパク質分解酵素が部位特異的プロテアーゼまたは標的特異的プロテアーゼである、段落137に記載のプローブ。
139.上記タンパク質分解酵素インヒビターがペプチドまたは化合物である、段落137に記載のプローブ。
140.上記タンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターが、アミノペプチダーゼおよびアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼおよび抗パイン、アミノペプチダーゼおよびベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼおよびキモスタチン、アミノペプチダーゼおよびジプロチンAまたはB、カルボキシペプチダーゼAおよびEDTA、エラスターゼ様セリンプロテアーゼおよびエラスチナール、ならびにテルモルシンまたはアミノペプチダーゼMおよび1,10−フェナントロリンからなる群より選択される、段落137に記載のプローブ。
141.少なくとも1つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含む、段落137に記載のプローブ。
142.上記タンパク質分解酵素が1つの鎖の1つの末端に存在し、上記タンパク質分解酵素インヒビターが他の鎖の隣接末端に存在する、段落141に記載のプロ−ブ。
143.上記2つの別個の鎖が5’から3’末端へ連続する互いに相補的な領域を形成し、かつ上記2つの鎖は同一数のヌクレオチドを有する、段落141に記載のプローブ。
144.互いに相補的な領域が上記2つの鎖の間で形成された後、1方の鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、上記ずれは10までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、段落141に記載のプローブ。
145.上記2つの鎖が各末端において5または6つの連続塩基対の互いに相補的な領域を形成する、段落141に記載のプローブ。
146.上記2つの鎖の配列が同一ではない、段落145に記載のプローブ。
147.上記鎖が30を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落141に記載のプローブ。
148.上記核酸が、DNA、RNAまたは両方である、段落141に記載のプローブ。
149.上記修飾された核酸がペプチド核酸、化学的に修飾されたDNAもしくはRNA、またはこれらの組合せを含む、段落141に記載のプローブ。
150.上記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の1つ以上において化学的に修飾されている、段落141に記載のプローブ。
151.上記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落150に記載のプローブ。
152.上記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、段落150に記載のプローブ。
153.上記化学的に修飾されたRNAの2’位がC−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、段落150に記載のプローブ。
154.上記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を含む、段落150に記載のプローブ。
155.ステム−ループ構造を含む、段落137に記載のプローブ。
156.上記ステム領域が5〜6つの連続塩基対を形成する、段落155に記載のプローブ。
157.上記ステム−ループ構造が鎖の各末端において少なくとも1つのタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、ここで、上記ステム領域が非相補的領域を介して連結された2つの互いに相補的な領域を含み、鎖の末端に隣接する互いに相補的な領域が5〜6つの塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する互いに相補的な領域が4〜5つの塩基対を形成する、段落155に記載のプローブ。
158.上記非相補的領域が一本鎖ループ領域またはミスマッチ領域である、段落157に記載のプローブ。
159.上記ステム−ループ構造が鎖の各末端において少なくとも1つのタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、ここで、上記ステム領域が2つの非相補的領域を介して連結された3つの互いに相補的な領域を含み、鎖の末端に隣接する第一の互いに相補的な領域が4〜6つの塩基対を形成し、第二の互いに相補的な領域が2〜3つの塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する第三の互いに相補的な領域が2〜3つの塩基対を形成する、段落155に記載のプローブ。
160.上記非相補的領域が1つ以上の一本鎖ループ領域およびミスマッチ領域である、段落159に記載のプローブ。
161.ダンベル構造を含む、段落137に記載のプローブ。
162.上記ダンベル構造が4つの連続塩基対の1つのステム領域、および3の連続塩基対の1つのステム領域を含む、段落161に記載のプローブ。
163.上記2つのステム領域が、上記ステム領域の1つのアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、段落161に記載のプローブ。
164.上記2つのステム領域が、上記ステム領域の1つのアームを介して、1または2つのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結されている、段落161に記載のプローブ。
165.3アーム接合構造を含む、段落137に記載のプローブ。
166.上記3アーム接合構造が鎖の各末端において少なくとも1つのタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、ここで、鎖の末端に隣接するステム領域が3〜4個の連続塩基対を形成し、上記第一のステム−ループ構造のステム領域が4〜5個の連続塩基対を形成し、かつ第二のステム−ループ構造のステム領域が2〜3個の連続塩基対を形成する、段落165に記載のプローブ。
167.上記3つの領域が、上記ステム領域のアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、段落165に記載のプローブ。
168.上記3つの領域が、上記ステム領域のアームを介して、1または2つのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結されている、段落165に記載のプローブ。
169.上記ステム−ループ構造、ダンベル構造または3アーム接合構造が30を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落155、161、または165に記載のプローブ。
170.上記構造がDNA、RNA、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、RNAまたはこれらの組合せである、段落155、161または165に記載のプローブ。
171.上記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の1つ以上において化学的に修飾されている、段落155、161、または165に記載のプローブ。
172.上記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落171に記載のプローブ。
173.上記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、段落171に記載のプローブ。
174.上記化学的に修飾されたRNAの2’位が、C−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、段落171に記載のプローブ。
175.上記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を含む、段落171に記載のプローブ。
176.少なくとも1つの目的のRNAおよびタグ配列をコードする少なくとも1つのDNAを含むDNA構築物であって、ここで、上記タグ配列は3アーム接合構造を形成し、かつ上記ステム領域は8〜9つの塩基対を含み、上記第一のステム−ループ領域は4〜6つの塩基対を含み、かつ上記第二のステム−ループ領域は13〜17個の塩基対を含む、DNA構築物。
177.上記3つのアームのステム領域が、さらに、非相補的領域を含む、段落176に記載のDNA構築物。
178.上記ステム領域および上記第一のステム−ループ領域が、共に、さらに、1つのミスマッチ領域を含み、かつ上記第二のステム−ループ領域が、さらに、2〜7つのミスマッチ領域またはバルジ領域を含む、段落176に記載のDNA構築物。
179.上記ステム領域の間の結合が合計8〜12個のヌクレオチドを有する、段落176に記載のDNA構築物。
180.少なくとも1つの目的のRNAおよびタグ配列をコードする少なくとも1つのDNAを含むDNA構築物であって、ここで、上記タグ配列は図42A、BおよびCに示された配列からなる群より選択される、DNA構築物。
181.少なくとも1つの目的のRNAおよびタグ配列をコードする少なくとも1つのDNAを含むDNA構築物であって、ここで、上記タグ配列は、図42A、BまたはCに示された配列によって予測されるよりエネルギー的に好都合な構造を形成する、DNA構築物。
182.段落176〜181のいずれか1つに記載のDNA構築物を含む、ベクター。
183.段落182に記載のベクター、または段落176〜181のいずれか1つに記載のDNA構築物を含む、細胞。
184.不死化された初代幹細胞および生殖細胞からなる群より選択される、段落183に記載の細胞。
185.HeLa細胞、NIH3T3細胞、HEK293細胞およびCHO細胞からなる群より選択される、段落183に記載の細胞。
186.それぞれが少なくとも1つの安定に組み込まれた発現された配列を含む少なくとも10,000個の細胞株を含む、安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
187.それぞれが少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも500個の細胞株を含む、安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
188.それぞれが少なくとも3つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも50個の細胞株を含む、安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
189.それぞれが少なくとも4つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも20個の細胞株を含む安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
190.上記細胞株が、さらに、薬物耐性遺伝子を含む、段落186〜189のいずれか1つに記載のライブラリー。
191.それぞれが、少なくとも1つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも50個の細胞株を含む安定な哺乳動物細胞株のライブラリーであって、ここで、上記細胞株は薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
192.それぞれが、少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも20個の細胞株を含む安定な哺乳動物細胞株のライブラリーであって、ここで、上記細胞株は薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
193.各細胞株が可変ライブラリー配列を含む、段落186〜192のいずれか1つに記載のライブラリー。
194.上記発現ライブラリーの可変配列が、ゲノム配列、ゲノム非翻訳配列、ゲノム翻訳配列、遺伝子配列、cDNA配列、EST配列、オリゴ配列、ランダム配列、RNA配列、タンパク質配列、タンパク質ドメイン配列、ペプチド配列、イントロン配列、エクソン配列、タグ配列、またはリンカー配列、またはこれらの組合せ、またはこれらの組換え物、あるいは未修飾配列、突然変異誘発配列、ランダム化配列、シャッフルされた配列または組換え配列の1つ以上からなる群より選択される、段落193に記載のライブラリー。
195.上記ライブラリーが、未知の配列同一性を有する遺伝子配列の少なくとも1つのプールまたは混合物を用いて作製された、段落186〜192のいずれか1つに記載のライブラリー。
196.未知の同一性を有する上記配列が、共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、段落195に記載のライブラリー。
197.上記ライブラリーが、既知の同一性を有する特異的配列を含む個々に合成された構築物の集合である、段落186〜192のいずれか1つに記載のライブラリー。
198.上記特異的配列が、共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、段落197に記載のライブラリー。
199.上記発現された配列が構成的プロモーターの制御下にある、段落186〜192のいずれか1つに記載のライブラリー。
200.上記発現された配列が、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、組織特異的プロモーター、一時的プロモーターまたは熱ショックプロモーターからなる群より選択される条件プロモーターの制御下にある、段落186〜192のいずれか1つに記載のライブラリー。
201.上記ライブラリーが細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いられる、段落186〜192のいずれか1つに記載のライブラリー。
202.上記細胞ベースのスクリーニングアッセイが、上記ライブラリーにおける全ての細胞株に関して平行して行われる、段落201に記載のライブラリー。
203.上記細胞ベースのスクリーニングアッセイが上記ライブラリーにおける細胞株の一部に関して行われる、段落201に記載のライブラリー。
204.図8〜24および41に示されるFP1〜FP18のいずれか1つの配列を含む、核酸分子または修飾された核酸分子。
205.さらに、相互作用する対を含む、段落204に記載の核酸分子または修飾された核酸分子。
206.上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、FRETドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落205に記載の核酸分子または修飾された核酸分子。
207.図42D1、2または3に示される配列にハイブリダイズする、核酸分子または修飾された核酸分子。
208.さらに、相互作用する対を含む、段落207に記載の核酸または修飾された核酸分子。
209.上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、およびFRETドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落208に記載の核酸分子または修飾された核酸分子。
210.図42A、BまたはC中の配列を含む、核酸分子または修飾された核酸分子。
211.図42D1またはD2中の配列を含む、核酸分子または修飾された核酸分子。
本発明は、RNAを発現する細胞を単離する方法を提供し、この方法は、
上記RNAを発現する細胞を提供する工程、上記細胞を、上記RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。1つの実施形態において、上記RNAは内因性RNAである。別の実施形態において、上記内因性RNAは、細胞に導入されるDNAの結果として発現され、例えば、そのDNAはエンハンサーまたはプロモーター、または内因性RNAの発現を誘導する他の配列を含む。例えば、DNAはタンパク質(例えば、RNAの発現を誘導する転写因子)をコードし得る。なお別の実施形態において、上記RNAは、細胞に導入される核酸によってコードされる。細胞に導入されるDNAは、さらに、タグ配列をコードし得、ここで、上記シグナリングプローブは、必要に応じて、タグ配列および/またはRNA配列に標的化され得る。上記タグ配列はRNAのオープンリーディングフレームのフレーム内またはフレーム外に存在し得る。1つの実施形態において、上記方法は、外因性または異種RNAおよび内因性RNAの両方の発現を検出する工程を包含する。これらの方法を行って、同時に複数のRNAおよび/またはタグを検出し得る。上記RNAは、同一または異なるRNAであり得る。上記方法を用いて、1を超えるシグナリングプローブを用いて1を超えるRNAを検出する実施形態において、異なるシグナリングプローブによって生じたシグナルは、互いに同一であっても異なっていてもよい。
また、本発明は、外因性または異種DNAの1を超えるコピーを含む細胞を単離する方法も提供する。このような方法は、RNAおよびタグ配列をコードするDNAを導入する工程、同一RNAおよび異なるタグ配列をコードするDNAを導入する工程;細胞を、両方のタグに対する検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および、両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。
1を超える暴露工程が存在する本発明の方法のいずれかにおいて、1回以上の暴露工程(すなわち、細胞がシグナリングプローブに暴露される工程)を同時または連続して行い得る。
本発明の方法のいずれかにおいて、上記RNAまたはタンパク質は、同一または関連する生物学的経路におけるものであってもよく、互いから上流または下流で作用してもよく、機能または活性に関して互いに依存して、互いに対して調節、活性化または抑制機能を有してもよく、同一複合体の成分、同一タンパク質ファミリーのメンバーなどである。
本発明は、条件プロモーターの制御下にある第一のRNAをコードするDNA構築物を含む細胞を単離する方法を提供し、この方法は、条件プロモーターの制御下にあるRNAをコードするDNA構築物を細胞に導入する工程であって、ここで、上記DNA構築物は、さらに、第二のRNAが発現されないか、または低レベルで発現される条件下で、条件プロモーターの制御下にある第二のRNAをコードする、工程;第一のRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。上記DNA構築物は、さらに、試験RNAをコードし得、ここで、例えば、上記試験RNAは可変であり、例えば、発現ライブラリーに由来する。これらの細胞を用いて、第二のRNAの発現を駆動する条件プロモーターを活性化し得るRNAまたは化合物を得るか、または同定し得る。
また、本発明は、上記細胞の部分集合は細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する、複数の細胞を単離する方法を提供し、この方法は、複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、上記複数のRNAの少なくとも1つの部分集合は互いに異なっている、工程、複数の異なるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、ここで、上記シグナリングプローブは複数のDNAによってコードされる1つ以上のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。細胞の部分集合は、1つの細胞であっても、または1を超える細胞であってもよい。1つの実施形態において、DNAはRNAをコードしないが、外因性RNAの発現を生じ、例えば、上記DNAはエンハンサー配列またはプロモーター配列を含み、例えば、DNAは内因性RNAの発現を誘導する配列を含む。例えば、上記DNAは、タンパク質(例えば、RNAの発現を誘導する転写因子)をコードし得る。上記DNAは、さらに、タグ配列をコードし得、上記シグナリングプローブは、タグ配列および/またはRNA配列を標的とし得る。1つの実施形態において、複数のRNAは発現ライブラリーを形成する。別の実施形態において、DNAの少なくとも1つの部分集合は、同一タグ配列をコードする。
本発明はまた、細胞の2つ以上のRNAライブラリーを単離する方法を提供し、この方法は、第一のRNA発現ライブラリーをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、各DNAは、さらに、第一のタグ配列をコードする、工程、第二のRNA発現ライブラリーをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、各DNAは、さらに、第二のタグ配列をコードする、工程、第一のタグへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブ、および第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程、および、両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。この方法は、さらなるRNA発現ライブラリーをコードするDNAで行うことができ、第三のタグなどを用いる。
本発明の方法のいずれかを用いて、化合物を細胞に添加し、次いで、シグナリングプローブによって生じたシグナルの変化(増加または減少)に関してアッセイすることによって、RNAまたは複数のRNAの発現を調節する化合物を同定し得る。
本発明は、タンパク質の発現を低下させる方法を提供し、この方法は、上記タンパク質の発現を低下させるアンチセンスRNAまたはshRNAをコードするDNAを細胞に導入する工程、アンチセンスRNAまたはshRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。この方法は、さらに、上記タンパク質をコードするRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程を包含し得、ここで、第二のシグナリングプローブからのシグナルの欠如は、タンパク質の発現が低下することを示唆する。また、他の方法を用いて、例えば、上記タンパク質に特異的に結合する抗体を用い、機能的試験を用いて(例えば、タンパク質の既知の生物学的活性に関してアッセイするなど)、タンパク質の低下した発現に関してアッセイし得る。この方法の1つの実施形態において、細胞を第一のシグナリングプローブに暴露する工程を省略し得る。shRNAを用いて、siRNAを用いる方法のいずれかを行うこともできる。
本発明の方法のいずれかにおいて、細胞に導入されるDNAは、条件プロモーターに作動可能に連結され得る。1つの実施形態において、DNAによってコードされるRNAは細胞に対して致死的であるか、または損傷的である。DNAは、加えて、DNAを含む細胞を選択するのに使用され得る選択マーカーを含み得る。
本発明はまた、生物学的試料中のRNAの発現レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに生物学的試料を暴露する工程、生物学的試料中のシグナルのレベルを定量する工程、およびシグナルのレベルをRNAの発現レベルに相関させる工程を包含する。
本発明はさらに、RNAの発現を調節する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、RNAを発現する細胞に試験化合物を添加する工程、RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程、および試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルを試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較する工程を包含し、ここで、後者の細胞によって生じたシグナルと比較して前者の細胞によって生じたシグナルの増加または減少は、上記化合物がRNAの発現を調節することを示唆する。1つの実施形態において、上記RNAは、細胞に導入されるDNAによってコードされる。1つの実施形態において、上記化合物はRNAまたはタンパク質である。
本発明は、生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法を提供し、この方法は、組み換えられた配列から転写されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程を包含し、ここで、シグナルを生じる細胞の検出は、上記細胞が遺伝的組換え事象を含むことを示唆する。
また、本発明は、上記方法のいずれかによって作製された細胞を提供する。これらの細胞は培養することができ、細胞株または複数の細胞株を作製するのに用いることができる。上記細胞は、例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、あるいは、細胞を動物、非ヒト動物、または哺乳動物に移植する場合に、種々の目的で用いることができる。上記細胞は、胚性幹細胞、初代生殖細胞または初代幹細胞であってもよい。上記細胞はまた、不死化された細胞であってもよい。上記細胞は、内皮細胞、表皮細胞、間葉細胞、神経細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、造血系細胞、または免疫細胞であってよい。上記細胞は、真核生物、原核生物、哺乳動物、酵母、植物、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、げっ歯類、有袋類、ネズミまたは他の細胞であってもよい。
上記タグ配列は、複数の標的配列を含み得、ここで、1つのシグナリングプローブは各標的配列にハイブリダイズする。上記タグ配列は二次構造を有するRNAであってもよい。上記構造は3アーム接合構造であってもよい。DNAは複数のタグ配列を含み得る。上記タグ配列はDNAによってコードされるRNAと同一のRNAとして転写されてもよく、あるいはタグ配列は別個のRNAとして転写されてもよい。また、RNAおよびタグ配列をコードするDNA配列を含むDNA構築物が提供される。タグ配列は本明細書中に記載されたもののいずれか1つであり得る。DNA構築物を含む細胞およびベクターも提供される。
本発明はまた、少なくとも1,000個、少なくとも800個、少なくとも600個、少なくとも500個、少なくとも400個、少なくとも200個、少なくとも100個または少なくとも50個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーを提供し、ここで、各細胞株は安定に組み込まれた発現された配列を含む。また、少なくとも500個、少なくとも400個、少なくとも300個、少なくとも200個、少なくとも200個、少なくとも100個、少なくとも50個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーも提供され、ここで、各細胞株は少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む。また、少なくとも100個、少なくとも50個、少なくとも25個、少なくとも10個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーが提供され、ここで、各細胞株は少なくとも3つの安定に組み込まれた配列を含む。また、少なくとも50個、少なくとも25個、少なくとも20個、少なくとも10個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーが提供され、ここで、各細胞株は少なくとも4つの安定に組み込まれた配列を含む。これらの細胞株における安定に組み込まれた配列はさらに、選択マーカー、例えば、薬物耐性遺伝子を欠いていてもよい。安定に組み込まれた配列は、既知または未知の配列同一性のものであってよい。これらの配列は共有された配列相同性、機能的重要性、または関連する起源を有し得る。これらのライブラリーは、例えば、細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて種々の目的で用いることができる。
本発明はまた、シグナリングプローブを用いて細胞における標的の検出を増強する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、標的配列を含む細胞にシグナリングプローブを導入する工程であって、ここで、上記シグナリングプローブは上記標的配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる工程、上記細胞を試験化合物に暴露する工程、および、細胞によって生じたシグナルを検出する工程を包含し、ここで、上記試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較して上記試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、上記試験化合物が、シグナリングプローブを用いて細胞における標的の検出を増強する化合物であることを示す。
本発明はまた、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介または改良する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、試験化合物の存在下でシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、上記細胞は標的配列を含み、上記シグナリングプローブは上記標的配列とのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じる工程、および上記細胞によって生じたシグナルを検出する工程を包含し、ここで、上記試験化合物に暴露されなかった細胞と比較して上記試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、上記試験化合物が、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介または改良する化合物であることを示す。
本発明のこれらおよび他の局面は以下の詳細な説明から理解される。
(発明の詳細な説明)
他の定義がなされない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって共通に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の文献は、本明細書においてその全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。
プローブに関連して用いられる用語「隣接」とは、相互作用する対が相互に機能的に相互作用することを可能とする、近接条件をいう。例えば、近接条件は、クエンチャー部位がフルオロフォアを消光するかもしくは部分的に消光すること、またはプロテアーゼインヒビターがプロテアーゼを阻害するかもしくは部分的に阻害することを可能にする。現在公知のフルオロフォアおよびクエンチャーが相互作用するために必要な距離は約20〜100Åである。
用語「塩基対」とは、ワトソン−クリック塩基対をいう。
用語「バルジ(bulge)領域」とは、塩基対形成されていない、1つのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの一本鎖領域をいう。バルジヌクレオチドは、相互に相補的な領域の間にあり得る(例えば、図4A)。
用語「ダンベル構造」とは、ステム領域の各々からのアームの末端を介して連結された2つのステム−ループ構造の高次構造を有する核酸または修飾された核酸の鎖をいう(例えば、図7)。結合は非相補的領域、または修飾された、または修飾されていないホスホジエステル結合であり得る。
