CN1206368C - 固相化核酸检测探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

固相化核酸检测探针及其制备方法是一种固定在固体基片上寡核苷酸探针及其用此法制作的微阵列芯片，是一种检测核酸序列信息的非标记的寡核苷酸探针，该探针在固体基片1上通过手臂分子2固定有荧光淬灭材料3，在荧光淬灭材料3表面上制备有由荧光基团5、寡核苷酸探针分子的茎杆部6、寡核苷酸探针的环部7组成的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的一端固定在荧光淬灭材料3表面上，寡核苷酸探针的另一端附近的碱基标记有荧光基团5，寡核苷酸探针两端附近的序列分别有3至15个碱基为互补序列，可使该寡核苷酸探针两端附近的序列能够形成杂交，寡核苷酸探针中间部分的碱基序列为被检测的核酸序列的互补序列。

Description

固相化核酸检测探针及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种固定在固体基片上寡核苷酸探针及其用此法制作的微阵列芯片，是一种检测核酸序列信息的非标记的寡核苷酸探针。

二、背景技术

随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。核酸序列信息的高通量检测和分析技术将成为医学等生命科学领域的核心技术之一。人们需要发展高通量、准确、低成本基因信息的检测方法。近来，基因芯片技术越来越受到人们的重视。但是，目前基因芯片技术尚存在一些问题，影响其在生物学和医学临床中的应用。1)检测过程复杂。提取的样品DNA需要进行扩增，并掺入荧光标记物。在这个过程中因标记效率问题，影响检测的可靠性。2)虽然目前有一些技术可进行基因序列的非标记检测，但都不很成熟。因此，发展可以对被检测的基因序列进行非标记检测的低成本的生物芯片技术是实现生物芯片在医学和生命科学等领域中大量实际应用的关键。3)单碱基错配检测目前尚是难题，主要方法还是测定核酸的序列，对于杂合性的基因突变测定不够准确方便。(4)引物特异性的检测方法尚不能用于杂合性基因突变的检测。

三、发明内容

1、发明目的：

本发明的目的是提供非一种标记的、低使用成本和高可靠性地检测核酸序列基因芯片的固相化核酸检测探针及其制备方法。

2、技术方案：

本发明是一种固相化核酸检测探针，在固体基片上通过手臂分子固定有荧光淬灭材料，在荧光淬灭材料表面上制备有由荧光基团、寡核苷酸探针分子的茎杆部、寡核苷酸探针的环部组成的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的一端固定在荧光淬灭材料表面上，寡核苷酸探针的另一端附近的碱基标记有荧光基团，寡核苷酸探针两端附近的序列分别有3至15个碱基为互补序列，可使该寡核苷酸探针两端附近的序列能够形成杂交，寡核苷酸探针中间部分的碱基序列为被检测的核酸序列的互补序列，寡核苷酸探针为多种探针组成的寡核苷酸探针阵列，即基因芯片，固定化寡核苷酸探针是脱氧核糖核酸，或核糖核酸、肽核酸或者是它们的组合，固定寡核苷酸探针的固体基片上的荧光淬灭材料可以是金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、金属盐纳米颗粒中的一种，也可以是包含有荧光淬灭基团的高分子材料和复合高分子材料，固定寡核苷酸探针的固体基片上的荧光淬灭材料可以是直接共价连接在固体基片上的荧光淬灭基团，固定有纳米颗粒的固体基片，其材料为玻璃、硅、陶瓷、塑料、硝酸纤维、尼龙或橡胶中的一种，方法为：a、用双功能活性试剂通过化学反应在固体基片表面键合上活性基团，即手臂分子，b、在具有活性基团的固体基片上固定荧光淬灭材料，c、在荧光淬灭材料的表面用双功能基基团化学度剂进行修饰，形成手臂分子，d、将固相化学合成好的包含有至少一个荧光发色基团的特异性核酸序列的寡核苷酸探针的一端接在荧光淬灭材料上，使荧光淬灭材料表面制备上寡核苷酸探针，在荧光淬灭材料表面上制备寡核苷酸探针的方法是原位合成法，即直接在荧光淬灭材料表面化学合成DNA探针，寡核苷酸探针的3’端固定于荧光淬灭材料上，在荧光淬灭材料表面上制备寡核苷酸探针的方法是用化学方法将预先合成的寡核苷酸探针整体固定在荧光淬灭材料上，寡核苷酸探针可以是全部原位合成的，也可以是部分原位合成，然后通过化学基团连接而形成完整的寡核苷酸探针，在固体基片上制备纳米金颗粒薄膜的方法是使用蒸镀法将金属等物质蒸镀在固体基片表面，形成紧密排列的纳米颗粒薄膜。

