KR20010042167A

KR20010042167A - 검출 복합체에 관한 방법, 키트 및 조성물

Info

Publication number: KR20010042167A
Application number: KR1020007010618A
Authority: KR
Inventors: 제임스 엠. 코울; 브라이언 디. 길데; 젠스 제이. 힐딕-닐센
Original assignee: 보스턴 프로브스, 인코포레이티드
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2001-05-25
Also published as: AU3012599A; JP2002507434A; EP1064399A2

Abstract

본 발명은 목적 샘플중에서 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하거나 확인하기 위해 검출 복합체를 이용하는 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 검출 복합체는 둘 이상의 성분 중합체 및 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함한다. 샘플중에서 목적 표적 서열 및/또는 표적 분자의 양의 존재/부재와 관련될 수 있는 검출가능한 신호의 변화를 검정에서 생성시키는 방식으로 복합체의 형성이 각각의 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키도록 공여체와 수용체 잔기의 세트중의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합된다.

Description

검출 복합체에 관한 방법, 키트 및 조성물 {METHODS, KITS AND COMPOSITIONS PERTAINING TO DETECTION COMPLEXES}

SEQUENCE LISTING

〈110〉 Coull, James M

Gildea, Brian D.

Hyldig-Nielsen, Jens J.

Boston Probes, Inc.

〈120〉 Methods, Kits And Compositions Pertaining To Detection

Complexes

〈130〉 BP9803PCT

〈140〉

〈141〉

〈150〉 60/079,211

〈151〉 1998-03-24

〈160〉 16

〈170〉 PatentIn Ver. 2.1

〈210〉 1

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5'-Biotin

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 1

gtggtagttg gagctggtgg cgta 24

〈210〉 2

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5' - Fluorescein

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 2

tcattcgcaa tcaatgactg aatataaact tgt 33

〈210〉 3

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5' -fluoreseein

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 3

tcattcgcaa tcactctatt gttggatcat att 33

〈210〉 4

〈211〉 111

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)..(111)

〈223〉 amplified region of k-ras plasmid

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Amplicon

〈400〉 4

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

attcagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga g 111

〈210〉 5

〈211〉 111

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)..(111)

〈223〉 amplified region only

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Amplicon

〈400〉 5

ctctattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga attagctgta tcgtcaaggc 60

actcttgcct acgccaccag ctccaactac cacaagttta tattcagtca t 111

〈210〉 6

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 6

atgactgaat ataaacttgt 20

〈210〉 7

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 7

cactatcgac tacgcgatca 20

〈210〉 8

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5' Rhodamine

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 8

tcattcgcaa tcataggtta gggccgttga gca 33

〈210〉 9

〈211〉 274

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)..(274)

〈223〉 amplified region of plasmid

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Amplicon

〈400〉 9

cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac acccgtcctg tggatcctct acgccggacg 60

catctgggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 120

caccgatggg gaagatcggg ctgcccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 180

tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 240

ccttgaggcg gcggtgctca acggcctcaa ccta 274

〈210〉 10

〈211〉 274

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)..(274)

〈223〉 amplified region of plasmid

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Amplicon

〈400〉 10

taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc 60

caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag 120

cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac 180

cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tccacaggac 240

gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat agtg 274

〈210〉 11

〈211〉 28

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5' - Fluorescein

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 11

tcattcgcaa tcaacgccac cagctcca 28

〈210〉 12

〈211〉 28

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5'- fluorescein

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 12

tcattcgcaa tcaacgccac aagctcaa 28

〈210〉 13

〈211〉 17

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 13

gttttcccag tcacgac 17

〈210〉 14

〈211〉 170

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)..(170)

〈223〉 amplified region of plasmid

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Amplicon

〈400〉 14

acgccaccag ctccaactac cacaagttta tattcagtca tttcgaattc tgcagatatc 60

catcacactg gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc caattcgccc tatagtgagt 120

cgtattacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 170

〈210〉 15

〈211〉 170

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)..(170)

〈223〉 amplified region of plasmid

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Amplicon

〈400〉 15

gttttcccag tgacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata 60

gggcgaattg ggccctctag atgcatgctc gagcggccgc cagtgtgatg gatatctgca 120

gaattcgaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtggcgt 170

〈210〉 16

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈221〉 misc_feature

〈222〉 (1)

〈223〉 5' -dabcyl

〈220〉

〈223〉 Description of Artificial Sequence:PCR Primer

〈400〉 16

tcattcgcaa tcactctatt gttggatcat att 33

형광 신호의 소광(quenching)은 형광 공명 에너지 전달 "FRET"[또한, 비-방사성 에너지 전달로서 공지됨; 문헌(Yaron et al., Analytical Biochemistry 95: 228-235(1979), p.232, col.1, Ins. 32-39) 참조]에 의해 일어나거나 비-FRET 상호작용[또한, 방사능이 없는 에너지 전달로서 공지됨; 문헌(Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.229, col.2, Ins. 7-13) 참조]에 의해 일어날 수 있다. FRET와 비-FRET 소광법을 구별짓는 결정적인 요인은 비-FRET 소광법에는 "충돌"이나 "접촉"에 의한 짧은 범위의 상호작용이 요구되므로 공여체와 수용체 쌍 잔기 간에는 어떠한 스펙트럼성 중첩도 요구되지 않는다는 것이다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.229, col.1, Ins. 22-42]. 역으로 말하면, FRET 소광법에는 공여체와 수용체 잔기 간에 스펙트럼성 중첩이 요구되고 소광의 효율이 FRET 쌍의 공여체와 수용체 잔기 간의 거리에 정비례한다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.232, col.1, In. 46 to col.2, In. 29]. FRET 현상에 관한 광범위한 고찰이 문헌[참조: Clegg, R.M., Methods Enzymol. 221:353-388(1992) and Selvin, P.R., Methods Enzymol., 246:300-334(1995)]에 기재되어 있다. 야론(Yaron) 등은 또한, 상기 문헌에 기재된 원리가 올리고누클레오티드의 가수분해에 적용될 수도 있다고 제안하였다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.234, col.2, Ins. 14-18].

이러한 FRET 현상은 표지된 핵산 하이브리드화 프로브 또는 프라이머를 검출 이전에 하이브리드화 복합체로부터 분리시켜야 하는 요구 조건 없이도 핵산 표적 서열을 직접적으로 검출하는데 이용되어 왔었다[참조: Livak et al., US 5,538,848]. 밀폐된 튜브 포맷에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭된 핵산을 분석하기 위해 FRET를 이용하는 한 가지 방법이 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 시판되고 있다. TaqMan^TM검정은 본래의 프로브에서의 형광을 소멸시켜 주는 형태로 형광성 리포터(reporter)와 소광인자(quencher) 잔기로 표지시킨 핵산 하이브리드화 프로브를 이용한다. PCR 증폭 동안, 상기 프로브 서열은 증폭된 핵산과 특이적으로 하이브리드화된다. 하이브리드화되면, Taq 폴리머라제의 엑소누클레아제 활성이 상기 프로브를 분해시킴으로써, 본래의 프로브에 의해 유지된 분자내 소광을 없애준다. 이러한 프로브는 증폭된 핵산과 특이적으로 하이브리드화되도록 고안되었기 때문에, 프로브의 효소적 분해에 의해 야기된, 샘플의 형광 세기 증가는 증폭 과정의 활성과 상관있을 수 있다.

그럼에도 불구하고, 이러한 방법은 바람직하게는, 형광단과 소광인자 잔기 각각이 프로브의 3' 및 5' 말단 상에 위치하여 최적의 신호 대 잡음 비가 달성되도록 하는 것을 필요로 한다[참조: Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25:2516-2521(1997), p.2516, col.2, Ins.27-35]. 그러나, 이러한 배치는 반드시 최적의 형광 소멸 보다는 못한 결과를 가져다 주는데, 이는 상기 형광단과 소광인자 잔기가 공간상 떨어져 있고 에너지 전달은 이들이 인접하여 있을 때 가장 효율적이기 때문이다. 결과적으로, 하이브리드화되지 않은 프로브로부터의 배경 발광이 TaqMan 검정에서 다소 높을 수 있다[참조: Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25, p.2516, col.2, Ins.36-40].

핵산 분자상 비이컨(Molecular Beacon)은 표적 핵산 서열을 검출하기 위해 FRET 현상을 이용하는 또 다른 작제물이다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14:303-308(1996)]. 핵산 분자상 비이컨은 2개의 상보적 암 서열 내에 봉매된 프로빙 서열을 포함한다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, p.303, col.1, Ins.22-30]. 이러한 프로빙 서열의 각 말단에 형광단 또는 소광인자 잔기 중의 어느 하나를 부착시킨다. 핵산 표적의 부재하에서는, 상기 암 서열이 서로 어닐링됨으로써 루프와 헤어핀 축(stem) 구조를 형성하는데, 이는 형광단과 소광인자를 결합시켜 준다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, p.304, col.2, Ins.14-25]. 표적 핵산과 접촉되는 경우에는, 상기 상보적 프로빙서열과 표적 서열이 하이브리드화될 것이다. 헤어핀 축은 하이브리드화시 형성되는 강성 이중 나선과는 함께 존재할 수 없기 때문에, 이로써 발생되는 형태상 변화는 상기 암 서열을 격리시키게 되며 상기 형광단과 소광인자를 떨어 놓게 만든다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, p.303, col.2, Ins.1-7]. 이러한 형광단과 소광인자가 서로 떨어지게 되면, 공여체 형광단의 에너지가 수용체 잔기로 전달되지 못하고 이때 형광성 신호가 검출 가능하다. 하이브리드화되지 않은 "분자상 비이컨"은 비-형광성이기 때문에, 과량의 어떠한 프로브도 특정 검정으로부터 제거시킬 필요가 없다. 결과적으로, 티아기(Tyagi) 등은 분자상 비이컨이 동종 검정 및 살아 있는 세포에서 표적 핵산을 검출하는데 사용할 수 있다고 언급하고 있다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, p.303, col.2, Ins.15-77].

기재된 핵산 분자상 비이컨 작제물의 암 서열은 프로빙 서열과 관련이 없다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, p.303, col.1, In.30]. 티아기 등의 분자상 비이컨은 핵산 분자를 포함하기 때문에, 적절한 축 형성 및 안정성은 상기 축의 길이, 암 세포의 G:C 함량, 이들이 용해되는 염의 농도 및 프로브가 용해되는 마그네슘의 존재 또는 부재 여부에 좌우된다[참조: Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, p.305, col.1, Ins.1-16]. 더욱이, 티아기 등의 핵산 분자상 비이컨은 엔도누클레아제 및 엑소누클레아제에 의해 분해되기 쉽다.

프로브 분해시, 배경 형광성 신호가 증가할 것인데, 이는 공여체 잔기와 수용체 잔기는 더 이상 근접한 상태를 유지하지 않기 때문이다. 따라서, 누클레아제 활성을 지니는 것으로 공지된 효소를 이용하는 검정은 핵산 분자상 비이컨이 분해됨에 따라 배경 형광을 지속적으로 증가시킬 것이다[참조: 티아기 등의 도 7; () 및 ()와 연관된 데이타는 아마도 프로브 분해에 의해 야기된 형광성 배경이 각 증폭 주기를 증가시킨다는 것을 나타낸다]. 부가적으로, 핵산 분자상 비이컨은 또한, 적어도 부분적으로는 살아있는 세포에서 분해될 것인데, 이는 세포가 능동적 누클레아제 활성을 함유하기 때문이다.

티아기 등에 의해 기재된 작제물은 WO95/13399(티아기2 등의 문헌으로 후술됨)에 보다 광범위하게 기재되어 있는데, 단 티아기2 등의 문헌에는 상기 핵산 분자상 비이컨이 이중-분자일 수도 있다고 언급되어 있는데, 여기서 이들은 표적 보체 서열의 절반, 또는 대략적으로 절반(이중 한 구성원은 친화 쌍이고 다른 한 구성원은 표지 상이다)이 각각의 분자에 존재하는 2개의 분자(예를 들어, 올리고누클레오티드)를 포함하는 상기 발명의 단일 프로브로서 이중-분자를 규정하고 있다[참조: Tyagi2 et al., p.8, In.25 to p.9, In.3]. 그러나, 티아기2 등의 문헌에는, PCR 반응에 사용하기 위한 단일의 프로브를 고안하는데 있어서, 당업자는 자연적으로 PCR 프라이머 중의 하나에 상보적이지 않은 표적 보체 서열을 선택할 것이라는 것이 구체적으로 언급되어 있다[참조: Tyagi2 et al., p.41, In.27]. 상기 발명의 검정은 핵산 합성 반응의 특이적 단일쇄 또는 이중쇄 생성물을 실시간으로 종점 검출하는 것을 포함하지만, 단 단일 프로브가 용융되거나 기타 변성을 거치는 경우에는, 이러한 프로브가 단일-분자여야만 한다[참조: Tyagi2 et al., p.37, Ins.1-9]. 더욱이, 티아기2 등의 문헌에는, 상기 발명의 단일 프로브가 증폭 또는 기타 핵산 합성 반응과 함께 사용될 수 있긴 하지만, 이중-분자상 프로브(티아기2 등에서 정의된 바와 같음)는 상기 친화 쌍이 표적-독립적인 방식으로 분리될 수도 있는 어떠한 반응(예: PCR)에서도 사용하기에 적합하지 못하다고 명기되어 있다[참조: Tyagi2 et al., p.13, Ins.9-12]. 티아기 등의 문헌이나 티아기2 등의 문헌 어디에도 PNA에 관하여 기재, 제안 또는 교시되어 있지 않다.

보다 최근의 문헌에서는, 티아기 등의 핵산 분자상 비이컨과 유사하지만 폴리머라제 연장용 프라이머로서 적합한 변형된 헤어핀 작제물이 기재되어 있다[참조: Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25:2516-2521(1997)]. 밀폐된 시스템에서 PCR-증폭된 DNA를 직접적으로 검출하는데 적합한 방법이 또한 기재되어 있다. 이러한 방법에 따르면, 나자렌코(Nazarenko) 등의 프라이머 작제물은 PCR 과정의 작동에 의해 증폭 생성물 내로 혼입된다. PCR 증폭된 생성물 내로 혼입하게 되면, 공여체 잔기와 수용체 잔기를 분리시키는 형태 상의 변화가 일어난다. 결과적으로, 상기 검정에서 형광성 신호의 세기 증가는 PCR 증폭된 생성물 내로 혼입된 프라이머의 양과 직접적으로 상관이 있을 수 있다. 본 작가는 상기 방법이 밀폐된 튜브 포맷에서 PCR 증폭된 핵산을 분석하는데 특히 잘 적합하다고 결론지었다.

이들은 핵산이기 때문에, 나자렌코 등의 프라이머 작제물은 누클레아제 분해에 명백하게 작용을 받음으로서 PCR 과정 동안 배경 신호의 증가를 유발시킨다[참조: Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25, p.2519, col.1, Ins.28-39]. 이러한 방법의 부가의 단점은 분자상 비이컨 유사 프라이머 작제물이 증폭 동안에 선형화되어야만 한다는 것이다[참조: Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25, p.2519, col.1, Ins.7-8]. 결과적으로, 상기 폴리머라제는 철저히 판독되어야만 하고, 형광성 신호가 발생되어야 하는 경우에는 헤어핀 변형된 분자상 비이컨 유사 프라이머 작제물의 축이 해리되어야만 한다. 따라서, 상기 축은 이의 안정성이 폴리머라제 활성을 억제하지 않도록 도안되어야만 한다. 나자렌코 등은 PNA에 관한 어떠한 것도 제안, 교시 또는 기재하지 않고 있다.

FRET를 표적 핵산 서열 검출에 적용하는 또 다른 응용에서는, 엑소누클레아제에 의해 분해되지 않도록 만든 이중 표지된 형광성 올리고누클레오티드 프로브를 또한 사용하여 PCR 반응 및 자체내 PCR에서 표적 핵산 서열을 검출하였다[참조: Mayrand, US 5,691,146]. 메이랜드(Mayrand)의 올리고누클레오티드 프로브는 이러한 올리고누클레오티드의 제1 말단에 부착된 형광인자(리포터) 분자와 올리고누클레오티드의 반대편 말단에 부착된 소광인자 분자를 포함한다[참조: Mayrand, Abstract]. 메이랜드는 선행 기술은 형광단과 소광인자 간의 거리가 최소화시켜야만 하는 중요한 양상이므로 특정 DNA 프로브의 리포터와 소광인자 잔기 간의 바람직한 간격은 6 내지 16 누클레오티드로 교시하고 있다고 제안하고 있다[참조: col.7, Ins. 8-24]. 그러나, 메이랜드는 최적의 신호 대 잡음 비를 달성하기 위해서는 리포터 분자와 소광인자 잔기가 18개 누클레오티드[참조: col.3, Ins.35-36] 또는 20개 염기[참조: col.7, Ins.24-46] 간격으로 위치하는 것이 바람직하다고 교시하고 있다. 결과적으로, 본원에서 인용된 선행 기술과 메이랜드 모두는 형광단과 소광인자를 포함하는 핵산 프로브(DNA 또는 RNA)의 검출가능한 특성이 프로브 길이에 상당히 의존적이라는 것을 교시하고 있다.

누클레아제 분해에 대한 내성이 또한 상기 발명의 중요한 한 국면이므로[참조: US 5,691,146, col.6, Ins.42-64], 메이랜드는 하나 이상의 변형된 분자간 연결을 포함시킴으로써 상기 올리고누클레오티드의 5' 말단이 누클레아제에 의해 분해되지 않도록 할 수 있다고 제안하였다. 더욱이, 메이랜드는 폴리아미드 핵산(PNA) 또는 펩티드가 누클레아제 내성 연결물로서 사용됨으로써 상기 발명의 올리고누클레오티드 프로브의 5' 말단을 변형시키고 이 것이 누클레아제 분해에 영향을 받지 않도록 한다고 제안하였다[참조: US 5,691,146, col.6, Ins.53-64]. 그러나, 메이랜드는 이의 존재에 대한 명확한 지식을 가지고 있음에도 불구하고 PNA 프로브 작제물이 상기 발명의 실시에 적합한 대체물일 수도 있다는 것에 관해서는 기재, 제안 또는 교시하지 않았다. 더욱이, 메이랜드는 형광인자 또는 소광인자 잔기를 갖는 PNA를 제조 및/또는 표지하는 방법에 대해서 당업자에게 교시하지 않았다.

공여체와 수용체 잔기는 올리고누클레오티드 길이(거리)에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 이들 잔기 간의 에너지 전달 효율을 추가로 조사하고 이를 특히 형광성 핵산 서열화 적용 분야에 적용하였다[참조: Mathies et al., US 5,707,804]. 마티즈(Mathies) 등은 2개의 형광단이 특정 주쇄 또는 쇄에 의해 결합될 것인데, 여기서 두 형광단 간의 거리는 다양할 수 있다고 언급하고 있다[참조: US 5,707,804, col.4, Ins.1-3]. 따라서, 이러한 거리는 널리 공지된 포스터(Forster) 기전을 통하여 공여체로부터 수용체로의 에너지 전달을 제공하도록 선택되어야만 한다[참조: US 5,707,804, col.4, Ins.7-9]. 바람직하게는, 약 3 내지 10개 누클레오티드가 단일쇄 핵산의 형광단을 갈라 놓고 있다[참조: US 5,707,804, col.7, Ins.21-25]. 마티즈 등은 PNA에 관해서는 전혀 제안, 교시 또는 기재하고 있지 않다.

DNA 이중체를 분석한 결과, 다음과 같은 사실이 관찰되었다: 1: FET(또는 본원에 정의된 바와 같은 FRET)는 올리고누클레오티드의 누클레오염기 서열에 다소 좌우되는 것으로 여겨지고; 2: 공여체 형광 변화는 염료-DNA 상호작용이 FET의 효능에 영향을 미친다고 제시하는 방식으로 변화하며; 3: 포스터 방정식은 관찰된 에너지 전달에 대해서는 정량적으로 고려하고 있지 않으므로 올리고누클레오티드에 부착된 공여체 잔기와 수용체 잔기 간의 길이가 정성적으로는 사용될 수 있긴 하지만 정량할 수는 없다[참조: Promisel et al., Biochemistry, 29:9261-9268(1990)]. 프로미셀(Promisel) 등은 비-포스터 효과가 이들에 대해 관찰된 몇몇 결과에 대해 고려될 수 있지만, 그 밖에는 설명할 수 없는 결과들이라고 제안하고 있다[참조: Promisel et al., Biochemistry, 29, p.9267, col.1, In.43 to p.9268, col.1, In.13]. 프로미셀 등의 결과는 핵산에서 이용되는 경우의 FRET 현상은 전적으로 예측 가능한 것이 아니거나 널리 인식된 것이 아니라는 것을 제안하고 있다. 프로미셀 등은 PNA에 관해서는 어떠한 것도 제안, 교시 또는 기재하고 있지 않으며, 사실상 필사본은 PNA의 발명에 앞선다.

따라서, 지금까지 논의된 배경 기술은 공여체 잔기와 수용체 잔기 한 쌍이 직접적으로 부착되어 있는 PNA 올리고머에 관한 어떠한 것도 기재, 제안 또는 교시하고 있지 않다. 사실상, 핵산의 검출에 적용된 바와 같은 FRET 현상은 표적 핵산 서열에 상보적인 프로브의 일부분 자체가 단지 핵산 만을 포함하는 작제물을 제조하는 것에 제한되는 것으로 여겨진다.

FRET는 또한 펩티드 분야 내에서 이용되어 왔다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.232, col.2, In.30 to p.234, col.1, In. 30]. 실제로, 효소 기질로서의 적합하게 표지된 펩티드의 용도는 공여체와 수용체 쌍으로 표지된 펩티드에 대해 1차적인 유용성을 지니고 있는 것으로 여겨진다[참조: Zimmerman etal., Analytical Biochemistry, 70:258-262(1976), Carmel et al., Eur. J. Biochem., 73:617-625(1977), Ng et al., Analytical Biochemistry, 183:50-56(1989), Wang et al., Tett. Lett., 31:6493-6496(1990) and Meldal et al., Analytical Biochemistry, 195: 141-147(1991)]. 초기 연구는 공여체와 수용체 쌍의 소광 효율이 펩티드 길이에 좌우된다고 제안하고 있다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.233, col.2, Ins.36-40]. 그러나, 나중의 연구는 소광 효율이 상기와 같이 펩티드 길이에 좌우되지는 않는다고 제안하였다[참조: Ng et al., Analytical Biochemistry, 183, p.54, col.2, In.23 to p.55, col.1, In.12; Wang et al., Tett. Lett., 31(여기서, 펩티드는 길이가 8개인 아미노산이다) and Meldal et al., Analytical Biochemistry, 195, p.144,col.1, Ins.33-37]. Ng 등은 긴 펩티드에서 관찰된 소광이 지금까지 인식되지 않은 기전에 의해 일어날 수도 있다고 제안하고 있다[참조: Ng et al., Analytical Biochemistry, 183, p.55, col.1, In.13 to col.2, In.7].

이의 명칭에도 불구하고, 펩티드 핵산(PNA)는 펩티드 또는 핵산이 아닐 뿐만 아니라 심지어 산도 아니다. 펩티드 핵산(PNA)은 서열 특이성을 지닌 핵산(DNA 및 RNA)와 하이브리드화될 수 있는 비-천연의 폴리아미드(슈도펩티드)이다[참조: 미국 특허 제5,539,082호, 제5,527,675호,제5,623,049호, 제5,714,331호, 제5,736,336호, 제5,773,571호, 제5,786,461호 및 Egholm et al., Nature 365:566-568(1993)]. PNA는 현재 시판되고 있는 포맷으로 표준 펩티드 합성 과정을 적용함으로써 합성한다[PNA 단량체 및 올리고머의 제조에 관한 일반적인 고찰에 대해서는 문헌(Dueholm et al., New. J.J Chme., 21:19-31(1997) or Hyrup et al., Biochemistry ＆ Med. Chem., 4, 5-23(1996))을 참조한다]. 또 다른 방법으로는, 표지된 및 표지되지 않은 PNA 올리고머를 구입할 수 있다[참조: PerSeptive Biosystems Promotiona Literature: BioConcepts, Publication No. NL612, Practical PNA, Review and Practical PNA, Vol. 1, Iss.2].

비-천연의 분자의 경우에는, 변형되지 않은 PNA는 펩티드 또는 핵산을 분해하는 것으로 공지되어 있는 효소에 대한 기질로 공지되어 있지 않다. 따라서, 변형되지 않은 PNA는 생물학적 샘플 내에서 안정해야 할 뿐만 아니라 긴 저장 수명을 지녀야 한다. 마찬가지로, 핵산과 복합체를 형성하는 경우에는, PNA가 핵산이 분해되지 못하도록 막는다[참조: WIPO 특허원: Stanley et al., WO95/15974]. 이온 강도에 매우 의존적인 핵산 하이브리드화와는 달리, PNA과 핵산과의 하이브리드화는 이온 강도와 상당히 무관하며 낮은 이온 강도를 선호하는데, 이는 핵산에 대한 핵산의 하이브리드화를 강력히 싫어하는 조건이다[참조: Egholm et al., Nature, p.567]. PNA 복합체의 안정성과 형태에 대한 이온 강도의 효과가 광범위하게 조사되었다[참조: Tomac et al., J. Am. Chem. Soc., 118:5544-5552(1996)]. 서열 식별은 DNA를 인식하는 DNA에 대해서 보다 DNA를 인식하는 PNA에 대해서 보다 더 효율적이다 [참조: Egholm et al., Nature, p.566]. 그러나, 하이브리드화 검정에서, DNA 프로브의 경우와 비교해서, PNA 프로브를 이용한 점 돌연변이 식별의 이점은 다소 서열 의존적인 것으로 여겨진다[참조: Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design 8:53-65, (1993) and Weiler et al., Nucl. Acids Res. 25:2792-2799(1997)]. 부가의 이점으로서, PNA는 평행 및 수직 방향 모두에서 핵산과 하이브리드화되지만, 수직 방향이 바람직하다[참조: Egholm et al., Nature, p.566].

서열 특이적 방식으로 핵산과 하이브리드화되는 능력에도 불구하고, PNA 프로브와 표준 핵산 프로브 간에는 많은 차이가 있다. 이러한 차이점은 통상적으로 생물학적, 구조적 및 생리-화학적 차이로 분류될 수 있다. 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 이들 생물학적, 구조적 및 생리-화학적 차이점은 핵산이 전형적으로 이용되어 온 응용 분야에서 PNA 프로브를 사용하기 위해 시도하는 경우에 예상치 못한 결과를 야기시킬 수 있다. 이러한 상이한 조성물의 비-등가 현상이 화학 분야에서 종종 발견된다.

생물학적 차이에 관해서는, 핵산이 형질 유전 및 발현의 특정 제제로서 살아있는 종의 삶에 중추 역할을 하는 생물학적 물질이다. 이들의 생체내 성질은 상당히 널리 인식되어 있다. PNA가 한편 최근에 전적으로 인공 분자로 개발되었고, 화학자들에게 인식되기 시작하였으며, 합성 유기 화학을 이용하여 제조하였다. PNA는 생물학적 기능이 전혀 공지되어 있지 않고 본래의(변형되지 않은) PNA는 어떠한 폴리머라제, 리가제, 누클레아제 또는 프로테아제에 대한 기질로도 공지되어 있지 않다.

구조적으로, PNA는 핵산과 상당히 상이하다. 이들 둘 다가 통상의 누클레오염기(A, C, G, T 및 U)를 사용할 수 있긴 하지만, 이들 분자의 주쇄는 구조적으로 다양하다. RNA와 DNA의 주쇄는 반복되는 포스포디에스테르 리보즈 및 2-데옥시리보즈 단위로 구성된다. 이와는 달리, 가장 통상적인 PNA의 주쇄는 N-[2-(아미노에틸)]글리신 서브유닛으로 구성된다. 부가적으로, PNA에서는 누클레오염기가 부가의 메틸렌 카르보닐 잔기에 의해 상기 주쇄에 연결되어 있다.

PNA는 산이 아니므로, DNA 및 RNA에 존재하는 것과 같은 하전된 산성 기을 전혀 함유하지 않는다. 이들은 정상적인 전하가 결여되기 때문에, PNA는 일반적으로 등가의 핵산 분자 보다 더 소수성이다. 이러한 PNA의 소수성 특징으로 인해, 핵산을 이용한 경우에는 관찰되지 않은 비-특이적 상호작용(소수성/소수성 상호작용)이 가능해진다. 추가로, PNA는 이의 등가물이 RNA/DNA계에서는 존재하지 않은 구조적 형태를 채택할 수 있는 능력을 제공해주는 아키랄(achiral)이다.

PNA의 독특한 구조적 특징으로 인해, 특히 푸린 풍부한 중합체에 대한 용액 중에서 고도로 유기화되는 중합체가 생성된다[참조: Dueholm et al., New J. Chem., 21:19-31(1997), p.27, col.2, Ins. 6-30]. 역으로 말하면, 단일쇄 핵산은 2차 구조를 거의 나타내지 않는 랜덤 코일이다. PNA는 고도로 유기화되었기 때문에, PNA는 대체 2차 구조(예를 들어, 헤어핀 축 및/또는 루프)를 채택하는데 대한 내성이 보다 더 커야 한다.