用語「相互作用する対」とは、相互に隣接した場合、および相互に隣接しない場合、機能的に相互作用し、シグナルのない状態または相互作用する化学基によって生じたバックグラウンドシグナルと比較して、検出可能なシグナルを生じるか、あるいは相互作用する化学基によって生じたシグナルとは異なるシグナルを生じる2つの化学基をいう。相互作用する対としては、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーもしくはアダクト、色素ダイマーおよびFRETのドナーとアクセプター、またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。シグナリングプローブは1つより多くの相互作用する対を含むことができる。例えば、波長シフトシグナリングプローブは、共にクエンチャーと相互作用する、第一のフルオロフォアおよび第二のフルオロフォアを有し、この2つのフルオロフォアはFRETドナーとアクセプターとの対である。
用語「ループ領域」とは、塩基対形成していない、1つより多くのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの一本鎖領域をいう(例えば、図4Bおよび図23A)。ループは相互に相補的な領域の間にあることもできる(図8A)。
用語「シグナリングプローブ」とは、標的核酸配列に相補的な配列、および少なくとも1つの相互に相補的な領域を含み、さらに、少なくとも1つの相互作用する対を含むプローブをいう。シグナリングプローブがその標的配列に結合しない場合、相互作用する対の部分は、全くシグナルが生じないようにか、またはほとんどシグナルが生じないようにか、または異なるシグナルが生じないように、相互に隣接する。シグナリングプローブは標的配列に結合する場合、相互作用する対の部分はもはや相互に隣接せず、検出可能なシグナル、またはその未結合状態のプローブによって生じたシグナルとは異なるシグナルが生じる。1つの実施形態において、シグナリングプローブはフルオロフォアおよびクエンチャー部分を含む蛍光原性プローブまたは蛍光プローブであり、蛍光の変化は標的配列へのハイブリダイゼーションに際して生じる。相互作用する対の部分はシグナリングプローブの末端に結合することができるか、あるいは核酸配列内に結合させることができる。シグナリングプローブの配列の内部に取り込むことができる部分の例としては、クエンチャー:dabcyl dT、BHQ2 dT、およびBHQ1 dT、およびフルオロフォア:フルオレセインdT、Alexa dT、およびTamra dTが挙げられる。
用語「プロテアーゼプローブ」とは、標的配列に相補的な配列、および少なくとも1つの相互に相補的な領域を含み、さらに、少なくとも1つのタンパク質分解酵素および少なくとも1つのこのタンパク質分解酵素のインヒビター、または上記酵素を可逆的に不活化することができる別の分子を含む、プローブをいう。プローブが標的配列にハイブリダイズされない場合、タンパク質分解酵素およびタンパク質分解酵素のインヒビターの近接は、それらが、相互作用し、タンパク質分解活性を阻害することを可能とする。プローブの標的配列のハイブリダイゼーションに際して、タンパク質分解酵素およびそのインヒビターが分離され、タンパク質分解酵素を活性化する。タンパク質分解酵素およびインヒビターはプローブに共通結合されても、または非共有的に結合されてもよい。
用語「ミスマッチ領域」とは、核酸分子または修飾された核酸分子中の二本鎖領域をいい、この領域において、塩基または修飾された塩基は、ワトソン−クリック塩基対形成を形成していない(例えば、図4BおよびC)。ミスマッチ領域は2つの塩基対形成領域間にある。二本鎖領域は非水素結合性に結合するか、または水素結合して、Hoogsteen塩基対などを形成し得るか、あるいは両方によりHoogsteen塩基対などを形成し得る。
用語「相互に相補的な領域」とは、ワトソン−クリック塩基対形成した、核酸分子中または修飾核酸分子中の領域をいう。
用語「非相補的領域」とは、ワトソン−クリック塩基対形成していない、核酸分子中または修飾核酸分子中の領域をいう。例えば、非相補的領域は、バルジヌクレオチド、一本鎖ループ、5’末端もしくは3’末端における突出ヌクレオチド、またはミスマッチ領域を有するように設計され得る。
用語「ステム領域」とは、少なくとも2つのワトソン−クリック塩基対を有する核酸分子または修飾された核酸分子中の領域をいう。例えば、ステム領域は、非相補的領域によって連結された1つより多くの相互に相補的な領域を有するか、あるいは連続的な相互に相補的領域を形成するように設計され得る。
用語「ステム−ループ構造」とは、5’および3’オリゴヌクレオチド対のアームまたは5’および3’修飾オリゴヌクレオチド対のアームによって近接された、一本鎖ループ配列を持つ、核酸分子または修飾核酸分子をいう(例えば、図4)。5’および3’アームはステム領域を形成する。
用語「3アーム接合構造」とは、ステム領域と、ステム領域のアームを介して一緒に連結された、第一のステム−ループ領域と、第二のステム−ループ領域との高次構造を有する、核酸または修飾核酸の鎖をいう(例えば、図6)。第一のステム−ループ領域は第二のステム−領域に対して5’側である。この3つの領域は、非相補的領域、ホスホジエステル結合もしくは修飾されたホスホジエステル結合、またはその組合せを介して結合され得る。
(シグナリングプローブ)
(相互作用する対)
シグナリングプローブは、1つより多くの相互作用する対を有し得るか、または異なる相互作用する対を有し得る。1つの実施形態において、シグナリングプローブは、蛍光原性プローブである。1つの実施形態において、蛍光原性プローブは、そのハイブリダイズしていない状態ではバックグラウンドレベルの蛍光を発しないが、その標的への結合に際してバックグラウンドレベルの蛍光、またはバックグラウンドレベルを超える蛍光を発する。複数のフルオロフォアを用いて、シグナルを増加させ得るか、または異なる色範囲で蛍光を提供し得る。複数のクエンチャーを用いて、標的配列の非存在下においてシグナルを減少させ得るか、または排除し得る。クエンチャーの例としては、DABCYL、EDAC、セシウム、臭化p−キシレン−ビス−ピリジニウム、タリウムおよび金ナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:スルホローダミン101、アクリジン、5−(2’−アミノエチル)アミノアフサリン(aminoaphthaline)−1−スルホン酸(EDANS)、テキサスレッド、エオシン、およびBodipyおよびAlexa Fluor350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor500、Alexa Fluor514、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750、アロフィコシアニン、アミノクマリン、Bodipy−FL、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、カルボキシフルオレセイン(FAM)、カスケードブルー、APC−Cy5、APC−Cy5.5、APC−Cy7、クマリン、ECD(Red613)、フルオレセイン(FITC)、ヘキサクロルフルオレセイン(HEX)、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンB(Lissamine Rhodamine B)、ルシファーイエロー、メトキシクマリン、オレゴングリーン488、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、PE−Cy7結合体、PerC、PerCP−Cy5.5、R−フィコエリトリン(PE)、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド−X、テトラクロロフルオレセイン(TET)、TRITC、テトラメチルローダミン、テキサスレッド−X、TRITC、XRITC、およびクアンタムドット(Quantum dots)。例えば、本明細書において参考として援用される、Tyagiら、Nature Biotechnology 16:49−53、(1998)およびDubertretら、Nature Biotechnology,19:365−370(2001)参照。
また、本発明は、波長シフト性シグナリングプローブも提供する。1つの実施形態において、このプローブの1つの末端は、少なくとも1つのハーベスター(harvester)フルオロフォアおよびエミッター(emitter)フルオロフォアを有し、このプローブの隣接末端は、少なくとも1つのクエンチャー部位を有する。例えば、本明細書において参考として援用される、Tyagiら、Nature Biotechnology,18,1191−1196(2000)参照。1つの実施形態において、ハーベスターフルオロフォアおよびエミッターフルオロフォアは、同一末端におけるものであり、ここで、エミッターフルオロフォアは、遠位末端にあり、クエンチャー部位は、ハーベスターフルオロフォアに対して反対の末端におけるものである。エミッターフルオロフォアは、数個のヌクレオチドのスペーサーアームによってハーベスターフルオロフォアから分離され得る。ハーベスターフルオロフォアは、単色光源の波長範囲において強く吸収する。標的配列の非存在下では、双方のフルオロフォアは、消光される。標的の存在下で、プローブは、エミッターフルオロフォアの放射範囲において蛍光を発する。放射スペクトルにおけるシフトは、蛍光共鳴エネルギー移動による、ハーベスターフルオロフォアからエミッターへの吸収されたエネルギーの移動によるものである。これらのタイプのシグナリングプローブは、単色光源から効果的にエネルギーを吸収できないフルオロフォアを含有するシグナリングプローブよりも強いシグナルを提供することができる。1つの実施形態において、ハーベスターフルオロフォアはフルオレセインであって、エミッターフルオロフォアは、6−カルボキシローダミン6G、テトラメチルローダミンまたはテキサスレッドである。
別の実施形態において、プローブの1つの末端は、少なくとも1つのフルオロフォア F1を有し、および別の隣接末端は、少なくとも1つの別のフルオロフォア F2を有する。2つのフルオロフォアは、それらが密に近接する場合に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように選択される。プローブがその標的配列に結合していない場合、F1の吸収バンドにおける励起に際して、F1の蛍光はF2によって消光され、F2の蛍光が観察される。プローブがその標的配列に結合している場合、FRETは、低下するかまたは排除され、F1の蛍光は上昇する一方、F2の蛍光は減少するかまたは消失する。蛍光強度のこの差はモニターすることができ、F1およびF2の蛍光の間の比率が計算され得る。残存蛍光が時々フルオロフォア−クエンチャー系で観察されるので、この系は標的配列の定量的検出でより有利である。本明細書において参考として援用される、Zhangら、Angrew.Chem.Int.Ed.,40,2,pp.402−405(2001)参照。FRETドナー−アクセプター対の例としては、各々、クマリン基および6−カルボキシフルオレセイン基が挙げられるが、これらに限定されない。
1つの実施形態において、シグナリングプローブは、発光標識とアダクトとの対を含む。アダクトと発光標識との相互作用は、標識から生じたシグナルを減少させる。本明細書において参考として援用される、BeckerおよびNelsonの米国特許第5,731,148号参照。
別の実施形態において、シグナリングプローブは、少なくとも1つの色素ダイマーを含む。プローブが標的配列に結合すると、色素からのシグナルは、ダイマーの構造である色素のシグナルとは異なる。
なお別の実施形態において、相互作用する対は、酵素およびその酵素のインヒビター、例えば、ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼインヒビター、キナーゼおよびキナーゼのインヒビター、プロテアーゼおよびプロテアーゼのインヒビター、ホスファターゼおよびホスファターゼのインヒビター、カスパーゼおよびカスパーゼのインヒビター、またはリボザイムおよびリボザイムのインヒビター、または抗原、およびその抗原に特異的に結合する(その結果、検出されたプローブの標的が、抗原の特異的細胞局在部、例えば、ニューロンのシナプスなどへ運ばれ得る)抗体であり得る。
(シグナリングプローブおよびプロテアーゼプローブまたは他のプローブの高次構造)
(二本鎖構造)
本発明は、相互に対してアニールするか、または少なくとも1つの相互に相補的な領域を形成するように設計された核酸の少なくとも2つの別々の鎖を含む、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブを提供する。1つの鎖の少なくとも1つの末端は、他の鎖の末端に隣接する(図1)。この核酸はDNA、RNA、または修飾されたDNAまたはRNAであり得る。2つの鎖は、自己ダイマーを形成する同一の鎖であり得る(図8B)。これらの鎖は、配列が同一でなくてもよい。
2つの別々の鎖は、十分に相補的であるか、相補的領域および非相補的領域を含むように設計することができる。1つの実施形態において、2つの別々の鎖は、互いに対して十分に相補的であるように設計される。1つの実施形態において、2つの鎖は、各末端において、4〜9個、5〜6個、2〜10個、10〜40個、または40〜400個の連続する塩基対の相互に相補的な領域を形成する(例えば、図8、9、15、22、24または41参照)。鎖は、5〜7、8〜10、11〜15、16〜22、30を超える、3〜10、11〜80、81〜200、または200を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むことができる。2つの鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有することができる(図2)。例えば、1つの鎖は他の鎖よりも長くてよい(図2C)。1つの実施形態において、1つの鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその双方であり、ここで、このずれは、ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドで10個まで、20個まで、または30個までである。
標的配列にハイブリダイズする領域は、一方もしくは両方の鎖の相補的な領域、非相補的な領域、またはそれらの組合せ中にあり得る。1つより多くの標的核酸配列が、同一のシグナリングプローブによって標的され得る。1つ以上の標的は、同一または異なる配列上にあってよく、そしてそれらは標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して正確に相補的であり得るか、または少なくとも十分に相補的であり得る。1つの実施形態において、2つの鎖は、各末端において相互に相補的な領域を形成し、標的相補的配列は、末端においてこの相互に相補的な領域以外の領域に存在する(図8B)。
1つの実施形態において、少なくとも2つの別々の鎖を持つシグナリングプローブは、蛍光原性プローブである。1つの実施形態において、1つの鎖は、1つの末端に少なくとも1つのクエンチャー部分を有し、他の鎖の隣接する末端にフルオロフォアを有する(図1)。1つの実施形態において、1つの鎖の5’末端および3’末端の各々は、同一または異なるフルオロフォアを有し、および他の鎖の5’末端および3’末端の各々は、同一または異なるクエンチャー部分を有する(図1Bおよび2A)。1つの実施形態において、1つの鎖の5’末端は、フルオロフォアを有し、かつ3’末端は、クエンチャー部分を有し、そして他の鎖の3’末端は、同一または異なるクエンチャー部分を有し、かつ5’末端は、同一または異なるフルオロフォアを有する(図1Cおよび2B)。
プロテアーゼプローブでは、1つの実施形態において、1つの鎖は、1つの末端に少なくとも1つのタンパク質分解酵素を有し、および他の鎖の隣接する末端にこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。1つの実施形態において、1つの鎖の5’末端および3’末端の各々は、タンパク質分解酵素を有し、そして他の鎖の5’末端および3’末端の各々は、このタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。1つの実施形態において、1つの鎖の5’末端はタンパク質分解酵素を有し、かつ3’末端はこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有し、そして他の鎖の3’末端はこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有し、かつ5’末端はタンパク質分解酵素を有する。
(ステム−ループ構造)
もう1つの実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、少なくとも1つの相互に相補的な領域と少なくとも1つの非相補的領域とを含む、核酸または修飾核酸の鎖である。1つの実施形態において、プローブは、ステム−ループ構造を形成する。ステム領域は、相互に相補的であり得るか、または相互に相補的な領域と非相補的領域とを含み得る(図4)。例えば、ステム領域は、塩基対形成していないバルジヌクレオチドを有することができる(図4)。また、ステム領域は、塩基対形成していない5’末端または3’末端において、突出ヌクレオチドを含むこともできる(図3Bおよび3C)。
ステム領域が十分に相補的な場合、ステム領域は、3〜4個、5〜6個、7〜8個、9〜10個、2〜6個、7〜10個、または11〜30個の塩基対を含むことができる(例えば、図3および5参照)。ループ領域は、10〜16個、17〜26個、27〜36個、37〜45個、3〜10個、11〜25個、または25〜60個のヌクレオチドを含有することができる。1つの実施形態において、ステム領域は4〜10個、4個または5個の連続する塩基対を形成する(例えば、図23参照)。
1つの実施形態において、ステム−ループ構造は、2つの化学基を含む少なくとも1つの相互作用する対を含み、1つの化学基は鎖の各末端にある。1つの実施形態において、シグナリングプローブは、少なくとも1つのフルオロフォアおよびクエンチャー部分を鎖の各末端に有する(図3、4および5)。プロテアーゼプローブは、少なくとも1つのタンパク質分解酵素およびこのタンパク質分解酵素のインヒビターを鎖の各末端に有する。
1つの実施形態において、ステム領域は、非相補的領域を介して連結した2つの相互に相補的な領域を含み、相互作用する対に隣接する相互に相補的な領域は、5〜9個の塩基対を形成し、およびループ領域に隣接する相互に相補的な領域は、4〜5個の塩基対を形成する(図8、15、21、22、24または41)。1つの実施形態において、非相補的領域は、一本鎖ループ領域(図8)、ミスマッチ領域(図15)、または両方である。別の実施形態において、ステム領域は、2つの非相補的領域を介して連結された3つの相互に相補的な領域を含み、相互作用する対に隣接する第一の相互に相補的な領域は、4〜5個の塩基対を形成し、第二の相互に相補的な領域は、2〜3個の塩基対を形成し、そしてループ領域に隣接する第三の相互に相補的な領域は、2〜3個の塩基対を形成する。
ステム−ループ構造において、標的配列に相補的である領域は、1つ以上のステム領域またはループ領域、または両方にあり得る。標的にハイブリダイズするステム領域は、相互に相補的な領域、非相補的領域、または両方にあり得る。1つの実施形態において、標的相補的配列は、一本鎖ループ領域にある。1つの実施形態において、相互作用する対に隣接するステム領域以外の領域は、標的相補的配列である(図8)。1つより多くの標的核酸配列は、同一のプローブによって標的化され得る。1つ以上の標的は、同一でも異なっていてもよく、それらは、標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して、正確に相補的であり得るか、あるいは少なくとも十分に相補的であり得る。
ステム長さの増加は、シグナリングプローブの、それらの閉じた高次構造における安定性を増加させることができ、したがって、検出可能なシグナルの、シグナル 対 ノイズ比を増加させることができる。これらのシグナリングプローブの細胞への暴露は、わずかに上昇した(細胞にとってまだ安全な)温度で、その後常温に戻すことで、行うことができる。より高い温度においては、シグナリングプローブは開き、もし存在すれば、それらの標的に結合する。一旦冷却されると、標的に結合していないシグナリングプローブは、それらの閉じた状態に戻る(これは、ステムの増大した安定性によって助けられる)。同様に、他の力を用いて、同一の結果を達成することができる。例えば、塩基対を緩めると考えられるDMSO。
(3アーム接合構造)
もう1つの実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、3アーム接合構造を形成する核酸の鎖である(図6Aおよび6B)。この構造において、ステム領域および2つのステム−ループ領域は、連結されて、三方接合を形成する。ステム領域は、2〜5個、7〜9個、10〜12個の塩基対を含有することができる。ステム−ループ領域のループは、3〜7個、8〜10個、11〜13個のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含有することができる。
1つの実施形態において、3アーム接合構造は、2つの化学基を含む少なくとも1つの相互作用する対を含み、1つの化学基が、鎖の各末端にある。1つの実施形態において、プローブは、鎖の各末端に、少なくとも1つのフルオロフォアおよびクエンチャー部分を有する。プロテアーゼプローブは、鎖の各末端に、タンパク質分解酵素およびこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
1つの実施形態において、相互作用する対に隣接するステム領域は、3〜4個、または3〜6個の連続する塩基対を形成し、第一のステム−ループ構造のステム領域は、4〜5個の連続する塩基対を形成し、第二のステム−ループ構造のステム領域は、2〜3個の連続する塩基対を形成する(図9)。1つの実施形態において、3つの領域は、ステム領域のアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される。1つの実施形態において、3つの領域は、ステム領域のアームを介して、1個または2個の、ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される。
標的にハイブリダイズするステムにおける領域は、相互に相補的な領域、非相補的領域、または両方に存在し得る。1つの実施形態において、標的相補的配列は、一本鎖ループ領域にある。1つの実施形態において、相互作用する対に隣接するステム領域以外の領域は、標的相補的配列である(図9)。1つより多くの標的核酸配列が、同一プローブによって標的化され得る。1つ以上の標的が同一または異なる配列上に存在でき、そしてそれらは、標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して正確に相補的であり得るか、あるいは少なくとも十分に相補的である。
(ダンベル構造)
別の実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、ダンベル形状構造を形成する核酸の鎖である(図7または11)。この構造は、2つのステム領域の1つのアームを介して連結された2つのステム−ループ領域である。ステム領域は、3〜5個の、7〜9個の、10〜12個の塩基対を含むことができる。ステム−ループ領域のループは、5〜7個の、8〜10個の、11〜13個のヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、ダンベル構造は、3つの連続する塩基対である1つのステム領域、および4つの連続する塩基対である1つのステム領域を有する。1つの実施形態において、2つのステム領域は、1個または2個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される。もう1つの実施形態において、2つのステム領域は、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される。1つの実施形態において、ステム−ループ構造、ダンベル構造または3アーム接合構造は、30個を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する。
1つの実施形態において、シグナリングプローブは、鎖の各末端に少なくとも1つのルオロフォアおよびクエンチャー部位を有する。プロテアーゼプローブは、鎖の各末端に少なくとも1つのタンパク質分解酵素およびこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
標的にハイブリダイズするステムにおける領域は相互に相補的な領域、非相補的領域またはその組合せ中にあり得る。1つの実施形態において、標的相補的配列は、一本鎖ループ領域にある。1つの実施形態において、標的相補的配列は、2つのステム領域以外の領域である。1津より多くの標的核酸配列が、同一プローブによって標的化され得る。1つ以上の標的が同一または異なる配列上に存在でき、そしてそれらは、標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して正確に相補的であり得るか、あるいは少なくとも十分に相補的である。
DNAまたはRNA折り畳みプログラムは、所与の核酸または修飾核酸の高次構造を予測するために当該分野で利用可能である。そのような折り畳みプログラムとしては、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に記載されたプログラム、およびhttp://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用できるoligoanalyzer 3.0ソフトウェア(これらは、本明細書において参考として援用される)が挙げられるが、これらに限定されない。そのような折り畳みプログラムは、しばしば、多数のエネルギー的により好適な構造を予測する。他の実施形態において、本発明は、折り畳みプログラムによって予測されるプローブFP1〜18の、エネルギー的により好適な構造を包含する(図8ないし24および41)。高次構造のエネルギーが自由エネルギーによって測定される場合、より低い自由エネルギー値(負)は、高次構造がよりエネルギー的に好適であることを示す。
(シグナリングおよびプロテアーゼプローブまたは他のプローブの化学的修飾)
また、本発明は、化学的に修飾されるシグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブを提供する。糖−ホスホジエステル型の骨格、2’OH、塩基のうちの1つ以上が修飾され得る。ホスホジエステル結合の置換としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−。Mは無機カチオンまたは有機カチオンである。上記骨格はペプチド核酸でもあり得、ここで、デオキシリボースリン酸骨格は、偽(pseudo)ペプチド骨格によって置き換えられている。ペプチド核酸は、以下によって記載されているHyrupおよびNielsen,Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5−23、1996、ならびにHydig−HielsenおよびGodskesen,WO95/32305(これらの各々は、本明細書により、参考として本明細書において援用される)。
糖の2’位は、H、OH、C〜Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0、1...30)、ハロゲン(F、Cl、Br、I)、C〜CアルキルおよびOCHを含むが、これらに限定されない。C〜CアルコキシおよびC〜Cアルキルは、直鎖、分岐鎖または環状である基であり得るか、またはそれを含み得る。
ヌクレオチドの塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン、または上記の修飾されたもののうちの、いずれか1つであり得る。修飾された塩基としては、N4−メチルデオキシグアノシン、デアザプリンまたはアザプリン、およびデアザピリミジンまたはアザピリミジンが挙げられるが、これらに限定されない。アデニンのN1、グアニンのN7、シトシンのN3のような環窒素はアルキル化され得る。ピリミジン塩基は、5位または6位において置換され得、プリン塩基は、2位、6位または8位において置換され得る。例えば、本明細書において参考として援用される、Cook,WO93/13121;Sanger,Principles of Nucleic Acid Structure,Springer−Verlag,New York(1984)参照。
慣用的ヌクレオチドの誘導体は、当該分野で周知であり、これらとしては、例えば、異なる型の糖を有する分子が挙げられる。この糖のO4’位は、SまたはCHで置換され得る。例えば、ヌクレオチド塩基認識配列は、連結部分によって連結されたシクロブチル部分を有し得、ここで、このシクロブチル部分は、それに結合した複素環塩基を有する。例えば、Cookら、国際公開WO94/19023(本明細書において参考として援用される)参照。
プローブの細胞への送達を促進するのに有用なプローブの他の化学的修飾としては、コレステロール、導入ペプチド(例えば、TAT、ペネトラチンなど)が挙げられるが、これらに限定されない。
(方法)
本発明の方法は、生きた細胞中の標的RNA配列へのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる、シグナリングプローブの能力に基づく。生じたシグナルは、コントロール細胞で生じたもの(例えば、バックグラウンド蛍光)よりも検出可能に高くあるべきである。したがって、コントロール細胞が全く蛍光を生じないことは、必要でない。1つの実施形態において、この方法は、RNAを検出または定量化するためのものである。1つの方法は、少なくとも1種のRNAを発現する細胞を単離するためのものか、またはそのような細胞株を作製するためのものである。細胞を単離することを含む本発明の方法のいずれかにおいて、細胞が培養され得るか、または、培養して、細胞株を作製し得る。RNAまたはRNAおよびタグ配列をコードするDNA構築物が細胞に導入される。DNA構築物は、細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれ得る。1つ以上の特異的遺伝子座における組込みも、また達成され得る。次いで、トランスフェクトされた細胞がシグナリングプローブに暴露され、これは、標的RNAまたはタグ配列への結合に際して検出可能なシグナルを生じる。検出可能なシグナルを生じる細胞が単離される。細胞は単離されて、当該分野におけるいずれかの方法によって培養され得る(例えば、細胞は個々に、またはまとめて(in batch)、単離し、平板培養することができる。細胞株は、単離された細胞を増殖することによって作製され得る。
任意の本発明の方法が、選択マーカーを用いて行われ得る。薬物選択(または任意の他の適当な選択マーカーを用いる選択)は必要な工程ではないが、それを用いて、安定にトランスフェクトされた細胞について、トランスフェクトされた細胞集団が濃縮され得る(但し、トランスフェクトされた構築物が薬物耐性を付与するように設計されている場合)。シグナリングプローブを用いる選択がトランスフェクションに続いてあまりにも直ぐに行われる場合、いくつかの陽性細胞は、一過性のものに過ぎず、そして安定にトランスフェクトされていない可能性がある。しかしながら、これは、安定にトランスフェクトされていない細胞由来のトランスフェクトされたプラスミドの希釈または除去を可能とする、十分な細胞継代を仮定すれば、最小化され得る。いくつかの安定に組み込まれたプラスミドが、クローン化されたcDNAインサートに対応するRNAを何も産生しない可能性がある。他のものは、シグナリングプローブによって検出され得ないか、または十分に検出され得ないRNAを産生する可能性がある。