本发明通过化学或物理的方法，将纳米金属颗粒固定在固体基片上，或者在固体基片上蒸镀一层纳米级厚度的金属薄膜，在纳米级的金属颗粒或薄膜表面修饰化学基团，然后通过分子印章原位合成或其它原位合成的方法将核酸合成在固相基片表面。在合成最后几个碱基时，有选择地在其中一个碱基上合成一个氨基或将荧光标记的核酸单体直接合成在核酸链上。由于设计的检测用的探针在其的两端有碱基序列是互补的，合成完成后，将芯片在缓冲液中可形成二级结构，此时，纳米金属颗粒或薄膜可有效地使核酸上修饰的荧光基团发射的荧光淬灭，探针不能检测到荧光。但当被检测的靶基因与探针识别之后，靶基因与探针杂交后使荧光基团远离纳米金属颗粒，从而使荧光基团可以被激发而检测到其发出的荧光。

如果将此种固定探针方法用于将不同被测核酸序列的探针构成微阵列，即构成一种原位合成的非标记基因芯片微阵列芯片。该新型固相化核酸探针的制备方法如下：通过手臂分子将纳米金属颗粒固定到固相的材料上，将化学合成的两种或两种以上的标记荧光寡核苷酸探针通过共价键结合或物理吸附连接到固相载体上。该探针包括一个或多个荧光分子基团，由于能量传递或电子云重叠的作用，荧光分子基团的荧光信号被纳米金属颗粒所淬灭；固定的标记探针，可以是单链或自我形成二级结构等多种形式，可构成微阵列芯片。

其原理是在核酸探针中引入纳米金属颗粒及荧光发色基团，通过被测核酸的与探针的相互作用下，实现对生物样品中被测核酸序列(靶序列)的非标记测定。该新型的核酸探针及其微阵列芯片可用于生物科学和医学领域中核酸序列的非标记检测。

3、技术效果：

本发明提出的固相化核酸探针及其制备方法具有以下特点：被测基因不用进行荧光标记或同位素标记；可以通过被测基因与固定的探针进行竞争性杂交，大大提高单碱基的错配识别能力；探针可通过不同形式直接固定在固体载体上，形成较高密度的微阵列芯片，利用空间分辩来区分不同的检测位点，实现高通量并行检测，避免了现有定量PCR仪器中荧光染料的选择受限于激发波长范围的问题；对于没有与靶分子杂交的探针，其荧光分子基团的荧光可被纳米金属颗粒高效淬灭，因此整个芯片的荧光背景很低，检测的灵敏度高；可进行靶基因的定量检测；通过构建微流体芯片，可有实现整个检测过程的自动化。

和现有技术相比，该方法具有以下的优势：利用核酸杂交动力学原理，被检测核酸竞争性与固定在纳米金属颗粒上的荧光基团标记核酸探针杂交，具有良好的信噪比，成功地解决了单碱基错配检测的技术难题。同时，该检测方法可实现检测样本的非标记检测(可实现样本高通量、非标记的自动化检测。)大大减少了检测所需的时间，并具有实现微全分析的潜力等。不仅大大缩短了诊断时间，且大大提高了单碱基错配检测的准确性，降低了检测成本，尤其可以肿瘤相关的单碱基错配多态性的检测。

本发明提出固相化核酸探针及其微阵列芯片，对后基因组时代非标记、实时、高通量的核酸序列检测，特别是单碱基多态性检测，肿瘤基因多态性检测等都具有重要应用价值。

四、附图说明

图1是固体基片1上纳米金颗粒表面合成或固定了寡核苷酸探针的结构示意图。

图2是固体基片1上荧光淬灭材料3表面合成的或固定的寡核苷酸探针与被检测核酸杂交后，寡核苷酸探针上的荧光基团5远离荧光淬灭材料3表面，在受激光的照射后发出荧光的示意图。