PNA와 DNA 또는 RNA 간의 생리/화학적 차이가 또한 실재한다. PNA는 핵산 프로브가 동일한 표적 서열에 결합되는 것 보다 더 신속하게 이의 상보적 핵산에 결합된다. 이러한 행위는 적어도 부분적으로는, PNA가 이의 주쇄 상에 전하가 결여되었다는 사실에 근거한 것으로 여겨진다. 부가적으로, 최근 문헌에는, 양전하를 띤 기을 PNA 내로 혼입하게 되면 하이브리드화의 역학이 향상될 것이라고 제시되어 있다[참조: Iyer et al., J. Biol. Chem. 270:14712-14717(1995)]. 주쇄 상에서의 전하 결여로 인해, PNA/핵산 복합체의 안정성은 유사한 DNA/DNA 또는 RNA/DNA 복합체 보다 더 높다. 특정 상황하에서는, PNA가 "쇄 전위"로 불리우는 과정을 통하여 고도로 안정적인 삼중 나선형 복합체를 형성할 것이다. 어떠한 등가의 쇄 전위 과정이나 구조도 DNA/RNA계에서는 공지된 적이 없다.

최근에는, 개개의 서열의 몇몇 1000 PNA 올리고머의 어레이를 중합체 막 상에서 합성시키는, "펩티드 핵산(PNA) 올리고머 어레이 상에서의 하이브리드화-이용 스크리닝"이 보고되었다[참조: Weiler et al., Nucl. Acids Res., 25:2792-2799(1997)]. 규정된 조성의 수 많은 프로브에 대한 특이적 서열 또는 샘플에 관한 친화적 결합(하이브리드화) 정보를 만들기 위해, 일반적으로 단일 검정에서 어레이가 사용된다. 따라서, PNA 어레이는 진단 응용 분야에 유용하거나 치료학적 유용성을 나타낼 지도 모르는 리드에 대한 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는데 유용할 수 있다. 그러나, 웨일러(Weiler) 등은 고정화된 PNA 올리고머에 대한 DNA 하이브리드화의 친화성 및 특이성이 예상 보다 훨씬 더 하이브리드화 조건에 좌우된다고 언급하고 있다. 더욱이, 낮은 이온 강도에서는 비-특이적 결합으로 향하는 경향이 있다. 또한, 보다 엄격한 세척 조건에 의해서도 제거될 수 없는 특정의 매우 강력한 결합성 부정합체가 확인되었다. 이러한 예상치 못한 결과는 새로이 발견된 이들 분자(즉, PNA)를 완벽히 인지하지 못했다는 것을 나타낸다

요약하면, PNA는 서열 특이성을 지닌 핵산과 하이브리드화되기 때문에, PNA는 프로브-이용된 하이브리드화 검정을 개발하는 경우에 대체 프로브로서의 유용한 연구 후보이다. 그러나, PNA 프로브는 구조나 기능 면에서 모두 핵산 프로브의 등가물이 아니다. 결과적으로, PNA의 독특한 생물학적, 구조적 및 생리-화학적 성질로 인해, 핵산이 통상적으로 이용되고 있는 응용 분야에 PNA가 적합한지 여부를 조사하는 연구가 수행되어야 한다.

본 발명은 프로브-이용되거나 프라이머-이용된 표적 서열 검출, 분석 및 정량 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 언급하면, 본 발명은 특정 샘플 중에서 관심있는 하나 이상의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 여부 또는 이들의 양을 지시해주는 검출가능한 신호를 생성시키기 위해 사용되는, 검출 복합체에 관한 신규한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다.

도 1a 내지 1c는 검출 복합체의 몇몇 상이한 양태를 예시하고 있다.

도 2는 표적 서열을 갖는 검출 복합체의 프로빙 서열의 하이브리드화에 대한 몇몇 상이한 양태를 예시하고 있다.

도 3a 내지 3c는 다중 세트의 검출가능한 잔기를 포함하는 검출 복합체의 몇몇 상이한 양태를 예시하고 있다.

도 4a 및 4b는 PCR 프라이머로서 검출 복합체를 사용하는 PCR의 초기 작동을 예시하고 있다.

도 5는 전진 및 후진 프라이머 모두가 검출 복합체인 1회전에서의 PCR의 작동을 예시하고 있다.

도 6은 전진 및 후진 프라이머 모두가 검출 복합체인 2회전에서의 PCR의 작동을 예시하고 있다.

도 7은 전진 및 후진 프라이머 모두가 검출 복합체인 PCR 증폭에서 제조된 앰플리콘을 예시하고 있다.

도 8a는 2개의 PNA로부터 어셈블리된 검출 복합체에 대한 형광성 대 온도 열 프로필을 예시하는 그래프이다.

도 8b는 PNA로부터 어셈블리된 검출 복합체에 대한 하이브리드화 검정 데이타를 예시하는 그래프이다.

도 9는 2개의 PNA로부터 어셈블리된 검출 복합체에 대한 형광성 대 온도 열 프로필을 예시하는 그래프이다.

도 10a 및 10b는 1개의 PNA 및 DNA 올리고머로부터 어셈블리된 검출 복합체에 대한 형광성 대 온도 열 프로필을 예시하는 그래프이다(여기서, 검출 복합체는 PCR 반응에서 전진 및 후진 프라이머로서 작동된다).

도 11은 PCR 반응에 대해 수득된 표로 만든 데이타를 예시한 그래프이다.

도 12a 내지 12c는 형광성을 알아보기 위해 PCR 반응 생성물을 분석하는데 사용된 폴리아크릴아미드 겔로부터 취한 사진의 전자 복합 영상이다.

도 13은 PCR 반응에 대해 수득된 표로 만든 데이타를 예시한 그래프이다.

도 14a 내지 14c는 형광성을 알아보기 위해 PCR 반응 생성물을 분석하는데 사용된 폴리아크릴아미드 겔로부터 취한 사진의 전자 복합 영상이다.

도 15는 독립적으로 검출가능한 PCR 검출 복합체를 사용하여 복합체 PCR 검정에 대해 생성된 데이타를 예시한 그래프이다.

도 16a 및 16b는 형광성을 알아보기 위해 PCR 반응 생성물을 분석하는데 사용된 폴리아크릴아미드 겔로부터 취한 사진의 전자 복합 음화 영상이다.

도 17a 및 17b는 형광성을 알아보기 위해 PCR 반응 생성물을 분석하는데 사용된 폴리아크릴아미드 겔로부터 취한 사진의 전자 복합 음화 영상이다.

도 18은 트랜스일루미네이터 상에 있는 열려 있지 않은 PCR 반응 샘플 튜브로부터 취한 2개의 사진의 전자 복합 음화 영상이다.

도 19a는 다중체 PCR 검정에 대해 수득된 표로 만든 데이타를 예시한 그래프이다.

도 19b는 에티듐 브로마이드 염색된 겔 사진의 전자 복합 음화 영상이다.

도 20a 및 20b는 기질 검출 복합체의 2가지 상이한 양태를 예시한 것이다.

도 21은 기질 검출 복합체가 표적 분자의 존재 여부를 검출하기 위한 신호 증폭 공정으로서 사용되는 프로브-이용된 하이브리드화 검정을 예시한 것이다.

1. 요약

본 발명은 관심있는 샘플 중에서 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하는데 사용되는, 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 조성물은 2가지 이상의 성분 중합체의 하이브리드인, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체이다. 상기 검출 복합체의 2가지 이상의 성분 중합체는 공여체와 수용체 잔기 세트로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하지만, 이러한 검출 복합체는 공여체와 수용체 잔기의 한 세트 이상 및/또는 2가지 이상의 성분 중합체를 포함할 수 있다. 성분 중합체는 상호작용기를 상호작용시킴으로서 상기 검출 복합체를 형성하도록 고안된다. 부가적으로, 이러한 검출 복합체는 하나 이상의 링커 및/또는 하나 이상의 스페이서 잔기를 포함할 수 있으므로, 이들은 특정 적용 분야에 적합한 검출 복합체를 작제하는데 유용할 수 있다.

검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체가 형성되는 경우에는 , 하나의 성분 중합체의 하나 이상의 공여체 잔기는 제2의 성분 중합체의 하나 이상의 수용체 잔기와 공간적으로 충분히 근접하게 된다. 이와 같이 어셈블리된 검출 복합체 세트의 공여체 및 수용체 잔기가 공간적으로 근접하게 위치되어 있기 때문에, 이러한 세트의 잔기 간에 에너지 전달이 일어난다. 검출 복합체가 해리되는 경우에는, 공여체와 수용체 잔기가 상기 세트의 공여체와 수용체 잔기로부터 에너지의 실재적인 전달을 야기시킬 정도로 충분히 상호작용하지 않는다. 결과적으로, 검출 복합체 형성/해리는, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 성분 중합체가 독립적으로 해리되지 않은 상태로 존재하는 경우와 비교해서, 상기 검출 복합체가 형성되는 경우에 상이한 것으로 검출가능한 상기 세트의 한 가지 이상의 구성원의 한 가지 이상의 물리적 성질을 측정함으로써 결정한다.

본 발명의 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체는 특정 성분 중합체의 하나 이상의 세그먼트를 표적 분자의 표적 서열에 직접적 또는 간접적으로 하이브리드화시킨 결과로서 해리되도록 주로 고안된다. 결과적으로, 이러한 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체는 관심있는 샘플에 존재할 수도 있는 관심있는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 이때, 표적 분자의 존재, 부재 또는 양은 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체의 해리와 표적 서열 또는 프라이밍 부위에 대한 성분 중합체의 하이브리드화를 직접적 또는 간접적으로 상관지음으로써 결정할 수 있다. 검출 복합체의 성분 중합체는 바람직하게 해리될 것이기 때문에, 상이한 중합체에 독립적으로 부착된 공여체와 수용체 잔기는 분자상 비이컨(PNA 또는 핵산) 또는 선형 비이컨과 같은 단일 분자상 "비이컨" 프로브와 비교해서 공간적으로 더 멀리 떨어질 수 있다. 그 결과, 공여체와 수용체 잔기 간의 거리에 비례하는 에너지 전달 효율은, 공여체와 수용체 잔기가 동일한 중합체에 연결되므로 공간상 무한정 떨어질 수 없는 단일분자상 프로브와 비교해서 훨씬 더 실재적으로 변화될 것이다. 따라서, 본 발명의 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체는 단일분자상 "비이컨" 프로브에 비해 상당히 비교되는 이점을 보유하고 있다.

해리되도록 주로 고안되긴 하였지만, 공여체와 수용체 잔기 간의 거리는 단순히 변화될 수 있는데, 이는 상기 검출 복합체의 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가, 검출 복합체의 해리 여부와 상관없이 표적 서열과 하이브리드화되기 때문이다. 결과적으로, 특정 세트의 공여체와 수용체 잔기 간의 에너지 전달은 심지어 이러한 검출 복합체가 해리되지 않는 경우에도 영향을 받을 수 있는데, 단 본래의 검출 복합체가 표적 분자의 표적 서열과 추가로 복합체를 형성하는 경우와 비교해서, 본래의 검출 복합체에서 상이한 것으로 검출가능한 특정 세트의 하나 이상의 구성원의 한 가지 이상의 물리적 성질이 검출가능한 수준으로 변화된다. 따라서, 본 발명의 검출 복합체를 또한 사용하여, 이러한 검출 복합체가 해리되지 않은 경우일지라도 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 결정할 수 있다.

따라서, 한 양태에 있어서, 본 발명은 특정 검정에서 관심있는 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출 또는 확인하는데 적합한 검출 복합체에 관한 것이다. 검출 복합체는, 이러한 검출 복합체가 해리되는지 여부와 상관없이, 적합한 하이브리드화 조건 하에서 표적 서열과 하이브리드화되는 프로빙 세그먼트를 갖는 하나 이상의 프로빙 중합체를 포함한다. 이러한 프로빙 중합체는 하나 이상의 기타 성분 중합체와 복합체를 형성하는데 적합한 하나 이상의 상호작용기를 또한 갖는다. 당해 검출 복합체는 또한, 최소한 하나 이상의 상호작용기를 갖는 하나 이상의 어닐링 중합체를 포함하는데, 여기서 둘 이상의 성분 중합체의 상호작용기의 상호작용으로 인해 복합체가 형성되고 이를 안정화시킨다. 당해 검출 복합체는 또한, 한 세트 이상의 공여체와 수용체 잔기를 포함한다. 둘 이상의 성분 중합체 각각에 하나 이상의 공여체 잔기와 하나의 수용체 잔기를 연결시켜, 상기 복합체의 형성이, 상기 성분 중합체가 독립적으로 또는 해리되지 않은 상태로 존재하거나 또는 상기 복합체가 관심있는 표적 분자의 표적 서열과 추가로 복합체를 형성하는 경우와 비교해서 용액 중에 존재하지 않는 경우와 검출가능한 수준으로 상이한 방식으로, 각 세트의 공여체와 수용체 잔기 간의 에너지 전달을 촉진시켜 준다. 당해 검출 복합체의 하나 이상의 성분 중합체는 비-핵산 중합체이다. 이러한 검출 복합체는 용액 중에 존재할 수 있거나, 지지체에 고정화될 수 있거나, 또는 특정 어레이에 배열된 둘 이상의 검출 복합체 중의 하나일 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 소광인자로만 표지되지만 공여체 잔기로는 표지되지 않은 비-핵산 중합체에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 소광인자는 다브실(dabcyl)이다. 바람직한 양태에 있어서, 이러한 비-핵산 중합체는 소광인자로 말단적으로 표지시키고, 가장 바람직하게는, 상기 비-핵산 중합체를 다브실로 C-말단적으로 표지시킨다. 몇몇 C-말단적 다브실 표지된 PNA의 비-제한적인 예가 표 1에 제시되어 있다. 표 1에 열거된 예에 대해서는, 다브실 잔기가, 기타 말단 부착법이 존재하기 때문에 비제한적인 방법을 통하여 C-말단 라이신 아미노산의 N-ε-아미노기에 통상 연결된다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 기질 검출 복합체에 관한 것이다. 기질 검출 복합체는 효소에 대한 기질로서 작용함으로써, 표적 독립적인 방식으로 검출가능한 신호에서의 변화를 발생시킨다. 기질 검출 복합체는 앞서 기재된 검출 복합체와 극히 유사한데, 단 이러한 기질 검출 복합체는 관심있는 표적 분자의 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화되는 프로빙 세그먼트를 함유하지 않는다는 점에서 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체와 상이하다. 따라서, 기질 검출 복합체는 관심있는 표적 서열이나 표적 분자와 직접적으로 상호작용하지 않는다. 그러나, 기질 검출 복합체는 최소한, 둘 이상의 어닐링 중합체를 포함하는데, 여기서 어닐링 중합체 중의 하나 이상은 상기 검정에서 자체, 또 다른 어닐링 중합체 또는 또 다른 분자와 상호작용함으로써 특정 효소에 대한 기질을 형성할 수 있다. 둘 이상의 어닐링 중합체는 기질 검출 복합체 뿐만 아니라 연결된 공여체와 수용체 잔기를 형성하고 이를 안정화시키는 상호작용기를 추가로 포함한다.

본 발명의 검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체는 표적 분자의 표적 서열의 존재, 부재 또는 양을 검출 또는 확인하는데 적합하다. 결과적으로, 본 발명은 또한, 특정 샘플에서 표적 서열 및/또는 표적 분자를 검출, 확인 또는 정량하는 방법에 관한 것이다.

한 양태에 있어서, 당해 방법은 샘플을 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체와 접촉시킨 다음, 표적 서열에 대한 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트의 하이브리드화시 또는 상기 복합체의 직접적 또는 간접적 해리시 비이컨 세트의 공여체와 수용체 잔기 간의 에너지 전달에 기인할 수 있는 검출가능한 신호의 변화를 검출 또는 확인하는 것을 포함한다. 이어서, 이와 같이 검출된 신호를 상기 샘플 중의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관지을 수 있다. 일반적으로, 정량는 대표적 샘플 중에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 공지된 양과 표준 검정을 사용하여 발생된 표준 곡선에 대해 상기 신호를 비교하는 것을 포함할 것이다.

또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 프로빙 중합체(들)를 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자와 상호작용시킨 후에 검출 복합체를 형성시키는 것을 포함한다. 이러한 양태에서는, 검출 복합체의 형성 정도를, 검출 복합체의 형성 전 및 후의 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원의 검출가능한 신호에서의 변화에 의해 측정할 수 있다. 상기 샘플에 가해진 프로빙 중합체(들) 및 어닐링 중합체(들)의 양이 조절 가능하고 산정될 수 있기 때문에, 검출 복합체의 형성 정도, 및 이로부터 유래된 검출가능한 신호의 측정 가능한 수준의 변화를 이용하여 관심있는 특정 샘플에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 결정할 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 당해 검출 복합체는 관심있는 표적 분자가 검출되는 효소에 대한 기질인데, 이는 기질 검출 복합체에 대한 상기 효소의 활성이 상기 샘플 중에서의 표적 분자의 존재 하에 또는 이러한 표적 분자의 존재 또는 양에 비례하여 검출가능한 신호를 발생시키기 때문이다. 이 방법은 샘플을 표적 의존적 효소 활성을 발생시키도록 고안된 효소 및 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 검정은 표적 분자와 복합체를 형성하는 프로브 중의 하나 이상이 프로브-효소 접합체인 프로브-이용된 검정으로서 고안된다. 이어서, 상기 샘플을 기질 검출 복합체와 접촉시킨 다음, 상기 복합체의 효소 촉매된 해리로부터 발생된 비이컨 세트의 공여체와 수용체 잔기 간의 에너지 전달에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 측정한다. 일반적으로, 정량은 대표적 샘플 중에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 공지된 양과 표준 검정을 사용하여 발생된 표준 곡선에 대해 상기 신호를 비교하는 것을 포함할 것이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 형성 방법에 관한 것이다. 검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체는 이들을 상호작용 및 어셈블리시키는데 적합한 조건하에서 둘 이상의 성분 중합체를 혼합함으로써 형성시킨다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 유용한 실시를 촉진시키는 키트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 키트는 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 하나 이상의 성분 중합체를 포함하고 임의로, 본 발명의 방법 실시에 유용한 기타 시약을 포함한다. 결과적으로, 본 발명의 키트는 관심있는 샘플 중에 존재할 수 있는 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출 또는 확인하는데 적합하다. 최종 사용자에 의해 인식된 바와 같이, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체는 예비어셈블리시킬 수 있거나, 또는 최종 사용자는 둘 이상의 성분 중합체를 혼합함으로써 키트와 함께 사용될 복합체를 생성시킬 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 지지체 결합된 검출 복합체 또는 둘 이상의 지지체 결합된 검출 복합체를 재생시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 재생 방법은 표면으로부터 모든 하이브리드화된 표적 분자를 제거한 다음, 이러한 표면을 상기 지지체 또는 어레이의 하나 또는 많은 상이한 검출 복합체를 재생시키는데 필요한 바와 같은 하나 이상의 통상의 표지된 성분 중합체의 일정 량과 접촉시키는 것을 포함한다.

2. 본 발명의 바람직한 양태에 관한 기재

I. 정의

a. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "누클레오염기"는 핵산 기술을 이용하거나 펩티드 핵산 기술을 이용하는 당업자에게 통상적으로 공지됨으로써 핵산과 특이적으로 결합되는 서열일 수 있는 중합체를 생성시키는 천연 및 비-천연의 헤테로사이클릭 잔기를 포함한다.

b. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "누클레오염기 서열"은 누클레오염기 함유 서브유닛을 포함하는 중합체의 모든 세그먼트이다. 적합한 중합체 또는 중합체 세그먼트의 비-제한적 예로는 올리고데옥시누클레오티드, 올리고리보누클레오티드, 펩티드 핵산, 핵산 동족체, 핵산 유사체 또는 키메라가 있다.

c. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 서열"은 특정 검정에서 검출되거나 또는 특정 검정에서 관심있는 표적 분자의 검출에 사용될 모든 누클레오염기 서열이다. 따라서, 이러한 "표적 서열"은 관심있는 완전한 서열을 포함할 수 있거나 또는 관심있는 큰 분자의 서브서열(subsequence) 또는 서브유닛일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 서열"은 또한, 본 발명의 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체(본원에서 정의된 바와 같음)에 대한 프라이밍 부위를 지칭할 수 있다.

d. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "관심있는 표적 분자"는 관심있는 핵산 분자, 비-핵산 중합체, PNA, 또는 기타 모든 2차 조성물일 수 있으나, 단 이러한 표적 서열은 상기 2차 조성물에 연결된다. 2차 조성물의 비-제한적 예로는 펩티드, 효소, 항체, 항체 단편 등이 있다.

e. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-핵산 프로브" 또는 "비-핵산 중합체"는 표적 서열의 적어도 일부분과 하이브리드화되는 것으로 고안된 프로빙 세그먼트를 포함하는 올리고머를 의미하며, 여기서 상기 올리고머의 프로빙 세그먼트는 적합한 하이브리드화 조건 하에서 중성 주쇄를 포함한다는 것을 추가로 특징으로 한다. 비-핵산 프로브의 바람직한 비-제한적 예는 펩티드 핵산(PNA) 프로브이다.

f. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 미국 특허 제5,539,082호, 제5,527,675호, 제5,623,049호, 제5,714,331호, 제5,736,336호, 제5,773,571호 또는 제5,786,461호(이들 모두는 본원에 참조문헌으로 삽입됨)에서 펩티드 핵산으로 지칭되거나 청구된 모든 화합물을 포함한, 둘 이상의 PNA 서브유닛(잔기)을 포함하는, 모든 올리고머, 연결된 중합체 또는 키메릭 올리고머로서 정의된다. 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 다음 문헌에 기재된 핵산 유사체의 둘 이상의 서브유닛을 포함하는 중합체에 적용된다[참조: Diderichsen et al., Tett. Lett. 37:475-478(1996); Fujii et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:637-627(1997); Jordan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:687-690(1997); Krotz et al., Tett. Lett. 36:6941-6944(1995); Lagriffoul et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:1081-1082(1994); Lower et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1997) 1:539-546; Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11:547-554(1997); Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11:550-560(1997); Petersen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:793-796(1996); Diederichsen, U., Bioorganic ＆ Med. Chem. Lett., 8:165-168(1998); Cantin et al., Tett. Lett., 38:4211-4214(1997); Ciapetti et al., Tetrahedron, 53:1167-1176(1997) and Lagriffoule et al., Chem. Eur. J., 3:912-919(1997)].

바람직한 양태에서는, PNA가 다음 식의 둘 이상의 서브유닛을 포함하는 중합체이다:

상기 식에서,

각각의 J는 동일하거나 상이하며, H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br 및 I로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 K는 동일하거나 상이하며, O, S, NH 및 NR¹로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 R¹은 동일하거나 상이하며, 헤테로원자를 임의로 함유할 수 있는 1개 내지 5개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고, 각각의 A는 단일 결합, 화학식 (CJ₂)_S-의 기 및 화학식 -(CJ₂)_SC(O)-의 기 (여기에서, J는 상기한 바와 같고, 각각의 s는 1 내지 5의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 t는 1 또는 2이고, 각각의 u는 1 또는 2이고; 각각의 L은 동일하거나 상이하며, J, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우리딘, 5-메틸시토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,6-디아미노푸린, 히포크산틴, 슈도이소시토신, 2-티오우라실, 2-티오티미딘, 그 밖의 천연 누클레오염기 유사체, 그 밖의 합성 누클레오염기, 치환된 방향족 잔기 및 비치환된 방향족 잔기, 비오틴, 플루오레세인 및 다브실로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 가장 바람직한 양태에서는, PNA 서브유닛이 메틸렌 카르보닐 연결을 통하여 N-[2-(아미노에틸)]글리신 주쇄의 아자 질소에 부착된 천연 또는 비-천연의 누클레오염기로 이루어진다.

g. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지" 및 "검출가능한 잔기"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 핵산 중합체, 비-핵산 프로브 또는 PNA 프로브에 부착됨으로써 특정 기기나 방법에 의해 검출가능한 프로브 또는 올리고머로 만들 수 있는 잔기를 지칭한다.

h. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라" 또는 "키메릭 올리고머"는 상이한 부류의 서브유닛 중에서 선택되는 둘 이상의 연결된 서브유닛을 포함하는 올리고머를 의미한다. 예를 들면, PNA/DNA 키메라는 하나 이상의 2'-데옥시리보핵산 서브유닛에 연결된 둘 이상의 PNA 서브유닛을 포함할 것이다(PNA/DNA 키메라 제조에 관한 예시 방법 및 조성물에 대해서는 WO 96/40709를 참조한다). 이러한 키메라의 예시적 성분 서브유닛은 PNA 서브유닛, 천연 아미노산 서브유닛, DNA 서브유닛, RNA 서브유닛 및 핵산 동족체 또는 유사체의 서브유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된다.

i. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연결된 중합체"는 링커에 의해 연결되는 둘 이상의 중합체 세그먼트를 포함하는 중합체를 의미한다. 연결된 중합체를 형성하기 위해 연결되는 중합체 세그먼트는 올리고데옥시누클레오티드, 올리고리보누클레오티드, 펩티드, 폴리아미드, 펩티드 핵산(PNA) 및 키메라로 이루어진 군 중에서 선택된다.

j. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "성분 중합체(들)"은 검출 복합체를 형성하기 위해 어셈블리되는 둘 이상의 중합체를 지칭한다. 적합한 중합체의 비-제한적 예로는 올리고데옥시누클레오티드, 올리고리보누클레오티드, 펩티드 핵산, 핵산 동족체, 핵산 유사체, 연결된 중합체 또는 키메라가 있다.

II. 총론:

PNA 합성

PNA를 화학적으로 어셈블리하는 방법은 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,539,082호, 제5,527,675호, 제5,623,049호, 제5,714,331호, 제5,736,336호, 제5,773,571호 또는 제5,786,461호(이들 모두는 본원에 참조문헌으로 삽입됨)]. 펩티드 핵산의 지지체 결합된 자동화 화학적 어셈블리에 대한 화학물질 및 기기가 현재 시판되고 있다. PNA의 화학적 어셈블리는 고체 상 펩티드 합성과 유사한데, 여기서는 각 어셈블리 주기에서, 올리고머가 성장하는 중합체에 가해질 다음 신톤(synthon)과 축합되는 반응성 알킬 아미노 말단을 보유하고 있다. 표준 펩티드 화학이 이용되기 때문에, 천연 및 비-천연 아미노산이 통상적으로 PNA 올리고머 내로 혼입된다. PNA는 폴리아미드이기 때문에, C-말단(카르복실 말단)과 N-말단(아미노 말단)을 갖는다. 표적 서열에 대한 직각 결합(바람직한 방향)에 적합한 하이브리드화 프로브를 고안하기 위해서는 PNA 프로브의 프로빙 누클레오염기 서열의 N-말단이 등가의 DNA 또는 RNA 올리고누클레오티드의 5'-하이드록실 말단의 등가물이다.

PNA 표지화

본 발명의 검출 복합체는 하나 이상의 공여체 잔기와 하나 이상의 수용체 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 공여체 잔기는 형광단이고 수용체 잔기는 소광인자 잔기이다. 공여체와 수용체 잔기는 당해 검출 복합체의 성분 중합체의 말단에 부착되는 것이 바람직하긴 하지만, 필수적인 것은 아니다.

PNA의 표지화는 펩티드 표지화와 유사하다. 어셈블리의 합성 화학은 본질적으로 동일하기 때문에, 펩티드를 표지시키는데 통상 사용되는 어떠한 방법도 PNA를 표지화하는데 이용될 수 있다. 따라서, PNA를 수 많은 검출가능한 잔기로 표지시킬 수 있다. 일반적으로, 핵산 또는 펩티드에 연결될 수 있는 모든 검출가능한 잔기를 PNA에 연결시킬 수 있다.

전형적으로, PNA의 N-말단은 카르복실산 또는 활성화된 카르복실산기를 갖는 잔기와 반응시킴으로써 표지시킨다. 하나 이상의 스페이서 잔기를 상기와 같이 표지된 잔기와 PNA 올리고머 사이에 도입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 스페이서 잔기는 표지화 반응을 수행하기 이전에 혼입시킨다. 그러나, 상기 스페이서를 표지 내에 봉매시킴으로써 표지화 반응 동안에 혼입시킬 수 있다. 특정화 시약을 PNA에 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 말단 아릴아민 잔기는, 적합하게 보호된 4-아미노벤조산 유도체를 PNA 올리고머의 아미노 말단과 축합시킴으로써 생성시킬 수 있다.

한 양태에서는, PNA의 C-말단을, 표지된 잔기를 먼저 지지체와 축합시켜 표지된 PNA를 어셈블리되게 함으로써 표지시킨다. 이어서, PNA의 제1 신톤을 표지된 잔기와 축합시킨다. 또 다른 방법으로는, 하나 이상의 스페이서 잔기를 표지된 잔기와 PNA 올리고머(예를 들어, 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산) 사이에 도입할 수 있다. PNA를 완벽하게 어셈블리하고 표지시킨 후, PNA를 상기 지지체로부터 절단하고, 탈보호시킨 다음, 표준 방법을 이용하여 정제한다.

예를 들면, 표지된 잔기는 라이신 유도체일 수 있는데, 여기서 ε-아미노기는 5(6)-카르복시플루오레신과 같은 검출가능한 잔기로 표지시킨다. 또 다른 한편, 표지된 잔기는 ε-아미노기를 4-((-4-디메틸아미노)페닐)아조)벤조산(다브실)로 유도체화시킨 라이신 유도체일 수 있다. 이러한 라이신 유도체를 상기 지지체와 축합시키는 것은 표준 축합(펩티드) 화학을 이용하여 달성할 수 있다. 이어서, 상기 라이신 유도체의 α-아미노기를 탈보호시키고 PNA 어셈블리는 제1 PNA 신톤과 라이신 아미노산의 α-아미노기와의 축합에 의해 개시되었다. 완전한 어셈블리 후, PNA 올리고머는 상기 지지체로부터 절단하고, 탈보호시킨 다음, 널리 공지된 기술을 사용하여 정제시킨다.