RNAは、以下の種々の役割の1つ以上を有し得る:メッセンジャーRNA(タンパク質、融合タンパク質、タンパク質に融合したペプチド、輸出シグナル、輸入シグナル、細胞内局在化シグナル、またはタンパク質またはペプチドに融合することができる他のシグナルをコードする);アンチセンスRNA、siRNA、構造RNA、細胞RNA(リボソームRNA、tRNA、hnRNA、snRNAが挙げられるが、これらに限定されない);ランダムRNA、cDNAまたはESTに対応するRNA;多様な種に由来するRNA、オリゴヌクレオチドに対応するRNA、全細胞、組織、または生物cDNA調製物に対応するRNA;他の核酸、タンパク質、他の細胞成分または薬物分子に対する何らかの結合活性を有するRNA;種々の高分子複合体に取り込まれ得るRNA;いくつかの細胞機能に影響し得るRNA;あるいは、上記の機能または活性を有さないが、それにもかかわらず、細胞によって発現され得るRNA;ウイルスまたは外来性RNAに対応するRNA、リンカーRNA、または1つまたは複数のRNAに結合する配列;あるいはタグとして働くRNAか、または上記のいずれか1つ以上の配列の、未修飾の突然変異誘発されているか、ランダム化されているか、もしくはシャッフルされている組合せもしくは組換え。RNAは、構成的または条件プロモーターの制御下にあり得る:これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:誘導性、抑制性、組織特異的、熱ショック、発生、細胞株特異的、または一時的プロモーター、あるいは上記のいずれか1つ以上の未修飾もしくは突然変異誘発された、ランダム化された、シャッフルされた配列の組合せまたは組換え。
1つの実施形態において、シグナリングプローブは蛍光原性プローブである。蛍光細胞ソーターまたは関連する技術を、蛍光原性プローブと共に用いて、1つ以上の波長においてあるレベルの蛍光を示す細胞を同定および/または分離し得る。生きた細胞において信頼性よくかつ有効にmRNAならびに他のRNAを検出できることは、それを使用して、例えば、蛍光細胞分析分離装置(FACS)を用いて、細胞の所望の特性に基づいて細胞を同定し、必要であれば、分離することを可能とする。FACS技術は、現在、1秒当たり70,000細胞までを分類することを可能とする。5,000,000細胞が、2分未満で分類され得る。
(1.タンパク質発現細胞株の作製)
細胞株を作製することに関与する最も退屈な工程のいくつかは、本明細書中に記載されるシグナリングプローブの適用によって排除される。1つの実施形態において、所望の遺伝子をコードするDNA構築物でのトランスフェクションに続いて、これらの細胞に、目的の遺伝子のメッセージを認識するように設計された蛍光原性プローブが導入される。この工程は、選択マーカーを用いる選択(例えば、薬物選択)に続いて行われ得る(但し、トランスフェクトされたDNA構築物もまた、薬物耐性をコードする)。遺伝子を転写する細胞は蛍光を発する。その後のFACS分析の結果、蛍光細胞の単離物が生じ、次いで、これが増殖させられて、目的の細胞を発現する細胞株を生じさせることができる。
1つの実施形態において、シグナリングプローブは、目的のタンパク質をコードするRNAの部分、またはそれらの5’または3’非翻訳領域の部分いずれかに対して相補的なように設計される。もし目的のメッセンジャーRNAを認識するように設計されたシグナリングプローブが、内因性に存在する標的配列を検出できるならば、トランスフェクトされた細胞によって生じた標的配列の割合に対するそれらの割合により、ソーターは2つの細胞型を区別可能である。目的の遺伝子はタグ配列でタグ化され得、シグナリングプローブは、それがタグ配列を認識するように設計され得る。タグ配列は、生成されるタンパク質をタグ化することを所望するか否かに依存して、遺伝子のメッセージのタンパク質コーディング部分を含むフレームの中にあり得るか、またはそれを含むフレームの外にあり得る。
加えて、任意の所与の細胞における目的の遺伝子の発現のレベルは、変化し得る。これは、RNA発現のレベルに影響し得る種々の要因に起因し得る:この要因としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:細胞にトランスフェクトされるDNAの量またはコピー数、何らかのDNAのゲノム組込みが生じた部位、ならびにゲノム組込みに続く、DNAの一体性、およびそれから生じる発現。FACSを適用して、発現レベルを評価し、そして同一遺伝子を発現する個々の細胞を差別的に選択することができる。
(2.遺伝子をダウンレギュレートする細胞株の作製)
タンパク質をコードするRNAではなく、遺伝子または遺伝子の一部のアンチセンスであるRNAを発現する細胞株の作製を記載する、いくつかの研究がある。そのような方法は、所与の細胞における特定のRNAまたはタンパク質の量を低下させることを目的とする。タンパク質発現細胞株の作製について上記した工程は、ここで等しく適用可能であり、この工程は、シグナリングプローブをアンチセンスRNAであるRNAを検出するように設計することを除いて、実質的に同一である。
安定にトランスフェクトされたアンチセンス発現細胞株を作製する全ての試みが、標的化されたタンパク質の発現が十分に影響を受ける細胞株をもたらすわけではない。この困難性は、そのような細胞株の生成を追及することをあまり価値のないものとしてきた。本明細書中に記載された手順の容易性を考えると、活性な、すなわち、効果的なアンチセンス発現細胞株を生じるそれらの能力について、多数の異なる遺伝子配列の有効性が容易にアッセイされる。次いで、これらの遺伝子配列を分析して、どの遺伝子配列が標的化された遺伝子のダウンレギュレーションを分析し得る適切な発現プロフィールを示すかを決定し得る。
RNA干渉は、特異的遺伝子の転写レベルを低下させることをやはり目的とする、代替的アプローチである。RNA干渉は、化学的に合成されたsiRNAまたは短いsiRNAをコードするDNA構築物を用いて一過的に誘導され得るか、あるいは短いsiRNAを適切に発現する安定な細胞が作製される場合、安定的に誘導され得る。本明細書中に記載された方法を用いて、細胞または細胞株を、それらのこのようなsiRNAの発現に基づいて、分析または単離し得る。
RNA干渉を誘導するRNAを発現する細胞を得るための本明細書中に記載された方法の適用は加えて重要である。なぜならば、それはそのような細胞で現在遭遇しているいくつかの複雑性を克服するのを助けるだろうからである。例えば、RNA干渉は、標的化されたRNAの転写レベルを低下させるために行われ、他のRNAの転写レベルに対する下流効果を引き起こし得るが、これが、意図した標的ではないRNAの転写レベルを低下させることも示されている。これらの意図しない標的の同定は、RNA干渉を誘導するのに用いたRNAの配列に依存して変化する。これは、結果がそのような意図しない結果によって損なわれ得るという、細胞におけるRNA干渉の使用の複雑な特徴である。本明細書中に記載された方法は、例えば、同一遺伝子に対するRNA干渉を誘導するのに用いられる異なるRNA配列を各々発現する、複数の安定な細胞の効果的な作製を可能とするため、これらの配列の各々は、他の遺伝子の転写レベルに対するその効果について、その細胞においてアッセイされ得る。この情報の分析を用いて、減少した転写レベルを有し、その減少は標的化されたRNAの減少した発現レベルによるものではないRNAを、区別することができる。RNA干渉は急速に人気を増してきた。というのは、RNA干渉は、アンチセンスRNAを用いて特異的ダウンレギュレーションを達成することに伴う困難さを克服するためにうまく用いられているためである。1つの方法は、非特異的活性を低下させたより特異的なRNA干渉のために最も効果的な配列を決定することの助けとなり得る。この方法は、最も効果的かつ特異的なアンチセンスの選択のための方法も提供するので、この方法はまた、効果的なアンチセンスRNAを同定する方法も表す。
(3.細胞表面−局所化抗原に基づく細胞の間の区別)
免疫学者などは、長い間、細胞を分類するのにFACSを用いてきた。一般に、この方法は、差別的に標識されるプローブ(通常、フルオロフォア標識抗体プローブ)で、細胞表面局在タンパク質を標識することに基づく。例えば、細胞表面局在タンパク質の発現について陽性の細胞を調査することができる。この方法は、細胞の一体性を保存し、その生存性を維持するように設計された条件下で最も通常に用いられる。
本発明によると、細胞表面局在タンパク質の存在を検出するためには、シグナリングプローブを作成して、目的のタンパク質をコードするmRNAを標的化する。シグナリングプローブを、細胞生存性をなくすることなくトランスフェクションによって細胞に導入する。次いで、細胞ソーターを用いて、陽性分類細胞を単離する。次いで、目的のタンパク質の1つのmRNAに各々標的化されるシグナリングプローブの組合せを用いる場合、各々は別々に標識され得る。もし細胞が、FACSの単回の適用において検出することができるものよりも多数の標的を有するならば、複数ラウンドの分類を行って細胞を分類する。
本明細書中に記載された方法は、他の細胞RNA、例えば、内部に局在化されるか、または細胞から分泌されるタンパク質をコードするmRNA、またはタンパク質をコードしないRNAについての細胞の分析または分類も可能とする。その結果、通常用いられる抗体プローブに接近できない、あるいはそれに対してプローブが未だ開発されていないタンパク質をコードするRNAを含めた、先に記載された細胞RNAの1つまたは複数を標的として検出することができる。これらとしては、膜会合タンパク質、膜架橋タンパク質、膜固定タンパク質、細胞質タンパク質または核細胞質タンパク質が挙げられる。
(4.特異的RNAの発現についての細胞のアッセイ、および細胞におけるRNA発現のレベルの定量)
もし細胞に導入される蛍光原性プローブの標的RNAが存在すれば、細胞は蛍光を発する。この情報は蛍光顕微鏡(共焦点顕微鏡、レーザー走査顕微鏡または他のタイプの顕微鏡を含む)またはFACSの使用によって定量的に評価することができ、それはこれらのいずれかによって定量可能でもある。例えば、イン・サイチュ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を組織のスライスに対して行って、特定のRNAについての発現のパターンを判定する代わりに、シグナリングプローブを用いて、同一実験を行う。さらに、各々が特異的RNAを標的化する、異なる蛍光性の発蛍光プローブの組合せを用い、1つの工程で目的の数個のRNAの存在または量につきアッセイする。(固定された試料中の)RNAの検出を経験的に決定された温度で行って、非標的特異的シグナル発生を制限することができる。核酸プローブを用いる場合、標的検出のための最適な温度条件を確立するのは通常の方法である(細胞および組織におけるRNAの検出と組み合わせ抗原の局在化)。
固定された細胞または組織スライスを用いて、認識されたタンパク質抗原の局在を記載するのに免疫細胞化学を用いて、シグナリングプローブ標的性特異的RNAを用いて、注目するRNAを同一試料中で共局在させる。RNAに標的化される蛍光原性プローブが固定細胞で機能することが示されている。
(5.複数のRNAまたはタンパク質を発現する細胞株の作製)
本発明の方法を用い、多数の選択薬剤の混合物の存在下で(または他の選択剤を用いて)これらの細胞を維持する必要性がなくとも、いずれかの数のRNAまたはタンパク質を発現する安定にトランスフェクトされた細胞株が非常に迅速に作製される。遺伝子トランスフェクション(および所望により、薬物−選択)に続いて、シグナリングプローブの組合せ(1つが各タンパク質についてのメッセージに対する)が細胞に導入される。遺伝子のうちの1つのみのmRNAに、またはメッセージが関連するタグ配列にハイブリダイズするように、各蛍光原性プローブの標的相補的配列を設計することによって、各シグナリングプローブは、遺伝子のうちの1つのみによってコードされるmRNAを認識するように設計される。1つの実施形態においては、次いで、細胞は、FACSによって分類される。1つまたは複数のシグナルについて選択することによって、種々の細胞株を単回の適用で作製する。
FACSの単回の適用において同定することができる数を超える、多数の目的のRNAを発現する細胞株を生じさせる必要性があり得る。例えば、特定の複合体の形成に関与する、あるいは生物学的経路に関与すると考えられるタンパク質およびRNA配列の全てが過剰発現される細胞株を有するのは情報性が高い。例えば、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するRNAまたはタンパク質、相互に対する調節、活性化または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性につき相互に依存するRNAまたはタンパク質、複合体を形成し、または相互に結合するRNAまたはタンパク質、相同性(例えば、配列、構造、または機能的相同性)を共有するRNAまたはタンパク質。もし必要な数のRNAが、FACSの1回の適用で分析できる数を超えれば、これを達成するには、さらなるRNAをコードするさらなる構築物がトランスフェクトされる宿主細胞として、RNAのいくつかの組合せを既に発現している細胞を用いて上記の工程を反復する。複数ラウンドの上記方法を用いて、必要なRNAの全てまたは部分集合を発現する細胞を得ることができる。
発現させるべき複数のRNAが、全て、同一薬物に対する耐性を細胞に付与する構築物にクローン化される場合、一実施形態において、FACSを用いて、所望のRNAの全てを発現する細胞を単離することができる。配列が安定にゲノムに組み込まれる場合、細胞がいずれの配列の発現も失わないことが所望される。しかしながら、配列の1つ以上が失われ得る可能性がある。この場合、これらの細胞が増殖される培地中の選択薬物または選択因子の濃度を増加させ、この確率をより低くさせる。別法として、その各々が異なる薬物に対する耐性を付与する構築物が用いられ、適切な薬物の混合物中に細胞を維持する。また、細胞に安定にトランスフェクトすべき構築物の部分集合を選択して、1つの薬物に対する1つの耐性遺伝子をコードさせることができ、別の部分集合を選択して、別の薬物についての耐性遺伝子をコードさせることができる。
さらに、細胞株のいくつかの細胞が目的のRNAの発現を失う場合、1つの手段として、上記の細胞株を単離する第一の実験を反復し、新しい細胞が得られる。別法として、所望のRNAの全てを発現する細胞を再度単離することを目的として、記載した細胞の混合物がFACSによって分析される。これは非常に有用な手順である。なぜなら、この手順は、選択された元の細胞株と同一の遺伝子的構成を有する細胞株を生じる細胞を、再度もたらすためである。
上記のアプローチは、タンパク質配列およびRNA配列の任意の組合せを発現する細胞の非限定的な供給をもたらし、実質的に限定されない分析方法に従う。過剰発現されるタンパク質は細胞に対して毒性であり得る可能性があるが、後に記載されるように、この確率は容易に対処され得る。
RNAの全てをもはや発現しない細胞から所望のRNAの全てを発現する細胞を再度単離することが可能であるという容易性は、薬物の非存在下、または最小濃度の薬物の存在下で細胞株を維持することを可能にさせる。本明細書中に記載された方法は、シグナリングプローブの、以前に作製された細胞または細胞株への再適用も可能とする。例えば、細胞が、RNAのいずれかの1つ以上(元々、これらに関して細胞が単離された)に対して依然として陽性であるか、またはどの程度陽性であるかを決定すること。
(6.1つ以上のRNAまたはタンパク質を劇的に過剰発現する細胞株の作製)
高度に過剰発現されるべき各遺伝子については、例えば、同一遺伝子についての2以上の配列を、まず、薬物耐性または他の選択マーカーを必要に応じてまた付与するDNA構築物中に、クローン化する。各遺伝子についての複数配列の各々を、異なるタグ配列をコードする配列を含むように設計する。1つの実施形態において、細胞へのDNA構築物のトランスフェクション、およびその後の選択に続き、その各々が1つのみのタグ配列に標的化され、差別的に蛍光的に標識される蛍光原性プローブが細胞に導入され、細胞ソーターを用いて、それらのシグナルにつき陽性である細胞が単離される。そのような細胞は、差別的にタグ化された配列の各々の少なくとも1つのコピーをそれらのゲノムに導入され、したがって、目的の配列の発現が、増大した数の、目的の配列の実質的に同一のコピーから生じる。目的の配列は細胞中のゲノムの種々の位置に一体化させることができる。この方法をFACSの使用と組み合わせて用いて、各フルオロフォアのシグナルについて最も強いスコアを示す細胞を拾い出す。上記種々のタグの一部または全ては、同一であり得、したがってこの共通配列に対する共通の1つのシグナリングプローブを用いて、細胞における種々のタグの全てを検出することができる。
(7.複数のアンチセンスRNAを発現する細胞株の作製)
複数のアンチセンスメッセージを生じる安定にトランスフェクトされた細胞株は以下のように作製される。このようなアンチセンスメッセージは、mRNAまたは他のRNAいずれかを標的とする。トランスフェクトされたアンチセンス配列のうちのいずれか1つを異なるレベルで発現する細胞を選択する。安定なトランスフェクションの反復されたラウンドを通じて、限定されない数のRNAのアンチセンスメッセージを発現する安定にトランスフェクトされた細胞株を生起する細胞が容易に選択される。
もちろん、アンチセンスRNA以外の他のRNAを発現する細胞は、本明細書中に記載された方法によって調製され得る。そのようなRNAとしては、限定されるものではないが、1種以上のmRNA、rRNA、siRNA、shRNA、hnRNA、tRNAまたはsnRNAのような他の構造RNA、RNA干渉活性を有するRNA、タグとして働くRNAなどが挙げられる。
(8.細胞株のライブラリーの作製)
複数の細胞を、発現ライブラリーを形成するDNA構築物でトランスフェクトする。DNA配列の発現ライブラリーとしては、限定されるものではないが、例えば、全生物、組織、細胞もしくは細胞株から作製されたcDNAまたはESTライブラリーを含めた当該分野で公知の種類のいずれかまたはこれらの混合物、および限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、またはペプチドをコードする配列を含めた合成ライブラリーが挙げられ得る。同様に、発現ライブラリーとして特異的に設計されていないDNA構築物のライブラリーが使用され得る。例えば、DNA構築物ライブラリーは、プロモーター、リプレッサーまたはエンハンサーエレメントのような調節機能を有し得るDNAの配列を含み得、これらは構成的であっても、誘導的であっても、抑制的であってもよい。同様に、DNA構築物ライブラリーは、それから転写が起こり得る全遺伝子座もしくは部分的遺伝子座またはゲノムDNAのようなDNAの大きなセグメントを含み得る。DNA構築物のこれらの発現ライブラリーのいずれも、各々、全体的または部分的に、突然変異され、ランダム化され、組換えられ、シャッフルされ、改変され得るか、あるいはそのいずれかの組合せで処理され得る。加えて、これらの型のライブラリーのいずれも、さらに、発現され、そしてシグナリングプローブのための標的として使用され得る少なくとも1つのタグを含み得る。
タンパク質の特定クラスについてのDNA配列の発現ライブラリーが作製され得、これを用いて、細胞株ライブラリーが作製され得る。例えば、プロテインキナーゼについてのcDNAは、タグ配列を含む発現構築物にクローン化され得る。異なるキナーゼを安定に発現する細胞が得られ得、これを用いて、キナーゼを発現する細胞株に限定された細胞株ライブラリーを作製し得る。この配列のクラスは、薬物スクリーニングのようなさらなる適用を満足するように選択され得る。
細胞株のライブラリーは、同一タンパク質ファミリーに属するか、または機能的ファミリー内の、配列相同性を有するタンパク質のクラス、また、所定のタンパク質の経路または複合体または系におけるその役割によって規定されるタンパク質も発現し得る。例えば、種々のHIVタンパク質に結合できる化合物に対する薬物スクリーニングにおいて、各細胞株が異なるHIVタンパク質を発現する細胞株ライブラリーが作製され得、これを薬物化合物をスクリーニングするのに用いることができる。
細胞株のライブラリーを用いて、所望の活性を有する分泌されたペプチドまたはタンパク質をアッセイし得る。まず、上記ペプチド/タンパク質に対してフレーム内で翻訳された輸出シグナルをさらにコードする(ペプチド、タンパク質、EST、cDNAなどについての)発現ライブラリーを用いて、細胞株ライブラリーが作製され得る。発現されたペプチド/タンパク質は増殖培地に分泌される。次いで、特定の活性に対するこれらのペプチドの効果は、適当に設計されたアッセイを仮定すると測定することができる。細胞株からの組織培養上清が収集され、試験細胞に適用して、活性に対してアッセイし得る。
加えて、例えば、発現ライブラリーを細胞にトランスフェクトし、必要に応じて、まず、(例えば、発現ライブラリーに含まれるタグに対して向けられたシグナリングプローブを用いて)発現ライブラリーでトランスフェクトされた細胞を選択し、次いで、目的の1種以上のRNAに対して向けられた1つまたは複数のシグナリングプローブに細胞を暴露することによって、細胞株のライブラリーが作製され得る。これにより、細胞において種々のRNAを発現し、これらのRNAのいずれが、目的の1種以上の複数のRNAの下流転写のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらすかを決定することが可能となる。
(9.1種以上のタンパク質について機能的にノックアウトされた細胞株の作製)
本発明の方法は、培養細胞において機能的ノックアウトを調製する手段を提供する。複数の遺伝子座から、ユニークなRNA配列に対するRNA干渉活性を有する実質的に同一のアンチセンスRNAまたはsiRNAを発現する細胞を作製することによって、目的のいずれか1つのタンパク質の機能的ノックアウトである細胞株が作製される。siRNAを用いる本発明の方法の任意のものがまた、shRNAを用いて実施され得る。例えば、その各々が、特定遺伝子に対するアンチセンスRNA、または上記遺伝子に対するRNA干渉活性を有するsiRNA、あるいは双方のいずれかをコードする複数の構築物を細胞にトランスフェクトする。ここに、各アンチセンスRNA配列は、各々がユニークなタグ配列のヌクレオチド配列をタグとして付された点でのみ異なる。異なってタグに付されたアンチセンスRNAの1つまたは複数または全てを発現する細胞が選択される。同様に、RNA干渉活性を持つ各siRNAまたはshRNAの存在は、各siRNAまたはshRNAが関連するタグの検出によって測定される。FACSを用いて先に記載されたように蛍光を定量化するので、この特徴により、アンチセンス配列のいずれか1つまたは複数を最も強く発現する細胞について選択するのが可能となる。所望の発現レベルの標的化されたRNAを呈するか、あるいは標的化されたRNAの発現レベルを増大させるように作用する、発現されたRNAのいずれかの数または組合せの発現に起因してその発現をほとんどまたは全く呈しない細胞を単離することが可能である。
重要なことには、同一遺伝子を標的化するRNA干渉活性を有する異なるアンチセンス配列およびsiRNAの1つまたは複数が、このアプローチにおいて使用され得る。例えば、その発現が、シグナリングプローブおよびFACSを使用することによって選択されるアンチセンスRNAのいくつかは、遺伝子に対するメッセンジャーRNAの特定の領域を標的化するように設計され、他方、他のものは、それらが同一メッセンジャーの別の部分を標的化するように設計される。目的のタンパク質の機能的ノックアウトである細胞株を作製するために、目的のタンパク質の発現の検出可能なレベルを呈しないか、あるいは発現の許容される低いレベルを呈する細胞株の作製が必要とされる場合、目的の同一遺伝子に対してRNA干渉活性を有する類似もしくは異なるアンチセンスRNAまたはsiRNAをコードする多くの遺伝子配列として、細胞に安定にトランスフェクトする。
さらに、いずれかの数の機能的にノックアウトすべき配列をアンチセンスまたはsiRNAによって標的化しつつ、上記した手順を反復することによって、複数タンパク質が機能的にノックアウトされたか、または低下した発現レベルを有する細胞株を作製する。例えば、タンパク質の複合体の機能を研究するためには、複合体を形成するタンパク質の1つ、全て、またはいずれかの組合せの発現レベルを、ノックアウトまたは低下させる。
(10.1以上の遺伝子の選択された交互にスプライシングされた形態のみの機能的ノックアウトである細胞株の作製)
単一遺伝子の異なってスプライシングされたバージョンは、しばしば、異なる機能を持つタンパク質に翻訳される。本発明の方法を用い、1以上のタンパク質の選択された交互にスプライシングされた形態のみが機能的ノックアウトされたか、または発現レベルが低下した細胞株を作製する。例えば、細胞から排除したい遺伝子のメッセンジャーRNAの交互にスプライシングされたバージョンのみを標的とするアンチセンスまたはsiRNAを設計することによって、目的の遺伝子の交互にスプライシングされたRNAの全てを機能的にノックアウトするか、あるいは目的の交互にスプライシングされたメッセージ以外を、その発現レベルを所望のレベルまで十分に低下させる。
(11.1以上の他のタンパク質を機能的にノックアウトしつつ、1以上のRNAまたはタンパク質を発現する細胞株の作製)
例えば、相互に相互作用すると考えられるタンパク質の所定の群に対して、目的のタンパク質の1以上が機能的にノックアウトされたか、あるいは低下した発現レベルを有する安定にトランスフェクトされた細胞株を、アンチセンスまたはsiRNA(またはshRNA)の細胞の発現によって作製することによって、それらの相互作用を研究することができる。次いで、細胞における目的の残りのタンパク質の機能を調べることができるが、おそらくはより興味深いことには、それが次に1以上の目的の残りのタンパク質を過剰発現するように、それをさらに操作することによって、そのような細胞をさらに改変し得る。加えて、細胞中でのさらなるタンパク質の発現を、過剰発現させても、排除しても、低下させてもよい。再度、ある種のタンパク質またはある種のタンパク質の機能的ノックアウトの過剰発現は細胞にとって致死的であり得る可能性がある。これは、以下に取り組む問題である。
類似の方法を用いて、転写調節において直接的または間接的役割を持つDNAを導入することによって、ランダムに遺伝子をアップレギュレート、またはダウンレギュレートし得る。例えば、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー配列、あるいは1以上のRNAについての転写レベルの改変をもたらすいくつかの他の結合または機能的活性を有する配列のうちの1つ、または組合せを含めたDNA配列が、細胞にトランスフェクトされ得る。これらのエレメントの活性は、構成的であってもの、誘導的であっても、抑制的であってもよい。1以上の特異的RNAに対するシグナリングプローブを用いて、これらのRNAの発現レベルが増加または減少している細胞を同定または単離し得る。記載された方法を用いるいくつかのDNA配列の安定な組込みは、遺伝子座からの転写をランダムに十分に開始または遮断することができる。これらの細胞株ライブラリーは、特異的遺伝子につき効果的に過剰発現するか、またはノックアウトされた細胞につきスクリーニングすることがされ得る。1以上のRNAの所望のレベルを持つ細胞が、このようにして選択され得る。複数ラウンドのこの手順を行って、必要な場合、目的の複数のRNAに対して所望の発現プロフィールを有する細胞を単離することができる。
(12.トランスジェニックマウスの作製)
いくつかの目的に対して、培養物中の細胞の研究は十分ではない。しかしながら、上記した方法は、胚性幹細胞の操作に向けてそれ自体も役に立つ。上記した手順に従い、複数のRNAまたはタンパク質を発現するか、あるいは複数のタンパク質、または複数のタンパク質の交互にスプライシングされた形態の部分集合の機能的ノックアウトとして働くかのいずれかである胚性幹細胞を得ることができる。次いで、そのような胚性幹細胞は、トランスジェニック動物の作製のための基礎として使用される。
記載された方法に従って単離された細胞は、生物に直接移植され得るか、あるいはそれらの核は、他のレシピエント細胞に導入され得、次いで、これらは移植され得る。1つの使用は、トランスジェニック動物を作製することであり、他の使用は、限定するものではないが、細胞産物を合成または生物に分泌する細胞、および生物において所望の役割を行うように操作された細胞の導入を包含し得る。
(13.誘導性の安定にトランスフェクトされた細胞株の作製)
細胞における特定のタンパク質もしくはRNAの過剰発現または発現の欠如は、致死的、または損傷を与えかねない。しかし、毒性タンパク質またはRNAを過剰発現する細胞、あるいはそれがなければ細胞が生存できないタンパク質またはRNAの機能的ノックアウトである細胞を研究することは、非常に重要である。この目的で、細胞に対してそのような有害効果を有する選択されたRNAが誘導性または条件プロモーターの制御下にある、安定にトランスフェクトされた細胞を作製する。そのような細胞株を単離するためには、1つの実施形態において、トランスフェクトされ、必要に応じて薬物選択された細胞が、まず、誘導性遺伝子の転写に影響するよう最小限に誘導され、次いで、適当なRNAを認識するように設計されたシグナリングプローブのそれへのトランスフェクションに続いて、細胞がFACS分析に供される。得られた細胞は、必要な場合のみ、毒性RNAが誘導され、転写されるように維持される。
誘導系は、毒性RNAの発現以外の適用で有利であり得る。例えば、同調された細胞株の細胞周期の間のある時点において、細胞に安定にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現を誘導する。あるいは、1以上の安定にトランスフェクトされた遺伝子配列のセットの発現産物が別のセットの発現産物に対して作用すると考えられる場合、1つの誘導性プロモーターの制御下にある第一のセットの遺伝子配列、および第二の誘導性プロモーターの制御下にある第二のセットの遺伝子配列をクローン化することが目的である。種々の誘導によって、他のセットの発現産物の非存在または存在いずれかにおいて、遺伝子配列のいずれかのセットによってコードされた発現産物を調べる。一般に、上記した方法に記載されたように細胞に取り込まれたDNA配列は、各々、プロモーター、または所望の活性を有する転写の他のレギュレーターの制御下に置くことができる。例えば、誘導性、組織特異的、時間特異的もしくは一時的なプロモーター、エンハンサーまたはリプレッサーが使用され得、ならびに限定されるものではないが、化合物または化学物質、他の細胞、タンパク質、ペプチド、ホルモン、シグナル伝達分子、細胞から分泌された因子、生物、組織もしくは細胞、または環境試料からの全抽出物あるいは分画された抽出物の1種以上を含めた、細胞または細胞外シグナルに起因して調節され、活性化されまたは抑制される調節エレメントが使用され得る。これらの場合において、細胞は、まず、シグナリングプローブへのその暴露に先立って、転写を調節する薬剤の適切なレベルに暴露される。
(14.生きた細胞における遺伝子組み換え事象の検出、および非組換え細胞または異なって組み換えられた細胞の引き続いての単離)
ある種の安定な細胞株に関与する組換え事象を受けた細胞を検出するためのシグナリングプローブの使用と平行して、生きた細胞の混合物から、他の特異的組換え事象を受けた細胞を検出し、単離するためのシグナリングプローブを使用する。同一の原理を用いて、例えば、VDJ組換え、トランスロケーション、およびウイルスゲノム組込みに対してアッセイし得る。
細胞組換え事象において、例えば、ゲノムDNAの1つの配列を別の配列と交換する。組換え事象が起こった領域をコードするDNA配列がRNAに転写された場合、そのような事象の存在は、組換えられていないDNA配列から転写されたRNA、または組換えられた配列から転写されたRNAいずれかを認識するように設計されたシグナリングプローブによって検出される。そのようなアッセイはまた、蛍光顕微鏡(または得られたシグナルを定量できる他の機器)を用いて実施され得る。組換えられなかった細胞から組み換えられた細胞を分離したい場合、細胞をFACSに供し、それを分類する。加えて、FACSは、多数の組換え事象の存在または非存在に基づいて細胞を分類するために使用され得る。
(15.発現されたRNAに基づく細胞の分類)