以上的图中有：固体基片1，手臂分子2、4，荧光淬灭材料3，荧光基团5，寡核苷酸探针分子的茎杆部6，寡核苷酸探针的环部7，被测的核酸分子8。

五、具体实施方式

本发明是一种固相化核酸检测探针，在固体基片1上通过手臂分子2固定有荧光淬灭材料3，在荧光淬灭材料3表面上制备有由荧光基团5、寡核苷酸探针分子的茎杆部6、寡核苷酸探针的环部7组成的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的一端固定在荧光淬灭材料3表面上，寡核苷酸探针的另一端附近的碱基标记有荧光基团5，寡核苷酸探针两端附近的序列分别有3至15个碱基为互补序列，可使该寡核苷酸探针两端附近的序列能够形成杂交，寡核苷酸探针中间部分的碱基序列为被检测的核酸序列的互补序列。由多个此类探针组合后在同一器件中，即构成一种非标记基因芯片。

在固体基片1上通过手臂分子2固定有荧光淬灭材料3，在荧光淬灭材料3表面上制备有由荧光基团5、寡核苷酸探针分子的茎杆部6、寡核苷酸探针的环部7组成的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的一端固定在荧光淬灭材料3表面上，寡核苷酸探针的另一端附近的碱基标记有荧光基团5，寡核苷酸探针两端附近的序列分别有3至15个碱基为互补序列，可使该寡核苷酸探针两端附近的序列能够形成杂交，寡核苷酸探针中间部分的碱基序列为被检测的核酸序列的互列。

1.固体基片的准备：用于固定纳米颗粒的材料要求表面具有可修饰化学活性基团、良好的光学性质并具有一定的稳定性。以玻璃片(glass slides)、硅片(silicon chip)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene)、或聚碳酸酯(polycarbonate)等为常用材料；

2.固体基片的活化与合成：用有双功能活性试剂通过化学反应在载体的表面键合上活性基团，以便与相应的配基共价结合，形成具有不同的生物特异性的亲和载体，用来固定不同的核酸探针。

3.荧光淬灭材料：用作固定本发明固相化核酸探针的荧光淬灭材料可以是纳米金属颗粒，如纳米金颗粒，纳米银颗粒，其表面用双功能基团化学试剂进行修饰；也可以是包含有荧光淬灭基团的有机分子或复合高分子材料。

4.固相化核酸探针的制备：采用商业化固相化学合成方法合成设

计好的包含有至少一个的荧光发色基团特异性核酸序列的寡核苷酸探针；制备核酸探针的方法也可以是采用原位合成法在荧光淬灭材料上直接进行核酸合成及荧光标记。

5.探针的固定：固相化学合成好的探针通过机器等方式转移到固体基片表面，在适当条件下与固体基片连接。每个点至少包含有两种分别用不同的荧光标记的探针。

6.杂交和检测：在被测体系中加入适当的离子、和缓冲液等，靶基因与本发明的固相化探针进行杂交反应、酶切反应或扩增反应。对相应的反应体系进行荧光信号的检测，通过相应软件分析其结果，得到被检测的基因信息。

实施例一，原位合成的非标记基因芯片

1.玻片清洗：用洗液浸泡玻片过夜，冲净，再用碱乙醇溶液浸泡两小时，双蒸水冲净后，氮气吹干备用。

2.玻片修饰：取冼净玻片，在三乙氧基氨基硅烷的丙酮溶液中浸泡5分钟，洗净，100度下烘烤40分钟，戊二醛溶液浸泡2小时后，洗净氮气吹干。

3. 纳米金固定：用巯基乙胺修饰的纳米金溶液浸泡玻片过夜，洗净氮气吹干。

4.寡核苷酸探针合成：用上述玻片在无氧无水手套箱中进行核酸序列合成，用分子印章法进行多种序列合成，制成芯片，其中最后一个碱基是带有荧光素标记的核酸单体，因此，制成的芯片已经标记了荧光素。