또 다른 한편, 상기와 같이 어셈블리되거나 부분적으로 어셈블리된 중합체 상의 작용기를 표지시키는데, 이는 여전히 지지체 결합된 상태이다. 이러한 방법은 적당한 보호기를 상기 올리고머 내로 혼입시킴으로써 검출가능한 잔기가 결합되는 반응성 작용기를 생성시켜야 하지만, 표지(예: 형광단 또는 소광인자 잔기)를 프로빙 세그먼트 내를 포함한 중합체 내의 어떠한 위치에도 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 라이신의 ε-아미노기를 4-메틸-트리페닐메틸(Mtt), 4-메톡시-트리페닐메틸(MMT) 또는 4,4'-디메톡시트리페닐메틸(DMT) 보호기로 보호시킬 수 있다. 이러한 Mtt, MMT 또는 DMT 기는, 상기 수지를 순한 산성 조건 하에서 처리함으로써, PNA(PAL 링커를 갖는 시판용 Fmoc PNA 단량체 및 폴리스티렌 지지체를 사용하여 어셈블리됨)로부터 제거할 수 있다. 결과적으로, 이때, 표지화 시약을 라이신 아미노산의 ε-아미노기와 축합시킬 수 있다. 완전하게 어셈블리시키고 적당히 표지화시킨 후, 중합체를 상기 지지체로부터 절단하고, 탈보호시킨 다음, 널리 공지된 기술을 사용하여 정제한다.

또 다른 방법으로는, 표지를 PNA에 부착시킨 후, 이를 완전하게 어셈블리시키며, 지지체로부터 절단한 후, 임의로 정제한다. 이러한 방법은 상기 표지가 PNA를 제조하는데 통상적으로 사용된 절단, 탈보호 또는 정제 과정과 부합되지 못한 경우에는 바람직하다. 이러한 방법에 의해, PNA는 일반적으로, PNA 상의 작용기와 표지 상의 작용기의 반응에 의해 용액 중에서 표지될 것이다. 당업자는 커플링 용액의 조성이 PNA 및 표지화 시약의 특성에 따라서 좌우될 것이라는 것을 인식할 것이다. 이러한 용액은 유기 용매, 물 또는 이들의 모든 조합물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 유기 용매는 극성의 비-친핵성 용매일 것이다. 적합한 유기 용매의 비제한적 예로는 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 디옥산 및 N,N'-디메틸포름아미드가 있다.

일반적으로, PNA 상의 작용기는 아민일 것이고 표지화 시약 상의 작용기는 카르복실산 또는 활성화 카르복실산일 것이다. 활성화 카르복실산 작용기의 비-제한적 예로는 N-하이드록시석신이미딜 에스테르가 있다. 이러한 표지가 효소인 경우에는, 바람직하게는 PNA 상의 작용기가 아릴아민일 것이다. 수용액 중에서는, PNA 또는 표지 중의 어느 하나(선택된 성분의 특성에 따름)의 카르복실산기는 수용성 카르보디이미드로 활성화시킬 수 있다. 시약 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)는 수성 아미드 형성 축합 반응에 대해 특이적으로 시판되고 있는 시약이다.

일반적으로, 수용액의 pH는 축합 반응 동안 완충액으로 조절시킬 것이다. 바람직하게는, 이러한 축합 동안의 pH는 4 내지 10의 범위이다. 아릴아민을 카르복실산과 축합시킨 경우에는, pH가 바람직하게는 4 내지 7의 범위 내이다. 알킬아민을 카르복실산과 축합시킨 경우에는, pH는 바람직하게는 7 내지 10의 범위 내이다. 일반적으로, 비-수성 반응의 염기도는 비-친핵성 유기 염기를 가함으로써 조절할 것이다. 적합한 염기의 비-제한적 예로는 N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 및 N,N-디이소프로필에틸아민이 있다. 또 다른 방법으로는, (N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산)(HEPES) 또는 4-모르폴린에탄설폰산(MES)과 같은 생물학적 완충제, 또는 중탄산나트륨과 같은 무기 완충제를 사용하여 조절한다.

핵산 합성 및 표지화

핵산 올리고머(올리고누클레오티드 및 올리고리보누클레오티드) 합성은 통상적인 것이 되었다. 핵산 합성에 관한 상세한 설명은 다음 문헌을 참조할 수 있다[Gait, M. J., Oligonucleotide Synthesis: a Practical Approach. 1RL Press, Oxford England]. 바람직하게는, 핵산 올리고머는 고체 상 합성으로서 공지되어 있는 지지체 상에서 합성한다. 또 다른 방법으로는 이들을 용액 중에서 합성한다. 당업자는 표지되고, 표지되지 않고/않거나 변형된 올리고누클레오티드(DNA, RNA 및 이의 합성 동족체) 모두를 용이하게 입수할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들은 시판용 기기 및 시약을 사용하여 합성하거나 소매를 위해 제작된 올리고누클레오티드의 판매상으로부터 구입할 수 있다. 핵산 합성 및 표지화에 대한 각종 조성물, 지지체 및 방법이 논의되어 있는 특허로는 미국 특허 제5,476,925호, 제5,453,496호, 제5,446,137호, 제5,419,966호, 제5,391,723호, 제5,391,667호, 제5,380,833호, 제5,348,868호, 제5,281,701호, 제5,278,302호, 제5,262,530호, 제5,243,038호, 제5,218,103호, 제5,204,456호, 제5,204,455호, 제5,198,527호, 제5,175,209호, 제5,164,491호,제5,112,962호, 제5,071,974호, 제5,047,524호, 제4,980,460호, 제4,923,901호, 제4,786,724호, 제4,725,677호, 제4,659,774호, 제4,500,707호, 제4,458,066호 및 제4,415,732호(이들 모두는 본원에 참조문헌으로 삽입됨)이 있다.

표지

본 발명의 검출 복합체에 부착된 표지는 하나 이상의 공여체 잔기와 하나 이상의 수용체 잔기를 포함하는 에너지 또는 전자 전달 잔기 세트("비이컨 세트(들)"로 후술됨)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 비이컨 세트는 단일 공여체 잔기와 단일 수용체 잔기를 포함할 것이다. 그럼에도 불구하고, 비이컨 세트는 하나 이상의 공여체 잔기와 하나 이상의 수용체 잔기를 함유할 수 있다. 예를 들면, 특정 세트를 3개 잔기를 포함할 수 있다. 잔기 1은 공여체 형광단일 수 있으며, 이는 잔기 2와 인접하게 위치하여 존재하는 경우에는, 에너지를 비이컨 세트의 잔기 2로 전달할 수 있다. 그 후, 잔기 2는 잔기 3과 인접하게 위치하여 존재하는 경우에 에너지를 비이컨 세트의 잔기 3으로 전달할 수 있다. 결과적으로, 에너지는 이러한 비이컨 세트의 3개 잔기 모두 사이에 전달된다. 이러한 세트에서는, 잔기 2가 잔기 1로부터의 에너지 공여체이며 동시에 잔기 3으로의 에너지 공여체이다. 이와 같이 비이컨 세트의 둘 이상의 잔기 간의 에너지 전달이 본 발명의 실시로써 고려된다.

공여체 잔기와 수용체 잔기는 하나 이상의 수용체 잔기가 하나 이상의 공여체 잔기로부터 전달된 에너지를 수용하거나 또는 공여체 잔기(들)로부터 신호를 소멸시키도록 작용한다. 에너지 전달은 비이컨 세트의 밀접하게 연결된 잔기의 충돌을 통하거나(비-FRET) 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET)과 같은 비-방사성 공정을 통하여 일어날 수 있다. FRET가 일어나는 경우에는, 공여체 잔기와 수용체 잔기 간에 에너지를 전달하기 위해서, 잔기들이 공간상 근접해야 하고 공여체의 발광 스펙트럼이 수용체의 흡광 스펙트럼과 상당히 중첩되어야 한다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.228-235(1979) and particularly page 232, col.1 through page 234, col.1]. 또 다른 한편, 비-FRET 에너지 전달은 공여체 잔기의 발광 스펙트럼이 수용체의 흡광 스펙트럼과 상당히 중첩되는지에 상관없이 매우 근접하게 연결된 공여체와 수용체 잔기 사이에서 일어날 수 있다[참조: Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, p.228-235(1979) and particularly page 229, col.1 through page 232, col.1]. 이러한 방법은 분자내 충돌로서 지칭되는데, 이는 소광이 공여체 잔기와 수용체 잔기의 직접적인 접촉에 의해 유발되는 것으로 여겨지기 때문이다[참조: Yaron et al.].

바람직한 공여체 잔기 및 수용체 잔기는 각각 형광단 및 소광인자 배합물이다. 수 많은 아민 반응성 표지화 시약이 시판되고 있다(공급원: Molecular Probes, Eugene, Oregon). 바람직한 표지화 시약은 카르복실산으로서 공급되거나 카르복실산의 N-하이드록시석시니딜 에스테르로서 공급될 것이다. 바람직한 플루오로크롬(형광단)으로는 5(6)-카르복시플루오레세인(Flu), 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥사노산(Cou), 5(및 6)-카르복시-X-로다민(Rox), 시아닌 2(Cy2) 염료, 시아닌 3(Cy3) 염료, 시아닌 3.5(Cy3.5) 염료, 시아닌 5(Cy5) 염료, 시아닌 5.5(Cy5.5) 염료, 시아닌 7(Cy7) 염료, 시아닌 9(Cy9) 염료(시아닌 염료 2, 3, 3.5, 5 및 5.5는 Amersham, Arlington Heights, IL로부터 NHS 에스테르로서 시판되고 있다) 또는 알렉사 염료 시리즈(Molecular Probe, Eugene, OR)가 있다. 가장 바람직한 형광단은 플루오레세인의 유도체 및 특히 5 및 6-카르복시플루오레세인이다. 수용체 잔기는 제2 형광단일 수 있지만, 바람직하게는 수용체 잔기는 소광인자 잔기이다. 소광인자 잔기는 형광단과 같은 공여체 잔기로부터 검출가능한 신호를 소멸시킬 수 있는 잔기이다. 가장 바람직하게는, 소광인자 잔기는 하나 이상의 아조 또는 니트로기로 치환되는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기이다. 가장 바람직한 소광인자 잔기는 4-((-4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산(다브실)이다.

에너지 전달의 검출:

당해 검출 복합체가 형성되는 경우에는, 하나의 성분 중합체의 하나 이상의 공여체 잔기를 제2 성분 중합체의 하나 이상의 수용체 잔기와 공간상 충분히 근접하도록 한다. 이러한 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기는 공간상 인접하게 위치하기 때문에, 에너지 전달이 비이컨 세트의 잔기들 간에 일어난다. 당해 검출 복합체가 해리하게 되면, 공여체 잔기와 수용체 잔기는 비이컨 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기로부터 상당한 에너지 전달을 유발시키기에 충분하게 상호작용되지 않으며, 상기 세트의 공여체 및/또는 수용체 잔기로부터의 검출가능한 신호에 있어서 상관있는 변화가 생긴다. 결과적으로, 검출 복합체 형성/해리는 당해 검출 복합체의 성분 중합체가 독립적으로 해리되지 않은 상태로 존재하는 경우와 비교해서 상기 복합체가 형성되는 경우에 검출가능한 수준으로 상이한 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원의 한 가지 이상의 물리적 성질을 측정함으로써 결정할 수 있다.

또 다른 한편, 복합체 해리를 가져다 주지 않는 단지 하이브리드화에만 기인하는 신호에서의 검출가능한 변화는 또한, 샘플 중에서의 표적 서열 및 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관있을 수 있는데, 단 본래의 검출 복합체가 표적 분자의 표적 서열과 추가로 복합체를 형성하는 경우와 비교해서, 본래의 검출 복합체에서 검출가능한 수준으로 상이한 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원의 한 가지 이상의 물리적 성질이 검출가능한 수준으로 변화된다. 본 발명자들은 본 발명의 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체(본원에서 정의된 바와 같음)의 자가-지시성으로서 복합체 해리 또는 하이브리드화에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 언급하고자 한다.

바람직하게는, 해리되지 않은 중합체의 연결된 공여체 잔기와 수용체 잔기 간의 평균 거리가 지속적으로 복합체를 형성하고 있는 중합체와 비교해서 매우 클 것이기 때문에 당해 검출 복합체는 해리된다. 이러한 큰 간격으로 인해, 해리된 중합체의 공여체 잔기와 수용체 잔기 간에는 에너지 전달이 거의 이루어지지 않는 반면, 지속적으로 복합체를 형성하고 있는 중합체의 잔기들 간에는 아마도 상당한 에너지 전달이 있을 것이다. 결과적으로, 단순한 하이브리드화로 인해 검출가능한 수준의 변화가 발생되는 경우와 비교해서, 당해 검출 복합체가 해리되는 경우에는 검출가능한 신호에 있어서 상당히 더 큰 변화가 있어야 한다. 유사하게, 본 발명의 검출 복합체는 단일분자상 프로브와 비교해서 검출가능한 신호에 있어서 보다 큰 변화를 발생시켜야 하는데, 이는 단일분자상 프로브의 연결된 공여체 잔기와 수용체 잔기가 공간상 무한정 떨어질 수 없기 때문이다.

에너지 전달 표지 이외에도, 본 발명의 공여체 잔기와 수용체 잔기는 전자 전달 잔기일 수 있는데, 여기서 이들이 공간상 인접하여 있는 경우에는 잔기들 간의 전자 전달로부터 검출가능한 신호가 발생되지만, 이들이 공간상 보다 떨어져 있는 경우에는 덜 효율적이다.

검출가능한 및 독립적으로 검출가능한 잔기/다중체 분석:

본 발명의 바람직한 양태에서는, 다중체 하이브리드화 검정을 수행한다. 다중체 검정에서는, 관심있는 수 많은 조건을 동시에 조사한다. 다중체 분석은 이러한 검정 동안 또는 완료 후, 샘플 성분을 또는 이와 연관된 데이타를 분류하는 능력에 좌우된다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 별개의 독립적으로 검출가능한 잔기를 사용하여 둘 이상의 상이한 검출 복합체의 성분 중합체를 표지시킨다. 독립적으로 검출가능한 잔기 각각을 식별하고/하거나 이를 정량하는 능력은 다중체 하이브리드화 검정에 대한 수단을 제공하는데, 이는 표적 서열에 대한 별개로(독립적으로) 표지된 검출 복합체 각각의 하이브리드화와 상관있는 데이타가 특정 샘플에서 검출하고자 하는 각 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관있을 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 다중체 검정은 동일한 샘플 및 동일한 검정에서 둘 이상의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 동시에 검출할 수 있다. 당해 검출 복합체는 자가-지시성이고 독립적으로 검출가능한 것으로 고안될 수 있기 때문에, 본 발명의 다중체 검정을 밀폐된 튜브 포맷으로 수행하여, 동일한 검정에서 관심있는 둘 이상의 표적 서열 또는 표적 분자에 대한 샘플을 동시에 실시간 및 종점 분석하기 위한 데이타를 제공할 수 있다. 부가적으로, 이러한 검정은 단일분자상 "비이컨" 프로브를 혼입함으로써 검정 성능을 확인하여 추가로 복합체 형성시키거나 또는 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자의 특이적 양태를 확인하는데 사용될 수 있다.

스페이서 링커 잔기:

일반적으로, 스페이서는 벌키 표지화 시약이 비-핵산 프로브의 하이브리드화 성질에 대해 지닐 수도 있는 광범위한 효과를 최소화하기 위하여 사용된다. 링커는 전형적으로, 가요성과 무작위성을 상기 프로브 내로 유도하거나 특정 프로브 또는 성분 중합체의 둘 이상의 누클레오염기 서열을 연결시킨다. 본 발명의 검출 복합체의 비-핵산 성분 중합체에 대해 바람직한 스페이서/링커 잔기는 하나 이상의 아미노알킬 카르복실산(예: 아미노카프로산), 아미노산의 측쇄(예: 라이신 또는 오르니틴의 측쇄), 천연 아미노산(예: 글리신), 아미노옥시알킬산(예: 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산), 알킬 이산(예: 석신산), 알킬옥시 이산(예: 디글리콜산) 또는 알킬디아민(예: 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄)으로 이루어진다. 스페이서/링커 잔기는 또한 우연히 또는 의도적으로 작제되어 프로브의 수 용해도를 향상시킬 수 있다[참조: Gildea et al., Tett. Lett. 39:7255-7258(1998)]. 바람직하게는, 스페이서/링커 잔기는 식 -Y-(O_m-(CW₂)_n)_o-Z-를 갖는 하나 이상의 연결된 화합물을 포함한다. 상기식에서, 기 Y는 단일 결합, -(CW₂)_p-, -C(O)(CW₂)_p-, -C(S)(CW₂)_p- 및 -S(O₂)(CW₂)_p-이다. 기 Z는 NH, NR², S 또는 O이다. 각 W는 독립적으로 H, R², -OR², F, Cl, Br 또는 I이며 각 R²는 -CX₃, -CX₂CX₃, -CX₂CX₂CX₃, -CX₂CX(CX₃)₂및 -C(CX₃)₃로 이루어진 군중에서 독립적으로 선택된다. 각 X는 독립적으로 H, F, Cl, Br 또는 I이다. 각 m은 독립적으로 0 또는 1이다. 각 n, o 및 p는 독립적으로 정수 0 내지 10이다.

하이브리드화 조건/엄격성

핵산 하이브리드화 분야의 숙련인은 하이브리드화의 엄격성을 부여하거나 조절하는데 통상 사용된 요인에는 포름아미드 농도(또는 기타 화학적 변성 시약), 염 농도(즉, 이온 강도), 하이브리드화 온도, 세제 농도, pH 및 카오트로프의 존재 또는 부재 여부가 포함된다는 것을 인식할 것이다. 프로브/표적 조합물에 대한 최적의 엄격성은 종종, 전술된 엄격성 요인들 몇개를 고정시킨 다음 단일 엄격성 요인의 다양성 효과를 결정함으로써 발견된다. 동일한 엄격성 요인을 조절함으로써 표적 서열에 대한 특정 검출 복합체의 프로빙 세그먼트의 하이브리드화의 엄격성을 조절할 수 있는데, 단 비-핵산 중합체(예: PNA)의 하이브리드화는 이온 강도와는 상당히 독립적이다. 특정 검정에 대한 최적의 엄격성은 목적하는 식별도가 달성될 때까지 각 엄격성 요인을 조사함으로써 실험적으로 결정할 수 있다.

전술한 엄격성 요인은 또한, 본 발명의 검출 복합체를 안정화시키거나 해리시키는데 적용할 수 있는데, 이는 이들이 어닐링되는 둘 이상의 성분 중합체를 포함하기 때문이다. 결과적으로, 엄격성 요인의 조절로 인해, 당해 검출 복합체 및/또는 표적 분자의 안정성을 조절 방식으로 우선적으로 조절할 수 있으므로써 부가의 이점과 이익을 달성할 수 있게 해준다. 예를 들면, 그 밖의 고도로 구조화된 핵산을 저염 조건 하에서 실질적으로 해리될 수 있는데, 여기서 검출 복합체는 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체(예: PNA)이기 때문에 안정성을 보존하도록 고안될 수 있다. 이들 조건 하에서, 검출 복합체의 PNA 프로빙 세그먼트는, 고도로 구조화된 영역에 통상 묻힐 수도 있고 통상적으로 핵산 프로브에 접근이 불가능할 수도 있는 표적 서열과 보다 용이하게 반응할 것이다.

안정한 하이브리드화 조건

일반적으로, 핵산 오염을 유발시키는 보다 밀접하게 관련된 배경은 표적 서열에 대한 것이고, 보다 주의 깊게 엄격성이 조절되어야만 한다. 블록킹 프로브를 또한, 엄격성 요인을 단순히 최적화시킴으로써 가능한 한계를 벗어난 식별력을 향상시키기 위한 수단으로서 사용할 수 있다. 따라서, 적합한 하이브리드화 조건은, 특정 검정이 정확하고도(검정에 대해 목적하는 내성 내임) 재생 가능한 결과를 가져다 주도록 목적하는 식별 수준이 달성되는 조건을 포함할 것이다. 단지 통상적인 실험과 본원에 제공된 기재 내용에 의거하여, 당해 분야의 숙련인은 본원에 기재된 방법, 키트 및 조성물을 이용하여 검정을 수행하는데 적합한 하이브리드화 조건을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

블록킹 프로브

블록킹 프로브는 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 비-표적 서열에 결합하는 것을 억제시키는데 사용될 수 있는, PNA, 핵산 또는 비-핵산 프로브이다. 바람직한 블록킹 프로브는 PNA 프로브이다[참조: Coull et al., WIPO 공보 No. WO98/24933]. 전형적으로, 블록킹 프로브는 프로빙 세그먼트와 밀접하게 관련이 있고 바람직하게는, 이들은 프로빙 세그먼트의 점 돌연변이를 포함한다. 블록킹 프로브는 비-표적 서열에 대한 하이브리드화에 의해 작동함으로써 프로빙 세그먼트와 비-표적 서열 간의 하이브리드화에 의해 형성되는 것 보다 더 열역학적으로 안정한 복합체를 형성하는 것으로 간주된다. 보다 안정하고도 바람직한 복합체의 형성은 프로빙 세그먼트와 비-표적 서열 간의 덜 안정하고도 바람직하지 못한 복합체의 형성을 차단한다. 따라서, 블록킹 프로브는 특정 검출 복합체의 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 비-표적 서열에 결합하는 것을 억제시키기 위해 본 발명의 방법, 키트 및 조성물에 함께 사용될 수 있다.

III. 본 발명의 조성물

A. 프로브 및 프라이머 검출 복합체(검출 복합체):

한 양태에 있어서, 본 발명은 검출 복합체에 관한 것이다. 검출 복합체는 둘 이상의 성분 중합체의 하이브리드이다. 이러한 검출 복합체의 성분 중합체 중의 둘 이상은 공여체와 수용체 잔기 세트(비이컨 세트)로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하지만, 검출 복합체는 하나 이상의 비이컨 세트를 포함할 수 있다. 성분 중합체는 상호작용기의 상호작용에 의해 검출 복합체를 형성하도록 고안된다. 이러한 검출 복합체는 하나 이상의 링커 및/또는 하나 이상의 스페이서 잔기를 포함할 수 있는데, 이는 특정 적용 분야에 적합한 검출 복합체를 작제하는데 유용할 수 있기 때문이다.

각 검출 복합체는 하나 이상의 프로빙 중합체와 하나 이상의 어닐링 중합체를 포함한다. 이러한 프로빙 중합체는 표적 서열 또는 프라이밍 부위에 대한 프로빙 세그먼트의 하이브리드화의 결과로서 표적 분자를 검출하는데 적합한 서브유닛의 서열을 함유한다. 전형적으로, 상기 어닐링 중합체의 1차적인 용도는 당해 검출 복합체를 형성하는 것일 것지만, 특정 양태에서는 이러한 어닐링 중합체가 관심있는 상이한 표적 분자를 검출하는데 적합한 누클레오염기 서열을 함유할 수도 있다. 상호작용기는 프로빙 중합체(들)가 어닐링 중합체(들)에 어닐링되게 함으로써 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시킨다. 적당한 상호작용기를 사용하여 프로빙 중합체와 어닐링 중합체의 어떠한 조합물도 작제할 수 있다. 더욱이, 프로빙 및 어닐링 중합체는 PNA, DNA, RNA, 키메릭 올리고머 또는 연결된 중합체일 수 있지만, 단 성분 중합체들 중의 하나 이상이 비-핵산 중합체여야 한다. 바람직하게는, 이러한 비-핵산 중합체가 펩티드 핵산(PNA)이다.

도 1a를 참조하면, 단일 공여체 잔기와 단일 수용체 잔기를 포함하는 검출 복합체의 간단한 예가 도시되어 있다. 이러한 검출 복합체는 단일 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기를 포함하고 있으며, 이들 각각은 상이한 성분 중합체에 연결되어 있다(즉, 단일 비이컨 세트). 도시된 바와 같이, 상호작용기(21과 상호작용하는 20)는 프로빙 중합체(30) 및 어닐링 중합체(31)의 누클레오염기 서열을 포함한다. 이러한 검출 복합체는 상기 상호작용기의 상호작용에 의해 형성되고 안정화된다. 도시된 바와 같이, 어닐링 중합체(31)는 프로빙 중합체(30)과 안정한 복합체를 형성하는데 필요한 상호작용기(21) 만을 포함하므로, 어닐링 중합체(31)는 프로빙 중합체(30) 보다 더 짧다. 프로빙 중합체(30)는 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 안정한 하이브리드를 형성해야만 하기 때문에, 종종 프로빙 중합체(30)가 어닐링 중합체(31) 보다 더 길게 고안될 것이다.

도 1b를 참조하면, 보다 정교한 검출 복합체의 예가 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 이러한 검출 복합체는 두 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기(즉, 두 비이컨 세트)를 포함한다. 하나의 비이컨 세트는 잔기(3 및 5)를 포함하는 반면, 제2의 비이컨 세트는 잔기(4 및 6)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 각 중합체는 두 세트의 상호작용기(23과 상호작용하는 22; 25와 상호작용하는 24)을 포함하는데, 여기서 하나의 상호작용기는 프로빙 중합체(32)와 어닐링 중합체(33) 각각의 각 말단에 위치한다. 상호작용기는 당해 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시킨다. 도시된 바와 같이, 프로빙 중합체(32)와 어닐링 중합체(33)의 중앙에서의 세그먼트는 상호작용하지 못하므로 각 성분 중합체의 비-상호작용성 세그먼트가 불록 솟아있다(26).

도 1c를 참조하면, 보다 정교한 검출 복합체의 예가 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 이러한 검출 복합체는 세 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기(즉, 세 비이컨 세트)를 포함한다. 하나의 비이컨 세트는 잔기(7 및 10)를 포함하고, 제2 비이컨 세트는 잔기(8 및 11)를 포함하며 제3 비이컨 세트는 잔기(9 및 12)을 포함한다. 이러한 검출 복합체는 3개의 중합체를 포함하는데, 이들 중 단지 1개만이 프로빙 중합체(34)로서 고안된다. 이러한 예시에서는, 다른 2개의 중합체가 어닐링 중합체(35 및 36)이다. 도시된 바와 같이, 각 중합체는 두 세트의 상호작용기(41과 상호작용하는 40; 43과 상호작용하는 42; 45와 상호작용하는 44)을 포함하는데, 여기서 하나의 상호작용기는 프로빙 중합체(34)와 어닐링 중합체 각각(35 및 36)의 각 말단에 위치한다. 검출 복합체는 이러한 상호작용기의 상호작용에 의해 형성되고 안정화된다. 도시된 바와 같이, 프로빙 중합체(34)와 어닐링 중합체(35 및 36)의 중앙에서의 세그먼트는 상호작용하지 못하므로 각 성분 중합체의 비-상호작용성 세그먼트가 불록 솟아있다(26).

본 발명의 검출 복합체는 주로, 성분 중합체의 하나 이상의 세그먼트가 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화됨에 따른 직접적 또는 간접적인 결과로서 해리되도록 고안된다. 결과적으로, 당해 검출 복합체는 관심있는 샘플에 존재할 수 있는 관심있는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 이때, 샘플 중에서의 관심있는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양은, 검출 복합체의 해리를 표적 서열에 대한 성분 중합체의 하이브리드화와 직접적 또는 간접적으로 상관지음으로써 결정할 수 있다. 이러한 검출 복합체의 성분 중합체는 바람직하게 해리될 것이기 때문에, 상이한 중합체에 독립적으로 부착되는 공여체 잔기와 수용체 잔기는 분자상 비이컨(PNA 또는 핵산) 또는 선형 비이컨 등의 단일분자상 "비이컨" 프로브와 비교해서 공간상 훨씬 더 떨어지게 될 수 있다[단일분자상 "비이컨" 프로브의 예로는 헤어핀 형성 핵산 분자상 비이컨(참조: Tyagi et al., Tyagi2 et al., and Tyagi3 et al.), PNA 분자상 비이컨(참조: USSN 08/958,532(허여됨) 및 계류중인 USSN 09/179,298: 둘다 본원에 참조문헌으로 삽입됨) 및 선형 비이컨(참조: 계류중인 USSN 09/179,162; 본원에 참조문헌으로 삽입됨)이 있다]. 그 결과, 공여체 잔기와 수용체 잔기 간의 거리에 비례하는 에너지 전달 효율은 단일분자상 "비이컨" 프로브와 비교해서 훨씬 더 실질적으로 변화될 것인데, 여기서 공여체 잔기와 수용체 잔기가 동일한 중합체에 연결되므로 공간상 무한정 떨어질 수는 없다. 따라서, 본 발명의 검출 복합체는 단일분자상 작제물에 비해 실재적으로 비교되는 이점을 보유하고 있다.

주로 해리되도록 고안되긴 하였지만, 검출 복합체의 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트는 상기 검출 복합체가 해리되는지의 여부와 상관없이 표적 서열과 하이브리드화되기 때문에 공여체 잔기와 수용체 잔기 간의 거리가 간단히 변화될 수 있다. 단, 본래의 검출 복합체가 표적 분자의 표적 서열과 추가로 복합체를 형성하는 경우와 비교해서, 본래의 검출 복합체에서 검출가능한 수준으로 상이한 세트의 하나 이상의 구성원의 한 가지 이상의 물리적 성질이 검출가능한 수준으로 변화된다면, 본 발명의 검출 복합체는 이러한 검출 복합체가 해리되는 경우일지라도 특정 샘플에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 결정하는데 사용될 수도 있다.