本明細書中に記載したシグナリングプローブの使用は、内部に局所化されたタンパク質、細胞表面に局所化されたタンパク質、または分泌されたタンパク質をコードするRNAの発現に基づき、ならびに細胞に存在し得る他のRNAについて細胞が分類されるのを可能とする。例えば、細胞の混合された集団から出発し、これらのタンパク質を生じるmRNAを認識するシグナリングプローブを設計することによって、目的の内部に局所化されたタンパク質を発現する細胞を単離する。これらのシグナリングプローブは、細胞の混合物にトランスフェクトされ、FACSを用いて、適切にはそれらを分類し得る。複数ラウンドのソーティングが実施され得る。
加えて、研究者は、例えば、1以上の特異的タンパク質のmRNA、または所定の付加された因子に応答して転写されるRNAを発現する細胞を単離すること、あるいはいずれの付加された因子が1種以上のタンパク質またはRNAの転写を誘導し、または抑制するのかを決定することに興味を持ち得る。このようにして試験できる付加された因子は、限定されるものではないが、核酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、シグナリング分子、化学化合物、無機化学物質または有機化学物質、細胞、生物、組織または細胞からの、またはそれに由来する全抽出物または分画された抽出物、細胞または生物から精製されたまたは単離された産物、環境または他の供給源からの試料を含むことができる。
サイトカインに応答して1種以上の特異的RNAを発現するように誘導される細胞を単離するためには、例えば、サイトカインによってまず細胞の混合物を誘導し、次いで、その各々が、目的のタンパク質の1つを生じるmRNAを認識するように設計されたシグナリングプローブでトランスフェクトする。1つの実施形態において、次いで、FACSを用いて、目的のmRNAに対して陽性のスコアである細胞を単離する。代替的な実施形態において、例えば、特定の遺伝子のその発現について、ウイルスで感染された細胞もアッセイする。あるいは、化学化合物ライブラリーのような化合物のセットまたはライブラリー、あるいはRNAの発現ライブラリーを細胞に適用して、いずれかの化合物もしくは化合物の混合物、またはRNAが、1種以上の特異的タンパク質またはRNAの転写を誘導し、抑制しまたは調節するかを決定し得る。
上記した方法で、以下の異なる役割の1以上を持つRNAの存在について陽性の細胞を検出することが可能である:タンパク質、融合タンパク質、タンパク質に融合したペプチド、輸出シグナル、輸入シグナル、細胞内局所化シグナルまたはタンパク質またはペプチドに融合することができる他のシグナルをコードするメッセンジャーRNA;アンチセンスRNA、siRNA、siRNAと同様な活性を有するヘアピン構造を形成する短いRNA;限定されるものではないが、リボソームRNA、tRNA、hnRNA、snRNAを含めた構造RNA、細胞RNA;ランダムRNA、cDNAまたはESTに対応するRNA;多様な種由来のRNA、オリゴヌクレオチドに対応するRNA、全細胞、組織または生物cDNA調製物に対応するRNA;他の核酸、タンパク質、他の細胞成分または薬物分子に対していくらかの結合活性を有するRNA;種々のマクロ分子複合体に取り込まれ得るRNA;いくつかの細胞機能に影響し得るRNA;または上記した機能または活性を有しないが、それにもかかわらず細胞によって発現され得るRNA;ウイルスまたは外来性RNAに対応するRNA、リンカーRNA、または1以上のRNAを連結する配列;またはタグ、あるいは上記のいずれかの1つ以上の未改変の変異誘発された配列、ランダム化された配列、またはシャッフルされた配列の組合せまたは組換えとして働くRNA。RNAは、限定されるものではないが、誘導的、抑制的、組織特異的、または一時的なプロモーター、あるいは上記のいずれかの1以上の未改変または変異誘発された配列、ランダム化された配列、シャッフルされた配列の組合せまたは組換えを含めた、構成的プロモーターまたは条件プロモーターの制御下にあり得る。上記したRNAの発現は、DNA構築物、ベクター、あるいはその発現をもたらす核酸を送達する他の送達方法の細胞への導入に由来し得る。
(16.プロテアーゼプローブを用いる核酸のインビボ検出および細胞の引き続いての選択)
本発明は、シグナリングプローブとは対照的に、その標的核酸への結合に際してタンパク質分解活性を呈するプロテアーゼプローブの新規な形態にも指向される。そのようなタンパク質分解活性は、標的核酸が細胞に存在する場合、検出目的で、また、細胞において特定のタンパク質配列を分解させるのに用いることができる。例えば、特異的にウイルスタンパク質を切断するプロテアーゼは、潜伏感染におけるように、ウイルス配列の転写が活性化される場合に、そして例えば、プロテアーゼプローブがウイルスメッセージに対して向けられる場合に、活性化され得る。
別の局面において、本発明は、本明細書においてプロテアーゼプローブといわれる、タンパク質分解活性作製単位ハイブリダイゼーションプローブに指向される。そのようなプロテアーゼプローブは、標的RNAに相補的なヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチド、および相互に相補的なヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドも含む。これらのプロテアーゼプローブは上記したプローブと同様の様式で作動するが、その標的核酸配列とシグナリングプローブとの相互作用に際しての蛍光シグナルの生成または変化の代わりに、このプロテアーゼプローブは標的の存在下でタンパク質分解性となる。
上記方法におけるシグナリングプローブの代わりにプロテアーゼプローブで置き換えることができ、新しい可能性が生じる。プロテアーゼプローブによって認識されるRNAを発現する細胞へのプロテアーゼプローブのトランスフェクションに際して、プロテアーゼプローブはその標的にハイブリダイズする。これはそのハイブリダイズされた状態のようにプロテアーゼの活性化を引き起こし、このプロテアーゼはもはやそのプロテアーゼインヒビターの近隣には存在しない。そのようなプロテアーゼプローブの標的が存在し、認識される細胞は、損傷され、かくして、それに対して選択される。このmRNAを発現しない細胞は影響されない。逆に、プロテアーゼプローブは、細胞の増殖または生存性に有益な効果を刺激するか、またはそうでなければこのような効果を与えるか、あるいはその標的が存在し、認識される細胞に増殖の利点を与えるタンパク質分解反応を触媒するように設計され得る。
加えて、プロテアーゼプローブは種々の他の適用において有用である。プロテアーゼの活性は容易に測定され得、さらに、特定の核酸標的配列の存在下において活性なプロテアーゼは検出目的のみならず、治療目的でも使用され得る。ここで、例えば、特定の遺伝子(例えば、細胞形質転換、癌形成、増殖異常(dysproliferation)などに関連する遺伝子)が転写された場合、プロテアーゼプローブが送達される細胞は、タンパク質分解され、生きていないようにされる。例えば、細胞のいくつかが特定のウイルスによって影響される細胞の混合物を考慮して、特異的にウイルスmRNAを標的とするプロテアーゼプローブを細胞に導入する。このようなmRNAを運ぶ細胞は、それが含むプロテアーゼプローブのタンパク質分解活性を活性化し、このことによってこれらの細胞を破壊する。
好ましくは、限定されるものではないが、金属および金属キレーターを含む他の分子も、インヒビターとの相互作用に際して酵素の可逆的阻害を供するのにやはり有用であるが、タンパク質分解酵素インヒビターはペプチドまたは小さな化学物質である。タンパク質分解酵素、およびタンパク質分解酵素のインヒビターの有用な対の例は、限定されるものではないが、アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンAまたはB、カルボキシペプチダーゼAとEDTA、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチナール、およびテルモリシンまたはアミノペプチダーゼMと1,10−フェナントロニンが挙げられる。
加えて、他の相互作用対を取り込むプローブを用いることができ、ここに、相互作用対の1つのメンバーは所望の活性を有し、第二のものは、プローブが標的に結合していない場合にこの活性を阻害または減少させるように作用する。それらの標的への結合に際して、プローブの活性が呈される。なぜならば、相互作用対の阻害メンバーはもはや所望の活性を有するメンバーの近隣には存在しないためである。
これまでの記載に基づき、以下の方法が実施され得る。
少なくとも1つのRNAを発現する細胞を単離するための方法であって、この方法は、
a)少なくとも1つのRNAをコードするDNAを細胞に導入する工程;
b)上記少なくとも1つのRNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;および
c)上記シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
この方法は、単離された細胞を増殖させて、RNAを発現する細胞株を作製する工程をさらに包含し得る。DNA構築物がトランスフェクトされた細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれる場合、複数の細胞株が作製され得る。トランスフェクトされた構築物のゲノム取り込みがゲノムを持つ特定の位置に向けられない限り、組込みはランダムに起こると考えられ、従って、各陽性細胞は相互に異なり得、それらが選択されるRNAに対して全て陽性の複数の異なる細胞株が存在し得る。DNA構築物が、細胞(例えば、不死化された、初代の、幹細胞または細胞株)の混合された集団に導入される場合、複数の細胞株がまた作製され得る。細胞は、限定されるものではないが、HeLa、HEK293T、Vero、Caco、Caco−2、MDCK、COS−1、COS−7、K562、Jurkat、CHO−K1、Huvec、CV−1、HuH−7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR−90、MCF−7、U−2 OSまたはCHOを含めた任意の樹立された細胞株に由来してもよい。必要に応じて、DNA構築物は、さらに、少なくとも薬物耐性マーカーまたは他の選択マーカーをコードし得、そして上記方法は、工程a)後に選択マーカーを用いて細胞を選択する工程をさらに包含し得る。単離された細胞は、別々に増殖させてもよいし、またはプールされてもよい。細胞が単離される場合は常に、1以上の構築物または1以上の発現ライブラリーでのトランスフェクションが続くか否かにかかわらず、単離された細胞は、相互から分離して増殖させてもよいし、またはプールされてもよい。
単離された細胞は、第二のRNAを発現するようにさらに調製され得る。同時または順次いずれかの様式において、さらなる工程は、細胞または細胞株を、第二のRNAをコードする第二のDNA構築物でトランスフェクトする工程;上記第二のRNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;および、上記RNAおよび第二のRNAの少なくとも一方または双方のシグナルを呈する細胞を単離する工程を包含する。上記第一のシグナリングプローブは、第二のシグナリングプローブと同一または異なるシグナルを生じることができ、例えば、それらは同一または異なるフルオロフォアを有し得る。2を超えるRNAを発現する細胞または細胞株は、上記工程を同時または順次に反復することによって提供され得る。第二のDNA構築物は、同一または異なる薬物耐性または他の選択マーカーも含み得る。第一の薬物耐性マーカーおよび第二の薬物耐性マーカーが同一である場合、薬物のレベルを増大させることによって、同時選択が達成され得る。発現ライブラリーを形成するDNA構築物を用いて上記工程を同時または順次様式で反復することによって、複数の細胞株が作製され得、ここに、上記細胞の少なくとも一部は異なるRNAを発現する。
トランスフェクトされた遺伝子と会合したタグ配列を、シグナリングプローブのための標的として用いる関連するアプローチが開示され、その内、1つの適用は、例えば、シグナリングプローブが密接に関連するRNA種を検出する場合、そのRNAがバックグラウンドを超えて同定するのが困難であり得る細胞の選択を可能にすることである。従って、少なくとも1種のRNAを発現する細胞を単離するための方法が提供され、この方法は、
a)少なくとも1つのRNAおよび少なくとも1つのタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程;
b)タグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;および
c)シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
この方法は、用いるシグナリングプローブが、上記RNAよりはむしろタグ配列を認識するように設計された以外は、上記したのと実質的に同一である。先のものよりも優れたこの手順の利点は、異なるタグ配列の数に対応する少数のシグナリングプローブのみが、1種以上のRNAを発現する非常に多数の異なる細胞株を調製するのに必要とされることである。必要に応じて、DNA構築物は、さらに、少なくとも薬物耐性マーカーまたは他の選択マーカーをコードし得、上記方法は、工程a)後に上記マーカーが耐性を付与する少なくとも1つの薬物または他の選択剤に対して耐性である細胞を選択する工程をさらに包含する。単離された細胞は、別々に増殖されてもよいし、またはプールされてもよい。細胞を単離する場合は常に、1以上の構築物または1以上の発現ライブラリーでのトランスフェクション後であるかを問わず、単離された細胞は、相互に分離して増殖させてもよいし、プールされてもよい。
タグ配列とは、シグナリングプローブによって検出されるべきRNAの部分として発現される核酸配列をいう。シグナリングプローブは、上記プローブを、タグの配列に対して相補的である部分を含むように設計することによって、タグに対して向けることができる。本発明で使用され得、かつシグナリングプローブがそれに対して調製され得るタグ配列の例としては、限定されるものではないが、HA(インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質)、myc、his、プロテインC、VSV−G、FLAGまたはFLUを含むがそれに限定されないエピトープタグのRNA転写産物が挙げられる。これらおよび他のタグ配列は当業者に公知であり、代表的には、発現されたタンパク質産物に取り込まれ得るアミノ酸配列に対応し、しばしば、それらの存在を報告するのに使用され得る頑強な抗体またはタンパク質検出試薬の利用可能性に基づいて選択される。本明細書中に記載されたタグ配列は、タグが付されるRNAによってコードされるタンパク質産物をアミノ酸レベルで改変するか、または対応する抗体もしくはタンパク質検出試薬の使用を介していずれかのそのような改変されたタンパク質産物の引き続いての検出を助けるために使用され得る配列のみをいうことは意味されない。本明細書中で使用される場合、タグ配列は、シグナリングプローブによる認識のための少なくともユニークな核酸配列を提供する。シグナリングプローブは、種々のRNAの検出で用いるのに記載されてきた。これらのRNAのいずれもタグとして用いることができる。タグ配列をコードする構築物のDNA部分は、少なくとも1つのRNAのタンパク質コード部分をコードするDNA構築物の一部を有するフレーム内であっても、フレーム外であってもよい。かくして、タグ配列は、シグナリングプローブによる検出のために翻訳される必要はない。
タグ配列は、シグナリングプローブ用の標的部位として作用するように設計された複数反復配列を含み得る。そのようなタグ配列は、複数シグナリングプローブ標的部位を提供する。結果として、非常に多数のシグナリングプローブが結合し得る。これは、シグナリングプローブによって検出されるべきいずれか1つの核酸分子から生じ得る合計シグナルを増大させ、かくして、ノイズに対するシグナルの比を増大させる。
プローブについての標的配列に加えて、タグは、タグを発現する細胞の検出を改良するように同定されまたは選択された、設計された1以上のさらなる配列(「ヘルパー」または「ヘルパー配列」という)を含み得る。例えば、ヘルパーは、限定されるものではないが、タグの折畳み、局所化、または二次構造、三次構造または四次構造に対する効果を含めた多数の効果を有し得、そこでは、これらの効果のいずれかまたは組合せは細胞における標的配列の検出を改良または増加させるように作用する。ヘルパーは、標的配列がプローブ結合に対してより接近可能であるように表されるようなタグの折畳みまたは構造に影響し得る。これは、改変された塩基対形成に由来し、あるいはそれはヘルパーとタンパク質または他の細胞成分もしくは導入された成分との間の結合相互作用に起因する。ヘルパーは、それらを含む配列の折畳みまたは構造を安定化するか、またはより動的にするように働き得る。また、ヘルパーは、プローブ結合の前、その間またはその後いずれかに、それらを含む配列の分解に対して安定化するよう働き得る、そのような効果は、配列の折畳みまたは構造の変化から直接、あるいはタンパク質または細胞成もしくは導入された成分のヘルパー配列への結合の結果として由来し得る。また、ヘルパーは、例えば、転写開始またはプロセッシングの効率を増強させ、転写の未成熟停止を減少させ、あるいは転写後プロセッシングの効率を増大させることによって、それらを含む配列の転写を増大させるように作用し得る。
機能的アプローチを用いて、どのようにしてそれらがそれらの効果を発揮するかに拘らずヘルパーを同定することが可能であり、いずれかの所定のタグおよび対応するプローブに対して異なるヘルパー配列が存在し得る。タグおよび対応するプローブの複数のセットに対して働くヘルパー配列は、また機能的に同定され得る。
可変配列を試験して、例えば、遺伝子配列およびタグ配列を含む発現ライブラリーを構築することによって、ヘルパーとしていずれが作用するかを同定することができ、ここに、可変配列は、上記遺伝子とタグ配列との間に挿入される。遺伝子が停止コドンを有する場合、可変配列は、停止コドンの下流に挿入され得る。さらなる可変配列は、異なる部位に挿入され得る。次に、発現ライブラリーが細胞に導入され、引き続いて、標的配列に対して向けられたシグナリングプローブの導入によって、細胞がアッセイされる。コントロールを超える増大したシグナルを呈する細胞が検出される(ここで、コントロールシグナルは、コントロール細胞、またはコントロール発現構築物(例えば、遺伝子およびタグを含むが、さらなる可変配列を含まないもの)が導入された細胞によって呈されるシグナルである)。そのような細胞は、例えば、FACSによって単離され得、所望の場合、それらによって表される可変配列が単離され、さらに特徴付けされ得る。このアプローチを用いて、用いる遺伝子、タグおよび対応するシグナリングプローブの特異的組合せについてのヘルパー配列として作用する配列を検出または同定し得る。本質的に同一のアプローチを用いて、対応するシグナリングプローブについての少なくとも標的配列を含むいずれかの配列に対するヘルパー配列を見出すことができる(すなわち、可変配列および標的配列いずれかを含むが、例えば、遺伝子を含まない発現ライブラリー、または遺伝子を含む発現ライブラリー、標的配列を含む発現ライブラリー、および可変配列を含むが、タグを含まない発現ライブラリーが、各々適当なヘルパーを検出するために使用され得る)。単離される細胞が増殖され得、細胞株が作製され得る。
このようにして検出しまたは同定されたヘルパー配列の利点は、用いた配列の状況に対して(すなわち、特異的なタグ、遺伝子、標的配列または対応するプローブに対して)特異的であり得る。種々の配列状況でより広く利点があるより多様なヘルパー配列は、例えば、上記した方法によって実験的に決定され得る。例えば、反復ラウンドの可変配列の選択を行うことができ、そこでは、ヘルパー配列として作用する可変配列は、各ラウンドで単離され得、次いで、引き続いてのラウンドで試験され得る。この場合、例えば、各引き続いてのラウンドの試験は、発現ベクターを作り出すことによって行われ、そこでは、前のラウンドから単離された配列を用いて、第一のラウンドの発現構築物で用いたのとは異なる遺伝子またはタグまたは標的配列を含む発現構築物を作製され得る。記載された方法を用いて、多様な配列の状況を仮定すれば、ヘルパー配列の多様性を確認することも可能である。多様なヘルパー配列または普遍的なヘルパー配列の同定は、細胞における多様な配列の検出を助けるのに有用であり得る。
可変配列の1つの供給源はゲノム配列であり得る。ゲノム配列は制限酵素で消化され、クローニングのために入手して、発現ライブラリーを作製することができる種々のサイズのフラグメントを生じ得る。
タグ配列は、シグナリングプローブ結合のためのタグ配列を最適に提示するのを目標とし、ある量の予測された二次構造または実験的に決定された二次構造を呈するように選択され得るか、または設計され得る。従って、タグ配列は、それに対して少なくとも1つのシグナリングプローブが向けられる少なくとも1つの配列を含み、タグ配列は、加えて、シグナリングプローブと直接相互作用するように選択または設計されていないさらなる配列を含み得る。核酸折畳み予測アルゴリズムを用いて、それらの構造適合に従って潜在的タグ配列を設計し得る。例えば、本明細書において参考として援用する、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)を参照のこと。核酸折畳み予測アルゴリズムは、しばしば、所定の配列の多数のエネルギー的に最も有利な構造を予測する。あるいは、例えば、限定されるものではないが、消化されたゲノムDNAを含めた可変核酸配列を表す配列のライブラリーをアッセイして、いずれの配列がシグナリングプローブによるタグ配列の検出を助けるように作用するかを決定または同定し得る。これはタグ配列の同定または単離に対する機能的アプローチを表す。これは、シグナリングプローブ、および少なくとも可変配列によって認識されるように、選択または設計された少なくとも共通する配列を含む発現ライブラリーを作製することによって達成され得る。そのような発現ライブラリーは、細胞にトランスフェクトされ得、次いで、細胞はシグナリングプローブに暴露され得、最も高度に陽性である細胞がFACSによって単離され得る。次いで、これらの細胞によって表された可変配列が単離され得る。例えば、PCR技術、続いて、増幅された産物のクローニングによって、配列は、単離された細胞から直接増幅され得る。あるいは、単離された細胞を溶解して、単離された細胞で発現された可変配列に対応するDNA構築物の放出をもたらし得、これらの構築物またはベクターを単離し、得られた物質から増幅され得る。例えば、構築物がプラスミドベクターである場合、溶解した物質を用いて、コンピテント細菌細胞を形質転換し、続いて、細菌宿主を用いてプラスミドを単離し、増幅し得る。複数反復配列ユニットを取り込むタグ配列については、これらのユニットの各々は、タグ配列を取り込む分子に存在する反復ユニットおよび/または他の配列の間の潜在的相互作用に起因して、必ずしも同一構造をとる必要はない。いずれかの所定のタグ配列の構造は、その配列の状況によって影響され得る。
1つの実施形態において、タグ配列は逆−vav(reverse−vav) RNAに由来する。1つの実施形態において、タグ配列は3アーム接合構造を形成する(図36)。1つの実施形態において、タグ配列は長さが10〜100、80〜100、90〜100、80〜120、100〜2Kb、2Kb〜15Kbのヌクレオチドである。1つの実施形態において、標的配列は、第一ステム−ループ領域と第二のステム−ループ領域との間の結合に対して、第一のステム−ループの領域のステムの3’側の全てまたは部分から第二のステム−ループ領域のステムの5’側の全てまたは部分の領域である(図36)。
1つの実施形態において、ステム領域は8〜9の塩基対を含み、第一のステム−ループ領域は4〜6の塩基対を含み、第二のステム−ループ領域は13〜17の塩基対を含む(図37)。1つの実施形態において、3つのアームのステム領域は、さらに、非相補的領域を含む。1つの実施形態において、ステム領域および第一のステム−ループ領域のステムは、さらに、1つのミスマッチ領域を含み、第二のステム−ループ領域は、さらに、2〜7のミスマッチ領域またはバルジ領域を含む。1つの実施形態において、ステム領域の間の結合は合計8〜12のヌクレオチドを有する(図37)。1つの実施形態において、タグ配列は図42A、BまたはCによる構造または配列を含む。別の実施形態において、タグ配列は図42A、BまたはCによる配列から予測されるエネルギー的により好都合な構造を有する。
また、本発明は、上記したように、目的の少なくとも1つのRNAおよびタグ配列をコードする少なくとも1つのDNAを含むDNA構築物も提供する。また、本発明は、DNA構築物を含むベクターおよび細胞を提供する。
さらなる実施形態において、細胞株は、少なくとも第二のRNAを発現するように作製され得;この工程は、さらに、第二のRNAおよび第二のタグ配列および、必要に応じて、第二の選択マーカー(例えば、薬物耐性マーカー)をコードする第二のDNA構築物で細胞株をトランスフェクトする工程;必要に応じて、第二のマーカーを転写する細胞につき選択する工程;第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程、ならびに、第一のタグ配列および第二のタグ配列の双方または少なくとも1つのシグナルを呈する細胞を単離する工程を包含する。2つのRNAの場合には、第二のタグ配列をコードするDNA配列の部分もまた、第二のRNAのタンパク質コード部分をコードするDNA配列の部分を有するフレーム内であっても、フレーム外であってもよい。第二のRNAは、第一のものと同時にまたは順次のいずれかでトランスフェクトされ得る。上記方法を同時に行い、かつ同一選択マーカー(例えば、薬物耐性マーカー)を双方の構築物で用いることを仮定すると、より高いレベルの薬物または適当な選択剤を用いて、双方の構築物を発現する細胞につき選択することができる。さらに、2を超えるRNAが、上記した工程を反復することによって、細胞株に提供され得る。
発現ライブラリーを形成するDNA構築物を用いて同時または順次様式で上記工程を反復することによって、複数の細胞株が作製され得る。1つの実施形態において、発現ライブラリーは単一タグ配列を用い、タグ配列に対して相補的である同一シグナリングプローブに細胞を暴露する。別の実施形態において、異なる発現ライブラリーは異なるタグ配列を使用し得る。1つの実施形態において、各細胞株は1つのRNAを発現する。別の実施形態において、各細胞株は1を超えるRNAを発現する。これは、複数のDNA構築物で細胞を順次または同時にトランスフェクトすることによって達成され得る。複数DNA構築物で安定にトランスフェクトされた細胞を得る可能性は、トランスフェクションで使用されるより高い濃度のDNA構築物を導入することによって増加させ得る。あるいは、出発細胞は、複数DNA構築物をもつ細胞を得るために第一のDNA構築物ですでにトランスフェクトされていてもよい。また、複数の異なる発現ライブラリーを用いて、細胞をトランスフェクトし得る。各ライブラリーは、対応するシグナリングプローブを用いて検出される区別されるタグ配列を取り込み得る。各発現ライブラリーは、選択マーカー(例えば、薬物耐性遺伝子)を含み得る。
単離された細胞は、個々に増殖させてもよいし、プールされてもよい。個々に単離された細胞またはプールされた細胞を増殖させて、細胞の集団を生じ得る。細胞株は、個々に単離された細胞を増殖させることによって作製され得る。個々の細胞株または複数の細胞株は、別々に増殖させてもよいし、プールされてもよい。細胞株のプールが所望の活性を生じる場合、この効果を有する細胞株または細胞株のセットが同定されるまで、それはさらに分画され得る。これは、各々を別々に維持する必要性なくして非常に多数の細胞株を維持することをより容易にし得る。
RNAを過剰発現する細胞株を作製するためのさらに別の方法が提供され、この方法は、
a)RNAおよび第一のタグ配列をコードする第一のDNA;および上記RNAおよび第二のタグ配列をコードする少なくとも第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここに、上記第一のタグ配列と第二のタグ配列とは異なる、工程;
b)上記第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションに対して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブ、および上記第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに対して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;ならびに
c)上記シグナリングプローブの少なくとも1つのシグナルを呈する細胞を単離する工程、
を包含する。
この方法は、さらに、単離された細胞を増殖させて、RNAを発現または過剰発現する細胞株を作製する工程を包含し得る。DNA構築物がトランスフェクトされた細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれる場合、複数の細胞株が作製され得る。トランスフェクトされた構築物のゲノム取り込みがゲノムに関して特定の位置に向けられない限り、組込みはランダムに起こり、従って、各陽性細胞は相互に異なり得、それらが選択されるRNAに対して全て陽性である複数の異なる細胞株となると考えられる。必要に応じて、DNA構築物は、さらに、少なくとも選択マーカー(例えば、薬物耐性マーカー)をコードし得、上記方法は、さらに、選択マーカーを用いて細胞を選択し、例えば、上記マーカーが工程a)後に耐性を付与する少なくとも1つの薬物に対する耐性に対して選択する工程を包含し得る。細胞が単離される場合は常に、1以上の構築物または1以上の発現ライブラリーでのトランスフェクション後であるかを問わず、単離された細胞は、相互から分離して増殖されてもよいし、プールされてもよい。
1つの実施形態において、細胞はアンチセンスまたはsiRNAまたはshRNAまたはタンパク質を発現する。加えて、特定のタンパク質を発現するようにされた細胞は、タンパク質およびアンチセンスRNA分子を発現する細胞を作製するための出発点として使用され得る。もちろん、アンチセンスまたはsiRNAまたはshRNA分子を発現する細胞は、本明細書中の方法を用い、さらなるタンパク質をコードするさらなるRNAを加えるための出発点として使用され得る。対応するシグナリングプローブおよび、所望の場合、タグ配列での、タンパク質およびアンチセンスまたはsiRNAまたはshRNA分子をコードするRNAの同時トランスフェクションもまた、実施され得る。上記した手順の種々の組み合わせは、本明細書において包含される。
同様に、少なくとも1種のRNAを発現する細胞を単離するための方法が提供され、この方法は、
a)少なくとも1つのRNAを発現することが疑われる細胞を提供する工程;
b)少なくとも1つのRNAとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
上記方法は、その標的RNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブを用い、第二のRNAも発現する細胞を同定するために使用され得、第一のシグナリングプローブおよび第二のシグナリングプローブの双方または各々の蛍光を有する細胞が単離される。2を超えるRNAの同時発現も達成可能である。細胞が単離される場合は常に、1以上の構築物または1以上の発現ライブラリーでのトランスフェクションの後であるかを問わず、単離された細胞は、相互から分離して増殖させてもよいし、プールされてもよい。
少なくとも1つの外因性RNAおよび1つの内因性RNAを発現する細胞を単離するための別の方法が提供され、この方法は、
a)少なくとも1つの外因性RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、ここに、上記細胞は潜在的に少なくとも1つの内因性RNAを発現する、工程;