实施例二，已合成寡核苷酸探针的固定制作非标记基因芯片

1.玻片清洗：用洗液浸泡玻片过夜，冲净，再用碱乙醇溶液浸泡两小时，双蒸水冲净后，氮气吹干备用。

2.玻片修饰：取冼净玻片，在三乙氧基氨基硅烷的丙酮溶液中浸泡5分钟，洗净，100度下烘烤40分钟，戊二醛溶液浸泡2小时后，洗净氮气吹干。

3.纳米金固定：用巯基乙胺修饰的纳米金溶液浸泡玻片过夜，洗净氮气吹干。

4.寡核苷酸探针合成：用常规方法合成，在寡核苷酸探针的一端修饰了氨基，在另一端修饰了荧光素。

5.芯片制作：用点样法将已合成的寡核苷酸探针固定在固定了纳米金的玻片上。

实施例三  纳米金薄膜非标记基因芯片

1.玻片清洗：用洗液浸泡玻片过夜，冲净，再用碱乙醇溶液浸泡两小时，双蒸水冲净后，氮气吹干备用。

2.纳米金薄膜的制作：用化学固相沉积法制备金纳米薄膜。

3.寡核苷酸探针合成：用上述玻片在无氧无水手套箱中进行核酸序列合成，用分子印章法进行多种序列合成，制成芯片，其中最后一个碱基是带有荧光素标记的核酸单体，因此，制成的芯片已经标记了荧光素。

Claims (8)

1、一种固相化核酸检测探针，其特征在于在固体基片(1)上通过手臂分子(2)固定有荧光淬灭材料(3)，在荧光淬灭材料(3)表面上制备有由荧光基团(5)、寡核苷酸探针分子的茎杆部(6)、寡核苷酸探针的环部(7)组成的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的一端固定在荧光淬灭材料(3)表面上，寡核苷酸探针的另一端附近的碱基标记有荧光基团(5)，寡核苷酸探针两端附近的序列分别有3至15个碱基为互补序列，可使该寡核苷酸探针两端附近的序列能够形成杂交，寡核苷酸探针中间部分的碱基序列为被检测的核酸序列的互补序列。

2、根据权利要求1所述的固相化核酸检测探针，其特征在于固定寡核苷酸探针的固体基片(1)上的荧光淬灭材料(3)是金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、金属盐纳米颗粒中的一种，或者是包含有荧光淬灭基团的有机分子或复合高分子材料。

3、根据权利要求1所述的固相化核酸检测探针，其特征在于：固定寡核苷酸探针的固体基片(1)上的荧光淬灭材料(3)是直接共价连接在固体基片(1)上的荧光淬灭基团。

4、根据权利要求1所述的固相化核酸检测探针，其特征在于固体基片(1)，其材料为玻璃、硅、陶瓷、塑料、硝酸纤维、尼龙或橡胶中的一种。

5、一种固相化核酸检测探针的制备方法，其特性在于方法的步骤为：a、用双功能活性试剂通过化学反应在固体基片(1)表面键合上活性基团，即手臂分子(2)，b、在具有活性基团的固体基片(1)上固定荧光淬灭材料(3)，c、在荧光淬灭材料(3)的表面用双功能基基团化学度剂进行修饰，形成手臂分子(4)，d、将固相化学合成好的包含有至少一个荧光发色基团的特异性核酸序列的寡核苷酸探针的一端接在荧光淬灭材料(3)上，使荧光淬灭材料(3)表面制备上寡核苷酸探针。

6、根据权利要求5所述的固相化核酸检测探针的制备方法，其特征在于在荧光淬灭材料(3)表面上制备寡核苷酸探针的方法是原位合成法，即直接在荧光淬灭材料(3)表面化学合成DNA探针，寡核苷酸探针的3’端固定于荧光淬灭材料(3)上。

7、根据权利要求5所述的固相化核酸检测探针的制备方法，其特征在于在荧光淬灭材料(3)表面上制备寡核苷酸探针的方法是用化学方法将预先合成的寡核苷酸探针整体固定在荧光淬灭材料(3)上。

8、根据权利要求5所述的固相化核酸检测探针的制备方法，其特征在于寡核苷酸探针是全部原位合成的，或者是部分原位合成，然后通过化学基团连接而形成完整的寡核苷酸探针。

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