예로써, 본 발명에 따라서 수행된 전형적인 검정은 이러한 검정 동안의 형광 증가를 결정하는 것을 포함할 수도 있는데, 여기서는 형광 증가가 검출 복합체가 해리되는지의 여부와 상관없이 표적 서열에 대한 프로빙 세그먼트의 하이브리드화와 상관이 있다. 결과적으로, 이때 형광 세기의 변화는 상기 샘플에 존재하는 표적 서열의 존재, 부재 또는 양과 상관있을 수 있다. 더욱이, 표적 서열의 존재, 부재 또는 양은 관심있는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관있을 수 있다. 전형적으로, 표적 서열 또는 표적 분자의 정량은 대표적 샘플 중에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 공지된 양과 표준 검정을 사용하여 발생된 표준 곡선과 비교함으로써 이루어질 것이다.

프로빙 중합체:

프로빙 중합체는 하나 이상의 프로빙 세그먼트를 포함한다. 당해 검출 복합체의 프로빙 세그먼트는 당해 작제물의 서열 특이적 인식 부분이다. 따라서, 프로빙 세그먼트는 적합한 하이브리드화 조건하에서 특이적 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화되도록 고안된 서브유닛을 함유하는 누클레오염기 서열이다. 핵산 분자상 비이컨과는 달리, 검출 복합체의 일정 부분이 자가-하이브리드화를 위해 특정하게 고안될 필요는 없다. 따라서, 완전한 프로빙 중합체는 상호작용기가 프로빙 세그먼트에 통합되는 프로빙 세그먼트를 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 프로빙 중합체는 프로빙 세그먼트와 하나 이상의 상호작용기 모두를 함유할 수 있는데, 여기서 이러한 상호작용기는 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화하지 않거나 이들과 상호작용하지 않는다.

프라이밍 세그먼트:

프로빙 중합체의 요구 조건을 심각히 고려해 보면, 프로빙 세그먼트의 길이는 일반적으로, 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이밍 부위 간에 안정한 복합체가 형성되도록 선택될 것이다. 본 발명의 실시예 적합한 프로빙 세그먼트는 일반적으로 길이가 5 내지 50서브유닛이다. 바람직하게는, 이러한 프로빙 세그먼트는 길이가 7 내지 25서브유닛일 것이다. 가장 바람직하게는, 프로빙 세그먼트는 길이가 12 내지 20서브유닛일 것이다.

검출 복합체의 프로빙 세그먼트는 일반적으로, 표적 서열에 상보적인 누클레오염기 서열을 가질 것이다. 또 다른 한편, 실질적으로 상보적인 프로빙 세그먼트가 사용될 수도 있는데, 이는 상기 프로브와 표적 서열 간에 단일 점 돌연변이(염기 부정합)이 존재하는 프로브를 이용하는 경우에 보다 큰 서열 식별을 획득할 수 있는 것으로 입증되었기 때문이다[참조: Guo et al., Nature Biotechnology 15:331-335(1997)].

어닐링 중합체:

하나 이상의 어닐링 중합체를 프로빙 중합체에 어닐링시킴으로써 검출 복합체를 형성시킨다. 따라서, 어닐링 중합체는 몇몇 양태에서는, 검출 복합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 또 다른 한편, 어닐링 중합체는 그 자체가 제2 프로빙 중합체와 같이 정보 함유 중합체일 수 있다. 결과적으로, 이러한 검출 복합체는 하나 이상의 프로빙 중합체로 작제할 수 있는데, 여기서 각 프로빙 중합체는 또한 다른 프로빙 중합체에 대한 어닐링 중합체이다. 최소한, 어닐링 중합체는 프로빙 중합체에 어닐링되는 경우에 검출 복합체의 형성에 필요한 상호작용기를 포함하지만, 검출 복합체의 하나 이상의 어닐링 중합체는 비이컨 세트의 하나 이상의 연결된 구성원을 가져야만 한다.

상호작용기:

상호작용기는 검출 복합체를 형성하고 안정화시키는 성분 중합체(들)의 잔기이다. 이러한 상호작용기는 완전한 프로빙 및/또는 어닐링 중합체(들)을 포함한다. 또 다른 한편, 상호작용기는 프로빙 및/또는 어닐링 중합체(들) 각각의 서브유닛의 아세트 만을 포함할 수 있다.

상호작용기는 형광단 및 소광인자 등과 같은 소수성 잔기일 수 있거나 또는 기타 친지성 잔기와 협력하여 형광단(들)과 소광인자(들) 모두를 포함할 수 있다. 다른 양태에서는, 이러한 상호작용기가 염 쌍을 형성하는 이온화기일 수 있다. 이러한 염 쌍의 한 예가 하나 이상의 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기의 음성적으로 하전된 측쇄 카르복실산기(들)과 쌍을 이룬 하나 이상의 라이신 잔기의 양성적으로 하전된 ε-아미노기(들)의 상호작용을 포함할 것이다(전하는 생리학적 pH를 기준으로 함). 또 다른 양태에 있어서, 상호작용기는 수소 결합 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 양태에서는, 상호작용기가 성분 중합체의 누클레오염기 서열 전부 또는 일부분의 상보적 누클레오염기이다. 검출 복합체의 형성 및 안정성은 불가피하게, 성분 중합체의 모든 잔기의 소수성, 이온 및 수소 결합 특성 모두에 의해 영향을 받을 것이다.

상호작용기는 프로빙 및 어닐링 중합체 각각의 한 말단에만 위치할 수 있다(예: 도 1a). 또 다른 한편, 상호작용기는 성분 중합체 각각의 양 말단에 연결시킨다(예: 도 1b ＆ 1c). 기타 양태에서는, 상호작용기가 성분 중합체 중의 하나 이상에 대해 내부적일 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 성분 중합체 내의 중앙에 위치함).

바람직한 양태에서는, 당해 검출 복합체가 단일 프로빙 중합체와 단일 어닐링 중합체로부터 형성된다. 보다 바람직하게는, 어닐링 중합체의 서브유닛 모두가 프로빙 중합체의 서브유닛의 일부분과만 상호작용한다(예: 도 1a). 가장 바람직한 양태에서는, 당해 검출 복합체의 형성과 안정성이 성분 중합체의 서브유닛의 상보적인 누클레오염기의 상호작용에 의해 주로 결정된다.

도 1b 및 1c를 참조하면, 검출 복합체의 둘 이상이 불록 솟아있을 수 있는데(26), 이는 성분 올리고머의 세그먼트가 특정 링커에 의해 연결되기 때문이다. 이러한 링커는 전형적으로 상호작용기를 함유하지 않기 때문에, 이들 성분 중합체의 세그먼트는 고안으로써 상호작용하지 못한다. 예를 들면, 본 명세서의 실시예 13 ＆ 14에 논의된 검출 복합체 중의 하나가 2개의 연결된 올리고머 세그먼트를 갖는 PNA 성분 중합체로부터 형성된다. 또 다른 한편, 간단히 불록 솟아있을 수 있는데,이는 성분 중합체의 누클레오염기가 비-상보적이므로 상호작용되지 않기 때문이다.

염기 쌍 형성 모티브:

상호작용기가 누클레오염기를 포함하는 경우, 검출 복합체의 둘 이상의 성분 중합체의 안정한 복합체를 형성하게 될 모든 염기 쌍 형성 모티브를 이용하여 검출 복합체를 형성시킬 수 있다. 적합한 염기 쌍 형성 모티브의 비-제한적인 예로는 이중체, 삼중체 뿐만 아니라 기타 다중체 및 보다 고차수의 구조물이 있는데, 여기서는 핵산, 핵산 동족체, 핵산 유사체, 키메라 및/또는 연결된 중합체를 채택하여 복합체를 형성할 수 있다.

평형 인자:

검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체는 복합체 형성에 선호되는 조건 하에서 성분 중합체들을 혼합함으로써 용액 중에서 형성된 하이브리드이다. 이러한 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 형성하기 위해 가해진 각 성분 중합체의 양을 산정하고 조절할 수 있기 때문에, 복합체 형성/해리 정도는, 당해 검정에 존재하는 둘 이상의 성분 중합체의 양과 농도를 조정함으로써 비이컨 세트의 양 구성원이 연결된 단일분자상 프로브를 사용한 경우에는 가능하지 않는 방식으로 배경을 감소시킴으로써 조작 또는 조절할 수 있다.

단일 형광단을 함유하는 프로빙 중합체, 및 단일 소광인자 잔기를 함유하는 어닐링 중합체가 1:1의 비율(소정의 농도에서임)로 혼합된 경우에는 95% 연결되지만, 1:5의 비율(소정의 농도에서임)로 혼합된 경우에는 99.9% 연결된다면, 1:1 비율을 포함하는 샘플은 용액 중에서 유리된 5% 형광성 표지된 프로빙 중합체에 기인하는 실재적인 배경 형광성을 지닐 것이다. 그러나, 1:5 비율을 포함하는 샘플은 실질적으로 덜 고유한 형광성을 지닐 것인데, 이는 거의 모든 형광단 함유 중합체가 소광인자 잔기 함유 어닐링 중합체와 완벽하게 복합체를 형성하기 때문이다. 결과적으로, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 함유하는 어떠한 용액의 배경 형광도 성분 중합체의 상대비와 농도를 변화시킴으로써 하이브리드 형성 정도를 조정함으로써 조정할 수 있다.

성분 중합체 중의 하나를 표적 서열에 결합시킴으로써, 본 발명의 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 이용하는 검정의 배경 형광을 또한 바람직하게 조절할 있다. 상기 예 분석을 확대하면, 본 발명자들은 표적 서열에 대한 샘플을 분석하기 위해 사용된 용액이 1:1 비율의 프로빙 중합체와 어닐링 중합체를 포함함으로써 검출 복합체를 95% 함유하는 용액을 생성시키는 것으로 추정할 것이다. 본 발명자들이 프로빙 중합체의 80%가 상기 샘플의 표적 서열에 우선적으로 어닐링됨으로써 당해 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 해리시키는 것으로 추정한다면, 이때 이러한 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 형성하기 위해 용액 중에서 여전히 유리되는 프로빙 중합체와 어닐링 중합체의 상대비가 1:5이다(이때, 모든 형광단 함유 프로브는 소광인자 함유 프로브와 99.9% 연결되어 있다). 이러한 평형 이동으로 인해, 상기 시스템의 배경 형광이 상당히 감소될 것이다. 이로써, 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 형성하기 위한 조성물 및 방법을 현명하게 선택하는 것이 본 발명의 실시를 증진시킬 것이다. 더우기, 본래의 PNA와 같은 비-핵산 중합체가 핵산이 그러한 경우보다 핵산에 보다 강력하게 결합되기 때문에, 검출 복합체의 성분 중합체로서 하나 이상의 PNA 중합체를 사용하는 것이 특히 유리한데, 이는 검출 복합체를 거의 완벽하게 형성하는 쪽으로 평형을 구동시키는데에는 덜 과량의 중합체가 필요하기 때문이다.

검출 복합체, PCR 복합체 및 기질 복합체의 형성 및 안정성

여러 가지 유형의 상호작용기가 존재하고 어셈블리된 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 안정성/불안정성에 기여하도록 성분 중합체를 작제할 수 있다("상호작용기" 제목의 섹션에서의 논의 참조). 전형적으로, 이러한 성분 중합체의 조성은 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체가 예정된 조건 하에서 안정적이고 예정된 조건 하에서 해리되도록 현명하게 선택한다. 일반적으로, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 안정성 및 불안정성에 대한 열역학적 파라미터는 융점을 조사함으로써 결정할 수 있는데, 이는 당해 분야의 숙련인은 Tm 분석이 둘 이상의 중합체의 하이브리드의 형성과 해리에 대한 △H, △S 및 △G 값을 결정하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이기 때문이다. 이러한 실시는 너무나 통상적이며, 자동화 기기를 수반하는 소프트웨어가 전형적으로 장착되어 Tm 수행 후에 △H, △S 및 △G 값을 유도시킨다. 적당한 안정성의 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 선택하는 것이 특정 샘플을 실시간으로 종점 분석하기 위한 검정을 고안하는데 필수적이다. 그러나, 실시간 분석은, 검출가능한 신호 변화가 표적 독립적인 해리를 유도하는 조건이 기인되는 것이 아니라 표적 서열 또는 표적 분자의 존재에 적절하게 기인되도록 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체가 유리되어 형성되는 조건 하에서 이루어져야 한다는 것이 중요하다. 본원에 제공된 기재 내용을 이용하여, 당해 분야의 숙련인은 특정한 적용 분야에 적합한 안정성/불안정성의 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 형성하기 위한 중합체를 고안하는 단지 통상적인 실험 만을 요구할 것이다.

상호작용기의 조성이 당해 복합체의 안정성/불안정성에 영향을 미치는데 사용되는 주요 요인이긴 하지만, 프로빙 중합체의 길이와 조성이 복합체 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로 언급하면, 하이브리드화는 협력해야 하는 사건이기 때문에, 프로빙 세그먼트를 표적 서열 또는 프라이밍 부위에 하이브리드화하는 것은 이에 연결된 상호작용기의 상호작용에 입체적으로 또는 기능적으로 영향을 미칠 수 있다. 결과적으로, 이들 유형의 2차적인 효과는 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 성분 중합체의 조성을 선택할 때 고려될 것이다.

바람직하게는, 당해 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체는, 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이머 부위와의 상호작용이 직접적으로 또는 간접적으로 복합체 해리를 가져다줄 때까지 안정한 작제물로서 존재하도록 고안된다. 결과적으로, 이러한 검출 복합체는 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이머 부위 간의 하이브리드 형성이 직접적으로 상기 복합체의 해리를 유발시키도록 고안될 수 있다. 또 다른 한편, 당해 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체는 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이밍 부위 간의 안정한 하이브리드 형성이 상기 검출 복합체를 직접적으로 해리시키지는 않지만 2차적인 "촉발" 사건의 작동에 의해 일어나도록 고안될 수 있다.

당해 검출 복합체가 표적 서열에 대한 프로빙 세그먼트의 하이브리드화시 직접적으로 해리되도록 고안되는 경우, 일반적으로 이러한 복합체는, 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이밍 부위 간의 하이브리드가 검출 복합체를 안정화시키는 상호작용의 본질 보다 더 열역학적으로 안정하도록 고안된다. 이러한 양태에서는, 검출 복합체가 일반적으로, 프로빙 중합체의 상호작용기를 포함하는 서브유닛의 적어도 일정 부분이 프로빙 세그먼트와 표적 서열 간의 하이브리드 형성에 또한 기인하도록 작제된다. 동일한 기가 하나의 하이브리드를 포함하거나 선호되는 열역학적 고려사항과 조합될 때 다른 것을 포함하는 요구 조건으로 인해, 검출 복합체가 직접적으로 해리될 것이다. 이러한 양태는 직접적인 해리로서 지칭되며, 당해 검출 복합체가 프라이머로서 사용된 경우와 비교해서 프로브로서 사용되는 경우에 가장 바람직하다.

프로빙 세그먼트를 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화시킨 후에 당해 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 본래대로 유지하고자 하는 경우에는, 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이밍 부위 간의 하이브리드 형성에 기여하는 프로빙 중합체의 상호작용기가 전형적으로 전혀 존재하지 않는다. 이러한 이유로 인해, 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이밍 부위로부터 형성된 하이브리드의 열역학적 안정성은 전형적으로, 검출 복합체를 형성하는 상호작용기의 열역학적 안정성과 상관이 없다. 결과적으로, 당해 검출 복합체는 2차 "촉발" 사건이 상호작용기의 상호작용을 파괴시킴으로써 검출 복합체의 해리를 유발시키도록 일반적으로 작제된다. 검출 복합체는 2차 "촉발" 사건이 일어날 때까지 예정된 검정 조건 하에서 열역학적으로 안정하기 때문에, 이로써 상기 2차 사건의 본질이, 이러한 2차 "촉발" 사건의 활성을 표적 서열의 존재, 부재 또는 양과 정확하게 상관짓는데 사용될 수 있는 방식으로 복합체의 해리를 유발시킨다. 이러한 양태는 본원에서 간접적 해리로서 지칭되며, 당해 검출 복합체가 프로브로서 사용되는 경우와 비교해서 프라이머로서 사용되는 경우에 가장 바람직하다.

예로써, 검출 복합체의 유전적 작제물이 도 2에 도시되어 있다. 검출 복합체는 프로빙 중합체의 조성에 따라서 프로빙 세그먼트가 표적 서열 또는 프라이밍 부위에 하이브리드화될 때 어셈블린된 채로 있거나 해리될 수 있다. 도 2A를 참조하면, 잔기 A 또는 B는 공여체 잔기 또는 수용체 잔기로서 독립적으로 선택되는데, 단 1. A가 공여체 잔기인 경우에는, B가 수용체 잔기이고; 2. A가 수용체 잔기인 경우에는, B가 공여체 잔기이다. 테테르(13 및 14)는 공여체 잔기와 수용체 잔기를 각각의 성분 중합체에 연결시키는 스페이서 잔기이다. 상호작용기(15 및 16)는 검출 복합체를 형성 및 안정화시키도록 상호작용된다. 연결물(17)은 단지 세그먼트(18)와 프로빙 중합체(37)의 상호작용기(들)(15) 간을 구별하는데만 사용된다. 도시된 바와 같이, 당해 검출 복합체는 세그먼트(18)가 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드를 형성하는데 적합한 조건 하에서 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자(19)와 접촉시킨다.

이러한 예시에서는, 검출 복합체의 해리가, 프로빙 세그먼트가 프로빙 중합체(37)의 세그먼트(15 및 18)를 모두 포함하는지의 여부 또는 프로빙 세그먼트가 세그먼트(18) 만을 포함하는지의 여부에 좌우된다. 경로 I에 의하면, 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체는 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화되지만(하이브리드화 사건), 프로빙 세그먼트가 세그먼트(18) 만을 포함하기 때문에 해리되지는 않는다. 세그먼트(15)의 하나 이상의 서브유닛이 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 상호작용하도록 고안되지 않았기 때문에 해리가 일어나지 않는데, 이로써 작용기에 어떠한 스트레스도 적용되지 않아 완전한 해리를 야기시킨다. 그럼에도 불구하고, 이러한 검출 복합체는 2차 "촉발" 사건을 검출하는데 사용될 수 있거나, 또는 하이브리드화 사건으로부터 발생되는 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원으로부터의 검출가능한 신호의 변화가 수반되는 경우에 표적 서열에 대한 프로빙 세그먼트의 하이브리드화에 대한 측정 수단으로서 사용될 수 있다. 본 명세서의 실시예 15는 하이브리드화 사건과 PCR 반응에 의해 생성된 핵산 양과의 상관관계의 타당성과 유용성을 입증해준다(즉, 2차 "촉발" 사건은 PCR이다).

경로 II에 의하면, 검출 복합체는 하이브리드화 사건의 결과로서 해리되는데, 이는 프로빙 세그먼트가 세그먼트(15 및 18)을 모두 포함하기 때문이다. 고안에 의하면, 프로빙 세그먼트와 표적 서열 또는 프라이밍 부위 간에 형성된 복합체가 열역학적으로 선호된다. 상기 표적과 세그먼트(18)에 의한 초기 상호작용으로 인해 프로빙 중합체의 전체 상보 서열이 협력하여 결합될 것이기 때문에, 이러한 상호작용은 필수적으로 어닐링 중합체(38)의 방출과 검출 복합체의 해리를 야기시킬 것이다. 따라서, 이러한 양태의 검출 복합체의 해리가 관심있는 샘플에 존재하는 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하는데 보다 직접적인 방법으로서 사용될 수 있다. 본 명세서의 실시예 14는 검출 복합체가 프로브로서 사용될 수 있다는 것을 입증해준다.

경로 I 도식은 핵산 분자상 비이컨 및 이와 관련된 단일분자상 "비이컨" 프로브에 비해 몇몇 이점을 지니고 있다. WO95/13399 및 WO97/06208에 기재된 작제물이 표적 서열에 대한 하이브리드화를 직접적이고도 특이적으로 검출하는데 특정하게 이용된다[pages 9-10, bridging paragraph 참조]. 게다가, WO95/13399에 기재된 작제물은 PCR 반응 중의 프라이머들 중의 하나로 고안되지 않는다[참조: pages41-42, bridging paragraph]. 구체적으로 언급하면, 검출가능한 신호가 상기 검정에서 생성되기 전에 2차 "촉발" 사건이 일어나야만 하는 요구 조건은 이러한 검정에 제2의 식별 수준을 부가해준다. 이러한 제2의 식별 수준은 비-표적 분자 및 비-표적 서열에 대한 프로빙 중합체의 비-특이적 결합과 같은 비-특이적 사건에 의해 유발된 신호의 발생을 저하시켜야 한다. 그 결과, 2차 "촉발" 사건의 발생과 커플링된 하이브리드화에 반응하여 신호를 생성하도록 고안된 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 이용하는 검정은 보다 신뢰성 있고, 정확하며 재생 가능한 결과를 가져다주어야 한다. 더욱이, 하나 이상의 비-핵산 중합체를 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체의 하나 이상의 성분 중합체로서 사용하는 것이 특히 유리한데, 이는 이들이 1) 효소적 분해에 적용되지 않으며; 2) 효소적 분해로부터 이들이 하이브리드화되는 핵산 중합체를 보호할 수 있으며; 3) 낮은 이온 강도에서 작동할 수 있고; 4) 하이브리드를 형성하는데 마그네슘을 필요로 하지 않으며; 5) 하이브리드를 매우 신속하고도 효율적으로 개정하고; 6) 보다 높은 서열 식별을 나타내기 때문인데, 이로써 핵산 분자상 비이컨 및 핵산 만을 포함하는 이와 관련된 작제물의 한계와 단점을 극복할 수 있다.

2차 "촉발" 사건

2차 "촉발" 사건에는 표적 서열 또는 프라이밍 부위에 대한 프로빙 세그먼트의 하이브리드화를 필요로 함으로써 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 간접적으로 해리시켜 주는 어떠한 작동도 포함된다. 2차 "촉발" 사건의 비-제한적 예에는 핵산 합성과 핵산 증폭 반응이 포함된다. 바람직한 양태에서는, 이러한 2차 "촉발" 사건이 폴리머라제 연쇄 반응이다. 바람직한 양태에서는, 프로빙 세그먼트와 표적 서열(프라이밍 부위) 간에 형성된 복합체가 폴리머라제에 대한 기질이다. 가장 바람직한 양태에서는, 폴리머라제 연장 반응이 PCR 증폭 반응에서 수행된다.

한 양태에서는, 형성되는 프로빙 중합체/표적 서열 복합체가 폴리머라제, 전사효소 또는 리가제와 같은 효소에 대한 기질일 수 있다[참조: 예를 들면, 도 2에 도시된 작제물]. 프로빙 중합체 또는 표적 서열은 프라이머로서 작용할 수 있기 때문에, 적합한 효소의 존재하 및 적합한 조건하에서 하이브리드화시, 프로빙 중합체/표적 서열 복합체는 촉매적 형질전환(예: 중합 반응, 전사 또는 연결 반응 등)을 진행할 것이다. 결과적으로, 이러한 적용을 위해서는, 프로빙 중합체가 일반적으로 핵산일 것인데, 이는 폴리머라제, 잔사효소 및 리가제가 이중쇄 핵산 복합체 상에서 작동되는 것으로 공지되기 때문이다. 그러나, 변형된 PNA 또는 키메릭 PNA는 또한, 특정 효소에 대한 기질인 것으로 공지되어 있는데, 단 이들은 필수 작용기를 포함한다[예를 들면, 3'-하이드록실기: 참조: Lutz et al.,J. Am. Chem. Soc., 119:3171-3178(1997)]. 따라서, 프로빙 중합체는 변형된 PNA 또는 PNA 키메릭 분자일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체가 하나의 핵산 프로빙 중합체와 하나의 비-핵산 어닐링 중합체로부터 작제된다. 가장 바람직하게는, 이러한 비-핵산 어닐링 중합체가 PNA이다.

다중 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기

다중 비이컨 세트는 본 발명의 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체 내로 용이하게 혼입할 수 있는데, 이는 개개의 성분 중합체가 다중성 표지를 혼입할 수 있는데, 여기서 개개의 성분 중합체의 상이한 표지 각각은 상이한 비이컨 세트의 구성원에 속한다. 예를 들면, 하나의 어닐링 중합체와 하나의 프로빙 중합체 각각은 양 말단에서 비이컨 세트의 공여체 형광단 또는 소광인자 수용체 잔기 중의 어느 하나로 표지시킬 수 있다. 결과적으로, 두 비이컨 세트는 단일 검출 복합체에 존재할 수 있다. 동일한 형광단 2개와 동일한 소광인자 잔기 2개가 존재한다고 가정하면, 3가지 이상의 조합물이 검출 복합체에 대해 존재한다. 한 조합물에서는, 양 형광단을 프로빙 중합체에 부착시키고 양 소광인자를 어닐링 중합체에 부착시킨다. 두 번째 조합물에서는, 양 소광인자를 프로빙 중합체에 부착시키고 양 형광단을 어닐링 중합체에 부착시킨다. 세 번째 조합물에서는, 하나의 형광단과 하나의 소광성 잔기를 프로빙 중합체에 부착시키고 하나의 형광단과 하나의 소광성 잔기를 어닐링 중합체에 부착시키는데, 단 각 비이컨 세트의 구성원은 어셈블리된 검출 복합체 내에서 상호작용된다.

기타 양태에서는, 형광단이 상이하다. 바람직하게는, 각 비이컨 세트에 사용된 상이한 형광단은 독립적으로 검출 가능하다. 결과적으로, 둘 이상의 독립적으로 검출가능한 공여체 및/또는 수용체 잔기를 함유하는 다중 비이컨 세트가 훨씬 더 다양하게 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 유용하게 적용할 수 있게 해준다. 바람직한 양태에서는, 이들 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체가 다중체 검정에서 사용하기에 특히 적합한데, 여기서 독립적으로 검출가능한 형광단 각각으로부터의 검출가능한 신호는 동일한 검정에서 상이한 표적 서열의 존재, 부재 또는 양과 상관있을 수 있다.

다중 형광단을 포함하는 검출 복합체의 몇몇 대표적인 예가 도 3a 내지 3c에 제시되어 있다. 도 3a 내지 3c를 참조하면, 각 검출 복합체의 성분 중합체는 양 말단에 존재하는 상호작용기로 나타내는데, 여기서 각 중합체의 중간 세그먼트는 상호작용하지 않으므로 결과적으로, 불록 솟아 올라온 것(26)으로 나타낸다.

이러한 예의 경우에는, 검출 복합체가 일반적으로 도 1b에 기재된 유형의 것이지만, 검출 복합체의 다른 양태를 이용할 수 있다. 도 3a 및 3b를 참조하면, 각 검출 복합체는 2개의 소광인자 잔기(Q)를 포함하는데, 여기서 각 소광인자는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 제1 공여체 형광단(F1) 및 제2 공여체 형광단(F2)이 제시된다. 성분 중합체의 상호작용기(50)는 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시킴으로써, 공여체 형광단과 소광인자가 상호작용하도록 한다. 이들 예의 경우에는, 상기 복합체의 프로빙 중합체와 어닐링 중합체가 구별될 필요가 없다.

도 3a에 제시된 양태를 참조로 하면, 제1 공여체 형광단(F1)과 제2 공여체 형광단(F2) 모두를 하나의 성분 중합체의 반대편 말단에 연결시킨다. 결과적으로, 각 비이컨 세트의 소광인자 잔기를 기타 성분 중합체의 말단에 연결시킴으로써, 어셈블리된 검출 복합체에서의 적당한 공여체/수용체 세트의 공여체 형광단과 상호작용한다.

도 3b에 제시된 양태를 참조로 하면, 제1 공여체 형광단(F1)과 제2 공여체 형광단(F2)을 각각 2개의 상이한 성분 중합체에 연결시킨다. 소광인자 잔기(Q)를 또한, F1과 F2 각각에 소광성을 제공해주는 방향으로 2개의 성분 중합체 각각에 연결시킨다. 이러한 작제물은 다중체 검정에 특히 유용한데, 단 2개의 상이한 성분 중합체 각각은 관심있는 표적 분자의 상이한 표적 서열에 지시되는 프로빙 세그먼트를 포함하고, 프로빙 세그먼트/표적 서열 하이브리드에 기인하는 신호는 하이브리드화되지는 않지만 해리된 성분 중합체로부터 발생된 신호과 구별지을 수 있다. 일반적으로, 이는 매트릭스(예: 음이온 교환 매트릭스) 상에 핵산을 비-특이적으로 농축시킨 다음, 각 비이컨 세트의 독립적으로 검출가능한 잔기 중의 어느 하나 또는 둘 다로부터의 검출가능한 신호에 대한 매트릭스 만을 검정함으로써 수행할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 성분 중합체의 프로빙 세그먼트가 불록 솟아오른(26) 검출 복합체의 해당 부분을 포함한다.

또 다른 양태에서는, 세 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기를 이용할 수 있다. 도 3c에 제시된 양태를 참조로 하면, 당해 검출 복합체는 3개의 소광인자 잔기(Q)를 포함하는데, 여기서 각 소광인자는 동일하거나 상이할 수 있다. 검출 복합체는 또한, 제1 공여체 형광단(F3), 제2 공여체 형광단(F4) 및 제3 공여체 형광단(F5)을 포함한다. 제시된 바와 같이, 3가지 중합체의 상호작용기(50)는 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시킴으로써, 특정 세트의 공여체 형광단과 소광인자가 상호작용하도록 한다. 이들 예의 경우에는, 공여체와 어닐링 중합체가 구별될 필요는 없으나, 각 세트의 성분 공여체 잔기와 수용체 잔기의 현명한 선택과 위치가 목적하는 검출 복합체를 생성시킬 것이라는 상기 논의 사항에 따른다. 가장 바람직한 검출 복합체가 형성될 것이며, 이는 3개의 독립적으로 검출가능한 잔기 각각을 사용하여 동일한 검정에서 3개의 상이한 표적 서열의 검출에 유용할 것이다.