b)上記少なくとも1つの外因性RNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第一のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)上記少なくとも1つの内因性RNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程であって、ここに、上記第二のシグナリングプローブは第一のシグナリングプローブのシグナルとは異なるシグナルを生じる、工程;ならびに
d)それらの各RNAへの上記シグナリングプローブのハイブリダイゼーションに際して上記シグナルの少なくとも1つを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
上記した2つの方法は、さらに、上記単離された細胞を増殖することによって、上記少なくとも1つの外因性RNAおよび少なくとも1つの内因性RNAを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含し得る。
これらの方法は、タンパク質(例えば、細胞表面−局所化タンパク質、細胞内タンパク質、分泌タンパク質または他のタンパク質)を発現するRNAで有用である。これらの方法は、より困難であり得るか、またはさらなる実験を行うことができないような細胞に影響する、タンパク質それ自体のためのプローブの使用を必要としない。タンパク質をコードする1を超えるRNAは、複数のシグナリングプローブ、単離のために用いられる技術によって同時に検出可能な数までのプローブを用いて同定され得る。必要に応じて、DNA構築物は、さらに少なくとも1つの選択可能なマーカー(例えば、薬物耐性マーカー)をコードし得、上記方法は、例えば、上記マーカーが工程a)後に耐性を付与する少なくとも1つの薬物に対して抵抗性である細胞を選択することによって、選択マーカーを用いて細胞を選択する工程をさらに包含し得る。単離された細胞は、別々に増殖されてもよいし、プールされてもよい。細胞が単離される場合は常に、1以上の構築物または1以上の発現ライブラリーでのトランスフェクション後かを問わず、単離された細胞は、相互から別々に増殖されてもよいし、プールされてもよい。
上記した方法では、1つの実施形態において、細胞は動物に移植することができる。1つの実施形態において、シグナリングプローブは発蛍光性プローブであり、上記RNAを発現する細胞は蛍光を発する。蛍光を発する上記細胞の単離は、蛍光細胞分析分離装置技術または蛍光に基づいて細胞を単離するために使用され得るいずれかの技術を用いて実施され得る。1つの実施形態において、2つのシグナリングプローブを用いて、RNAまたはタグ配列を標的化する。第一のプローブのフルオロフォアは、第二のプローブのフルオロフォアと同一であっても異なっていてもよい。2つの異なるフルオロフォアの場合には、それらは同一または異なる発光波長を有し得る。現在、FACS技術は、分類手順の間に7つまでの異なるフルオロフォアの検出を可能とすることができる。上記方法を同時に反復して、7つまでの異なるタンパク質の発現を得ることができる。所望の場合、次いで、7つの異なるタンパク質を発現する細胞株は、上記手法に続いてより多くのタンパク質の導入のための出発点として使用され得る。FACS技術が進むにつれ、より多数のシグナルを分解することができ、FACSの1つの適用においてより多数のRNAを有する細胞についての選択が可能になる。
当然、上記した手順を用いて、生物学的試料における少なくとも1つのRNA転写産物の発現のレベルを定量化し得、この方法は、
a)RNA転写産物とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに生物学的試料を暴露する工程;
b)生物学的試料におけるシグナルのレベルを定量する工程;および
c)少なくとも1つのmRNA転写産物の上記レベルとシグナルのレベルとを相関させる工程、
を包含する。
生物学的試料は、細胞試料であっても、組織試料であっても、それに由来する調製物であってよく;それらは凍結し、および/または、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはシグナリングプローブを用いるRNAの検出に干渉しないいずれかの数の公知の細胞固定剤で固定され得る。細胞試料の調製物としては、限定されるものではないが、非細胞小器官または区画、ミトコンドリア、細胞の小器官、非細胞画分、細胞の原形質膜、細胞内物質または細胞外物質、膜調製物、これらのいずれかの1以上由来の核酸の調製物、これらのいずれかの1以上に存在するいずれかのウイルスまたは他のウイルスまたは生物の調製物、あるいはこれらの1以上のいずれかの組合せが挙げられる。
発蛍光性プローブの実施形態では、蛍光は、蛍光顕微鏡または蛍光細胞分析分離装置技術によって定量化され得る。さらなるRNA種は、第二のRNA転写産物へのハイブリダイゼーションに際して蛍光を発する第二のシグナリングプローブを用いて同時に定量(quanttitate)(すなわち、定量化(quantify))され得る。上記方法は、細胞内の事象、状態または組成物の検出のための発蛍光性レポーターを利用するアッセイと同時に使用され得る。そのような蛍光アッセイとしては、限定されるものではないが、TUNEL、アポトーシス、壊死、Ca2+/イオンフラックス、pHフラックス、免疫蛍光、小器官標識、細胞接着、細胞周期、DNA含有量、およびタンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タンパク質−RNAの間の相互作用を検出するのに用いるアッセイが挙げられる。これらのアッセイで用いるために蛍光標識され得る試薬としては、限定されるものではないが、(蛍光分子または自動蛍光タンパク質で標識された)タンパク質;蛍光代謝インジケーター(細胞分裂のためのC12レザズリン、CFSE);蛍光基質または副産物;蛍光標識されたレクチン;蛍光化学物質;ケージド(caged)蛍光化合物;蛍光核酸色素;蛍光ポリマー、脂質、アミノ酸残基およびヌクレオチド/側(side)アナログが挙げられる。
細胞へのアンチセンスまたはsiRNA分子の導入は、細胞からの1以上のタンパク質もしくはRNAのレベルを機能的に排除または低下させるのに有用である。上記方法に続き、予め選択された少なくとも1つのタンパク質もしくはRNAの、機能的にヌルな細胞または発現レベルを低下した細胞を単離あるいは作製するための方法が提供され、この方法は、上記細胞において、上記予め選択されたタンパク質またはRNAに対する複数のアンチセンスまたはsiRNAを提供する工程であって、各々は、上記した方法によって提供され、ここで、上記複数のアンチセンスまたはsiRNAは、上記少なくとも1種の予め選択されたタンパク質またはRNAのmRNA転写産物の本質的に全てあるいは十分なレベルに結合する工程を包含する。予め選択されたタンパク質は、遺伝子産物の交互にスプライシングされた形態であり得る。
同様な方針に従い、トランスジェニック動物を作製するための方法が提供される。このトランスジェニック動物は、少なくとも1種の予め選択されたタンパク質またはRNAの機能的ヌルを発現する変異体であるか、あるいは少なくとも1種の予め選択されたタンパク質またはRNAを低下したレベルで発現する。この方法は、胚性幹細胞を利用し、かつ生きた胚性幹細胞を用いて上記した工程を行って、上記トランスジェニック動物を作製する工程を包含する。
同様に、同一細胞に対して本明細書における方法を行うことを包含する、少なくとも1つのタンパク質またはRNAの機能的にヌルであるかまたはその発現レベルが低下し、かつ少なくとも1つの他のタンパク質またはRNAを過剰発現する細胞を単離するか、あるいはそのような細胞株を作製する方法が提供される。同じ様式で、誘導性プロモーター、または転写レベルの調節をもたらすいくらかの他の結合活性または機能的活性を有する配列の制御下にある、致死的アンチセンスまたはsiRNAを発現する細胞株を作製する方法が提供される。これは本明細書の方法を行うことによって達成され得ることができ、ここに、上記トランスフェクション工程は最小量のインデューサーまたは化合物の存在下で行われる。
従って、本発明は、
a)少なくとも第一のタンパク質をコードする少なくとも1つのRNA、および少なくとも第一のタグ配列をコードする少なくとも第一のDNA;および上記少なくとも1つのRNAおよび少なくとも第二のタグ配列をコードする少なくとも第二のDNAを細胞に導入する工程であって、ここに、上記第一のタグ配列と第二のタグ配列は異なる、工程;
b)上記少なくとも第二のタンパク質のmRNA転写産物に結合し、またはそれに干渉する少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAをコードする少なくとも1つのDNAを細胞に導入する工程;
c)上記少なくとも第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第一のシグナリングプローブ、および上記少なくとも第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
d)上記少なくとも1つのアンチセンスRNAまたはsiRNAへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;ならびに
e)それらの各RNAへの上記シグナリングプローブのハイブリダイゼーションに際して上記シグナルの少なくとも1つを生じる細胞を単離する工程、
を包含する、少なくとも第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも第二のタンパク質につき機能的にヌルであるものを発現するか、または発現が低下した細胞を単離するための方法を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、
a)個々の化合物または化合物のセットを細胞に加える工程;
b)少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)上記細胞においてシグナルのレベルを定量する工程;
d)化合物を加えない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程;ならびに、必要に応じて、
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する工程、
を包含する、少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する化合物を同定する方法を提供する。
1つの実施形態において、上記予め選択されたRNAは、細胞のゲノムによってコードされる。1つの実施形態において、上記予め選択されたRNAは、工程a)に先立って細胞にトランスフェクトされたDNA構築物によってコードされる。1つの実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、上記RNAを認識するように設計されたシグナリングプローブに暴露され、上記細胞は上記RNAを発現する。1つの実施形態において、DNA構築物はプロモーターまたはオペレーターを含み、リプレッサー、エンハンサー、または転写を調節する配列をコードする。1つの実施形態において、予め選択されたRNAはタグ配列に連結され、そしてシグナリングプローブはタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる。
もう1つの実施形態において、本発明は、
a)少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を潜在的に調節する試験RNA配列をコードする少なくとも1つの構築物を細胞に導入する工程;
b)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも1つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程;
c)上記細胞におけるシグナルのレベルを定量する工程;
d)試験RNA配列無しの細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を選択する工程;ならびに、必要に応じて、
e)上記少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節する試験RNA配列を同定する工程、
を包含する、少なくとも1つの予め選択されたRNAの転写を調節するRNA配列を同定する方法を提供する。
これらの細胞は、単離され、増殖させて、細胞株を生じ得る。それらは、別々に増殖させてもよいし、プールされてもよい。転写の調節は、予め選択されたRNAの下流のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであり得る。1つの実施形態において、上記予め選択されたRNAはゲノムによってコードされる。上記予め選択されたRNAは、工程a)に先立って細胞にトランスフェクトされるDNA構築物によってコードされる。1つの実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、上記RNAを認識するように設計されたシグナリングプローブに暴露され、上記細胞は上記RNAを発現する。1つの実施形態において、予め選択されたRNAはタグ配列に連結され、シグナリングプローブはタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる。1つの実施形態において、RNA配列の発現ライブラリーを用いて、転写を調節するRNA配列を同定する。1つの実施形態において、試験RNA配列はタグ配列に連結される。工程e)は、工程a)に続いて、上記RNA配列またはタグ配列へのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくともシグナリングプローブに細胞を暴露し、続いて、工程b)を行うことによって促進される。試験RNA配列またはそのタグ配列に向けられたシグナリングプローブによって生じたシグナルは、予め選択されたRNAに向けられたシグナリングプローブとは異なり得、従って、細胞は、異なるシグナリングプローブに同時に暴露され得る。
また、
a)組換え配列から転写されたもの、および非組換え配列から転写されたものからなる群から選択されるRNA配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程;および
b)上記RNA配列を発現する上記細胞を検出する工程、
を包含する、生きた細胞において遺伝子的組換え事象を同定するための方法も、本明細書において提供される。
細胞の検出および/または分類は、FACSまたは蛍光顕微鏡によって行うことができる。
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的実施例を参照することによって良好に理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために提示される。しかしながら、それらは、断じて、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書中に記載されたのと同様もしくは同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験で使用され得る。
(17.シグナリングプローブの細胞への導入を誘導または改良するか、あるいは標的の検出を増強するための試薬または化合物の同定)
シグナリングプローブを細胞に導入するのに使用され得る試薬は、限定されるものではないが、タンパク質、脂質、ポリマー、抽出物またはこれらの化合物もしくは混合物を含めた種々の化学物質を試験することによって同定され得る。化学物質は、気体、液体、または固体の形態であってよい。これは、限定されるものではないが、有機溶媒および水性溶媒、緩衝化溶液または培地またはこれらの任意の組合せを含めた種々の溶媒において、1:1,000,000,000〜1,000,000,000:1の範囲の種々の比率で化学物質をシグナリングプローブと混合することによってなされ得る。ここで、上記混合物は、1分〜48時間の範囲の種々の時間の間インキュベートされ、そして上記インキュベーションは、何も行わないか、ないし温和な振盪、または揺動ないしボルテックス、または一定のピペッティングの種々の程度の攪拌または混合を行いつつ、0℃未満〜100℃を超える範囲の種々の温度条件下で行われ、そして、上記インキュベーションは明所または暗所にて、あるいは種々の他の環境条件下で行われる。次に、混合物は、細胞に適用され、プローブの送達は、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー技術を使用するか、あるいはFACSまたは他の蛍光検出方法によってアッセイされる。これは、例えば、引き続いての高スループット分析に適合可能な、96ウェルプレート、384ウェルプレートもしくは1536ウェルプレートにて、またはビーズにて行われ得る。ビーズを用いる場合、FACSを用いて、ビーズは分析または単離され得、それらがさらにコードされる場合、単離されたビーズを用いて、それらが処理された混合物の同一性を決定し得ることに注意されたい。
用いる細胞は、生きたものでも、固定されたものでもよく、限定されるものではないが、組織培養プレートまたはビーズを含めた固体表面に付着して提示され得るか、あるいはそれらは懸濁液中に存在し得る。種々の緩衝液または溶液を混合物の添加に先立って用い、細胞が洗浄され得る。一旦試薬が細胞に適用されたならば、反応物は、上記したように、明所または暗所にて、または種々の他の環状条件下で、かつ種々の温度において、種々の程度の攪拌または混合を行いつつ種々の時間の間インキュベートされ得る。ここで、例えば、細胞生存率を維持すべきならば、これらのパラメーターは制限され得る。インキュベーションに続き、細胞は、直接分析されてもよいし、分析の前に上記したように洗浄されてもよい。
上記方法は、シグナリングプローブまたは構成的に活性なプローブを用いて実施され得る(例えば、発蛍光性プローブの場合、クエンチャーを欠くプローブが使用され得る)。また、試験すべき混合物の各々は、1以上の細胞試料を用いて試験され得る。例えば、混合物は、使用されるシグナリングプローブの標的を含むことが公知である細胞、ならびにコントロール細胞の双方を用いて試験され得る。複数の細胞型は、混合されて存在してもよいし、別々に存在してもよい。好ましい混合物は、増大したノイズに対するシグナルをもたらすものであり、例えば、コントロール細胞と比較して標的を含む細胞において増大したシグナルを生じる。
同様に、細胞が混合物に加えられる以外は、本質的に同一の方法が実施される。例えば、試験すべき混合物は、まず、試験チャンバー、例えば、96ウェルプレート、384ウェルプレートまたは1536ウェルプレートのウェル、あるいはビーズに適用され、そして、細胞は次に適用され得る。細胞は、プレートした混合物に直接添加され得るか、あるいは、例えば、乾燥、加熱またはエバポレーションによって、一旦混合物を処理して添加され得る。
関連した方法で、シグナリングプローブを用いて細胞における標的の検出を増強する能力について、化合物は試験され得る。この場合、シグナリングプローブは、まず細胞に導入され、ここで、細胞は標的を含むことが公知である細胞およびコントロール細胞を共に含む。次に、上記に記載され、かつ上記に記載された種々の条件およびパラメーターを用いる化学物質は、シグナルを改良するそれらの能力についてアッセイされ得る。この場合に用いる化学物質はシグナリングプローブと混合しないことに注意されたい。好ましい化学物質は、ノイズに対するシグナルの比を増大させることが検出または同定されるもの、例えば、コントロール細胞と比較して標的を含む細胞における増大したシグナルをもたらすものである。このアプローチを用いて同定される化学物質は、限定されるものではないが、シグナリングプローブの細胞の細胞質への送達の増大、プローブによるその検出が(例えば、標的の改良された接近可能性を引き起こすことによって)改良されるような標的の折畳みまたは構造への影響を含めた多数のメカニズムによって、あるいは非特異的バックグラウンドシグナルを低下させることによって(例えば、細胞の外側表面に付着したシグナリングプローブの量を低下させることによって)作用し得る。
シグナリングプローブを細胞に導入するために使用され得るか、または標的の検出を増強するために使用され得ることができるノイズに対するシグナルの比を増大するよう作用する化学物質はまた、各々が標的を含むことが知られた細胞に適用される試験シグナリングプローブおよびコントロールシグナリングプローブを使用し、コントロールシグナリングプローブと比較して試験シグナリングプローブを用いる場合に増大したシグナルに対して化学物質を分析することによって、決定され得る。
(実施例1)
一般的プロトコル。出発材料;シグナリングプローブは、DNA構築物からいずれのRNAも発現していない細胞に導入することができるか、あるいはそれらを用いて、DNA構築物からコードされたRNAメッセージを検出することができる。シグナリングプローブをこれらの2つの型の細胞のいずれかに導入する方法は同一である。以下のプロトコルは、分析すべき細胞が相互から分離可能であって、かつFACS分析に使用できることのみを必要とする。
1)本発明の記載においてより徹底的に記載されるように、シグナリングプローブをFACSと組み合わせて用いて、特異的RNAの細胞内での発現または発現の欠如に基づいて、組織の細胞を分類し得る。この目的では、ホモゲナイゼーションおよびさらなる化学的処理のような標準方法および良く確立された方法によって、細胞をまず相互から分離する。次いで、以下のプロトコルに従い、適当なシグナリングプローブをそのような細胞に導入することができる。
2)第二に、シグナリングプローブを用いて、細胞の集団にトランスフェクトされているDNA構築物によってコードされる、特定のRNAを発現する細胞について選択することができる。この目的では、まず、所望のRNAをコードするDNA構築物を細胞の培養物にトランスフェクトする。次いで、シグナリングプローブを作製して、発明の説明においてより詳細に記載したように、これらのRNAを認識することができる。DNA構築物の細胞へのトランスフェクションは、限定されるものではないが、製造者の指示に従って、バイオテクノロジーの会社(Qiagen,Promega、Gene Therapy Systems,Invitrogen,Stratagene等)から得た試薬またはキットいずれかを用いることを含めた、非常に種々の方法を介して達成することができる。DNA構築物を、各々が抗生物質に対する耐性を付与しするように選択する。これらのDNA構築物の細胞へのトランスフェクション、および細胞の回収のための短い時間(通常、24時間)に続き、DNA構築物が抗生物質耐性を付与した細胞のみが生存する適切な抗生物質に細胞を供す。これは、一般に、細胞の型および用いる抗生物質の双方に依存して、3〜4日、そして時々は、それより長い時間を必要とする。
結果は、細胞のプールが残り、これらの全ては抗生物質に対して耐性であるが、目的のRNAを発現するものの小さな画分に過ぎないというものである。所望のRNAを発現する細胞について選択するために、以下のプロトコルを行う。
(実施例2 シグナリングプローブを用いる細胞の選択)
1)シグナリングプローブの細胞へのトランスフェクション:シグナリングプローブは、RNAにおいて内因的な配列へハイブリダイズすること、または天然RNA配列に付加したタグへハイブリダイズすることのいずれかによって、所望のRNAを認識するように設計されなければならない。シグナリングプローブの設計は、本発明の説明おいて詳しく述べる。
DNA構築物の細胞へのトランスフェクションと同様に、トランスフェクションは非常に種々の方法によって行うことができる。使用する方法は、用いる細胞のタイプに基づいて選択すべきである。なぜならば、一部の細胞は他の方法よりもいくらかのトランスフェクション方法に対して良好に応答するからである。トランスフェクションは、用いるトランスフェクション試薬の製造者の指示に従って行うべきであり、最適化する必要があり得る。最適化は、トランスフェクトした材料の細胞または細胞質への送達を増強する化学物質での処理を包含し得る。
シグナリングプローブの細胞へのトランスフェクションは、用いる細胞およびトランスフェクション試薬に依存して、懸濁液中の細胞、または固体表面で増殖する細胞に対して行うことができる。
2)発蛍光性プローブの細胞へのトランスフェクションに続き、次いで、細胞をFACS分析に供し得る。FACSを用いて、用いる発蛍光性プローブのいずれかの1以上に対して陽性の細胞を分類することができる。また、それを用いて、発蛍光性プローブのシグナルの強度に基づいて細胞を分類し、それにより、研究者が種々のレベルでRNAを発現する細胞を選択することが可能となる。
(実施例3)
(1以上のRNAを発現する細胞株の作製)
FACS選択に続き、陽性スコアリング細胞を、発明の説明においてより詳細に記載したように適当な培地中に維持することができる。これらの細胞は、目的のRNAを発現する細胞株を生じる。
シグナリングプローブの濃度:用いるべきシグナリングプローブの濃度はいくつかの因子に依存する。例えば、検出すべきRNAの細胞内での豊富さ、およびこのRNAのシグナリングプローブへの接近性を考慮しなければならない。例えば、検出すべきRNAが非常に少量で存在する場合、あるいは検出すべきRNAの三次元折畳みに基づいて、またはタンパク質のRNAへの結合に起因して接近できないRNAの部分に見い出される場合、検出すべきRNAが非常に豊富である場合、およびシグナリングプローブによって認識される部位が十分に接近可能な場合に、より多くのシグナリングプローブをここでは用いるべきである。用いるべきシグナリングプローブの正確な量は、各適用に対して経験的に決定されなければならない。
これは、細胞の異なる群へ異なる量のシグナリングプローブを導入し、そして、バックグラウンド蛍光が低く、かつシグナルが高い条件(全てではないがいくつかの細胞がシグナリングプローブに対して陽性のスコアである条件)を選択することによって達成することができる。
(実施例4)
(シグナリングプローブへの細胞の暴露)
限定されるものではないが、マイクロインジェクション、渦巻または混合のような機械的剪断力、ニードルの通過、または掻き落としを含めた細胞負荷技術、特定の抗生物質もしくは洗剤または試薬もしくは溶媒の組合せのような試薬を用いる浸透化のような当該分野で公知の方法を含めた、分子を細胞に導入する種々の方法を用いるか、あるいは種々の化学的特性(例えば、リポソームベース、化学物質、またはタンパク質ベース)を有する種々のトランスフェクション試薬の使用を通じて、またはこれらの方法のいずれか1以上の組合せを通じて、表面または溶液中に付着した細胞、部分的に付着した細胞、または沈降した細胞をFPに暴露することができる。
脂質ベースのトランスフェクション試薬の使用を記載するより詳細な試料プロトコルを以下に概説する。
(1.細胞の調製)
FPへの暴露の前(細胞プレーティング方法1)またはそれと同日に細胞を組織培養のウェルにプレートするか(細胞プレーティング方法2)、あるいは細胞をFPへの暴露同日にミクロ遠心機チューブに移した(細胞プレーティング方法3)。
全ての3つの調製方法を首尾よく用いた。細胞プレーティング方法1は、培養ウェルの表面へ細胞が付着するのに十分な時間を可能とし、他方、細胞プレーティング方法2は、どれ位の時間が細胞がさらに処理される前に過ぎるかに依存して、細胞が処理すべき種々の程度にプレートに沈降または付着するのを可能とした。そして細胞プレーティング方法3は、細胞がいずれかの表面に沈降または付着するいずれの時間も可能とすることなく、細胞がチューブに移された後直接に処理されるのを可能とするが、処理は所定の量の時間が過ぎた後に行うこともできる。
細胞を無血清培地またはPBSのような緩衝液で1回以上リンスしたが、他の緩衝液を用いることもできる。一般に、緩衝液は種々のmM濃度でMgClを含む。暴露の方法に依存して、リンスする工程を省略することができる。
(2.FP試薬の調製および細胞への暴露)
商業的に入手可能なトランスフェクション試薬を用い、かつ製造者によって記載された以下のプロトコルに従い、FPを細胞調製への添加のために調製した。製造者のプロトコルは、複数パラメーターは、いずれの細胞型を用いるか、いずれのコンフルエンスまたは濃度にて細胞を処理すべきか、いずれの特定の分子を導入すべきか、いずれの割合および絶対量にて種々の試薬を組み合わせるべきか、そしていずれの間種々の工程を行い、またはインキュベートすべきか、いずれの工程を省略できるか、および他の変数を含めた複数の変数に対して経験的に決定される必要があることを指示する。製造者のプロトコルにおいて、特定の範囲が提供されているが、上記プロトコルはまた、これらは超過されなければならない可能性があり、あるいは他のパラメーターはそれらの試薬の首尾のよい使用のために最適化されなければならない可能性があることも示唆する。一般には、細胞のFPへの暴露は、製造者のプロトコルによる予備的範囲として提案された範囲内にあるこれらの条件のためのパラメーターを用いて行った。
一般に、製造者によって提案された容量および濃度を用い、FPは無血清培地含有チューブに加えられ、トランスフェクション試薬はやはり無血清培地を含有する第二のチューブに加えられる。全て製造業者のプロトコルによって示されるように、各チューブの内容物を混合し、合わせ、一定時間インキュベートする。次に、FPを細胞の調製物に適用し、種々のインキュベーション時間に続いて細胞をアッセイする。
図32におけるFPを細胞に暴露するプロトコルは以下の通りである:
24ウェルプレートのウェル当たりほぼ1×10細胞/mLかつ0.5mLにおいて、FPへの暴露の前日に細胞をプレートした。用いた細胞を薬物でトランスフェクトし、r−vavをコードする発現構築物について選択した。
1つのチューブ中に1〜4mM MgClを含有する50uL〜200uLの無血清培地中の0.625〜2.5uLの20uMのFPのストック、および第二のチューブ中の同一濃度のMgClを含む等容量の無血清培地中の0.625〜2.5uLのTfX50(Promega)をインキュベートすることによって、FP試薬を調製した。各チューブの内容物を混合し、次いで、合わせ、室温にて15〜45分間インキュベートした。
細胞を、上記で用いたのと同一濃度のMgClを補足した無血清培地で1回以上リンスした。FPの調製物を細胞に適用し、過剰の無血清培地+MgClを、必要に応じて、細胞が覆われるように加えたFP調製物の容量に応じて加えることができる。
細胞を組織培養インキュベーター中で3〜5時間インキュベートし、次いで、アッセイし、必要に応じて、観察に先立ってDMSOを加えることができる。DMSOは、シグナリングプローブの細胞への送達において、検出すべき標的の折畳みまたは提示において助けとなることができる。他の溶媒または化学物質は、シグナリングプローブの細胞または細胞質への送達を増大させる目的で、またはシグナリングプローブによる標的の検出を改良する目的で用いることもできる。溶媒および化学物質は、双方の細胞型がシグナリングプローブに暴露される場合、それらが、標的を発現しない細胞と比較して標的を発現する細胞における標的の検出に対して増大した送達効率または増大したノイズに対するシグナルをもたらすか否かを測定することによって、それらの所望性または適当性について試験することができる。
図34についてのプロトコルは、トランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞にFP16を加え、標的配列6CA4を含むRNAをコードする発現構築物につき薬物を選択する以外は、図32に記載したように実質的に行った。
図33(A、B、C)におけるFPを細胞に暴露するプロトコルは以下の通りである。
4mM MgClを補足したPBS(PBS+4)中にて、ほぼ2.5×10細胞/mLでプレートしたほぼ50〜100ulの細胞を96ウェルプレートのウェル中でプレートし、それらがプレート表面に沈降するのに過ぎた十分な時間の後であるが、それらが拡大する前に細胞をFPに暴露した。
1つのチューブ中で100uLのPBS+4中の2.5uLの20uMのFPのストックを混合することによってFP試薬を調製し、第二のチューブ中で7uLのリポフェクタミン(InVitrogen)を100uLのPBS+4に加えた。各チューブの内容物を混合し、溶液を室温にて30分間インキュベートし、その後、それらを合わせ、混合し、室温にてさらに15分間インキュベートした。50uLのFP調製物を各ウェルに加えた。無血清培地または他の緩衝液での細胞のリンスは任意である。2〜3時間の組織培養インキュベーター中でのインキュベーションに続いて細胞をアッセイし、次いで、アッセイした。
図33(D、E)におけるFPの細胞への暴露のためのプロトコルは、4ulのPlus試薬(InVitrogen)を、FPを含有するチューブに加えた以外は図32と本質的に同一であった。
(実施例5 FACSを介する細胞の分析および単離)
上記したように細胞をFPに暴露し、次いで、処理して、それらが付着している場合それらを表面から脱着させ、(例えば、(他の酵素または非酵素手順を用いることができるが)トリプシンを用いることによって)それらを相互から分離し、次いで、それらをFACSに適用する。
FPへの暴露に続き、FP含有溶液を細胞から除去し、トリプシンを細胞に直接適用する。いずれかのFP試薬、または細胞のFPへの暴露の間に細胞表面に会合し得る他の試薬を除去するように設計された試薬を含めた、種々の緩衝液または試薬を用いるこの工程に先立って、細胞をリンスすることができる。細胞を緩衝液(例えば、血清およびマグネシウムを含有する培地)中に再懸濁し、例えば、ピペッティングによって細胞をさらに分配させる。
次いで、標準的FACS方法に従い、細胞をFACSによって分析した。細胞の分析については、FPを用い、これらの配列の存在について、コントロール細胞、および標的配列を潜在的に発現する細胞の蛍光強度を比較することによって、この手順を受けた細胞のバックグラウンド蛍光を測定して、標的化配列を潜在的に発現する細胞がいずれかの変化した蛍光を示すかを判断することができる。細胞は、この情報に基づいて、個々にまたはバッチにて単離することができる。例えば、既存の技術は、96ウェルプレートのユニークなウェルへの所望の細胞の直接的単離を可能とするか、あるいは複数の所望の細胞を得ることができる。
FACSにおける蛍光強度の閾値を増加または減少させることによって、異なるレベルの蛍光シグナルを呈する細胞を単離することができる。例えば、陽性細胞についての単離された細胞を豊富化するのを単に望む場合には、細胞が事実陽性であるという高い確信を有するように非常に高い閾値を設定するのを望むことができるか、あるいは得られる集団における陽性細胞の純度が臨界的でないのであればより低い閾値を設定することができる。
(実施例6 発現の安定性の測定)
細胞中の1以上の遺伝子の発現レベルを経時的にモニターすることができる。例えば、配列を認識するように設計されたFPを用いる配列の発現について陽性として単離された細胞に由来する細胞株を考慮すると、細胞およびコントロール細胞をFPに暴露することができ、そしてFPによって発せられたシグナルについての2つの細胞型の蛍光強度の比率を測定することができる。この手法は経時的に反復することができ、比率の変化はFPによって検出されるべき配列についての発現の相対的レベルの変化を反映する。この手順は複数FPを用いて行うことができる。
(実施例7 タグ配列の設計)
タグ1についての配列を用いて、シグナリングプローブの標的配列が同様に結合につき示されるように、シグナリングプローブの結合に最も直接的に関与する構造の領域に特に関与して同一または同様な予測される構造を有する配列を作製する意図をもって、配列の各々をユニークなシグナリングプローブによって認識できるように、2つのさらなる異なる配列を作製した。作製された2つの異なるタグ配列(タグ2およびタグ3)の各々については、タグ1についての元の配列内の標的化配列をまず変化させ、これらの同一位置での相互作用を維持する努力において変化した配列と相互作用することが予測されたいくつかのさらなる塩基に対して、補償変化を行った(図43および44)。新しい配列の予測された配列を得、もしそれがタグ1の予測された構造に密接にマッチしないならば、上記構造を用いて、いずれのさらなる変化が必要であるかを予測した。これは、タグ1の構造と同様な予測された構造を有する新規な配列が得られるまで行った反復プロセスである。これらの配列に対してなされた変化は、塩基の置換、欠失および付加を含む。
(実施例8 上昇した温度におけるシグナリングプローブの暴露)
FP17は、相互作用対に隣接する7塩基対の相互に相補的な領域を形成すると予測される。コントロールオリゴと比較して、標的オリゴの存在下でインキュベートした場合、より強い蛍光シグナルをFP17が与えるため上昇した温度が必要であった。例えば、これはそれらを90〜95℃の熱水中に軽く入れることによる。ここで用いるチューブは、ほぼ2.34mMの最終マグネシウム濃度を有する、5uLの20uM FPストック、1.5uLの25mM MgCl、8uLの20uMオリゴ、および1.5uLの水よりなる合計16uLを含有した。用いた標的オリゴはTO−FP1であり、用いたコントロールオリゴは上記したようなTO−FP18であった。
(実施例9 化学的に改変したシグナリングプローブ)
FP1プローブ配列に基づく15の異なる化学的に改変したプローブを合成した。これらのプローブの全ては同一配列を有し、同一標的配列に対して向けられる。プローブを293T細胞に導入した。これらの細胞はFP1の標的配列を含むタグ配列を発現する。FACSを用いて、これらの細胞からの蛍光を分析した。15の異なるプローブを以下に記載する。FACS分析の結果を図46〜60に示す。結果は、15個の全てのプローブは、標的配列を発現する細胞を検出することができることを示す。プローブの全ては、化学的改変を除いて、濃度、送達の方法、フルオロフォア、クエンチャーおよび配列に関して同一であった。
Figure 2007522818
図1は、2つの別個の鎖を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の1つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色および灰色の楕円形は異なるフルオロフォアを示す。 図2は、2つの別個の鎖を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の1つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色および灰色の楕円形は異なるフルオロフォアを示す。 図3は、ステム−ループ構造を有するように設計されたシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の1つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。 図4は、ステム−ループ構造を有するように設計されたシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の1つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。 図5は、ステム−ループ構造を有するように設計されたシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の1つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。 図6は、3アーム接合構造を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は、本発明の1つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。 図7は、ダンベル構造を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の1つの実施形態を表し、ここで、暗い楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。 図8は、蛍光プローブFP1の配列および予測される天然立体配座を示す。FP1配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer3.0ソフトウェアに従って予測されるFP1配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図9は、蛍光プローブFP2の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。影をつけた領域の全てまたは一部はワトソン−クリック塩基対を形成するようであり、それにより、3アーム接合を形成するようである。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで入手可能なoligoanalyzer3.0ソフトウェアに従って予測されるFP2配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図10は、蛍光プローブFP3の配列および予測される天然立体配座を示す。FP3配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。図面は、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP3配列の自己二量体化を示す。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図11は、蛍光プローブFP4の配列および予測される天然立体配座を示す。FP4配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。図面は、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図12は、蛍光プローブFP5の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング配列は下線を施す。 図13は、蛍光プローブFP6の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング配列は下線を施す。 図14は、蛍光プローブFP7の配列および予測される天然立体配座を示す。FP7配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP7配列の自己二量体化が示される。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図15は、蛍光プローブFP8の配列および予測される天然立体配座を示す。FP8配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基には下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP1配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図16は、蛍光プローブFP9の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。 図17は、蛍光プローブFP10の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。 図18は、蛍光プローブFP11の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。 図19は、蛍光プローブFP12の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。 図20は、蛍光プローブFP13の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。 図21は、蛍光プローブFP14の配列および予測される天然立体配座を示す。FP14配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。図面は、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図22は、それぞれ、蛍光プローブFP15の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP15配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図23は、それぞれ、蛍光プローブFP16の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP15配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図24は、それぞれ、蛍光プローブFP17の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP15配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図25は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図25Aは、シグナリングプローブFP1に暴露されたコントロールNIH3T3細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアAlexafluor633をFP1で用いた。コントロールNIH3T3細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図25Bは、シグナリングプローブFP1に暴露されたトランスフェクトされたNIH3T3細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたNIH3T3細胞は、図42Aに示された、目的のRNAおよびタグ1配列をコードするDNAを含んでいた。図25Cは図25Aおよび25Bの重なりである。図25Cは、FACSが、トランスフェクトされてないコントロール細胞から、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を識別することを示す。 図26は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図26Aは、シグナリングプローブFP2に暴露されたコントロールNIH3T3細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアAlexafluor680をFP2で用いた。コントロールNIH3T3細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図26Bは、シグナリングプローブFP2に暴露されたトランスフェクトされたNIH3T3細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたNIH3T3細胞は、図42Bに示された、目的のRNAおよびタグ2配列をコードするDNAを含んでいた。図26Cは、図26Aおよび26Bの重なりである。図26Cは、FACSが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。 図27は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図27Aは、シグナリングプローブFP3に暴露されたコントロールNIH3T3細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをFP3で用いた。コントロールNIH3T3細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図27Bは、シグナリングプローブFP3に暴露されたトランスフェクトされたNIH3T3細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたNIH3T3細胞は、図42Cで示された、目的のRNAおよびタグ3配列をコードするDNAを含んでいた。図27Cは、図27Aおよび27Bの重なりである。図27Cは、FACSが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。 図28は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図28Aは、シグナリングプローブFP1に暴露されたコントロールHeLa細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをFP1で用いた。コントロールHeLa細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図28Bは、シグナリングプローブFP1に暴露されたトランスフェクトされたHeLa細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたHeLa細胞は、逆vav RNAをコードするDNAを含んでいた。図28Cは、図28Aおよび28Bの重なりである。図28Cは、FACSが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。 図29は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図29Aは、シグナリングプローブFP8に暴露されたコントロールHeLa細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをFP8で用いた。コントロールHeLa細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図29Bは、シグナリングプローブFP8に暴露されたトランスフェクトされたHeLa細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたHeLa細胞は逆vav RNAをコードするDNAを含んでいた。図29Cは、図29Aおよび29Bの重なりである。図29Cは、FACSが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から区別することを示す。 図30は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図30Aは、シグナリングプローブFP5に暴露されたコントロールHeLa細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをFP5で用いた。コントロールHeLa細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図30Bは、シグナリングプローブFP5に暴露されたトランスフェクトされたHeLa細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたHeLa細胞は、逆vav RNAをコードするDNAを含んでいた。図30Cは、図30Aおよび30Bの重なりである。図30Cは、FACSが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。 図31は、FACSプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図31Aは、シグナリングプローブFP9に暴露されたコントロールHeLa細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをFP9で用いた。コントロールHeLa細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図31Bは、シグナリングプローブFP9に暴露されたトランスフェクトされたHeLa細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたHeLa細胞は、逆vav RNAをコードするDNAを含んでいた。図31Cは、図31Aおよび31Bの重なりである。図31Cは、FACSが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。 図32は、逆向きにクローン化されたvav(r−vavという)の配列の一部、ならびに薬物耐性遺伝子をコードする発現プラスミドでトランスフェクトされた薬物選択HeLa細胞の蛍光画像を示す。細胞を、r−vav内の同一標的配列(5’GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGA3’)を認識するように設計された蛍光プローブ(FP)に暴露した。画像は、Famから蛍光を検出するように設計された蛍光顕微鏡およびフィルターを用いて得られた。全てのFPを、ここでは、フルオレセインを用いて標識されたFP1を除くFAMを用いて標識した。パネルA、B、C、Dは、それぞれ、FP10、FP11、FP12およびFP13に暴露した。 図33は、FP15によって認識されるように設計されたRNAおよびタグ配列をコードする構築物でトランスフェクトされた(パネルA、B、D)、またはタグ配列ではなく同一のRNAをコードするコントロール構築物でトランスフェクトされた(パネルCまたはE)細胞の蛍光画像を示す。用いたタグ配列を6−5、6−7、または6B10と名付け、これは、それぞれ、FP15が認識するように設計された、標的配列の1、2および3コピーを含む。FP15によって認識されるように設計されたタグ配列を含む構築物でトランスフェクトされた細胞(パネルA、BおよびD)はコントロール細胞(パネルCまたはE)よりも大きな蛍光を示した。 図34は、FP16によって認識されるように設計されたRNAおよびタグ配列6CA4をコードする構築物でトランスフェクトされた(パネルA)、またはタグ配列ではなく同一のRNAをコードするコントロール構築物でトランスフェクトされた(パネルB)細胞の蛍光画像を示す。タグ配列を含む構築物でトランスフェクトされた細胞(パネルA)は、コントロール細胞(パネルB)よりも大きな蛍光を示した。 図35Aは、タグ配列の形成に関して選択されたvav DNA配列の逆相補体(r−vav DNA)の一部(下線を施す)を示す。この配列は、r−vav mRNAを発現するように設計された発現プラスミドにクローン化された。太字で示された配列は、特定の蛍光プローブについての標的配列である。図35Bは、それらがタグ配列(タグ1配列)を形成するように組み合わされた後における、図35Aで下線を施した配列を示す。 図36Aは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)におけるRNA折り畳みプログラムを用いてr−vav RNAの一部の予測された構造を示す。図36Bは、図35Bに示されるタグ1配列の予測された構造である。陰影は、蛍光プローブのいくつかによって認識されるように設計された標的配列を示す。 図37A、BおよびCは、図42に記載されたタグ1配列、タグ2配列およびタグ3配列についての予測される構造を示す。これらの構造は互いに似ているが、蛍光プローブによる認識に関して異なる配列を表す。予測は、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)におけるRNA折り畳みプログラムを用いて行った。 図38は、標的オリゴ配列またはコントロールオリゴ配列の存在下での溶液中のFPから発せられた蛍光シグナルを示す。試料はUVを照射し、写真を撮影した。ここで用いる全てのFPはフルオレセインを組み込んだ。チューブは、それぞれ、ほぼ2.34mMの最終マグネシウム濃度を有する、5uLの20uM FPストック、1.5uLの25mM MgCl、8uLの20uMオリゴ、および1.5uLの水からなる合計16uLを含む。FP1およびFP18をここで用い、硫黄結合を、それぞれ、標的オリゴTO−FP1およびTO−FP18を認識するように設計された配列の塩基の間に組み込んで合成した。FP1は標的オリゴ1(TO−FP1 5’GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGA3’)の配列に対して指向し、FP18は標的オリゴFP18(TO−FP18 5’TCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAAC3’)の配列に対して指向する。TO−FP1およびTO−FP18の配列は、互いの逆相補体であった。TO−FP18はFP1によって標的化されない配列を有し、FP1についてのコントロールオリゴとして役立った。TO−FP1はFP18によって標的化されない配列を有し、FP18についてのコントロールオリゴとして役立った。全てのパネルにおけるチューブの組成を以下に示す:
Figure 2007522818
この図面は、試験したFPのそれぞれが、非標的化配列を有するオリゴを含有するコントロールチューブと比較して標的化された配列を有するオリゴを含有するチューブにおいてより大きなシグナルを発することによって、標的配列の存在を特異的に報告することを示す。標的配列を含むオリゴの存在下でFPを含有するチューブは星印によって示される。
図39は、標的オリゴ配列またはコントロールオリゴ配列の存在下での溶液中のFPから発せられた蛍光シグナルを示す。試料はUVを照射し、写真を撮影した。ここで用いる全てのFPはFAMを組み込んだ。パネルA、B、Cは、それぞれ、同一FPが加えられた4つのチューブを示す。各チューブは、4mM MgClに補充されたPBS中の2μLの20μM FPストックおよび1μLの100μMオリゴストックを含有する合計10μLを含有する。各パネルにおいて、チューブ1はオリゴストックを含有せず、その代わり、1uLの水を含有し、チューブ2はオリゴTO−M1を含有し、チューブ3はオリゴTO−M2を含有し、およびチューブ4はオリゴTO−M3を含有した。FPによって認識されるように設計された配列を含むオリゴと共に、各パネルで試験されたFPを以下に列挙する:
Figure 2007522818
この図面は、試験したFPのそれぞれが、オリゴを含有しないか、または非標的化配列を有するオリゴを含有するコントロールチューブと比較して、標的化配列を有するオリゴを含有するチューブにおいてより大きなシグナルを発することによって、標的配列の存在を特異的に報告することを示す。標的配列を含むオリゴの存在下でFPを含有するチューブを星印によって示す。
TO−M1、TO−M2およびTO−M3についての5’〜3’方向の配列を以下に列挙する:
Figure 2007522818
図40は、標的オリゴ配列またはコントロールオリゴ配列の存在下で溶液中のFPから発せられた蛍光シグナルを示す。試料はUVを照射し、写真を撮影した。ここで用いた全てのFPはFAMを組み込んだ。FP1、FP2およびFP3は、それぞれ、パネルA、パネルBおよびパネルCで試験し、それぞれは、図42に記載されるように、それぞれ、タグ1、タグ2およびタグ3に組み込まれた関連標的配列を認識するように設計されている。標的配列を含むオリゴの存在下でFPを含有するチューブを星印によって示す。パネルA、B、Cについてのプロトコルは図39についてのプロトコルに従い、試料を以下に記載する:
Figure 2007522818
図41は、蛍光プローブFP18の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルAは、Nucleic Acids Res.31:3429−3431(2003)に従ってDNA折り畳みプログラムを用いて予測された配列の構造を示す。パネルBは、http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.aspで利用可能なoligoanalyzer 3.0ソフトウェアに従って予測されるFP2配列の自己二量体化を示す。両方のパネルAおよびBにおいて、フランキング塩基を灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。 図42A、BおよびCは蛍光プローブによって認識される3つのタグ配列を示す。図42A、BおよびCにおいて、標的配列を太文字で示し、それらを図42Dにおいても示す。第一の配列(タグ1、42A)は図35Bに示した配列と同一である。次の2つの配列(タグ2、42Bおよびタグ3、42C)はタグ1の改変されたバージョンである。標的1と比較した標的2および標的3の配列の違いを、パネルDにおいて下線を施す。さらなる配列の変化を残りのタグ配列で行って、示された部分でなされた変化を補う。 図43は、タグ1配列からのタグ2配列の設計を示す。A〜Fは、設計の間になされた連続的な塩基変化を示す。 図44は、タグ1配列からのタグ3配列の設計を示す。A〜Fは、設計の間になされた連続的な塩基変化を示す。 図45は、本発明の方法に従って単離された細胞が生きていることを示す。パネルAは、細胞を、それぞれが、タグ1、タグ2およびタグ3でタグが付された目的のRNAをコードする3つのDNA構築物でトランスフェクトした後に、FACSを用いて単離された細胞を示す。細胞を薬物選択し、FP1、FP2およびFP3に暴露し、単離した。3つのプローブのそれぞれについての細胞の蛍光強度は、いずれのDNA構築物によってもトランスフェクトされていないコントロール細胞と比較してバックグラウンド強度を超えるものであった。細胞を、直接的に、FACSによって96ウェルプレートのウェル中で個々に平板培養し、その単離の後に直ちに1つを画像化した。パネルBは、それをウェルの表面に付着させた後における、1時間後の同一細胞を示す。パネルCは、それが細胞分裂を受けた後、翌日の同一細胞を示す。3つのパネルは、それぞれ、細胞をプローブに暴露するのに用いた試薬のこれまでに未知の効果にもかかわらず、上記方法に従って単離された細胞が生きたままであることを示す。これらの効果は、細胞の原形質膜を損ない、そしておそらくは、さらに、細胞をFACSの間に高い圧力に供することを含む。パネルAは、細胞膜が損なわれていることが見出されていないことを示し、パネルBおよびCは、さらに、細胞が生きていることを実証する。なぜならば、それは、培養皿の表面に付着し得、分裂し得、その両方は生きた細胞の特性だからである。 図46は、コントロール細胞と比較した、mcon1でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図47は、コントロール細胞と比較した、mcon2でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図48は、コントロール細胞と比較した、mcon3でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図49は、コントロール細胞と比較した、mcon4でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図50は、コントロール細胞と比較した、mcon5でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図51は、コントロール細胞と比較した、mcon6でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図52は、コントロール細胞と比較した、mcon7でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図53は、コントロール細胞と比較した、mcon8でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図54は、コントロール細胞と比較した、mcon9でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図55は、コントロール細胞と比較した、mcon10でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図56は、コントロール細胞と比較した、mcon11でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図57は、コントロール細胞と比較した、mcon12でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図58は、コントロール細胞と比較した、mcon13でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図59は、コントロール細胞と比較した、mcon14でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。 図60は、コントロール細胞と比較した、mcon15でトランスフェクトされた293T細胞のFACS分析の結果を示す。