상기 논의된 원리는 다중 성분 중합체와 다중 세트의 공여체 및 수용체 잔기가 혼입되는 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체의 수 많은 대체 양태를 만드는데 사용할 수 있다. 독립적으로 검출가능한 형광단의 조합물이 본 발명의 검출 복합체에 대한 다중체 적용에 특히 유용하다. 독립적으로 검출가능한 다중 잔기와 조합되는 검출 복합체의 수 많은 대체 양태가 본 발명의 일부로서 고려된다.

B. 기질 검출 복합체

본 발명은 또한, 특정 효소에 대한 기질로서 작동할 수 있으므로 표적 독립적인 방식으로 검출가능한 신호의 변화를 발생시킬 수 있는 검출 복합체에 관한 것이다. 적합한 효소의 비-제한적인 예에는 전사효소, 리가제 또는 폴리머라제가 포함된다. 기질 검출 복합체는 둘 이상의 성분 중합체의 복합체이다. 기질 검출 복합체의 둘 이상의 성분 중합체는 공여체와 수용체 잔기 세트(비이컨 세트)로부터 하나 이상의 잔기를 포함하지만, 이러한 검출 복합체는 하나 이상의 비이컨 세트를 포함한다. 성분 중합체는 상호작용기의 상호작용에 의해 검출 복합체를 형성하도록 고안된다. 이러한 검출 복합체는 하나 이상의 링커 및/또는 하나 이상의 스페이서 잔기를 포함할 수 있는데, 이는 이들이 특정한 적용에 적합한 기질 검출 복합체를 작제하는데 유용할 수 있기 때문이다.

기질 검출 복합체는 전술된 검출 복합체와 매우 유사하지만, 단 이러한 기질 검출 복합체는 관심있는 표적 분자의 표적 서열 또는 프라이밍 부위와 하이브리드화되는 프로빙 세그먼트를 함유하지 않는다는 점에서 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체와 상이하다. 따라서, 기질 검출 복합체는 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자와 직접적으로 상호작용되지 않는다. 그러나, 기질 검출 복합체는 최소한, 둘 이상의 어닐링 중합체를 포함하는데, 여기서 하나 이상의 어닐링 중합체는 당해 검정에서 그 자체, 표적 서열이 아닌 당해 검정 중의 또 다른 어닐링 중합체 또는 또 다른 분자와 상호작용할 수 있음으로써, 특정 효소에 대한 기질을 형성한다. 둘 이상의 어닐링 중합체는 기질 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 상호작용기를 추가로 포함한다. 적당한 상호작용기를 사용하여 어떠한 어닐링 중합체의 조합물도 작제할 수 있다. 게다가, 이러한 어닐링 중합체는 PNA, DNA, RNA, 키메릭 올리고머 또는 연결된 중합체일 수 있다. 바람직하게는, 성분 중합체 중의 하나 이상은 비-핵산 중합체이다. 가장 바람직하게는, 이러한 비-핵산 중합체는 펩티드 핵산(PNA)이다.

도 20을 참조로 하면, 기질 검출 복합체의 비-제한적인 예가 제시되어 있다. 예시 20a를 참조로 하면, 기질 검출 복합체(90)는 2개의 어닐링 중합체(80 및 81)로 구성된다. 잔기 A 또는 B가 독립적으로, 공여체 잔기 또는 수용체 잔기로서 선택되는데, 단 1) A가 공여체 잔기이면, B는 수용체 잔기이고; 2) A가 수용체 잔기이면, B는 공여체 잔기이다. 테테르(83 및 84)는 공여체 잔기와 수용체 잔기를 각각의 성분 중합체에 연결시키는 스페이서 잔기이다. 상호작용기(85 및 86)는 상호작용하여 기질 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시킨다. 예시된 바와 같이, 성분 어닐링 중합체(81)는 헤어핀 루프(88)를 포함함으로써 세그먼트(86 및 87)의 누클레오염기 간의 상보적 염기 쌍 형성 결과로서 축을 형성한다. 더욱이, 전사효소, 리가제 또는 폴리머라제 등의 효소에 이용 가능한 유리 3' 또는 5'-하이드록실 말단(89)이 있다. 폴리머라제(예: Taq 폴리머라제)가 적합한 조건하에서 기질 검출 복합체 상에서 작용하여 3'-하이드록실기로부터 연장된다고 가정하면, 이러한 폴리머라제는 어닐링 중합체(81)의 말단에 대해 판독함으로써 성분 중합체(80)를 전위시키고 기질 검출 복합체를 해리시킬 것이다.

예시 20b를 참조로 하면, 또 다른 예의 기질 검출 복합체(91)는 3개의 성분 어닐링 중합체(80, 92 및 93)로 구성될 수 있다. 잔기 A 또는 B가 독립적으로, 공여체 잔기 또는 수용체 잔기로서 선택되는데, 단 1) A가 공여체 잔기이면, B는 수용체 잔기이고; 2) A가 수용체 잔기이면, B는 공여체 잔기이다. 테테르(83 및 84)는 공여체 잔기와 수용체 잔기를 각각의 성분 중합체에 연결시키는 스페이서 잔기이다. 상호작용기(85 및 86)는 상호작용하여 기질 검출 복합체를 형성하고 이를 안정화시킨다. 예시된 바와 같이, 성분 어닐링 중합체(92)는 양 성분 중합체(80 및 93)과 하이브리드화되지만, (80 및 93)은 직접적으로 상호작용되지 않는다. 기질 검출 복합체(90)와 비교함으로써, 이러한 양태는 헤어핀 루프를 포함하지 않는데, 이는 상이한 성분 중합체(92 및 93) 각각의 세그먼트(94 및 95) 간의 상보적 염기 쌍 형성으로부터 축이 발생되기 때문이다. 기질 검출 복합체(91)는 전사효소, 리가제 또는 폴리머라제 등의 효소에 이용 가능한 유리 3' 또는 5'-하이드록실 말단(96)이 있다. 폴리머라제(예: Taq 폴리머라제)가 적합한 조건하에서 기질 검출 복합체 상에서 작용하여 3'-하이드록실기로부터 연장된다고 가정하면, 이러한 폴리머라제는 어닐링 중합체(92)의 말단에 대해 판독함으로써 성분 중합체(80)를 전위시키고 기질 검출 복합체를 해리시킬 것이다.

기질 검출 복합체는 해리하도록 유도될 수 있기 때문에, 이는 단일 증폭 방법에 특히 유용하다. 바람직한 양태에서는, 신호 증폭 방법을 표적 의존적 효소 활성과 연계하여 기질 검출 복합체에 의해 발생된 신호를 특정 검정에서 관심있는 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있도록 한다. 바람직한 양태에서는, 표적 의존적 효소 활성이 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자의 검출에 적합한 프로브-이용된 하이브리드화 검정과 연계할 것이다.

도 21을 참조하면, 표적 분자를 검출하기 위한 프로브-이용된 하이브리드화 검정에서 기질 검출 복합체를 사용한 양태가 도시되어 있다. 기질 검출 복합체(90)를 사용하여 검출될 프로브/표적 복합체(99)는 표지되지 않은 프로브(106 및 107)이 하이브리드화되는 표적 서열(101)을 갖는, 표적 분자(100)로부터 형성된다. 이어서, 효소 잔기(102)를 포함하는, 효소 표지된 프로브(103)를 표지되지 않은 프로브(106 및 107)의 암과 추가로 복합체를 형성시킨다[참조: 이러한 복합체의 형성과 유용성 논의에 대한 유럽 공개특허공보 EP A 849,363]. 상기 예시에 따르면, 이때 효소(102)가 기질 검출 복합체(90; 도 20 참조) 상에서 작용됨으로써 헤어핀 축의 말단을 연장시키고 이중체(108)를 형성시킨다. 이러한 이중체(108)의 형성으로 인해, 성분 중합체(80)이 방출되고 기질 검출 복합체가 해리된다. 해리시, 상기 검정에서 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있는 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원으로부터 검출가능한 신호의 측정 가능한 수준의 변화가 일어난다. 더욱이, 신호 증폭이 일어나는데, 이는 폴리머라제 효소가 많은 기질 검출 복합체를 턴 오버함으로써 해리된 많은 기질 검출 복합체에 기인하는 신호에서의 대단한 검출가능한 수준의 변화를 야기시킬 수 있다.

특정 표면에 대한 검출 복합체의 고정화

지지체 결합된 검출 복합체를 형성하기 위하여, 본 발명의 검출 복합체, 기질 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 포함하는 성분 중합체 하나 이상을 특정 표면에 임의로 고정화시킬 수 있다. 이러한 성분 중합체는 UV-가교결합의 널리 공지된 방법을 사용하여 상기 표면에 고정화시킬 수 있다. 또 다른 한편, 성분 중합체를, 합성 지지체로부터 절단되지 않지만 탈보호에 적합한 방식으로 상기 표면 상에서 합성시킨다[참조: Weiler, J. et al., "Hybridization based DNA screening on peptide nucleic acid(PNA) oligomer arrays", Nucl. Acids Res., 25:2792-2799(1997)]. 또 다른 양태에서는, 하나 이상의 성분 중합체를, 프로브 상의 적합한 작용기를 특정 표면의 작용기와 반응시킴으로써 상기 표면에 공유 결합시킨다[참조: Lester, A. et al., PNA array technology, Presented at Biochip Technologies Conference in Annapolis(October, 1997)].

중합체를 표면에 부착시키는 방법은 일반적으로, 고정화시킬 중합체의 친핵성 기(예: 아민 또는 티올)를 변형될 지지체 상의 친전자기와 반응시키는 것을 포함한다. 또 다른 한편, 이러한 친핵체는 지지체 상에 존재할 수 있고 친전자체(예: 활성화 카르복실산)는 중합체 상에 존재한다. 본래의 PNA 및 기타 비-핵산 프로브가 전형적으로 아미노 말단을 보유하고 있기 때문에, 이들은 특정 표면에 고정화시키도록 반드시 변형시킬 필요는 없을 것이다[참조: Lester et al., Poster entitled "PNA Array Technology"]. 역으로 말하면, 핵산 프로브는 일반적으로, 시판용 시약 및/또는 이들이 지지체에 고정화되어야 하는 경우에는 지지체를 사용하여 변형된 형태(예를 들면, 아민 또는 티올 변형된 폴리누클레오티드로서 제조됨)로 제조될 것이다.

핵산 또는 PNA를 특정 표면에 고정화시키는데 적합한 조건은 일반적으로 중합체를 표지시키는데 적합한 조건과 유사할 것이다. 이러한 고정화 반응은 필수적으로 표지화 반응과 등가이므로, 표지를 중합체가 공유적으로 고정화되는 표면으로 대체한다. 아미노기, 카르복실산기, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 및 말이미드로 유도체화된 수 많은 유형의 표면이 시판되고 있다. 적합한 표면의 비-제한적인 예로는 막, 유리, 조절된 기공 유리, 폴리스티렌 입자(비이드), 실리카 및 금 나노입자가 있다.

단일 성분 중합체가 일단 특정 표면에 고정화되면, 당해 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체는, 상기 복합체를 어셈블리시키는데 적합한 조건 하에서 기타 성분 중합체를 함유하는 용액을 상기 표면과 접촉시킴으로써 간단히 형성시킬 수 있다. 특정 표면에 고정화되는 경우, 당해 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체는 성분 중합체가 해리될 때까지 거의 또는 전혀 검출가능한 신호를 나타내지 않을 것이다. 성분 중합체 중의 하나를 특정 표면 상에 보유하고 동시에 기타 성분 중합체를 용액 내로 방출시키는 능력은 또한, 성분 중합체를 분리시키기 위한 신속한 수단을 제공해줌으로써 이러한 검정에서의 검출를 간단하게 만들어 준다.

따라서, 둘 이상의 성분 중합체(여기서, 하나의 성분 중합체 만이 지지체 결합되어 있다)로부터 형성된 당해 검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체는 분자상 비이컨과 같은 단일분자상 "비이컨" 프로브로는 입수할 수 없는 이점을 지니고 있다. 구체적으로 언급하면, 단일분자상 "비이컨" 프로브는 공여체 잔기와 수용체 잔기를 단일 분자로 연결하는데, 이는 비이컨 세트의 공여체 잔기와 숭요체 잔기를 완벽하게 분리시키는 것이 가능하지 않기 때문이다. 비교해보면, 하이브리드화 유도된 당해 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 해리로 인해, 비이컨 세트의 잔기들 간에 무한정 간격 분리가 효과적으로 이루어지므로 검출가능한 신호에서의 실질적으로 보다 강력한 변화를 가져올 수 있다.

예를 들면, 고정화된 검출 복합체의 해리시, 연결되지 않은 중합체는 용액으로 방출되는 반면, 연결된 성분 중합체는 표면에 부착된 채로 있다. 지지체 결합된 중합체가 비이컨 세트의 소광인자 잔기를 포함한다고 가정하면, 형광적으로 표지된 성분 중합체를 상기 용액 내로 방출시키면, 용액을 대상으로 한 형광성 분석 이전에 모든 소광인자 잔기로부터 간단히 분리시킬 수 있을 것이다. 또 다른 한편, 지지체 결합된 중합체는 비이컨 세트의 형광성 잔기를 포함할 수 있는데, 여기서 소광인자 함유 성분 중합체를 용액 내로 방출하게 되면, 지지체를 대상으로 한 형광성 분석을 간단하게 만들 수 있을 것이다.

유리하게는, 본 발명의 지지체 결합된 검출 복합체는 하이브리드화된 모든 표적 분자를 표면으로부터 단순히 제거함으로써 용이하게 재생시킬 수 있다. 이는 통상적으로, 표면을 포름아미드 및/또는 염기(예: 수산화나트륨)로 처리하는 것과 같이 표면을 변성 조건에 노출시키거나, 또는 표면을 승온에서 세척함으로써 수행할 수 있다. 이어서, 상기 표면을 일정량의 표지된 성분 중합체와 접촉시키는데, 이는 적합한 조건하에서 지지체 결합된 검출 복합체을 재생시키는데 필요하기 때문이다.

검출 복합체의 어레이

프로브의 어레이가 최근에, 수 많은 표적 서열에 대한 샘플을 동시에 호출하기 위한 수단으로서 널리 공지되어 있다[참조: US 5,556,752, US 5,837,832, US 5,744,305, US 5,843,655, US 5,631,734, US 5,770,722, US 5,874,219 및 US 5,856,174(이들 모두는 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다)]. 일반적으로, 이러한 어레이 장치를 사용하여 생성될 수 있는 정보는 표면 상에 고정될 수 있는 상이한 서열의 수와 선택된 검출 방법에 의해서만 제한된다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 수 많은 상이한 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체를 표면 상의 특정한 위치에 각각 고정화시킴으로써, 이와 같이 고정화된 검출 복합체의 성분 프로빙 중합체의 프로빙 서열이 관심있는 하나 이상의 표적 분자를 함유할 수 있는 샘플을 호출하도록 현명하게 선택되는 검출 복합체의 어레이를 형성시킬 수 있다. 각 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체의 위치와 조성이 공지되어 있기 때문에, 검출 복합체의 어레이를 사용하여 동일한 샘플에 존재하는 둘 이상의 표적 분자를 동시에 검출, 확인 또는 정량할 수 있다. 따라서, 검출 복합체 어레이는 진단 적용 분야, 치료학적 유용성을 나타낼 수 있는 리드용 화합물의 스크리닝(예: 약물 개발) 또는 각종 약물 상호반응에 대한 민감성 여부를 알아보기 위하여 환자를 모니터하는데 유용한 인자에 대한 샘플의 스크리닝(예: 약물 유전학)에 특히 유용할 것이다.

예를 들면, 각 검출 복합체의 경우, 형광적으로 표지된 프로빙 중합체가 특정 샘플 중에서 검출하고자 하는 상이한 표적 분자 각각에 대한 표면에 고정화되도록 검출 복합체의 어레이를 형성시킬 수 있다. 이어서, 하나 이상의 소광인자 함유 어닐링 중합체를 각 프로빙 중합체에 하이브리드화시킴으로써 각각의 고정화된 검출 복합체를 형성한다. 가장 바람직하게는, 동일한 어닐링 중합체를 사용하여 상기 어레이의 많은 상이한 검출 복합체를 형성한다. 이러한 어레이를 샘플과 접촉시킨 경우, 표적 서열을 특정한 프로빙 중합체에 하이브리드화시키면 특정한 검출 복합체의 해리가 직접적 또는 간접적으로 발생되므로, 방출된 어닐링 중합체가 상기 검정으로부터 용이하게 제거될 수 있따. 결과적으로, 어레이 상의 특정한 위치에서의 형광성 신호의 검출는 공지된 프로빙 서열의 일정 위치에서 하이브리드화시킨 샘플 중에서 표적 서열의 존재 및/또는 양을 지시해준다. 결과적으로, 어레이 상의 모든 형광 분석을 이용하여, 동일한 샘플에 존재할 수도 있는 관심있는 둘 이상의 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 동시에 결정할 수 있다.

이러한 검출 복합체의 어레이의 한 가지 부가의 이점은 재생/재순환의 용이성이다. 구체적으로 언급하면, 특정 샘플의 단일 분석을 완료하게 되면, 이러한 샘플로부터 하이브리드화된 핵산을, 하이브리드를 해리시키는 조건(예; 변성 조건)을 이용하여 제거할 수 있다. 이어서, 이러한 검출 복합체의 어레이는, 소광인자 함유 어닐링 중합체를 적합한 하이브리드화 조건 하에서 지지체 결합된 프로빙 중합체와 재하이브리드화시킴으로써 재생시킬 수 있다. 바람직한 양태에서는, 모든 프로빙 중합체가 통상의 상호작용기를 포함하므로, 단일 소광인자 함유 어닐링 중합체는 모든 상이한 지지체 결합된 프로빙 중합체의 형광을 소멸시키는데 유용하다. 상이한 프로빙 중합체를 각각 포함하는 다중의 상이한 검출 복합체를 어셈블리하는데 유용한 통상의 소광인자 함유 어닐링 중합체를 고안하기 위한 예가 본 명세서의 실시예 15, 16 및 17에 제시되어 있다.

IV. 검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체에 대한 사용 방법 및 적용 방법

표적 서열의 검출 방법

본 발명의 검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체는 표적 분자의 표적 서열의 존재, 부재 또는양을 검출 또는 확인하는데 적합하다. 결과적으로, 본 발명은 또한, 특정 샘플에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 검출, 확인 또는 정량 방법에 관한 것이다.

한 양태에서는, 당해 방법이 상기 샘플을 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체와 접촉시킨 다음, 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트이 표적 서열과 하이브리드화될 때 또는 상기 복합체가 직접적 또는 간접적으로 해리될 때 비이컨 세트의 공여체 잔기와 수용체 잔기 간의 에너지 전달에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 검출 또는 확인하는 것을 포함한다. 이어서, 이와 같이 검출된 신호를 상기 샘플 중에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관지을 수 있다. 일반적으로, 정량은 대표적 샘플 중에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 공지된 양과 표준 검정을 사용하여 발생된 표준 곡선과 상기 신호를 비교하는 것을 포함할 것이다.

또 다른 양태에서는, 당해 방법이 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트를 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자와 상호작용하도록 한 후에 검출 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 이러한 양태에서는, 검출 복합체의 형성 전 및 후에 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원의 검출가능한 신호의 변화에 의해, 검출 복합체의 형성 정도를 결정할 수 있다. 샘플에 가해진 프로빙 중합체(들)와 어닐링 중합체(들)의 양은 조절 및 산정될 수 있기 때문에, 검출 복합체의 형성 정도, 및 이로부터 유도된 검출가능한 신호의 측정 가능한 수준의 변화를 이용하여 관심있는 샘플 중에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 결정할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 당해 검출 복합체가 관심있는 표적 분자가 검출되는 효소에 대한 기질인데, 이는 기질 검출 복합체에 대한 상기 효소의 활성이 상기 샘플 중에서의 표적 분자의 존재 하에 또는 이러한 표적 분자의 존재 또는 양에 비례하여 검출가능한 신호를 발생시키기 때문이다. 이 방법은 샘플을 표적 의존적 효소 활성을 발생시키도록 고안된 효소 및 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 검정은 표적 분자와 복합체를 형성하는 프로브 중의 하나 이상이 프로브-효소 접합체인 프로브-이용된 검정으로서 고안된다. 이어서, 상기 샘플을 기질 검출 복합체와 접촉시킨 다음, 상기 복합체의 해리로부터 발생된 비이컨 세트의 공여체와 수용체 잔기 간의 에너지 전달에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 측정한다. 일반적으로, 정량은 대표적 샘플 중에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 공지된 양과 표준 검정을 사용하여 발생된 표준 곡선에 대해 상기 신호를 비교하는 것을 포함할 것이다.

본 발명의 방법에 대한 예시 용도

본 발명의 방법을 수행하는 경우, 당해 검출 복합체를 프로브, 프라이머 또는 효소에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 이러한 검출 복합체의 특정 양태는 해리될 때까지는 고유의 신호를 거의 나타내지 않기 때문에, 당해 방법은 살아있는지에 상관없이, 세포, 조직 또는 유기체에서 표적 서열 또는 서열 분자를 검출하는데 특히 잘 적합하다. 적합한 방법에는 동일계 검정 뿐만 아니라 세포, 조직 또는 유기체로부터 추출된 표적 분자를 함유하는 샘플 상에서 수행된 검정이 포함된다. 동일계 하이브리드화 방법 뿐만 아니라 분석하기 위해 핵산을 추출 및 프로세싱하는 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

예를 들면, 본 발명은 유기체 또는 바이러스와 연관된 표적 핵산의 검출를 통하여 특정 샘플에서의 유기체 또는 바이러스의 존재 또는 양을 검출, 확인 또는 정량하는데 유용하다[참조: 본원에 참조문헌으로 삽입된, "유기체 및 바이러스를 검출, 확인 및 정량하는 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5,641,631호]. 유사하게, 본 발명은 특정 샘플에서 유기체의 하나 이상의 종을 검출, 확인 또는 정량하는데 유용하다[참조: 본원에 참조문헌으로 삽입된, "유기체 및 바이러스를 검출, 확인 및 정량하는 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5,288,611호]. 본 발명은 또한, 특정 샘플에서 하나 이상의 미생물 성장에 대한 항미생물제의 효과를 결정하는데 유용하다[참조: 본원에 참조문헌으로 삽입된, "리보좀성 핵산 서브유닛 서열 특이적 프로브를 사용하여 성장에 대한 항미생물제의 효과를 결정하는 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5,612,183호]. 본 발명은 또한, 특정 샘플에서 유기체의 분류학적 군의 존재 또는 양을 결정하는데 유용하다[참조: 본원에 참조문헌으로 삽입된, "프로브로서 특이적 r-RNA 이서열을 사용하여 유기체의 분류학적 군의 존재 또는 양을 검출하는 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5,601,984호]. 본원에 사용된 바와 같이, 유기체의 비-제한적 예에는 미생물, 효모, 진균, 세균, 미소세균, 해조류, 바이러스 및 포자가 포함된다.

본 발명의 방법은 또한, 식품, 음료, 물, 약제학적 생성물, 개인 보호용 생성물, 일상용품 또는 환경학적 샘플에서 세균과 유캐랴(eucarya)를 검출하는데 특히 유용하다. 바람직한 음료에는 소다, 병에 담긴 물, 과일 쥬스, 맥주, 포도주 또는 액상 제품이 포함된다. 적합한 방법은 또한, 식품, 음료, 물, 약제학적 생성물, 개인 보호용 생성물, 일상용품 또는 환경학적 샘플을 제작 또는 저장하는데 사용되는 원료, 장비, 생성물 또는 공정을 분석하는데 특히 유용할 것이다.

또 다른 한편, 당해 방법은 관심있는 의학적 질환을 진단하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 사람 또는 동물을 치료하기 위해 사용된 임상 표본 또는 장비, 비품 또는 제품을 분석하는데 특히 유용할 것이다. 하나의 바람직한 양태에서는, 상기 검정을 이용하여 유전병에 대해 특이적이거나 유전병에 대한 소질에 대해 특이적인 표적 서열을 검출할 수 있다. 이러한 질병의 비-제한적 예로는 β-지중해 빈혈, 겸상적혈구 빈혈, 인자-V 라이덴(Leiden), 담낭 섬유증, 및 p53, p10, BRC-1 및 BRC-2와 같은 표적과 관련된 암이 있다. 또 다른 양태에서는, 표적 서열이 염색체 DNA와 관련이 있을 수 있는데, 여기서 표적 서열의 검출, 확인 또는 정량은 태아검진 스크리닝, 부계 시험, 신분 확인 또는 위법 조사와 같은 법정 기술과 관련하여 사용될 수 있다.

본 발명의 방법 사용에 관한 기타 비-제한적인 예에는 식물 및 이로부터 유도된 유전 물질 뿐만 아니라 세균전 시약의 분석 또는 조작이 포함된다. 검출 복합체는 또한, 진단 적용 분야, 치료학적 유용성을 나타낼 수 있는 리드용 화합물의 스크리닝(예: 약물 개발) 또는 각종 약물 상호반응에 대한 민감성 여부를 알아보기 위하여 환자를 모니터하는데 유용한 인자에 대한 샘플의 스크리닝(예: 약물 유전학)에 특히 유용할 것이다.

표면 상 및 어레이에서의 방법 작동

본 발명의 방법은 검정 성분들 중의 하나 이상이 특정 표면에 고정화되는 경우에 수행할 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 상기 표면을 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 포함한 기타 검정 성분과 접촉시킴으로써 상기 검정을 수행하도록, 표적 서열을 특정 표면에 고정화(공유적으로 결합되거나, 정전기적으로 결합되거나 또는 흡착됨)시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 이의 성분 중합체 중의 하나 이상을 통하여 특정 표면에 고정화시키거나 연결시킨다. 또 다른 양태에서는, 상기 샘플을, 둘 이상의 고정화되거나 연결된 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체를 포함하는 어레이와 접촉시킨다. 어레이는 통상적으로, 관심있는 둘 이상의 독특한 표적 서열의 존재, 부재 또는 양을 알아보기 위하여 샘플을 동시에 호출시키는데 사용된다. 표면 결합된 표적 또는 검출 복합체는 특정 적용 분야에 특히 유용한데, 이는 당업자가 표적 서열 또는 표적 분자의 존재에 반응하여 표면으로부터 하나 이상의 성분 중합체가 방출되는 것을 조절할 수 있기 때문이다.

한 양태에서는, 표적 서열을 포함하는 표적 분자를 특정 표면에 고정화시킨다. 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체가 해리되어 형광적으로 표지된 중합체를 용액 내로 방출시킨다고 가정하면, 이러한 용액을 대상으로 하여, 고정화된 표적 서열 또는 표적 분자의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 수단으로서 형광단의 존재 및 양에 대해 검정할 수 있다. 또 다른 한편, 소광인자 표지된 어닐링 중합체를 용액으로 방출시키고 세척함으로써, 상기 표면 상에 하이브리드화되고 농축된 검출가능한 형광적으로 표지된 프로빙 중합체를 생성시키는데, 여기서 신호 세기를 이용하여 상기 샘플에서의 표적 서열 또는 표적 분자를 검출 또는 정량한다.

유사하게, 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 표면에 고정화시킬 수 있다. 이러한 양태에서는, 표적 서열 또는 표적 분자의 존재로 인해, 형광단 표지된 중합체 또는 소광인자 표지된 중합체가 용액 내로 방출된다. 결과적으로, 이러한 검출 방법은 상기 표면으로부터 방출된 용액의 분석, 또는 샘플 중에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 결정하기 위한 수단으로서 표면 상에 농축된 신호의 분석을 포함할 것이다.

통상의 어닐링 프로브를 이용한 경우의 이점

이들이 표면에 고정화되는지 또는 용액에서 사용되는지 여부와 상관없이, 다중의 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 단일 검정에 사용하는 경우, 관심있는 둘 이상의 독특한 표적 서열 또는 표적 분자와 하이브리드화되는 둘 이상의 상이한 프로빙 중합체와 복합체를 형성하는데 동일한 어닐링 프로브를 사용할 수 있는 것이 본 발명의 중요한 특징이다. 각각 상이하고도 독특한 표적을 검출하는데 적합한, 많은 상이한 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 형성하는데 있어서 하나의 공통의 성분 중합체를 이용하는 능력이 검정 제조에 특히 유리하다. 구체적으로 언급하면, 제조 공정을 상당히 단순화시킬 수 있는데, 이는 독립적으로 검출가능한 상이한 잔기를 포함하는 많은 상이한 단독 표지된 프로빙 중합체가 자체적으로 벌크상 제조될 수 있고 상이한 많은 프로빙 중합체와 혼합될 수 있는 통상의 어닐링 중합체의 존재하여 검출 복합체를 형성할 것이기 때문이다. 바람직한 양태에서는, 상이한 많은 프로빙 중합체를 단일 튜브에서 단일 어닐링 중합체와 혼합함으로써 단일의 다중체 검정에 유용한 상이한 많은 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체를 동시에 형성할 수 있다.

더욱이, 다중 표지를 지닌 핵산 및 PNA 올리고머를 제조 및 정제하는 것은 귀찮고 힘들 수 있다. 비이컨 세트의 두 표지를 각각 검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체의 상이한 중합체에 부착시킬 수 있기 때문에, 각각 단일 표지를 포함하는 성분 중합체의 제조는, 비이컨 세트의 둘 이상의 잔기가 동일한 중합체에 연결되는 단일분자상 "비이컨" 프로브의 제조와 비교해서 훨씬 더 단순하고, 시간이 덜 소모되며 비용이 더 저렴할 것이다.