Claims (116)

  1. RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    RNAを潜在的に発現する細胞を提供する工程;
    該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  2. RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    該RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程;
    該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  3. 内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    内因性RNAの発現を生じるDNAを細胞に導入する工程;
    該細胞を、該内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  4. RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    該RNAをコードし、さらにタグ配列をコードするDNAを細胞に導入する工程;
    該細胞を、該タグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  5. 外因性RNAおよび内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    該外因性RNAをコードするDNAを細胞に導入する工程であって、該細胞が内因性RNAを潜在的に発現する、工程;
    該細胞を、該外因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  6. 2つ以上の外因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    第一の内因性RNAの発現を生じるDNAを細胞に導入する工程であって、該細胞がさらなる内因性RNAを潜在的に発現する、工程;
    該細胞を、該第一の内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該さらなる内因性RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  7. 2つ以上の異なるRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    2つ以上の異なるRNAを潜在的に発現する細胞を提供する工程;
    該細胞を、第一のRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、さらなるRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  8. 2つ以上の異なるRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    第一のRNAをコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
    さらなるRNAをコードするさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
    該細胞を、該第一のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該さらなるRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  9. 2つ以上の異なる内因性RNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    第一の内因性RNAの発現を生じる第一のDNAを細胞に導入する工程;
    さらなる内因性RNAの発現を生じるさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
    該細胞を、該第一の内因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該さらなる内因性RNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  10. 2つ以上の異なるRNAを発現する細胞を単離する方法であって、以下:
    第一のRNAをコードし、さらに第一のタグ配列をコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
    さらなるRNAをコードし、さらにさらなるタグ配列をコードするさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
    該細胞を、該第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該さらなるタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  11. 1つより多い外因性DNAのコピーを含む細胞を単離する方法であって、以下:
    RNAをコードし、さらに第一のタグ配列をコードする第一のDNAを細胞に導入する工程;
    該RNAをコードし、およびさらなるタグ配列をさらにコードするさらなるDNAを該細胞に導入する工程;
    該細胞を、該第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  12. 前記暴露工程を同時に行う、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 前記暴露工程を連続して行う、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。
  14. 2つ以上のRNAまたは該2つ以上のRNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流に作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、同一複合体の成分であるRNAまたはタンパク質、および同一タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。
  15. 前記第一のシグナリングプローブが、前記第二のシグナリングプローブによって生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。
  16. 条件プロモーターの制御下にあるRNAをコードするDNA構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下:
    構成的プロモーターの制御下にある第一のRNAをコードするDNA構築物を細胞に導入する工程であって、該DNA構築物は、第二のRNAが発現しない条件下で、条件プロモーターの制御下にある第二のRNAをさらにコードする工程;
    該細胞を、該第一のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  17. 前記DNA構築物が、さらに、試験RNAをコードする、請求項12に記載の方法。
  18. 複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する方法であって、以下:
    複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、該複数のRNAの少なくとも1つの部分集合が互いに異なる、工程;
    該細胞を、複数の異なるシグナリングプローブに暴露する工程であって、該シグナリングプローブが、該複数のDNAによってコードされる1つ以上のRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  19. 複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する方法であって、以下:
    複数の内因性RNAの発現を生じる複数のDNAを細胞に導入する工程であって、該複数の内因性RNAの少なくとも1つの部分集合が互いに異なる、工程
    該細胞を、複数の異なるシグナリングプローブに暴露する工程であって、該シグナリングプローブが、該複数の内因性RNAの1つ以上のRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  20. 複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の少なくとも1つの部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないRNAを発現する方法であって、以下:
    複数のRNAをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、各DNAはさらにタグ配列をコードする、工程;
    該細胞を、該タグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  21. 前記複数のRNAが発現ライブラリーを形成する、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
  22. 前記複数のRNAまたは該複数のRNAによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるRNAまたはタンパク質、互いの上流または下流に作用するRNAまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するRNAまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するRNAまたはタンパク質、同一複合体の成分であるRNAまたはタンパク質、および同一タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
  23. 前記複数のDNAの少なくとも1つの部分集合が同一のタグ配列をコードする、請求項20に記載の方法。
  24. 細胞の2つ以上のRNA発現ライブラリーを単離する方法であって、以下:
    第一のRNA発現ライブラリーをコードする複数のDNAを細胞に導入する工程であって、各DNAが、さらに、第一のタグ配列をコードする、工程;
    第二のRNA発現ライブラリーをコードする複数のDNAを該細胞に導入する工程であって、各DNAが、さらに、第二のタグ配列をコードする、工程;
    該細胞を、該第一のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該細胞を、該第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程;および
    両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  25. さらに、前記単離された細胞を培養する工程を包含する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
  26. さらに、前記単離された細胞を培養する工程によって、細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
  27. 前記タグ配列が複数の標的配列を含み、1つのシグナリングプローブが各標的配列にハイブリダイズする、請求項4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
  28. 前記タグ配列が二次構造を有するRNAである、請求項4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
  29. 前記タグ配列が、ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む3アーム接合構造を形成する、請求項28に記載の方法。
  30. 前記DNAが複数のタグ配列をコードする、請求項4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
  31. 前記タグ配列をコードするDNAが前記RNAをコードするDNAに対してフレーム内にある請求項4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
  32. 前記タグ配列をコードするDNAが該RNAをコードするDNAに対してフレーム外にある請求項4、10、11、20または24のいずれか1項に記載の方法。
  33. さらに、前記提供する工程または導入する工程の前に、前記RNA、さらなるRNAまたは複数のRNAの発現を調節する化合物を細胞に添加する工程を包含する、請求項1〜16、18〜20または24のいずれか1項に記載の方法。
  34. タンパク質の低下した発現を有する細胞を単離する方法であって以下:
    アンチセンスRNA、または該タンパク質の発現を低下させるshRNAをコードするDNAを細胞に導入する工程;
    該細胞を、該アンチセンスRNAまたはshRNAへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および、
    シグナルを生じる細胞を単離する工程;
    を包含する、方法。
  35. 前記DNAが条件プロモーターに作動可能に連結される、請求項2、4、5、8、10、11、18、20または24のいずれか1項に記載の方法。
  36. 前記RNAが細胞に対して致死的であるか、または損傷的である、請求項35に記載の方法。
  37. 前記DNAが選択マーカーをさらにコードし、ここで、該方法が、該DNAを細胞に導入する工程の後であるが、該細胞を前記シグナリングプローブに暴露する前に、該選択マーカーを用いて該細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項2〜6、8〜11、16〜20、24または34のいずれか1項に記載の方法。
  38. 条件プロモーターを活性化する化合物を同定する方法であって、以下:
    請求項16に記載の方法によって単離された細胞に試験化合物を添加する工程;
    該条件プロモーターの制御下で第二のRNAの存在に関してアッセイする工程;および
    該細胞が該第二のRNAを発現する場合、組織特異的プロモーターを活性化する化合物として試験化合物を同定する工程;
    を包含する、方法。
  39. 条件プロモーターを活性化するRNAを得る方法であって、以下:
    請求項17に記載の方法によって単離された細胞を得る工程;
    条件プロモーターの制御下で第二のRNAの存在に関してアッセイする工程;および
    該第二のRNAを発現する細胞を得る工程;
    を包含する、方法。
  40. 生物学的試料中のRNAの発現レベルを定量化するための方法であって、以下:
    該生物学的試料を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程;
    該生物学的試料中のシグナルのレベルを定量する工程;および
    該シグナルのレベルを該RNAの発現レベルと相関させる工程;
    を包含する、方法。
  41. RNAの発現を調節する化合物を同定する方法であって、以下:
    該RNAを発現する細胞に試験化合物を添加する工程;
    該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;
    該試験化合物に暴露した細胞によって生じるシグナルを、該試験化合物に暴露しなかった細胞によって生じるシグナルと比較する工程;
    を包含し、
    ここで、該試験化合物に暴露しなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加または減少が、該化合物が該RNAの発現を調節する化合物であることを示す、方法。
  42. 前記RNAが、細胞に導入されるDNAによってコードされる、請求項41に記載の方法。
  43. RNAの発現を調節するRNAを同定する方法であって、以下:
    試験RNAを細胞に導入する工程であって、該細胞がRNAを含む、工程;
    該細胞を、該RNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程;および
    該試験RNAに暴露された細胞によって生じたシグナルを、該試験RNAに暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較する工程;
    を包含し、
    ここで、該試験RNAに暴露しなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験RNAに暴露された細胞によって生じたシグナルの増加または減少は、該試験RNAが該RNAの発現を調節することを示す、方法。
  44. 生きた細胞における遺伝的組換え事象を同定するための方法であって、以下
    細胞を、組換え配列から転写されたRNAとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程を包含し、
    ここで、該シグナルを生じる細胞の検出は、該細胞が遺伝的組換え事象を含むことを示唆する、方法。
  45. さらに、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する、請求項44に記載の方法。
  46. 請求項1〜24、34または45のいずれか1項に記載の方法によって得られた、細胞。
  47. 前記細胞が細胞ベースのアッセイで用いられる、請求項46に記載の細胞。
  48. 前記細胞が動物に移植される、請求項46に記載の細胞。
  49. 前記細胞が胚性幹細胞である、請求項46に記載の細胞。
  50. 請求項49に記載の胚性幹細胞を用いて、トランスジェニック動物またはキメラ動物を作製する工程を包含する、トランスジェニック動物をまたはキメラ動物を作製する、方法。
  51. 前記シグナリングプローブが、少なくとも1つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
  52. 前記2つの別個の鎖が5’末端〜3’末端の連続する互いに相補的な領域を形成し、ここで、該2つの鎖は同じ数のヌクレオチドを有する、請求項51に記載の方法。
  53. 互いに相補的な領域が前記2つの鎖の間で形成された後、1つの鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、該ずれは10までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、請求項51に記載の方法。
  54. 前記核酸がDNA、RNAまたはその両方である、請求項51に記載の方法。
  55. 前記修飾された核酸が、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、化学的に修飾されたRNA、またはこれらの組合せを含む、請求項51に記載の方法。
  56. 前記修飾された核酸が糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の1つ以上において化学的に修飾されている、請求項51に記載の方法。
  57. 前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、請求項56に記載の方法。
  58. 前記ホスホジエステル結合が、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、請求項56に記載の方法。
  59. 化学的に修飾されたRNAの2’位が、C−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、請求項56に記載の方法。
  60. 前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を含む、請求項56に記載の方法。
  61. 前記シグナリングプローブが2つの化学基を含む相互作用する対を含み、ここで、1つの化学基が1つの鎖の1つの末端に存在し、ここで、該他の化学基が他の鎖の隣接末端に存在する、請求項51に記載の方法。
  62. 前記シグナリングプローブが2つの相互作用する対を有し、ここで、該プローブの各末端が両方の鎖の隣接末端において1つの相互作用する対を有する、請求項51に記載の方法。
  63. 前記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、FRETドナーおよびアクセプター、ハーベスターおよびエミッターフルオロフォア、ならびに酵素および該酵素のインヒビターまたは該酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、請求項61に記載の方法。
  64. 前記シグナリングプローブがステム−ループ構造を含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
  65. 前記シグナリングプローブが、2つのステム領域を含むダンベル構造を含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
  66. 前記シグナリングプローブが、ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む3アーム接合構造を形成する一本鎖を含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
  67. 前記構造の領域が前記ステム領域のそれぞれのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、請求項65または66に記載の方法。
  68. 前記構造がDNA、RNA、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、RNA、またはこれらの組合せである、請求項64〜66のいずれか1項に記載の方法。
  69. 前記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の1つ以上において化学的に修飾されている、請求項64〜66のいずれか1項に記載の方法。
  70. 前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、請求項69に記載の方法。
  71. 前記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、請求項69に記載の方法。
  72. 前記化学的に修飾されたRNAの2’位が、C−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、請求項69に記載の方法。
  73. 前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を有する、請求項69に記載の方法。
  74. 前記相互作用する対が、フルオロフォアとクエンチャー、化学発光標識とクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマーとFRETドナーおよびアクセプター、ハーベスターとエミッターフルオロフォア、タンパク質分解酵素と該タンパク質分解酵素のインヒビターまたは該酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、請求項64〜66のいずれか1項に記載の方法。
  75. 前記シグナリングプローブが、前記鎖の1つの末端に少なくとも2つのフルオロフォア、および該鎖の他の末端にクエンチャーを含み、ここで、該2つのフルオロフォアはFRETドナーおよびアクセプター対である請求項64〜66のいずれか1項に記載の方法。
  76. 標的配列に相補的な配列および互いに相補的な配列、酵素および該酵素のインヒビターを含む核酸または修飾された核酸を含むプローブであって、ここで、該プローブは、該標的配列へのハイブリダイゼーションの際に酵素活性の検出可能な増加を生じる、プローブ。
  77. 前記酵素がタンパク質分解酵素である、請求項76に記載のプローブ。
  78. 前記プローブが、少なくとも1つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の2つの別個の鎖を含む、請求項76に記載のプローブ。
  79. 酵素が1つの鎖の1つの末端に存在し、該酵素のインヒビターが他の鎖の隣接する末端に存在する、請求項76に記載のプローブ。
  80. 前記2つの別個の鎖が5’末端〜3’末端の連続する互いに相補的な領域を形成し、該2つの鎖は同じ数のヌクレオチドを有する、請求項78に記載のプローブ。
  81. 互いに相補的な領域が2つの鎖の間で形成された後、1つの鎖の5’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の3’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、該ずれは10までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、請求項78に記載のプローブ。
  82. 前記核酸がDNA、RNA、またはその両方である、請求項78に記載のプローブ。
  83. 前記修飾された核酸が、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNAもしくはRNA、またはこれらの組合せを含む、請求項78に記載のプローブ。
  84. 前記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の1つ以上において化学的に修飾されている、請求項78に記載のプローブ。
  85. 前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、請求項84に記載のプローブ。
  86. 前記ホスホジエステル結合が、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、請求項84に記載のプローブ。
  87. 化学的に修飾されたRNAの2’位が、C−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、請求項84に記載のプローブ。
  88. 前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を含む、請求項84に記載のプローブ。
  89. ステム−ループ構造を含む、請求項76に記載のプローブ。
  90. 2つのステム領域を含むダンベル構造を含む、請求項76に記載のプローブ。
  91. ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む3アーム接合構造を含む、請求項76に記載のプローブ。
  92. 前記構造の領域が前記ステム領域のそれぞれのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、請求項90または91に記載のプローブ。
  93. 前記構造がDNA、RNA、ペプチド核酸、化学的に修飾されたDNA、RNA、またはこれらの組合せである請求項90〜92のいずれか1項に記載のプローブ。
  94. 前記構造が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基の1つ以上において化学的に修飾されている、請求項90〜92のいずれか1項に記載のプローブ。
  95. 前記ホスホジエステル結合が、−OP(OH)(O)O−、−OP(O)(O)O−、−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−、−NHP(O)O−、−OC(O)O−、−OCHC(O)NH−、−OCHC(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−OP(CH)(O)O−、−P(S)(O)O−および−OC(O)NH−からなる群より選択される化学基で置換されている、請求項94に記載のプローブ。
  96. 前記ホスホジエステル結合が−OP(SH)(O)O−、−OP(S)(O)O−または−P(S)(O)O−で置換されている、請求項94に記載のプローブ。
  97. 前記化学的に修飾されたRNAの2’位がC−Cアルコキシ、OCH−CH=CH、OCH−CH=CH−CH、OCH−CH=CH−(CHCH(n=0,1...30)、ハロゲン、C−CアルキルおよびOCHからなる群より選択される化学基を含む、請求項94に記載のプローブ。
  98. 前記化学的に修飾されたRNAが2’−O−メチル置換を有する、請求項94に記載のプローブ。
  99. 目的のRNAおよびタグ配列をコードするDNA配列を含む、DNA構築物。
  100. 請求項99に記載のDNA構築物を含む、ベクター。
  101. 請求項99に記載のDNA構築物を含む、細胞。
  102. 前記細胞が不死化された、初代幹細胞または生殖細胞である、請求項101に記載の細胞。
  103. それぞれが安定に組み込まれた発現された配列を含む少なくとも1,000個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
  104. それぞれが少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも500個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
  105. それぞれが少なくとも3つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも50個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
  106. それぞれが少なくとも4つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも20個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
  107. それぞれが少なくとも1つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも50個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーであって、該細胞株が、薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
  108. それぞれが少なくとも2つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも20個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーであって、該細胞株が、薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
  109. 各細胞株が可変ライブラリー配列を含む、請求項103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
  110. 前記発現ライブラリーの可変配列が、ゲノム配列、ゲノム非翻訳配列、ゲノム翻訳配列、遺伝子配列、cDNA配列、EST配列、オリゴ配列、ランダム配列、RNA配列、タンパク質配列、タンパク質ドメイン配列、ペプチド配列、イントロン配列、エクソン配列、タグ配列、もしくはリンカー配列、またはこれらの組合せ、またはこれらの組換え物、あるいは未修飾配列、突然変異誘発配列、ランダム化配列、シャッフルされた配列または組換え配列の1つ以上からなる群より選択される、請求項109に記載のライブラリー。
  111. 前記ライブラリーが未知の配列同一性を有する複数の異なる配列を用いて作製される、請求項103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
  112. 前記ライブラリーが複数の構築物を含み、各構築物が既知の配列同一性を有する配列を含む、請求項103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
  113. 前記配列が共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、請求項111または112に記載のライブラリー。
  114. 前記ライブラリーが細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いられる、請求項103〜108のいずれか1項に記載のライブラリー。
  115. シグナリングプローブを用いる、細胞における標的の検出を増強する化合物を同定する方法であって、以下:
    標的配列を含む細胞にシグナリングプローブを導入する工程であって、ここで、該シグナリングプローブは標的配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程;
    該細胞を試験化合物に暴露する工程;および
    該細胞によって生じるシグナルを検出する工程;
    を包含し、
    ここで、該試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、該試験化合物が、シグナリングプローブを用いる細胞における標的の検出を増強させる化合物であることを示す、方法。
  116. シグナリングプローブの細胞への導入を媒介し、または改良する化合物を同定する方法であって、以下:
    試験化合物の存在下でシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、ここで、該細胞は標的配列を含み、該シグナリングプローブは該標的配列とのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じる、工程;および
    該細胞によって生じたシグナルを検出する工程;
    を包含し、
    ここで、該試験化合物に暴露されなかった細胞と比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、該試験化合物が、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介し、または改良する化合物であることを示す、方法。
JP2006554209A 2004-02-18 2005-02-17 シグナリングプローブを使用する方法および材料 Pending JP2007522818A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54607504P 2004-02-18 2004-02-18
PCT/US2005/005080 WO2005079462A2 (en) 2004-02-18 2005-02-17 Methods and materials using signaling probes