바람직한 검정 포맷:

검출 복합체, PCR 검출 복합체 또는 기질 검출 복합체는 자가-지시성이기 때문에, 본 발명의 방법은 밀폐된 튜브 검정 포맷에서 수행된 검정에 특히 잘 적합하다. 밀폐된 튜브 검정 포맷이란, 검정 결과를 결정하기 위하여 검정 동안 또는 후에 검정 샘플의 조작(예: 검정 성분의 분리)이 수행될 필요가 없는 검정을 의미한다. 예를 들면, 검정 용기가 반드시는 아니지만, 밀봉시킬 수 있는데, 단 이러한 용기의 벽을 통하여, 검정 샘플의 한 가지 이상의 검출가능한 파라미터를 결정할 수 있다(예: 형광성). 바람직한 양태에서는, 이러한 결과가 복잡한 기기의 도움없이도 육안으로 볼 수 있다. 예를 들면, 이러한 샘플을 함유하는 튜브에 자외선을 제공하면 형광을 볼 수 있다. 가장 바람직한 양태에서는, 상기 샘플을 실시간 뿐만 아니라 종점 검정으로 분석할 수 있다. 밀폐된 튜브 검정의 실시간과 종점 결정을 수행할 수 있는 시판용 기기의 예에는 라이트 사이클러(공급원: Idaho Technologies) 및 프리즘 7700(공급원: Perkin Elmer)이 포함된다. 이들 기기는 상기 튜브가 공개되어야 하거나 반응 내용물이 노출되어야 하는 어떠한 요구 조건도 없이 검정을 실시간 및 종점으로 기기 중의 모든 샘플의 형광성을 측정할 수 있다.

바람직한 밀폐된 튜브 검정은 특정 검정에서 생성시킨 표적 서열의 검출를 포함한다. 이러한 표적 서열은 전사 또는 연결에 의해 생성될 수 있지만, 핵산 증폭 반응에서 증폭시키는 것이 바람직하다. 전사, 연결 또는 폴리머라제 연장 반응(예: PCR)에서 이용되는 경우, 당해 검출 복합체는 새로이 합성되거나 증폭된 핵산 내에서의 표적 서열에 대해 지시할 수 있다. 또 다른 한편, 당해 검출 복합체는 핵산 합성 또는 증폭 반응에서 프라이머로서 참여할 수 있다. 적합한 핵산 합성 또는 증폭 반응의 비-제한적 예로는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 쇄 전위 증폭(SDA), 전사-중개된 증폭(TMA), Q-베타 레플리카제(Q-베타) 및 롤링 써클 증폭(RCA)이 있다. 핵산을 합성 또는 증폭시키는 기타 새로운 방법이 공지될 것이며 당해 분야의 숙련인에 의해 통상적으로 이용될 것으로 예상된다. 핵산을 합성 및/또는 증폭시키기 위한 모든 방법(새로운 또는 기존의 방법)을 모니터하기 위한 본 발명의 검출 복합체의 용도가 본 발명의 명세에 포함된다.

PCR이 본 발명을 실시하는데 바람직한 검정 포맷이다. 이러한 PCR 촉매적 공정은 반복적이므로, 표적 서열을 포함하는 많은 복사 수의 핵산 표적 분자가 PCR 반응에서 신속하게 생성될 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 검출 복합체가 PCR 반응에서 전진 및/또는 후진 프라이머로서 수행된다. 프라이머로서 사용된 경우, 하나 이상의 검출 복합체의 프로빙 중합체를 증폭된 핵산 내로 혼입한다. 검출 복합체가 프라이머인지 아닌지에 상관없이, PCR은 이러한 검출 복합체의 해리를 유발시키는 2차 "촉발" 사건이다. 따라서, 새로이 형성된 핵산(즉, 암플리콘)의 양에 비례하여 신호가 생성된다. 결과적으로, 당해 검출 복합체는 샘플 중에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. PCR 프라이머로서 검출 복합체를 사용하는 용도가 본 명세서의 실시예 15, 16, 17및 18에 입증되어 있다.

PCR 적용에서 프라이머로서의 검출 복합체의 용도

바람직한 양태에서는, 본 발명의 방법 및 조성물이 PCR 반응에 사용되며, 여기서 하나 이상의 PCR 검출 복합체가 PCR 반응에서 전진 및/또는 후진 프라이머 중의 어느 하나 또는 둘 다로서 사용되는데, 단 본 발명의 PCR 검출 복합체는 하나 이상의 비-핵산 중합체를 포함할 필요가 없는데, 이는 선행 기술에서는 이러한 복합체가 PCR에 사용하기에 적합하지 않다고 교시되어 있기 때문이다[참조: Tyagi2 et al., WIPO 특허원 WO95/13399 및 본 명세서의 배경 섹션]. 결과적으로, 본 발명의 PCR 검출 복합체에는 핵산 중합체로만 구성된 복합체 뿐만 아니라 하나 이상의 비-핵산 중합체를 사용하여 형성된 복합체가 포함된다. 그러나, 바람직하게는, 성분 중합체 중의 하나 이상이 비-핵산 중합체이고, 가장 바람직하게는 PNA이다. 이러한 방법은 특정 샘플에서 관심있는 핵산 표적 분자의 검출 또는 확인에 사용되며, 여기서 핵산 표적 분자는 프라이머 연장 반응을 개시하기 위하여 당해 PCR 검출 복합체의 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 하이브리드화되는 하나 이상의 프라이밍 부위를 포함한다. 이러한 프라이머 연장 반응은 예를 들어, PRINS로서 공지된 기술을 사용하여, 튜브 또는 세포(동일계)와 같은 인공 시스템에서 개시될 수 있다[참조: Serakinci et al., Nature Biotechnology, 17:200-201(February, 1999)].

형광성-이용된 PCR 검정의 예가 도 4 내지 7에 예시되어 있다. 도 4a를 참조로 하면, 이중쇄 플라스미드 주형(60)이 예시되어 있다. 예시된 바와 같이, PCR 반응의 전진(61) 또는 후진(62) 프라이머 중의 어느 하나 또는 둘 다가 PCR 검출 복합체일 수 있다.

전진 프라이머(61)에 의해 지시된 폴리머라제 반응의 연장이 도 4b에 예시되어 있다. 예시된 바와 같이, 표적 서열(64)을 포함하는 플라스미드(63)의 단일쇄가 제시된다. 이로써, 폴리머라제(65)는 상기 플라스미드의 상보적 쇄를 생성시킨다. 예시된 바와 같이, 프로빙 중합체(68)의 프로빙 세그먼트는 표적 서열(64)과 하이브리드화된다. 어닐링 중합체(69)는 프로빙 중합체(68)의 상호작용기(67)과 하이브리드화됨으로써, PCR 검출 복합체를 형성한다. 예시된 바와 같이, 당해 검출 복합체는 표적 서열과의 하이브리드화시 해리되지 않는데, 이는 프로빙 중합체의 상호작용기(67)이 표적 서열(64)과 하이브리드화되지 않기 때문이다. 예시된 PCR 검출 복합체는 제1 형광단(F)과 소광인자(Q)를 포함한다.

PCR의 1회전 생성물이 도 5에 예시되어 있다. 예시된 바와 같이, 전진(70) 및 후진 프라이머(71) 모두가 PCR 검출 복합체이다. 플라스미드의 상보적 쇄가 73 및 74로서 예시되어 있다. 폴리머라제(65)는 이 것이 분리될 때까지 플라스미드를 복사할 것이다. 예시된 바와 같이, PCR 검출 복합체는 아직까지 해리되지 않았다. 따라서, 각 형광단 F6 및 F7을 소광인자 잔기 Q2 및 Q3에 의해 각각 소광시킨다.

PCR의 2회전이 도 6에 예시되어 있다. 도 6을 참조로 하면, 폴리머라제 효소는 1회 중합 생성물(75) 상에서 다시 복사된다. 이 것이 주형쇄의 말단에 도달하게 되면, 폴리머라제(65)는 어닐링 중합체(77)를 상기 주형으로 밀어냄으로써 PCR 검출 복합체를 해리시키고 어닐링 중합체를 용액 내로 방출시킬 것이다. 결과적으로, PCR 검출 복합체의 간접적인 해리가 검정의 검출가능한 신호를 생성시켜 주는 2차 "촉발" 사건이다.

도 6을 참조로 하면, 프로빙 중합체가 핵산이고 상호작용기(76)이 누클레오티드를 포함하게 되면, 이러한 폴리머라제는 PCR 검출 복합체의 프로빙 세그먼트의 하이브리드화 부위를 지나서 복사함으로써 상기 주형의 본래의 프라이밍 부위(들)을 지나서 앰플리콘을 연장시킨다는 것이 명백해진다. 주형 상의 프라이밍 부위의 말단 사이의 거리 보다 긴 앰플리콘을 생성시키면, 앰플리콘의 바람직한(풍부한) 재생이 일어날 것인데, 이는 PCR의 연속 회전에서는 프로빙 중합체의 전체 누클레오티드 서열이 앰플리콘의 말단에 상보적일 것이기 때문인 반면, 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트 만이 표적 서열에 상보적이다["검출 복합체, PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체의 형성 및 안정성"이란 표제의 섹션에서의 도 2에 관한 논의 고찰]. 앰플리콘과 프로빙 중합체 간에 형성된 복합체의 열역학적 안정성 증가로 인해, PCR의 연속 회전에서 주형의 재새에 비해 풍부해진 앰플리콘의 증폭이 이루어질 것이다.

마찬가지로, 주형 상의 하이브리드화 부위를 지난 앰플리콘의 연장으로 인해, 상호작용기의 조성이 주문 받을 수 있기 때문에 입수 가능하지 않을 수도 있는 앰플리콘의 조작을 가능하게 해준다. 예를 들면, PCR 검출 복합체를 형성하고 안정화시키는데 사용된 상호작용기는, PCR 반응에서 형성된 앰플리콘이 주형 내에서는 발견되지 않는 말단 제한 부위를 포함하도록 고안될 수 있다. 따라서, 앰플리콘은 PCR 반응이 일단 완료되면, 직접적으로 클로닝시킬 수 있다.

도 7을 참조로 하면, 최종 PCR 앰플리콘이 예시되어 있다. 예시된 바와 같이, 앰플리콘(79 및 80)의 각 말단에서 각 형광단(F6 ＆ F7)의 형광성을 검출할 수 있는데, 이는 상기 검출 복합체가 해리됨으로써 소광인자 잔기(Q2 ＆ Q3)를 포함하는 어닐링 중합체(77 및 78)를 용액 내로 방출시켰기 때문이다. 앞서 논의된 바와 같이, 형광단과 소광인자 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다. 더욱이, 단일 검정은 다중체화됨으로써 둘 이상의 독특한 표적 서열을 확인 또는 정량할 수 있다. 다중체화하는 경우, 관심있는 둘 이상의 표적 분자에 대한 핵산 프라이머 및 소광인자 잔기를 포함하는 통상의 PNA 어닐링 중합체를 사용하는 것이 바람직한데, 여기서 각 세트의 프라이머 중의 하나 또는 둘 다는, 각각의 독특한 표적 분자에 대한 앰플리콘의 생성이 독립적으로 검출 가능해지도록 독립적으로 검출가능한 잔기로 표지된다. 예시적 다중체 PCR 검정이 본 명세서의 실시예 16에 제시되어 있다.

A. PCR 클램핑:

PCR 반응의 작동은 PCR 클램핑[참조: Ørum et al., Nucl. Acids Res. 21:5332-5336(1993) and WIPO 특허원 WO93/25706]으로서 공지된 공정을 사용하여 향상시킴으로써 점 돌연변이 식별에 적합한 검정을 생성시킬 수 있다. 따라서, 상기 기재된 PCR 검출 복합체는 PCR 클램핑과 조합하여 사용함으로써 종점 및 실시간 점 돌연변이 식별할 수 있는 밀폐된 튜브 검정을 발생시킬 수 있다. 점 돌연변이 식별을 달성하기 위해 PCR 클램핑과 함께 PCR 검출 복합체를 사용하는 예가 본 명세서의 실시예 17에 제시될 수 있다.

B. 내부 검정 모니터링/독립적인 양태 확인:

검출 복합체를 단일분자상 "비이컨" 프로브, 예를 들면, 헤어핀 형성 핵산 분자상 비이컨[참조: Tyagi et al., Tyagi2 et al., and Tyagi3 et al.], PNA 분자상 비이컨[참조: USSN 08/958,532(허여됨) 및 계류중인 USSN 09/179,298, 둘 다 본원에 참조문헌으로 삽입됨] 및 선형 비이컨[참조: 계류중인 USSN 09/179,162, 모두 본원에 참조문헌으로 삽입됨]과 동시에 사용할 수 있다. 분자상 "비이컨" 프로브와 PCR 검출 복합체를 동일한 반응에서 혼합하는 것은 각 프로브 세트의 활성이 독립적으로 검출가능한 다중체 검정에 특히 유용하다는 것을 입증해줄 수 있다. 예를 들면, 이러한 동시 사용은 적당한 검정 성능을 모니터하거나 상기 검정에서 발생된 앰플리콘의 양태를 독립적으로 확인 또는 측정하기 위한 내부 수단으로서 매우 유익하다는 것을 입증할 수 있다.

i. 내부 검정 모니터링:

한 양태에서는, PCR 검정에서 프라이머로서 작용하는 PCR 검출 복합체와, 독립적으로 검출가능한 잔기를 포함하는 단일분자상 "비이컨" 프로브(예: 헤어핀 형성 핵산 분자상 비이컨, PNA 분자상 비이컨 또는 선형 비이컨)가 앰플리콘 내의 하이브리드화 부위와 하이브리드화됨으로써 독립적으로 검출가능한 신호를 발생하도록 특정 검정을 고안한다. PCR 검출 복합체와 단일 분자상 프로브 모두로부터 예상된 독립적으로 검출가능한 신호의 조합물을 이용하여 상기 검정을 모니터할 수 있다. 예를 들면, PCR 검출 복합체 또는 단일분자상 비이컨 중의 어느 하나로부터의 신호 중의 하나 만이 검출되거나 상기 검정에 우세한 경우, 이는 미스프라이밍 또는 프라이머 이량체 형성과 같은 문제를 지시해주는 결과일 것이다. 그러나, PCR 검출 복합체와 단일분자상 "비이컨" 프로브의 활성 모두에 대한 각각의 독립적으로 검출가능한 신호의 검출를 이용하여 정확한 검정 성능을 보장할 수 있다.

ii. 독립적인 양태 확인:

또 다른 양태에서는, 상기 방법을, 특정 샘플에서 관심있는 일반 양태의 존재 여부를 확인할 뿐만 아니라 앰플리콘의 한 가지 이상의 특이적 양태를 동시에 독립적으로 결정하기 위한 수단으로서의 증폭 반응의 용도에 적용할 수 있다[비-종 특이적 표적을 증폭시킨 다음 증폭 생성물의 군 또는 종 특이적 검출를 수행하는 검정에 대해서는 Nycz et al., 유럽 특허원 제725,148호 참조]. 예를 들면, 이러한 본 발명의 검정을 사용하여 특정 속의 유기체의 존재 여부를 검출하고 이와 동시에 유기체의 하나 이상의 종이 또한 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다. 또 다른 한편, 이러한 검정을 이용하여 일반적인 표적 상기 샘플에 존재하는지를 결정하고 이와 동시에 야생형과 돌연변이체 간의 차이가 단일 점 돌연변이를 포함하는 경우일지라도 야생형, 돌연변이체 또는 양 버젼이 존재하는지를 결정할 수 있다. 예시적인 검정이 본 명세서의 실시예 18에 제시될 수 있다.

예로써, 당해 PCR 검출 복합체는 샘플 중에서의 모든 세균성 핵산을 증폭함으로써 그린 신호를 발생시키도록 선택될 수 있다(예를 들면, 하나 이상의 플루오레세인 표지된 PCR 검출 복합체를 사용함). 따라서, 적당한 PCR 검출 복합체 프라이머를 선택함으로써, 상기 검정에서의 그린 신호의 발생이 세균의 존재를 지시할 것이다. 또한, 하나 이상의 단일분자상 "비이컨" 프로브가 또한 상기 검정에 포함되어, 예를 들면, 특정 종의 세균이 존재하는지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 하나의 단일분자상 "비이컨" 프로브를 블루 형광단으로 표지시키고, 이. 콜라이의 핵산이 샘플 중에 존재하는 경우에 앰플리콘에 존재할지도 모르는 표적 서열에 대해 지시할 수 있다. 레드 형광단으로 표지되고, 에스. 아우레우스(S. aureus)의 핵산이 샘플에 존재하는 경우에 앰플리콘에 존재할 수도 있는 표적 서열에 대해 지시된 또 다른 단일분자상 "비이컨" 프로브를 가함으로써, 상기 검정을 추가로 다중체화할 수 있다. 따라서, 신호의 부재는 샘플 내에 세균이 전혀 존재하지 않는다는 것을 지시해줄 것이다. 그린 신호는 세균은 존재하지만, 이. 콜라이나 에스. 아우레우스는 전혀 존재하지 않는다는 것을 지시해준다. 유사하게, 블루 및 그린 신호는 이. 콜라이가 존재한다는 것을 지시해주고; 레드 및 그린 신호는 에스. 아우레우스가 존재한다는 것을 지시해주며; 블루, 그린 및 레드신호는 이. 콜라이와 에스. 아우레우스 모두가 샘플에 존재한다는 것을 지시해준다. 결과적으로, 본 발명은 특정 집단에 공통적인 성질 뿐만 아니라 이러한 집단에 특이적인 성질 모두를 동시에 검출하는데 적합한 밀폐된 튜브 다중체 검정을 포괄한다. 본 출원인은 밀폐된 튜브 검정 포맷을 이용하는 단일 검정에서 속 및 종 정보 모두를 동시에 생성시키는데 적합한 어떠한 방법도 알지 못하였다. 결과적으로, 이는 본 발명의 방법과 조성물의 가장 독특하고도 유용한 적용 분야이다.

부가적으로, 단일분자상 "비이컨" 프로브[참조: USSN 09/179,162]와 본 발명의 PCR 검출 복합체 모두의 용도는 각각 독립적으로 사용되어, 밀폐된 튜브 검정 포맷에서 점 돌연변이를 검출할 수 있다. 결과적으로, PCR 검출 복합체와 단일분자상 "비이컨" 프로브를 단일 검정에서 혼합하는 것은, 속 및 종 확인 각각 간의 구별 요인이 핵산의 점 돌연변이에 있는 경우일지라도 실시간 또는 종점 분석에 적합한 단일의 밀폐된 튜브 검정 포맷에서 속 및 종 정보 모두를 동시에 수집하는 것을 촉진시켜 준다.

다중체 적용

앞서의 예로써 예시된 바와 같이, 검출 복합체 및 PCR 검출 복합체는 각 비이컨 세트가 하나 이상의 독립적으로 검출가능한 잔기를 포함하는 다중 비이컨 세트를 포함하는 적용에 특히 유용하다. 바람직하게는, 독립적으로 검출가능한 잔기는 독립적으로 검출가능한 형광단이다. 예를 들면, 4가지 상이한 검출 복합체의 혼합물을 사용하여 4가지 상이한 표적 서열 각각을 검출할 수 있는데, 여기서 각 검출 복합체는 1개 또는 4개의 독립적으로 검출가능한 형광단을 포함한다. 이러한 예의 경우, 상기 4가지 상이한 표적 서열의 존재, 부재 또는 양의 검출는, 상기 혼합물을 관심있는 샘플과 배양한 후에 4가지 상이한 독립적으로 검출가능한 형관단 각각을 검출 및/또는 정량함으로써 가능해진다. 앞서 논의된 바와 같이, 당해 검출 복합체는 또한, 독립적으로 검출가능한 잔기가 동일한 검정에서 일어나는 동일하거나 상이한 공정의 작동을 구별시키는데 사용되는 검정에서 사용할 수 있다. 이러한 복합체 검정은 당해 검출 복합체가 프로브로서 사용되는지 또는 프라이머로서 사용되는지를 가능하게 해준다. 본 명세서의 실시예 16 및 18은 당해 검출 복합체를 이용하거나 단일분자상 "비이컨" 프로브와 협력하여 검출 복합체를 이용하는 다중체 적용의 실시예이다.

V. 검출 복합체의 형성 방법:

또 다른 양태에서, 본 발명은 검출 복합체의 형성 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 둘 이상의 성분 중합체를 복합체 형성을 촉진시키는 조건 하에서 함께 혼합하는 것을 포함한다. 특정 양태에서는, 기타 검정 공정의 일부 또는 전부가 수행되기 전, 수행되는 동안 또는 심지어 수행 후에 검출 복합체를 형성하는 것이 바람직한데, 단 상기 검정에서 일어나는 비이컨 세트의 하나 이상의 구성원으로부터의 검출가능한 신호의 변화가 샘플에서의 관심있는 표적 서열 또는 서열 분자의 존재, 부재 또는 양과 상관있을 수 있다. 본 발명에 의해 형성된 검출 복합체는 "본 발명의 조성물"이란 제목 하에 기재되어 있다. 이러한 방법에 의해 형성된 검출 복합체에는 PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체가 포함된다.

V. 본 발명의 키트:

본 발명은 추가로, 검출 복합체의 성분 중합체 및 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 기타 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 관심있는 샘플에 존재할 수 있는 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출 또는 확인하는데 적합하다. 최종 사용자에 의해 인지되는 바와 같이, 당해 검출 복합체는 예비어셈블리시킬 수 있거나, 또는 최종 사용자는 둘 이상의 성분 중합체를 혼합할 필요가 있으므로 당해 검출 복합체를 형성할 수 있다. 첨부된 청구의 범위는 성분 중합체가 개별적으로 존재하는 키트 뿐만 아니라 예비어셈블리된 검출 복합체를 함유하는 키트에 적용하고자 하는 것이다. 본 발명의 키트에 적합한 검출 복합체는 "본 발명의 조성물"이란 제목하에 기재되어 있다. 키트에 사용하기에 적합한 검출 복합체에는 PCR 검출 복합체 및 기질 검출 복합체가 포함된다.

본 발명의 바람직한 키트는 PCR 반응을 형성하기 위한 시약 모두를 포함하는데, 여기서 당해 키트의 하나 이상의 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체 각각을 사용하여 관심있는 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 알아보기 위하여 특정 샘플을 모니터한다. 바람직한 양태에서는, 당해 키트의 하나 이상의 검출 복합체가 PCR 반응에서 프라이머로서 수행된다. 당해 검출 복합체가 PCR에서 프라이머로서 작동하기 위해서는, 하나 이상의 검출 복합체의 프로빙 중합체가 3'-하이드록실 군을 보유하는 프로빙 세그먼트를 포함해야만 한다. 바람직하게는, 이러한 프로빙 중합체는 표적 서열과 서열 특이적으로 상호작용하지는 않지만 어닐링 중합체의 상호작용기의 누클레오염기와만 상호작용하는 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함한다. 더욱이, 바람직하게는, 어닐링 중합체는 프로빙 중합체의 상호작용기에 대한 정확한 보체인 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함한다.

전형적인 PCR 키트는 둘 이상의 프라이머(여기서, 하나 이상이 PCR 검출 복합체일 수 있다), 하나 이상의 검출 복합체 또는 PCR 검출 복합체, 누클레오티드 트리포스페이트, 폴리머라제 효소(바람직하게는 열안정한 폴리머라제) 및 완충 용액(조절된 이온 강도, 조절된 마그네슘 함량 및 pH 조절인자를 지님)을 함유할 것이다.

본 발명의 바람직한 양태를 기재하였지만, 당해 분야의 숙련인에게는 본원에 기재된 개념을 혼입한 기타 양태가 사용될 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 따라서, 이들 양태가 기재된 양태로만 제한되지 않고 다음 청구 범위의 요지와 범위에 의해서만 제한되어야 한다고 여겨진다.

실시예 1: N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-라이신-OH의 합성

N-α-(Fmoc)-N-ε-(t-boc)-L-라이신-OH 20mmol에 60ml의 2/1 디클로로메탄(DCM)/트리플루오로아세트산(TFA)를 가한다. 이 용액을, 3급-부틸옥시카르보닐(t-boc)기가 N-α-(Fmoc)-N-ε-(t-boc)-L-라이신-OH로부터 완전하게 제거될 때까지 교반시킨다. 이어서, 상기 용액을 건고 증발시키고 잔사를 15ml의 DCM에 재용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 350ml의 에틸 에테르에 적가함으로써 상기 생성물을 침전시킨다. 상기 생성물을 기름에 절였기 때문에, 에틸 에테르를 경사제거하고 고 진공하에 오일을 가하여 백색 발포체를 수득한다. 이러한 백색 발포체를 250ml의 물에 용해시키고, 이 용액에 포화 인산나트륨(2가)을 가함으로써 pH 4로 중성으로 만든다. 형성된 백색 고체를 진공 여과시켜 수집한다. 이 생성물을 35 내지 27℃ 하의 진공 오븐에서 밤새 건조시킨다. 수율: 17.6mmol, 88%.

실시예 2: N-α-(Fmoc)-N-ε-(다브실)-L-라이신-OH("Fmoc-K(다브실)-OH")의 합성

1mmol의 N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-라이신-OH에 5ml의 N,N'-디메틸포름아미드(DMF) 및 1.1mmol의 트리플루오로아세트산을 가한다. 이 용액을, 상기 아미노산이 완전하게 용해될 때까지 교반시킨다.

1.1mmol의 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산, 석신이미딜 에스테르(다브실-NHS; 분자상 프로브, P/N D-2245)에 4ml의 DMF 및 5mmol의 디이소프로필에틸아민(DIEA)를 가한다. 이러한 교반 용액에 상기 기재된 바와 같이 제조된 N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-라이신-OH 용액을 적가한다. 이 반응물을 밤새 교반시킨 다음 후처리한다.

용매를 진공 증발시키고 잔사를 50ml의 DCM과 50ml의 10% 수성 시트르산으로 분별시킨다. 층을 분리하고 유기 층을 수성 중탄산나트륨으로 세척한 다음 10% 수성 시트르산으로 다시 세척한다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시킨 다음, 오렌시색 발포체로 증발시킨다. 이 발포체를 아세토니트릴(ACN)으로부터 결정화시키고, 진공 여과시켜 결정을 수집한다. 수율: 0.52mmol, 52%.

실시예 3: 비스-(2-메톡시에틸)아미딜-디글리콜산의 합성

800ml의 디클로로메탄(DCM)에서 교반하고 있는 500mmol의 디글리콜산 무수물에 1.1mole의 비스(2-메톡시에틸)아민(Aldrich Chemical)을 적가한다. 이 반응물을 2시간 동안 교반시킨 다음, 280ml의 6N HCl를 적가한다. 이어서, 내용물을 분리용 깔대기에 옮기고 분리시켜 둔다. DCM 층을 제거하고 수성 층을 100ml의 DCM으로 추출한다. 합한 DCM 층을 100ml의 10% 수성 시트르산으로 추출한다. 이어서, 이러한 DCM 층을 분리시키고, 건조시키며(Na₂SO₄), 여과시킨 다음, 증발시켜 73.8g(296mmol; 59% 수율)을 수득한다. 이어서, 쿠겔로흐(kugelroch)를 사용하여 미량의 용매를 제거한다(생성물을 대략 180μM Hg에서 60℃로 가열시키지만, 증류시키지는 않는다).

실시예 4: N-[N'"-Fmoc-(2"-아미노에틸)]-N-[N,N'-(2-메톡시에틸)아미딜-디글리콜릴글리신("Fmoc-"E"aeg-OH")의 합성

60mmol의 Fmoc-aeg-OH(PerSeptive Biosystems, Inc.)에 360ml의 밀리큐 수, 180ml의 아세톤, 120mmol의 NaHCO₃및 60mmol의 K₂CO₃를 가한다. 이 용액을 모든 Fmoc-aeg-HO가 용해될 때까지(대략 2시간) 교반시킨 다음, 다음에 기재된 바와 같이 제조된 용액을 가한다.

70mmol의 비스-(2-메톡시에틸)아미딜-디글리콜산에 120ml의 무수 아세토니트릴(Fluka Chemical), 240mmol의 N-메틸모르폴린(NMM: Fluka Chemical) 및 75mmol의 트리메틸아세틸 클로라이드(Aldrich Chemical)을 가한다. 이 용액을 실온에서 30분 동안 교반시킨 다음 상기와 같이 제조되는 Fmoc-aeg-OH의 용액에 적가한다.

합한 용액을 1시간 동안 교반시키고 tlc 분석이 완전한 반응을 지시한 후, pH가 종이에 의해 2미만으로 될때까지 6N HCl을 상기 반응물에 가한다. 이어서, 유기 용매를 진공 증발시켜 제거한다. 그 다음, 잔여 수용액을 분리용 깔대기에 옮기고 250ml의 에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 합한 에틸 아세테이트 층을 건조시키고(Na₂SO₄), 여과시키며 증발시켜 오일을 41.5g 수득한다.

이러한 조 생성물을, 이러한 생성물을 용출시키고 피발산을 제거하기 위한 수성 아세토니트릴의 구배 및 역상 정지 상(C18)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피하여 정제한다. tlc에 의해서는 가시적이지 않지만, 피발산으로 냄새로써 모니터할 수 있다. 이러한 피발산은 상기 생성물을 용출시키기 이전에 상기 칼럼으로부터 거의 완전하게 용출될 수 있다. 상기 생성물의 용출은 tlc에 의해 모니터할 수 있다. 수득량: 26.8g(47mmol; 78%). PNA 또는 폴리아미드의 "E" 변형물은 다음 식을 갖는다:

실시예 5: N,N'-(2-메톡시에틸)-글리신-3급-부틸 에스테르의 합성

1.1mole의 비스(2-메톡시에틸)아민(Aldrich Chemical)에 500mmol의 3급-부틸 클로로아세테이트(Aldrich Chemical)를 적가한다. 이 반응물을 3일 동안 교반시킨 다음 후처리한다.

최종 반응 내용물에 250ml의 DCM 및 200ml의 물을 가한다. 이러한 교반성 용액에 300mmol의 고체 탄산칼륨(K₂CO₃)을 조금씩 가한다. 완전하게 혼합한 후, 층들을 분리한다. DCM 층을 일정 용적의 물로 1회 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 여과시킨 다음 증발시켜 매우 얇은 황색 오일을 66.3g 수득한다. 이러한 조 생성물을 60℃(200-500μM Hg)에서 쿠겔로흐 증류시켜 청정한 무색 오일을 58.9g(238mmol; 95%) 수득한다.

실시예 6: N,N'-(2-메톡시에틸)-글리신의 합성

정제된(교반성) N,N'-(2-메톡시에틸)-글리신-3급-부틸 에스테르에 12.1ml의 진한 염산을 서서히 가한다. 이 반응물을 밤새 교반시킨 다음, 부산물(예: 물, HCl, 이소부틸렌)을 진공 증발시켜 제거한다.¹H-NMR 분석은 t-부틸 에스테르가 가수분해되지만, 물과 HCl은 여전히 존재하는 것으로 보인다. 이러한 조 생성물을 ACN으로부터 2회 공동-증발시키지만, 물과 HCl은 여전히 존재한다.

불순물을 제거하기 위하여, 4.4g 샘플을 상기 조 생성물로부터 제거하고 135 내지 155℃에서 쿠겔로흐 증류시킨다(증류가 시작된 후 압력을 신속하게 강하시킨 100-200μM Hg). 수득량: 4.2g(18.4mmol; 진하고 청정한 무색 오일 회수율 95%). 이와 같이 증류된 생성물은 어떠한 물이나 HCl도 함유하지 않는다.

실시예7:N-[N'"-Fmoc-(2"-아미노에틸)]-N-[N,N'-(2-메톡시에틸)글리실]글리신("Fmoc-"+"aeg-OH")의 합성

8mmol의 Fmoc-aeg-OH(PerSeptive Biosystems, Inc.)에 24ml의 아세톤 및 40ml의 밀리큐 수을 가한다. 이러한 교반성 용액에 16mmol의 NaHCO₃및 8mmol의 K₂CO₃를 가한다. 이 용액을 모든 Fmoc-aeg-HO가 용해될 때까지(대략 1시간) 교반시킨 다음, 다음에 기재된 바와 같이 제조된 용액을 가한다.

9mmol의 N,N'-[비스-(2-메톡시에틸)]-글리신에 20ml의 무수 아세토니트릴(Fluka Chemical), 9mmol 디이소프로필에틸아민(DIEA, Aldrich Chemical), 27mmol의 N-메틸모르폴린(NMM: Fluka Chemical) 및 9.3mmol의 트리메틸아세틸 클로라이드(Aldrich Chemical)을 가한다. 이 용액을 실온에서 30분 동안 교반시킨 다음 상기와 같이 제조되는 Fmoc-aeg-OH의 용액에 적가한다.

합한 용액을 1시간 동안 교반시키고 tlc 분석이 완전한 반응을 지시한 후, 유기 용매를 진공 증발시켜 제거한다. 그 다음, 잔여 수용액에 시트르산을 나누어 적가함으로써 pH 7.0이 되게 산성화시킨다. 이어서, 상기 용액을 분리용 깔대기에 옮기고 35ml의 에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 유기 층에서 생성물이 전혀 존재하지 않는데, 이는 이를 경사 제거했기 때문이다.

상기 용액이 대략 pH 8에서 혼탁해질 때까지 상기 수용액의 pH를 종이로 상향 및 하향 조정한다. 이어서, 용매를 분리용 깔대기에 다시 옮기고 25ml의 DCM으로 추출한다. 생성물이 유기 층에 존재하기 때문에, 수성 층을 DCM으로 다시 3회 추출한다. 모든 DCM 층을 합하고 5% 중탄산나트륨 용액으로 다시 추출한다. pH를 다시 약 8.0으로 조정한다. 수성 층을 DCM으로 수회 추출하고 모든 DCM 층을 합하며, 건조시키고(Na₂SO₄), 여과시키며 증발시켜 백색 고체를 대략 5.0g 수득한다.

이러한 조 생성물을 DCM에 용해시키고 2/1 헥산/디에틸 에테르의 혼합물 내로 침전시킨다. 최종 생성물을 진공 여과시켜 수집한다. 수득량: 2.97g(5.8mmol; 72% 수율). PNA 또는 폴리아미드의 "+" 변형물은 다음 식을 갖는다:

실시예 8: C-말단 변형을 갖는 폴리아미드를 제조하는데 적합한 PAL-Peg/PS 합성 지지체의 합성에 대한 일반적인 과정

Fmoc-K(다브실)-OH, Fmoc-"E"aeg-OH 및 Fmoc-"+"aeg-OH 신톤을 사용하여 하나 이상의 C-말단 "다브실", "E" 또는 "+" 잔기를 포함하는 올리고머를 제조하는데유용한 합성 지지체를 제조한다. Fmoc-K(다브실)-OH, Fmoc-"E"aeg-OH 및 Fmoc-"+"aeg-OH 신톤이 사용될 수 있고 자동화 기기에 직접적으로 사용되긴 하지만, 예비유도체화된 지지체의 제조가 바람직한데, 이는 벌크 지지체를 제조하는데 신톤이 덜 요구되기 때문이다.

제1 단계에서는, 시판용 Fmoc-PAL-Peg-PS 합성 지지체(PerSeptive Biosystems, Inc.; P/N GEN913384)의 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기를 병류 용기에서 30분 동안 N,N'-디메틸포름아미드(DMF) 중의 20% 피페리딘으로 처리함으로써 제거한다. 이어서, 상기 지지체를 DCM으로 세척한다. 최종적으로, 상기 지지체를 DMF으로 세척하고, 아르곤의 플러싱 스트림으로 건조시킨다.

제2 단계에서는, DMF 중의 0.15M 단량체, 0.14M [O-(7-아자벤조트리아올-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 0.15M DIEA 및 0.225M 2,6-루티딘을 함유하는 용액을, 상기 시약을 순차적으로 배합함으로써 제조한다. 이어서, 상기 용액을 합성 지지체에 가하고 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 이 용액을 아르곤의 스트림으로 용기 내로 플러싱하고, 지지체를 DMF, DCM 및 DCM으로 순차적으로 세척한다. 그 다음, 수지를 아르곤 스트림으로 건조시킨다.

제3 단계에서는, 상기 지지체를 5ml의 표준 시판용 PNA 캡핑 시약(PerSeptive Biosystems, Inc.; P/N GEN063102)로 처리한다. 이어서, 상기 캡핑 시약을 용기로부터 플러싱하고 지지체를 DMF 및 DCM으로 순차적으로 세척한다. 그 다음, 상기 지지체를 아르곤 스트림으로 건조시킨다.

2개의 "E" 잔기를 포함하는 지지체의 경우, 제3 단계 주기를 반복한다(단, "E"의 Fmoc 탈보호는 짧게 유지되어야 하는데, 이는 비스-(2-메톡시에틸)아미딜-디글리콜산 잔기의 이동이 일어날 수 있기 때문이다). 지지체를 적당하게 유도체화시키면, 이를 고 진공하에 건조시킨다. 지지체의 최종 부하는 Fmoc 부하를 분석함으로써 결정한다.

그 다음, 이러한 합성 지지체를 필요에 따라 빈 PNA 합성 칼럼 내로 충진시키고, C-말단 변형 잔기를 갖는 PNA 올리고머를 제조하는데 사용한다.

실시예 9: PNA의 합성

공급원(PerSeptive Biosystems, Inc.)으로부터 수득된 시판용 시약과 기기를 사용하여 PNA를 합성한다. C-말단 변형물을 보유하는 PNA는 변형된 합성 지지체를 사용하여 합성을 수행하거나 자동화 기기 상에서 직접적으로 Fmoc-K(다브실)-OH, Fmoc-"E"aeg-OH 및 Fmoc-"+"aeg-OH 신톤을 사용하여 합성을 수행함으로써 제조한다.

실시예 10: 5(6)카르복시플루오레세인-NHS 또는 5(6)카르복시플루오레세인으로 지지체 결합된 PNA을 N-말단 표지화시키는 일반적인 방법

완전하게 어셈블리된 PNA의 아미노 말단 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기를 피페리딘 처리함으로써 제거하고 합성 지지체를 세척한 다음 진공하에 건조시킨다. 이어서, 상기 합성 지지체를 37℃에서 4 내지 5시간 동안 0.1M 5(6)카르복시플루오레세인-NHS(분자상 프로브, P/N C-1311), 0.3M DIEA 및 0.3M 2,6-루티딘을 함유하는 대략 300㎕의 용액으로 처리한다. 처리 후, 상기 합성 지지체를 세척하고 고 진공하에 건조시킨다. 이어서, PNA 올리고머를 절단하고, 탈보호시킨 다음 정제한다.

또 다른 방법으로는, 링커와 적당히 반응시키고 말단 아민 보호기를 제거한 후, 상기 수지를 DMF 중의 0.5M 5(6)카르복시플루오레세인, 0.5M N,N'-디이소프로필카르보디이미드, 0.5M 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)를 함유하는 250㎕의 용액으로 처리한다[참조: Weber et al., Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters, 8:597-600(1998)]. 처리 후, 상기 합성 지지체를 세척하고 고 진공하에 건조시킨다. 이어서, PNA 올리고머를 다음에 기재된 바와 같이 절단하고, 탈보호시킨 다음 정제한다.

플루오레세인 표지화에 대한 주:

본원에 기재된 플루오레세인 표지된 PNA는 상이한 과정을 이용하여 제조한다. 이러한 상이한 과정은 플루오레세인 표지화 조건을 최적화시키도록 전개시킨다. 이때, 대부분의 플루오레세인 표지화 작동을 위해서는 웨버(Weber) 등의 과정을 사용하는 것이 바람직하다.

실시예 11: PNA의 Cy3 표지화

PNA를 함유하는 정제된 아민을 1/1 DMF/물에 0.05OD/㎕의 농도로 용해시켜 스톡 PNA 용액을 제조한다. 이러한 스톡으로부터, 대략 30nmole의 PNA를 튜브에 가한다. 이어서, 이러한 튜브에 125㎕ 0.1M HEPES(pH 8.5) 및 충분한 1/1 DMF/물 을 가하여 총 용적이 250㎕가 되도록 한다. 이 용액을 철저히 혼합한다. Cy3 염료(Amersham)의 예비패키지된 튜브에 상기와 같이 제조된 250㎕ 용액 전체를 가한다. 이 튜브를 잘 혼합한 다음 주위 온도에서 1시간 동안 반응시킨다.

반응 후, 상기 용매를 스피드-백(speed-vac)에서 증발시킴으로써 제거한다. 이어서, 상기 펠릿을 3:1 1% 수성 TFA/ACN을 함유하는 400㎕의 용액에 용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 바람직하게는 5000MW 울트라프리(Millipore P/N UFC3LCC25) 또는 3000MW 아미콘(Microcon microconcentrator P/N 42404) 스핀 카트릿지에 옮겨 과량의 염료를 제거한다. 이어서, 회수된 생성물을 HPLC에 의해 재정제한다.

실시예 12: 절단, 재보호 및 정제시키기 위한 일반적인 과정

합성 지지체(Fmoc-PAL-PEG/PS; P/N GEN913384)를 합성 카트릿지로부터 제거하고, 울트라프리 스핀 카트릿지(Millipore Corp., P/N SE3P230J3)에 옮기며, TFA/m-크레졸(7/3 또는 8/2(바람직함))의 용액으로 1 내지 3시간 동안 처리한다. 이 용액을 지지체 상 내로 방사하고, 지지체를 TFA/m-크레졸 용액으로 1 내지 3시간 동안 다시 처리한다. 이 용액을 상기 지지체 상 내로 다시 방사한다. 디에틸 에테르 대략 1ml를 가함으로써 합한 용출액(TFA/m-크레졸)을 침전시킨다. 이 침전물을 원심분리시켜 펠릿화시킨다. 이어서, 상기 펠릿을 에틸 에테르에 재현탁시키고 2가지 부가의 시간 동안 펠릿화시킨다. 이어서, 상기 건조된 펠릿을 0.1% TFA를 함유하는 20% 수성 아세토니트릴(ACN)에 재현탁시킨다(부가의 ACN을 필요에 따라 가하여 상기 펠릿을 용해시킨다). 이 생성물을 분석하고 역 상 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제한다.

주: 공급원(PerSeptive Biosystems, Inc.)로부터 시판중인 새로운 생성물 Fmoc-XAL-PEG/PS 합성 지지체(P/N GEN 913394)를 사용하여 몇몇 PNA를 제조한다. 이러한 지지체는 PNA가 보다 순한 산 조건 하에서 가장 신속하게 제거될 수 있다는 이점을 지니고 있다. Fmoc-XAL-PEG/PS로 제조된 PNA의 경우, 상기 지지체를 상기 언급된 바와 같이 처리하는데, 단 TFA/m-크레졸 9/1 용액을 일반적으로 10 내지 15분 동안 사용한다(2회).

제조된 PNA 올리고머:

프로브 번호	서열
N-말단적으로만 표지됨
1	Flu-O-ACGCCA-CCA-GCT-CCA-NH₂
C-말단적으로만 표지됨
2	Ac-TGG-AG-OO-G-GCG-T-K(다브실)-NH₂
3	Ac-TGG-AG-OOO-G-GCG-T-K(다브실)-NH₂
4	Ac-TGG-AG-O"+"O-G-GCG-T-K(다브실)-NH₂
5	Ac-"E"-TGG-TGG-CGT-K(다브실)-NH₂
6	Ac-"+"-OO-TGA-TTG-CGA-ATG-A-K(다브실)-NH₂
7	Ac-"+"-OO-ATT-GCG-AAT-GA-K(다브실)-NH₂
8	Ac-"+"-OO-TGC-GAA-TGA-K(다브실)-NH₂
C-말단과 N-말단 모두 상에서 표지된 프로브
9	Flu-O-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-K(다브실)-NH₂
10	Cy3-O-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-K(Flu)-NH₂
11	Cy3-O-TTG-AG-OOO-GGC-GT-K(다브실)-NH₂
12	Cy3-O-TTG-AG-O"+"O-GGC-GT-K(다브실)-NH₂

모든 PNA 서열은 아민(N-) 말단으로부터 카르복실(C-) 말단으로 기재된다. 약어는 다음과 같다: Ac=아세틸, "E" 및 "+"는 상기 정의된 바와 같고, Flu=5(6)-카르복시플루오레세인, 다브실=4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산, O=8-아미노-3,6-디옥사옥타노산, K=아미노산 L-라이신 및 Cy3=Cy3 염료(Amersham).

실시예 13: 열 프로필 분석:

일반적인 실험 과정:

1.6ml, 10mm 궤도 길이 큐벳(Stana Cells, Inc.)을 사용하여 수 재킷화 셀 홀더(P/N 206-15439, Shimadzu)이 고정된 RF-5000 분광 형광측정계(Shimadzu)를 이용하여 형광성 측정치를 취한다. 순환성 수욕(Neslab)을 사용하여 큐벳 온도를 조절한다. 큐벳 내용물의 온도를, 프로브 팁을 상기 큐벳 상의 캡 내로 통과시킴으로서 액체 수준 아래에 삽입시킨 열전쌍 프로브(Barnant; 모델 번호 600-0000)를 사용하여 직접적으로 모니터한다(관행적인 제조).

PNA를 50% 수성 N,N'-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킴으로써, 정제된 PNA 프로브의 스톡 용액을 제조한다. 각 PNA 스톡으로부터, 1.6ml의 하이브리드화 완충액(50mM 트리스 HCl pH 8.3 및 100mM NaCl) 중에 각 10pmol의 농도로 다브실-PNA 및 Flu-PNA의 용액을 제조한다. PNA/PNA 이중체를 형성하기 위하여, 상기 튜브를 가열 블록에서 95℃ 하에 12분 동안 가열한다. 형광성 측정치를 기록하기 전에, 상기 용액을 가열 후 주위 온도에서 2시간 동안 정치시켜 둔다.

샘플을 493nm에서 여기시키고 형광을 521nm에서 측정한다. 큐벳을 가열함에 따라 수 많은 온도에서 데이타 지점을 수집한 다음 큐벳을 냉각시킴에 따라 다시 측정한다. 일반적으로, 욕 온도를 순차적으로 5℃씩 상승시킨 다음, 각 데이타 지점을 기록하기 전에 평형시킨다. 유사하게, 냉각 프로필을 만들기 위하여, 욕 온도를 순차적으로 5℃씩 강하시킨 다음 각 데이타 지점을 기록하기 전에 평형시킨다.

데이타 논의:

총론:

두 PNA 프로브를 혼합함으로써 당해 검출 복합체를 형성한다. 형성된 경우, 이러한 검출 복합체를 함유하는 용액의 형광 세기는 비교적 낮은데, 이는 형광단과 소광인자가 2개의 개별적인 중합체에 공유적으로 부착되어 있긴 하지만, 이들은 이들 각각의 누클레오염기 서열의 고안에 의해, 대부분 또는 거의 모든 형광 신호가 형광단과 소광인자 잔기의 상호작용에 의해 소멸되도록 인접하게 위치되어 있기 때문이다. 일단 형성되면, 이러한 검출 복합체를 가열하여 상기 검출 복합체를 열 변성시킴으로써 검출 복합체의 안정성을 결정한다. 검출 복합체를 열 변성시키면, 보다 강력한 형광 신호가 발생되는데, 이는 개개의 중합체가 물리적으로 떨어져 있게 되면, 소광인자 잔기가 대부분 또는 거의 모든 형광 신호를 소멸시킬 수 있을 정도로 형광단과 소광인자 잔기가 더 이상 근접하게 연결되어 있지 않기 때문이다. 따라서, 형광 신호의 세기는 샘플에 존재하는 검출 복합체의 비율(%)과 직접적으로 관련이 있다. 자외선 흡광도(전형적으로 260nm에서) 대신 형광 세기를 사용하긴 하지만, 이러한 데이타는 A₂₆₀분석을 이용하여 핵산 이중체의 열 융점(Tm)을 결정하는 경우에 관찰된 것과 유사한 S자형 프로필을 나타내야 한다. 이론적으로, 양 방법은 동일한 Tm을 생성시켜야 한다. 더욱이, 이러한 공정은 검출 복합체가 제련됨에 따른(재어닐링) 온도 강하와 함께 형광 세기가 저하되도록 가역적이어야 한다.

데이타:

a. 도 8a를 참조로 하면, 열 프로필 결과가, 1.6ml의 하이브리드화 완충액 중에서 1 대 1의 비율로 두 PNA 프로브를 혼합함으로써[10pmol의 Flu-O-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-NH₂(프로빙 중합체: 표 1의 프로브 번호 1)과 혼합된 10pmol의 Ac-TGG-AG-OO-GG-CGT-K(다브실)-NH₂(어닐링 중합체: 표 1의 프로브 번호 2)] 형성되는 검출 복합체에 대해 그래프적으로 예시된다. 고안에 의하면, 이러한 검출 복합체는 상보적 누클레오염기가 전혀 존재하지 않는 중합체의 중앙에 5bp 정도로 불록 솟아오른 복합체의 각 말단에 2개의 5bp 축 영역을 포함한다(도 1b 참조). 따라서, 이러한 2개의 5bp 세그먼트를 연결시키는 링커는, 검출 복합체가 형성할 수 있을 정도로 각각의 중합체 말단에 누클레오염기의 적합한 상호작용을 제공하기에 충분할 정도로만 필요하다.

본 실시예에서는, 검출 복합체는 가열(용융)시 형광 세기의 증가 및 냉각(재어닐링)시 이와 상관있는 형광 세기의 감소에 의해 지시된 바와 같이 용융과 재어닐링과 부합되는 열 프로필을 나타낸다. 데이타는 검출 복합체의 융점(Tm)이 대략 55℃라는 것을 지시해준다.

b. 도 9를 참조로 하면, 열 프로필 결과가, 1.6ml의 하이브리드화 완충액 중에서 1 대 1의 비율로 두 PNA 프로브를 혼합함으로써[10pmol의 Flu-O-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-NH₂(프로빙 중합체: 표 1의 프로브 번호 1)과 혼합된 10pmol의 Ac-"E"-TGG-TGG-CGT-K(다브실)-NH₂(어닐링 중합체: 표 1의 프로브 번호 5)] 형성되는 검출 복합체에 대해 그래프적으로 예시된다. 고안에 의하면, 이러한 검출 복합체는 상이한 길이의 두 PNA를 포함한다. 보다 짧은 어닐링 중합체가 프로빙 중합체의 말단의 일정 부분에 상보적이기 때문에, 이러한 검출 복합체는 6bp 테일링 서열을 갖는 9bp 이중체를 포함한다(도 1a 참조).

다시 언급하면, 검출 복합체는 가열(용융)시 형광 세기의 증가 및 냉각(재어닐링)시 이와 상관있는 형광 세기의 감소에 의해 지시된 바와 같이 용융과 재어닐링과 부합되는 열 프로필을 나타낸다. 데이타는 검출 복합체의 융점(Tm)이 대략 67℃라는 것을 지시해준다.

실시예 14: 하이브리드화 검정 데이타의 분석

일반적인 실험 과정:

본 연구를 위하여, 표적 서열로서 적합한 바이오틴 표지된 wt k-ras DNA 올리고누클레오티드를 합성한다. 상기 DNA는 5'에서 3'로 제시된다.

WT K-ras 바이오틴-GTG-GTA-GTT-GGA-GCT-GGT-GGC-GTA (서열 1)

F485 CW-램프 필터와 F535 방사 필터가 장착된 왈락(Wallac) 다중표지된 계수기를 사용하여 모든 하이브리드화 검정 데이타를 수집한다. MUNC MaxiSorp, 브릭아파트 미세역가판을 반응 용기로서 사용한다. 반응 성분을 가하기 전에, 각 미세역가판을 실온에서 15분 동안 하이브리드화 완충액으로 예비세척한다.

정제된 DNA를 TE(10mM 트리스.HCl pH 8.0; 0.1mM EDTA, Sigma Chemical)에 용해시킴으로써, 정제된 WT K-ras DNA(Genosys)의 스톡 용액을 제조한다. 이러한 DNA 스톡으로부터, 이 DNA 스톡을 하이브리드화 완충액으로 일련으로 희석시킴으로써 100pmol/㎕의 농도에서 WT K-ras DNA의 용액을 제조한다.

각 측정치는 도 8b에 도시된 바와 같이 상대적 양의 WT K-ras DNA와 검출 복합체를 갖는 100㎕의 총 용적을 함유하고 있다. 요구량의 검출 복합체(1당량에 대해서는 2㎕ 및 5당량에 대해서는 10㎕), 표적으로서의 WT K-ras DNA(1당량에 대해서는 1㎕ 및 5당량에 대해서는 5㎕) 및 하이브리드화 완충액을 필요에 따라 배합함으로써 샘플 100㎕을 제조함으로써 각 반응 샘플을 제조한다.

샘플을 혼합한 다음, 왈락 VICTOR 기기를 사용하여 형광 세기를 시간 함수로서 모니터한다. 수집된 데이타를 플롯팅하여 수치로 나타낸다.

데이타 논의:

총론:

어닐링 중합체와 프로빙 중합체를 혼합함으로써 검출 복합체를 형성시킨다. 형성되는 경우, 이러한 검출 복합체를 함유하는 용액의 형광 세기는 비교적 낮다. 형성되면, 상기 검출 복합체를, 프로빙 중합체를 표적 핵산(TNA)과 하이브리드화시키기에 적합한 조건 하에서 표적 핵산과 접촉시킨다. 표적 핵산에 대한 프로빙 중합체의 하이브리드화는 일반적으로, 검출 복합체를 해리시키는데, 단 표적 서열과 프로빙 세그먼트 간의 복합체의 안정성은 검출 복합체의 안정성과 비교해서 열역학적으로 더 선호된다. 검출 복합체 해리로 인해, 보다 강력한 형광 신호가 발생되는데, 이는 소광인자 잔기가 대부분 또는 거의 모든 형광 신호를 소멸시킬 수 있을 정도로 형광단과 소광인자 잔기가 더 이상 근접하게 연결되어 있지 않기 때문이다. 따라서, 하이브리드화는 표적 핵산이 존재하지 않는 샘플과 비교해서 형광 세기의 증가로써 검출된다.

데이타:

도 8b를 참조로 하면, 하이브리드화 검정 결과가 그래프로 도시되어 있다. 본 실시예의 경우에는, PNA 중합체의 1:1 혼합물[Ac-TGG-AG-OO-GG-CGT-K(다브실)-NH₂(표 1의 프로브 번호 2) 및 Flu-O-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-NH₂(표 1의 프로브 번호 1)]로부터 검출 복합체를 생성시킨다. 본 실시예에서는, 1:5, 5:1 및 1:1 표적 핵산/검출 복합체의 혼합물 각각을 분석한다. 대조군은 각각 0:5 및 0:1 표적 핵산/검출 복합체이다. 이 데이타는 대조군 샘플(시간이 지남에 따라 형광 세기의 실질적인 변화를 나타내지 않음)과 비교해서, 표적 핵산을 함유하는 샘플의 형광 세기가 시간에 따라 증가하고 대조군에서 관찰된 형광성 보다 실질적으로 더 크다. 따라서, 이러한 데이타는 본 발명의 검출 복합체가 프라이머 대신 프로브로서 사용될 수 있다는 것을 입증해준다.

실시예 13 및 14에서 수행된 분석을 표 1에 열거된 다른 PNA에 적용함으로써 유사한 결과를 생성시킬 수 있다. 이 결과는 안정한 검출 복합체는 예측 가능한 방식으로 형성/해리된다는 것을 입증해준다. 더욱이, 이들 검출 복합체를 프로브로서 사용하여 샘플 중에서의 표적 서열 및/또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출할 수 있다.

실시예 15: PCR에서 프라이머로서의 검출 복합체의 용도

개론

본 실시예에 기재된 검정은 초기에는 어두운(비-형광성) PCR 반응으로부터 발생된 예측 가능한 형광 신호를 수득하기 위해 제시된 것이다. 이러한 검정 동안에 발생된 검출 가능한 형광 신호는 증폭 반응에 의해 생성된 핵산의 양에 정비례한다.

실험 A

본 실험은 검출 복합체가 PNA 소광인자의 하이브리드화에 의해 형성되고 3' 및 5' DNA 프라이머 각각이, 검출 복합체가 해리되는 경우에 검출 가능한 형광 신호를 발생시키는 방식으로 특정 환경에서 열 변화에 반응하여 가역적인 용융과 재어닐링될 수 있다는 것을 입증하기 위해 사용된다.

실험 B

본 실험의 경우에는, 증폭 반응에 의해 발생된 형광 세기가 증폭 주기수와 상관될 수 있도록 주형 농도를 고정시킨다. 반응마다 1fmole의 주형을 사용하여 PCR 반응을 17, 20, 23, 26, 29, 32 및 35 증폭 주기에 대해 수행한다. 이어서, PCR 반응의 형광 신호를 정량하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 샘플 성분을 분리함으로써, 핵산 증폭 생성물의 존재와 길이를 확인한다. 음성 대조군(주형 없음)을 또한 수행한다(35주기). 형광 정량 데이타는 PCR의 주기 수와 상당히 상관이 있다. 이와 같이 정량된 형광 신호는 또한, 폴리아크릴아미드 겔 분석에서 관찰된 형광성 출발 물질 및 생성물의 양과 상당한 상관이 있다.

실험 C

본 실험의 경우에는, 고정된 주기수에서 일어나는 증폭 반응에 의해 발생된 형광 세기가 각 PCR 반응에서 주형의 양과 상관이 있을 수 있도록 주형 농도를 변화시킨다. 본 검정에 의해 발생된 정량된 형광 신호가 표적의 7log 범위에 걸쳐 극히 규칙적인 것으로 밝혀졌다(1fmole 내지 1zmole). 이러한 실험은 검정 결과를 표준 곡선과 비교함으로써 공지되지 않은 샘플에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 양을 결정하는데 사용될 수 있는, 표준 곡선을 발생시키는 방법을 사용하는 것의 실행 가능성을 입증해준다.

재료 및 방법

프로브, 프라이머 및 주형:

PNA 소광인자:

이러한 PNA 소광인자는 3' 및 5' DNA 프라이머 모두의 5' 말단의 13개 누클레오염기에 상보적이도록 고안한다. 이러한 바람직한 양태를 사용하여, 3' 및 5' DNA 소광인자 모두의 형광을 소멸시키는데에는 단지 1개의 PNA 소광인자 만이 필요하다. PNA 소광인자의 보다 짧은 버젼(길이가 11 및 9개 누클레오염기임)(표 1, 번호 7 및 8 참조)은 또한, 검출 복합체의 형광 신호를 소멸시키는 것으로 밝혀졌다(데이타는 제시되지 않음). 그러나, 이들 실험에는 가장 긴 PNA 소광인자가 선택되었는데, 이는 이 것이 가장 안정한 검출 복합체를 형성하기 때문이다.

PNA 소광인자(표 1, 번호 6) C 다브실(K)-AGTAAGCGTTAGT-OO-+-Ac N

여기서, C=카르복시 말단, N=아민 말단, "Ac", "K", "+", "다브실" 및 "O"은 앞서 정의된 바와 같다.