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010179758A Division JP2010246570A (ja) 2004-02-18 2010-08-10 シグナリングプローブを使用する方法および材料

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007522818A true JP2007522818A (ja) 2007-08-16

Family

ID=34886236

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006554209A Pending JP2007522818A (ja) 2004-02-18 2005-02-17 シグナリングプローブを使用する方法および材料
JP2010179758A Pending JP2010246570A (ja) 2004-02-18 2010-08-10 シグナリングプローブを使用する方法および材料
JP2012247323A Withdrawn JP2013078320A (ja) 2004-02-18 2012-11-09 シグナリングプローブを使用する方法および材料
JP2015028199A Pending JP2015097532A (ja) 2004-02-18 2015-02-17 シグナリングプローブを使用する方法および材料

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010179758A Pending JP2010246570A (ja) 2004-02-18 2010-08-10 シグナリングプローブを使用する方法および材料
JP2012247323A Withdrawn JP2013078320A (ja) 2004-02-18 2012-11-09 シグナリングプローブを使用する方法および材料
JP2015028199A Pending JP2015097532A (ja) 2004-02-18 2015-02-17 シグナリングプローブを使用する方法および材料

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8916503B2 (ja)
EP (3) EP1725573B1 (ja)
JP (4) JP2007522818A (ja)
KR (5) KR20100063144A (ja)
CN (2) CN1981051A (ja)
AT (1) ATE540128T1 (ja)
AU (2) AU2005214970B2 (ja)
CA (1) CA2556418C (ja)
DE (1) DE10180022T1 (ja)
DK (1) DK1725573T3 (ja)
ES (1) ES2379634T3 (ja)
HK (3) HK1150634A1 (ja)
IL (1) IL177495A (ja)
MX (1) MXPA06009423A (ja)
NZ (3) NZ597400A (ja)
WO (1) WO2005079462A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013500722A (ja) * 2009-07-31 2013-01-10 クロモセル コーポレーション 細胞運命の修飾因子を同定および検証するための方法および組成物

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006138145A1 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
JP4989493B2 (ja) * 2006-01-20 2012-08-01 オリンパス株式会社 分子内プローブによる核酸配列の検出方法
EP2092056A1 (en) * 2006-11-30 2009-08-26 Chromocell Corporation Optimized host cells for protein production
CN103966345A (zh) * 2007-02-09 2014-08-06 西北大学 检测细胞内标靶的颗粒
JP5126877B2 (ja) * 2007-06-26 2013-01-23 独立行政法人理化学研究所 一塩基変異体の検出方法
CN103525751B (zh) 2008-02-01 2017-04-12 克罗莫塞尔公司 细胞系以及制备和使用其的方法
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
JP6297769B2 (ja) 2009-02-02 2018-03-20 クロモセル コーポレーション 新規の細胞株および方法
WO2010099662A1 (zh) * 2009-03-05 2010-09-10 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种用于核酸实时检测的探针
WO2011017288A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Chromocell Corporation Improved plants, microbes, and organisms
US9139860B2 (en) * 2011-04-11 2015-09-22 Korea University Research And Business Foundation Signal-amplifying folded oligonucleotide
WO2013040499A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Northwestern University Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier
IN2014MN00714A (ja) 2011-10-20 2015-07-03 Chromocell Corp
EP2980225B1 (en) * 2012-04-20 2017-11-08 Alacris Theranostics GmbH Cdr sequence-specific enrichment of live immune cells
CA2900852A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Chromocell Corporation Methods and materials using signaling probes
US10669547B2 (en) 2013-03-15 2020-06-02 Kambiz Shekdar Genome editing using effector oligonucleotides for therapeutic treatment
RU2015144371A (ru) 2013-04-24 2017-05-29 Хромоселл Корпорейшн Способы исследований для выявления соединений, модулирующих горький вкус
US11213593B2 (en) 2014-11-21 2022-01-04 Northwestern University Sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
WO2018195019A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 The Broad Institute Inc. Compositions for detecting secretion and methods of use
JP6788148B1 (ja) * 2017-10-23 2020-11-18 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ, アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー, デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ スペクトル散乱フローサイトメトリのための光学構成方法
CN108531566A (zh) * 2018-04-17 2018-09-14 厦门基科生物科技有限公司 基于复合编码探针杂交的dna检测方法及复合编码探针
WO2019210268A2 (en) 2018-04-27 2019-10-31 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
CN117467751B (zh) * 2023-12-27 2024-03-29 北京百力格生物科技有限公司 靶向目的基因fish荧光探针及其自组装放大探针系统

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003054223A2 (en) * 2001-12-20 2003-07-03 Mcmaster University Tripartite molecular beacons
US20040005595A1 (en) * 2001-09-28 2004-01-08 Browne Kenneth A. Inversion probes
US6692965B1 (en) * 1999-11-23 2004-02-17 Chromocell Corporation Isolation of living cells and preparation of cell lines based on detection and quantification of preselected cellular ribonucleic acid sequences

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU658132B2 (en) 1989-11-13 1995-04-06 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
EP1695979B1 (en) 1991-12-24 2011-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped modified oligonucleotides
EP0662152A1 (en) 1992-07-17 1995-07-12 Aprogenex, Inc. Enriching and identyfying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
US5629147A (en) * 1992-07-17 1997-05-13 Aprogenex, Inc. Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
JPH08503957A (ja) 1993-02-19 1996-04-30 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド シクロブチルアンチセンスオリゴヌクレオチド、その作成および使用方法
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US6169169B1 (en) 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
US5641675A (en) * 1994-10-07 1997-06-24 University Of Massachusetts Medical Center Cis-acting sequences for intracellular localization of RNA
WO1996012025A1 (en) 1994-10-14 1996-04-25 Basf Aktiengesellschaft TRANSGENIC NONHUMAN ANIMAL HAVING FUNCTIONALLY DISRUPTED INTERLEUKIN-1β CONVERTING ENZYME GENE
US5783683A (en) * 1995-01-10 1998-07-21 Genta Inc. Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene
US5741657A (en) * 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
US5731148A (en) 1995-06-07 1998-03-24 Gen-Probe Incorporated Adduct protection assay
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US5866336A (en) * 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US7098320B1 (en) * 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6361944B1 (en) * 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
GB9701492D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Univ Edinburgh Transfection of embryonic stem cells
US6416959B1 (en) * 1997-02-27 2002-07-09 Kenneth Giuliano System for cell-based screening
US6750052B1 (en) * 1997-07-23 2004-06-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lens epithelial cell derived growth factor
AU9220498A (en) 1997-09-04 1999-03-22 Bayer Corporation Oligonucleotide probes bearing quenchable fluorescent labels, and methods of usethereof
US6485901B1 (en) * 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
AU3909199A (en) * 1997-12-15 1999-07-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction
WO1999037806A2 (en) * 1998-01-27 1999-07-29 Cytocell Limited Modified nucleic acid probes and uses thereof
AU3012599A (en) * 1998-03-24 1999-10-18 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US6461864B1 (en) * 1998-04-15 2002-10-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and vector constructs for making non-human animals which ubiquitously express a heterologous gene
AU762728B2 (en) 1998-07-02 2003-07-03 Gen-Probe Incorporated Molecular torches
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
US6203986B1 (en) * 1998-10-22 2001-03-20 Robert H. Singer Visualization of RNA in living cells
WO2000031302A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
AU2740000A (en) * 1999-01-25 2000-08-07 Lockheed Martin Energy Research Corporation Multifunctional and multispectral biosensor devices and methods of use
CA2370237A1 (en) 1999-04-13 2000-10-19 Northwest Biotherapeutics, Inc. Methods for the diagnosis and treatment of metastatic prostate tumors
GB2355791B (en) 1999-10-28 2004-10-20 Molecular Light Tech Res Ltd Detection of mRNA expression using chemiluminescent labelled probes
CN1180091C (zh) * 1999-12-08 2004-12-15 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 一种复合基因探针的结构和用途
JP3460673B2 (ja) * 2000-02-04 2003-10-27 浜松ホトニクス株式会社 特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法
EP1172445A1 (en) 2000-07-14 2002-01-16 Praenadia GmbH A method for direct genetic analysis of target cells by using fluorescence probes
AU2001293232A1 (en) * 2000-08-29 2002-03-13 The Rockefeller University Methods employing fluorescence quenching by metal surfaces
AU2002213096B2 (en) 2000-10-06 2007-03-29 Nugen Technologies, Inc. Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences
US6350580B1 (en) * 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
WO2002061133A2 (en) 2000-11-09 2002-08-08 Yale University Nucleic acid detection using structured probes
JP2004516834A (ja) 2000-12-22 2004-06-10 ユニヴァーシティー オブ エディンバラ 胸腺上皮前駆細胞およびその使用
US20020090614A1 (en) 2001-01-09 2002-07-11 Jia Zhang Direct measurement method for gene expression using single chain antisense array
WO2003000933A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 Georgia Tech Research Corporation Dual resonance energy transfer nucleic acid probes
AU2002351233A1 (en) 2001-12-04 2003-06-17 Genome Biosciences, Llc Gene targeting methods and vectors
EP1405908A1 (en) 2002-10-04 2004-04-07 ProBioGen AG Creation of high yield heterologous expression cell lines
CN1206368C (zh) * 2003-03-05 2005-06-15 东南大学 固相化核酸检测探针及其制备方法
CN103966345A (zh) * 2007-02-09 2014-08-06 西北大学 检测细胞内标靶的颗粒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6692965B1 (en) * 1999-11-23 2004-02-17 Chromocell Corporation Isolation of living cells and preparation of cell lines based on detection and quantification of preselected cellular ribonucleic acid sequences
US20040005595A1 (en) * 2001-09-28 2004-01-08 Browne Kenneth A. Inversion probes
WO2003054223A2 (en) * 2001-12-20 2003-07-03 Mcmaster University Tripartite molecular beacons

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013500722A (ja) * 2009-07-31 2013-01-10 クロモセル コーポレーション 細胞運命の修飾因子を同定および検証するための方法および組成物
JP2017046716A (ja) * 2009-07-31 2017-03-09 クロモセル コーポレーション 細胞運命の修飾因子を同定および検証するための方法および組成物
US9657357B2 (en) 2009-07-31 2017-05-23 Chromocell Corporation Methods and compositions for identifying and validating modulators of cell fate

Also Published As

Publication number Publication date
CN104109712A (zh) 2014-10-22
WO2005079462A3 (en) 2007-02-01
NZ586619A (en) 2012-02-24
EP2806035A1 (en) 2014-11-26
US8916503B2 (en) 2014-12-23
CN1981051A (zh) 2007-06-13
KR20160045937A (ko) 2016-04-27
NZ549622A (en) 2010-09-30
EP2806035B1 (en) 2017-09-13
WO2005079462A2 (en) 2005-09-01
EP1725573A2 (en) 2006-11-29
DE10180022T1 (de) 2011-12-01
AU2005214970B2 (en) 2010-07-29
IL177495A (en) 2013-08-29
JP2010246570A (ja) 2010-11-04
EP2270204A2 (en) 2011-01-05
AU2010236074A1 (en) 2010-11-18
JP2015097532A (ja) 2015-05-28
CA2556418A1 (en) 2005-09-01
IL177495A0 (en) 2008-03-20
ES2379634T3 (es) 2012-04-30
MXPA06009423A (es) 2007-04-02
EP1725573B1 (en) 2012-01-04
ATE540128T1 (de) 2012-01-15
EP1725573A4 (en) 2007-08-01
KR20100063144A (ko) 2010-06-10
HK1204480A1 (en) 2015-11-20
HK1150634A1 (en) 2012-01-06
DK1725573T3 (da) 2012-04-02
AU2010236074B2 (en) 2012-09-27
CA2556418C (en) 2017-09-26
NZ597400A (en) 2013-06-28
US20090106853A1 (en) 2009-04-23
JP2013078320A (ja) 2013-05-02
KR101771373B1 (ko) 2017-09-05
EP2270204A3 (en) 2011-08-24
EP2270204B1 (en) 2014-05-28
US20150299782A1 (en) 2015-10-22
KR20130082179A (ko) 2013-07-18
KR20150005720A (ko) 2015-01-14
KR20060129469A (ko) 2006-12-15
HK1102512A1 (en) 2007-11-23
AU2005214970A1 (en) 2005-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2015097532A (ja) シグナリングプローブを使用する方法および材料
EP2036989B1 (en) Polynucleotide suitable for single cell based reporter assay to monitor gene expression patterns with high spatio-temporal resolution
CA2496821C (en) Selection and isolation of living cells using rna-binding probes
US20160123959A1 (en) Methods and materials using signaling probes
US20130323726A1 (en) Methods and materials using signaling probes
AU2011203213A1 (en) Selection and Isolation of Living Cells Using mRNA-Binding Probes
US20040038221A1 (en) Test system for detecting a splicing reaction and use therof

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070807

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100510

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100810

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20100810

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110601

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110830

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110906

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110930

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111007

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111027

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20120509

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120910