DNA 프라이머:

5' DNA 프라이머와 3' DNA 프라이머는 관심있는 표적 핵산 상의 프라이밍 부위에 상보적인 프라이밍 서열(밑줄쳐져 있음)과 PNA 소광인자가 하이브리드화되는 공통의 복합체 형성 세그먼트(CFS)(진하게 표지됨) 모두를 포함한다. 상기 공통의 복합체 형성 세그먼트는 PNA 소광인자와 하이브리드화되는 상호작용기를 포함한다.

〈 공통의 CFS〉〈독특한 프라이밍 서열〉

5' 프라이머 5' Flu-TCATTCGCAATCAATGACTGAATATAAACTTGT-OH 3'(서열 2)

3' 프라이머 5' Flu-TCATTCGCAATCACTCTATTGTTGGATCATATT-OH 3'(서열 3)

시판용 시약과 기기를 사용하여 DNA 프라이머를 제조하고 당해 분야의 숙련인에게 공지된 방법을 이용하여 정제한다. Flu=5(6)-카르복시플루오레세인 표지를 아미노헥산올 연결물을 통하여 프라이머에 부착시킨다.

dsDNA K-ras 플라스미드 주형(증폭된 영역 만이 밑줄쳐져 있는 프라이밍 부위와 함께 제시됨)

PNA 소광인자를 물에 희석시키고 4℃ 하에 저장한다. 프라이머와 DNA 주형을 TE(10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA)에서 희석시키고 4℃ 하에 저장한다.

PCR 검정:

오일이나 왁스를 사용하지 않고 개개의 미니에펜도르프 튜브에서 퍼킨-엘머 2400 더머사이클러로 PCR 반응을 수행한다. 이러한 PCR 프로토콜은 94℃까지 5초 가온시킨 다음(단지 1회전임), 94℃에서 5초간 변성시키고, 55℃에서 1분간 어닐링시키며, 74℃에서 1분간 연장시키는 것을 포함한다. 실험 B에서는 변성-어닐링-연장 주기를 35회 반복하고 실험 C에서는 40회 반복한다. 실험 C에서만, 40회 후에 7분 간의 연장 단계를 추가로 수행한다.

각 PCR 반응물은 2pmole의 5' 및 3' DNA 프라이머, 2mM MgCl₂, 125μM ATP, 125μM CTP, 125μM GTP, 125μM TTP, 1단위 Ampli Taq DNA 폴리머라제, 50mM KCl, 및 10mM 트리스, pH 8.3을 함유한다. 실험 B는 반응마다 12pmole의 PNA 소광인자가 사용됨으로써 3:1 비율의 PNA 소광인자 대 DNA 프라이머가 발생된다. 실험 C는 반응마다 16pmole의 PNA 소광인자가 사용됨으로써 4:1 비율의 PNA 소광인자 대 DNA 프라이머가 발생된다.

DNA 프라이머와 PNA 소광인자 간의 완전한 하이브리드화를 허용하기 위하여, PCR의 성분들을 먼저, 환저 미세역가판에서 혼합하고, 실온에서 약 5분 동안 온화하게 진탕시키면서 배양한다. 상기 판을 왈락 다중표지 계수기 내로 놓아두고, 형광성을 웰당 1초 동안 측정한다. 485nm에서 여기 필터를 사용하고 535nm에서 방사 필터를 사용하여 형광을 측정한다. 예비반응 형광을 결정한 후("RLU 이전" 측정), 상기 샘플을 미니에펜도르프 튜브에 옮기고 PCR을 수행한다.

PCR 후, 샘플을 "RLU 이후" 형광 측정을 위해 새로운 미세역가판에 옮긴다. 각 반응의 후 PCR 형광을 결정한 후, 2㎕의 5X 부하 염료를 각 샘플에 가하고, 이어서 전체 반응 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(조건: 10 내지 20% 폴리아크릴아미드 구배 겔, 및 100V, 40mA에서 대략 1.5시간 동안 전기영동됨)을 이용하여 분리한다. 에티듐 브로마이드 염색 이전에, 트랜스일루미네이터(UV광 302nm; 예를 들면, 도 12a 및 14a 참조)를 사용하여, 상기 겔에 함유된 형광성 생성물의 사진 영상을 수득한다. 주위 온도에서 2분 동안 온화하게 진탕시키면서 겔을 500μM 에티듐 브로마이드 용액에서 염색시키고, 약 15분 동안 물에서 탈색시킨 다음, 트랜스일루미네이터로부터 UV광에 노출되는 동안 다시 사진을 찍는다(도 12b 및 14b). 이어서, 고 pH 완충액에 2분 동안 놓아두어 본래의 PNA 소광인자-DNA 프라이머 복합체를 변성시킨 후, 이들을 트랜스일루미네이터로부터 UV광에 노출되는 동안 3번째로 사진을 찍는다(도 12c 및 14c).

시약:

DNA 주형을 사람 DNA로부터 PCR 증폭시키고(Clontech로부터 구입한 키트를 사용함) pCR2.1 플라스미드(Invitrogen) 내로 클로닝시킨다. 클론을 제한 단편 분석함으로써 스크리닝한 다음 서열화한다. 큰 플라스미드 제제를 생성시키고 표준 기술을 사용하여 정량한다. 이와 같이 클로닝된 서열을, 점 돌연변이가 특정 질환 상태에서 발생되는 것으로 공지되어 있는 사람 K-ras유전자에서 특정 영역에 플랭킹한다. 이와 같이 증폭된 K-ras 영역은 길이가 111bp이지만, 상기 언급된 DNA 프라이머 모두를 사용하여 증폭시킨 경우에는, 이러한 프라이머에 존재하는 2개의 13bp 복합체 형성 세그먼트의 혼입으로 인해 137bp 앰플리콘이 제조된다(111+13+13=137).

10X 완충액, 염화마그네슘 용액, AmpliTaq DNA 폴리머라제, 및 누클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 PCR 시약을 퍼킨-엘머로부터 수득한다.

10 내지 20% 구배 예비-주조 미니-겔, 10X 수행 완충액, 및 5X 샘플 염료를 공급원(ESA, Inc., Chelmsford, MA)으로부터 수득한다.

고 pH 완충액: 0.4M NaOH, 0.6M NaCl, pH 대략 13.

TE: 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA.

PhiX174/Hae III는 공급원(New England BioLabs)으로부터 수득한다. 이는 TE에 1㎍/㎕로 공급된다.

결과

개론:

다음 결과 및논의에서는, 본래의 데이타 지점 모두가 유도된 수로 포함되어 있다. 배경을 유도된 데이타 모두로부터 삭감한다.

실험 A:

검정 기재:

1.6ml, 10mm 궤도 길이 큐벳(Stana Cells, Inc.)을 사용하여 수 재킷화 셀 홀더(P/N 206-15439, Shimadzu)이 고정된 RF-5000 분광 형광측정계(Shimadzu)를 이용하여 형광성 측정치를 취한다. 순환성 수욕(Neslab)을 사용하여 큐벳 온도를 조절한다. 큐벳 내용물의 온도를, 액체 수준 아래에 삽입시킨 열전쌍 프로브(Barnant; 모델 번호 600-0000)를 사용하여 직접적으로 모니터한다.

PNA를 50% 수성 N,N'-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킴으로써, 정제된 PNA 소광인자의 스톡 용액을 제조한다. DNA를 10mM 트리스 pH 8.3, 1mM EDTA(TE)에 용해시킴으로써, 정제된 DNA 프라이머의 스톡 용액을 제조한다. 각 하이브리드에, 20pmole PNA 소광인자 및 10pmole의 3' 또는 5' DNA 프라이머를 혼합한 다음, 1.6ml의 하이브리드화 완충액(50mM 트리스, pH 8.3 및 100mM NaCl)에서 희석시킨다. 열 프로필에 대한 데이타가 수집되기 전에 상기 검출 복합체가 실온(21℃)에서 형성되도록 한다.

샘플을 495nm에서 여기시키고 형광을 520nm에서 측정한다. 큐벳을 가열함에 따라 수 많은 온도에서 데이타 지점을 수집한 다음 큐벳을 냉각시킴에 따라 다시 측정한다.

논의:

PNA 소광인자에 하이브리드화된 3' 및 5' DNA 프라이머 각각에 대한 형광 대 온도 데이타로부터 발생된 열 프로필이 도 10a 및 10b에 도시되어 있다. 도 10a와 10b는 모두, PNA/핵산 하이브리드의 용융과 재어닐링에 대해 예상된 유형의 S자형 가열 및 냉각 곡선을 나타낸다. 양 가열 곡선의 경우, 곡선의 반곡점이 대략 60℃인데(대략 Tm 값임), 이러한 곡선은 보다 위 아래로 레벨링하여 각각 대략 50 및 70℃에서 안정된다. 5' DNA 프라이머에 대한 냉각 곡선이 다소 히스테리시스를 나타내긴 하지만, 데이타는 상기 복합체가 특정 환경하에서의 열 변화에 반응하여 용이하게 해리되고 개정된다는 것을 입증해준다. 더욱이, 이러한 검출 복합체의 해리로부터 발생되는 굉장한 형광 증가가 존재하게 된다.

실험 B:

검정 기재:

미세역가판에 시약을 가하기 전에, 이러한 미세역가판의 각 웰에 대한 배경 형광을 기록한다. 주형, DNA 프라이머 및 PNA 소광인자를 제외한, PCR 반응에 대한 시약 모두를 함유하고 있는 마스터 혼합물을 만든다. 이러한 마스터 혼합물 6마이크로리터를 상기 미세역가판의 8개 반응 웰 각각에 가한다. 이어서, 각 웰에 1㎕의 각 3' 및 5' DNA 프라이머(2pmole/㎕), 1.5㎕의 PNA 소광인자(8pmole/㎕), 및 1㎕의 주형(1fmole/㎕)을 총 용적 10.5㎕에 대해 가한다. 음성 대조군의 경우, 주형 대신 1㎕의 TE를 가한다. 각 반응에 대한 시약 모두가 배합되면, RLU 이전 측정을 기록하고, 앞서 언급된 바와 같이 PCR 반응을 수행하기 위하여 샘플을 미세튜브에 옮긴다.

분석용 샘플을 회수하기 위하여 주기 17, 20, 23, 26, 29 및 32에서 1분간 74℃ 연장 단계 후 PCR을 잠시 중단한다. 이들 샘플을 더모사이클러로부터 꺼낸 후, 이를 4℃ 냉장고에 넣어둔다. 이러한 프로토콜의 각 주기는 대략 1분 15초 동안 지속되므로, 17주기에서의 샘플의 회수와 35주기에서의 샘플의 회수 간의 시간양은 거의 정확하게 60분으로 동일하다. 모든 PCR 반응을 완료한 후에 35주기 샘플을 냉장고에서 5분 동안 냉각시킨다. 모든 샘플을, 후-PCR 형광성 측정을 위해 깨끗한 미세역가판에 옮기기 전에 실온에서 간단하게 원심분리시킨다. 이때, 후-PCR 형광성 측정은 샘플을 대략 10분 동안 실온에서 놓아두게 만든다.

	A	B	C	D	E
1	샘플	PCR 주기	RIU 이전	RIU 이후	S/N 비
2	음성	35	2412	1804	0.7
3	양성	17	2422	4858	2.0
4	양성	20	2794	10589	3.8
5	양성	23	2568	14249	5.5
6	양성	26	2494	15510	6.2
7	양성	29	2820	20833	7.4
8	양성	32	2934	25192	8.6
9	양성	35	2754	28007	10.2

논의:

이러한 실험 B에 대해 수득된 데이타가 표 2 및 도 11 및 12에 제시되어 있다. 표 2를 참조로 하면, 양 실험 및 유도된 표로 만든 데이타가 제시되어 있다. 샘플 유형(양성 또는 음성)이 칼럼 A에 표시되어 있다. PCR 주기의 수가 칼럼 B에 열거되어 있다. PCR에 앞서 취한 형광 측정치가 칼럼 C("RIU 이전")에 표시되어 있다. PCR 후의 형광 측정치가 칼럼 D("RIU 이후")에 표시되어 있고, 산정된 신호 대 노이즈 비율이 칼럼 E에 제시되어 있다. 신호 대 노이즈는 "RIU 이후" 값을 "RIU 이전" 값으로 나눔으로써 산정한다. 도 11은 표 2의 칼럼 B ＆ E에 제시된 데이타를 그래프로 나타낸 것이다. 도 12는 트랜스일루미네이터 상에 위치한 특정 겔의 형광으로부터 취한 3개 사진(A, B ＆ C)의 3가지 컴퓨터 발생된 복합 음화 영상을 포함한다. 3개 사진 모두는 재료 및 방법(상기)에 기재된 조작 각각을 수행한 후에 동일한 겔로부터의 것이다. 더욱 구체적으로 언급하면, 사진 A에서는, 분리된 샘플 성분의 모든 본래의 형광이 가시적이다. 사진 B에서는, 에티듐 브로마이드에 의해 염색될 수 있는 모든 성분이 가시적이다. 사진 C에서는, 변성 조건 하에서 형광성인 모든 샘플 성분이 가시적이다.

앞서 정의된 바와 같이, "RIU 이전" 값은 PCR 이전 반응의 형광 측정치이다. 표 2를 참조로 하면, 칼럼 C, "RIU 이전" 값은 극히 낮고, 모든 샘플에 대해 다소 유사하다. 이는 형광 소광이 PNA 소광인자와 3' 및 5' DNA 프라이머 간에 형성된 복합체에 대해 상당히 효율적이라는 것을 지시해준다.

PCR 증폭으로 인해, 당해 검출 복합체가 해리됨으로써, 주형을 함유하고 있는 모든 샘플에 대한 "RIU 이후" 값(칼럼 D)을 "RIU 이전" 값(칼럼 C)와 비교함으로써 추론될 수 있는 바와 같이 검출 가능한 형광 신호를 발생시킨다. 이러한 데이타는 형광성 3' 및 5' PNA 프라이머를 dsDNA 내로 혼입한 것과 부합된다. 1보다 큰 신호 대 노이즈비(S/N, 칼럼 E)는 PCR 반응을 완료한 후의 형광성 증가를 지시해준다.

표 2의 칼럼 B 및 E를 참조로 하면, 1fmole의 주형을 함유하는 모든 샘플에 대한 S/N 비와 PCR의 주기 수 간에는 명백한 상관이 있다. 이러한 S/N 비는 주기 17에서 2.0의 값(칼럼 E, 3열)에서부터 주기 35에서의 10.2값(칼럼 E, 9열)까지 꾸준하게 증가한다. 이러한 꾸준한 증가는 데이타를 그래프로 도시한 것으로부터 명백하다(도 11). 음성 대조군은 35주의 PCR로부터 발생되는 어떠한 형광성 증가도 나타내지 않는다. 미세역가판과 미니-에펜도르프 튜브 간의 전달 동안에 샘플의 손실이 관찰되었다(약 1 내지 2㎕). 이러한 샘플 손실은 적어도 부분적으로는, 상기 대조군에 대한 1.0 미만의 S/N 비에 원인이 있을 것이다.

도 12에 제시된 사진 영상은 표 2 및 도 11을 참조하여 논의된 관찰된 형광성 증가가 PCR 반응에 의한 dsDNA의 생성과 상관이 있을 수 있다는 것을 명백히 입증해준다.

이러한 사진 영상이 상단에서 샘플 웰과 함께 표시되어 있다. 레인 1은 음성 대조군을 함유하고, 레인 2 내지 8은 순차적으로 PCR의 17, 20, 23, 26, 29, 32 및 35주기에 대한 반응물이다. 레인 9는 크기 마커 PhiX174/Hae III이다.

도 12, 사진 A를 참조로 하면, 겔을 수행한 직후에 형광이 관찰되었다. 이러한 사진에서는, 형광성 dsDNA가 상기 영상 중간지점 바로 아래인, 레인 2 내지 8에서 가시적이다. 형광 세기는 보다 큰 수의 PCR 주기에 의해 생성된 dsDNA의 증가량에 대해 예상되는 바와 같이 좌측에서 우측으로 증가하였다. 음성 대조군(레인 1) 또는 당해 PCR 검출 복합체로부터는 어떠한 형광도 관찰되지 않았다.

도 12, 사진 B를 참조로 하면, 겔을 에티듐 브로마이드로 염색한 후에 형광이 관찰되었다. 사진 B에서는 dsDNA 크기 마커 PhiX174/Hae III이 레인 9에서 가시적인 것을 제외하고는 사진 A와 B에서의 영상 간의 차이는 거의 없다. 137bp의 증폭된 PCR 단편의 위치는 198bp와 118bp 단편(2개의 검은 화살표로 표시됨) 간의 위치와 일치된다.

도 12, 사진 C를 참조로 하면, 에티듐 브로마이드 처리된 겔을 연속적으로 수산화나트륨 용액으로 처리하여 dsDNA 뿐만 아니라 프라이머/PNA 소광인자 복합체를 변성시킨 후에 형광이 관찰되었다. 상기 도면은 혼입되지 않은 형광성 프라이머가 dsDNA 밴드와 염료 프런트(이러한 염료 프런트는 사진 영상에서는 가시적이지 않다) 사이에 위치한다는 것을 나타낸다. 프라이머의 형광 세기는 dsDNA 앰플리머의 세기와 반비례한다. 구체적으로 언급하면, 이러한 프라이머 벤드가 레인 1에서 매우 두드러지는데, 여기서는 PCR 35주기 동안 dsDNA이 전혀 형성되지 않았다. 그러나, 각각의 연속되는 레인 2 내지 8을 사용한 경우, 형광 세기가 감소하였는데, 이로써 형광성 프라이머가 dsDNA 앰플리콘 내로 혼입되었다는 것이 입증되었다(보다 고차수로 수행된 밴드의 세기와 비교함).

이들 프라이머는 사진 A와 B에서는 전혀 가시적이지 않는데, 이는 이들이 PNA 소광인자와 연결되었기 때문이다(사진 A). 변성 조건 하에서, 상기 프라이머는 PNA 소광인자로부터 해리되기 때문에 형광을 나타낸다. 흥미롭게도, dsDNA 크기 마커는 사진 C에서는 사라지는데, 이는 아마도, 에티듐 브로마이드가 변성 조건 하에서 비-형광성이기 때문이다.

요약:

PCR 반응을, 1pmole의 주형을 유입하면서 17, 20, 23, 26, 29, 32 및 35 주기에 대해 수행한다. 주형을 사용하지 않는 음성 대조군을 35주기의 PCR에 대해 수행한다. 주형 함유 반응에서 발생된 형광성 신호의 세기와 PCR 주기 수 간에 직접적인 관계를 정립한다. 신호 대 노이즈 비는 주기 17에서의 2.0에서부터 주기 35에서의 10.2로 증가한 반면, 음성 대조군은 검출 가능한 어떠한 형광 신호도 발생하지 못하였다. 형광계로 측정한 형광 신호는 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 형광성 dsDNA 스크린의 양 및 PCR 반응 각각에서 소모된 형광성 프라이머의 양과 상당한 상관이 있다. 전체적으로 언급하면, 본 실험은, 총 PCR 주기수와 일치하는 방식으로 PCR 반응 각각에서 형광 신호가 증가하므로 이러한 PCR 공정에 의해 발생된 dsDNA 앰플리콘의 양이 증가하게 된다는 것을 결론적으로 입증해준다.

실험 C:

검정 기재:

실험 C는 주형 수준이 1.0E-15mole(1femtomole)에서 1.0E-21mole(1zeptomole)로 다양한 경우에 PCR 반응으로부터 형광 신호를 발생하는 것을 모니터하도록 고안된다.

미세역가판에 시약을 가하기 전에, 이러한 미세역가판의 각 웰에 대한 배경 형광을 기록한다. 주형, DNA 프라이머 및 PNA 소광인자를 제외한, PCR 반응에 대한 시약 모두를 함유하고 있는 마스터 혼합물을 만든다. 이러한 마스터 혼합물 6마이크로리터를 상기 미세역가판의 8개 반응 웰 각각에 가한다. 이어서, 각 웰에 1㎕의 각 DNA 프라이머(2pmole/㎕), 2.0㎕의 PNA 소광인자(8pmole/㎕)총 용적 10.0㎕에 대해 가한다. 최종적으로, 1㎕ 등취량의 앞서 제조된 희석 시리지의 플라스미드 주형을 가한다. 이러한 희석 시리즈는 TE 완충액에서 만든, 1fmole/㎕ 내지 1zmole/㎕의 7개 1log 단계로 이루어진다. 음성 대조군의 경우, 주형 대신 1㎕의 TE를 가한다. 각 반응에 대한 시약 모두가 배합되면, "RLU 이전" 측정치를 기록하고, 앞서 언급된 바와 같이 PCR 반응을 수행하기 위하여 샘플을 미세튜브에 옮긴다.

각 반응의 형광 세기를 PCR 이전 및 40주기 후에 측정한다. 모든 샘플을 "RIU 이후" 형광 측정을 위해 깨끗한 미세역가판에 옮기기 전에 실온에서 간단하게 원심분리시킨다.

논의:

이러한 실험 C에 대해 수득된 데이타가 표 3 및 도 13 및 14에 제시되어 있다. 표 3를 참조로 하면, 양 실험 및 유도된 표로 만든 데이타가 제시되어 있다. 표 3을 참조로 하면, 주형 농도가 칼럼 A에 표시되어 있다. PCR에 앞서 측정된 형광 측정치가 칼럼B에 표시되어 있고, PCR 후의 형광 측정치가 칼럼 C에 표시되어 있다. 산정된 신호 대 노이즈 비(실험 A에서 산정된 바와 같음)가 칼럼 D에 제시되어 있다. 칼럼 D에 제시된 데이타는 도 13에 그래프로 도시되어 있다. 도 14는 재료 및 방법(상기)에 기재된 바와 같이 처리시킨 동일한 겔의 3개 사진(A, B ＆ C)의 3가지 컴퓨터 발생된 복합 음화 영상을 포함한다. 더욱 구체적으로 언급하면, 사진 A에서는, 분리된 샘플 성분의 모든 본래의 형광이 가시적이다. 사진 B에서는, 에티듐 브로마이드에 의해 염색될 수 있는 모든 성분이 가시적이다. 사진 C에서는, 변성 조건 하에서 형광성인 모든 샘플 성분이 가시적이다.

	A	B	C	D
1	주형(mole)	RIU 이전	RIU 이후	S/N 비
2	NT	2694	1750	0.6
3	1E-21	2158	7290	3.4
4	1E-20	2526	23312	9.2
5	1E-19	2504	19393	7.7
6	1E-18	2638	25438	9.6
7	1E-17	2542	32365	12.7
8	1E-16	2594	35302	13.6
9	1E-15	2478	43563	17.6

표 3, 칼럼 B를 참조로 하면, "RIU 이전" 값은 극히 낮고, 모든 샘플에 대해 다소 유사하다. 이는 형광 소광이 PNA 소광인자와 3' 및 5' DNA 프라이머 간에 형성된 복합체에 대해 상당히 효율적이라는 것을 지시해준다.

표 3의 칼럼 A 및 D를 참조로 하면, PCR 반응에 가해진 주형의 양(칼럼 A)과 PCR 40주기 후의 샘플에 대한 S/N 비(칼럼 D) 간에는 명백한 상관이 있다. 구체적으로 언급하면, 이러한 S/N 비는 주형의 1E-21mol에 대한 3.4값(칼럼 D, 3열)에서부터 주형의 1E-15mole에 대한 17.6값까지 예측 가능한 방식으로 일정하게 증가하였다. 이러한 일정한 형광 세기 증가는 도 13에 제시된 데이타에 의해 용이하게 가시화된다. 음성 대조군은 0.6의 S/N 비(칼럼 D, 2열)에 의해 지시된 바와 같이 PCR 동안 형광 증가를 전혀 나타내지 않는다. 미세역가판과 미니-에펜도르프 튜브 간의 전달 동안에 샘플의 손실이 관찰되었다(약 1 내지 2㎕). 이러한 샘플 손실은 적어도 부분적으로는, 상기 대조군에 대한 1.0 미만의 S/N 비에 원인이 있을 것이다.

도 14에 제시된 사진 영상은 표 3 및 도 13을 참조하여 논의된 관찰된 형광성 증가가 PCR 반응에 의한 dsDNA의 생성과 상관이 있을 수 있다는 것을 명백히 입증해준다.

이러한 사진 영상이 상단에서 샘플 웰과 함께 표시되어 있다. 레인 1은 HaeIII로 분해된 1㎍의 PhiX174 dsDNA를 함유한다. 레인 2 내지 8은 순차적으로, 주형 DNA의 양에 있어서 지수적 증가를 함유하는 반응물이다.

도 14, 사진 A를 참조로 하면, 겔을 수행한 직후에 형광이 관찰되었다. 이러한 사진에서는, 형광성 dsDNA가 상기 영상 중간지점 바로 아래인, 레인 3 내지 9에서 가시적이다. 형광 세기는 PCR 반응의 초기 주기에서 보다 더 많은 주형을 가짐으로써 생성된 dsDNA 앰플리콘의 증가량에 대해 예상되는 바와 같이 좌측에서 우측으로 증가하였다. 주형이 결여된 샘플(음성 대조군, 레인 2)에서는 어떠한 형광도 관찰되지 않았다.

도 14, 사진 B를 참조로 하면, 겔을 에티듐 브로마이드로 처리한 후에 형광이 관찰되었다. 사진 B에서는 dsDNA 크기 마커 PhiX174/Hae III이 레인 1에서 가시적인 것을 제외하고는 사진 A와 B에서의 영상 간의 차이는 거의 없다. 크기 마커는 상기 웰에서의 작제로 인해 약하게 부하되며, 그 결과, 사진을 보기가 어렵다. 레인 3 내지 9에서 관찰된 밴드와 크기가 가장 근접한 두 단편을 198bp 단편과 118bp 단편이며, 이는 검은색 화살표로 표시된다.

도 14, 사진 C를 참조로 하면, 에티듐 브로마이드 처리된 겔을 연속적으로 수산화나트륨 용액으로 처리하여 dsDNA 뿐만 아니라 프라이머/PNA 소광인자 복합체를 변성시킨 후에 형광이 관찰되었다. 상기 도면은 혼입되지 않은 형광성 프라이머가 dsDNA 밴드와 염료 프런트(이러한 염료 프런트는 사진 영상에서는 가시적이지 않다) 사이에 위치한다는 것을 나타낸다. 프라이머 밴드의 형광 세기는 dsDNA 앰플리머의 세기와 반비례한다. 구체적으로 언급하면, 이러한 프라이머 벤드가 레인 2에서 매우 두드러지는데, 여기서는 dsDNA이 전혀 형성되지 않았다. 그러나, 각각의 레인 3 내지 9에서는, 형광 세기가 순차적으로 감소하였는데, 이로써 형광성 프라이머가 dsDNA 앰플리머 내로 혼입되었다는 것이 입증되었다(각 레인에서 프라이머에 대한 형광 세기를 보다 고차수로 수행된 137bp 밴드의 세기와 비교함).

이들 프라이머는 도 14, 사진 A와 B에서는 전혀 가시적이지 않는데, 이는 이들이 PNA 소광인자와 연결되었기 때문이다(사진 A). 변성 조건 하에서, 상기 프라이머는 PNA 소광인자로부터 해리되기 때문에 형광을 나타낸다. 흥미롭게도, dsDNA 크기 마커는 도 14, 사진 C에서는 사라지는데, 이는 아마도, 에티듐 브로마이드가 변성 조건 하에서 비-형광성이기 때문이다.

요약:

주형 DNA의 일련의 희석물을 만든 다음 이를 PCR 증폭 반응에 사용한다. PCR 반응에서 발생된 형광 신호 세기는 7log 범위(1fmole 내지 1zmole)에 걸쳐 주형 유입량과 직접적인 상관이 있다는 것을 나타내기 위해 제시된다. 분광 형광측정계로 측정한 형광 신호는 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 형광성 dsDNA 스크린의 양 및 PCR 반응 각각에서 소모된 형광성 프라이머의 양과 상당한 상관이 있다. 전체적으로 언급하면, 본 실험은 각 PCR 반응에서 발생된 형광 세기가 주형 유입량과 상관이 있으므로 PCR 공정에 의해 발생된 dsDNA 앰플리콘의 양과 상관이 있다는 것을 결정적으로 입증해준다. 결론적으로, 이러한 검정은 공지되지 않은 샘플 중에서의 표적 서열 또는 표적 분자의 양을 결정하는데 사용할 수 있는 밀폐된 튜브 검정에 대한 표준 곡선을 생성시키는 타당성을 입증해준다. 추가로, 상기 검정은 매우 민감한데, 이는 검사된 가장 낮은 표적 수준인 1zeptomole 아래의 배경 위에서 검출될 수 있는 신호를 생성시킬 수 있기 때문이다.

실시예 16: 다중체 PCR에서의 검출 복합체의 용도

개론

본 실시예에서는, 두 세트의 독립적으로 검출 가능한 PCR 검출 복합체 프라이머를 사용하여 다중체 PCR 검정을 수행하는데, 여기서 각 세트의 프라이머는 당해 검정에 존재하는 경우에 2개의 상이한 DNA 표적 분자 중의 하나를 증폭시키도록 고안된다. 제1 프라이머 세트를 플루오레세인(그린)으로 표지시키고 K-ras 플라스미드에서 K-ras 유전자 서열을 특이적으로 증폭시킨다(실시예 15에 기재된 바와 같음). 제2 프라이머 세트를 로다민(적색)으로 표지시키고 BR322 플라스미드 중의 특정 영역을 특이적으로 증폭시킨다. 양 PCR 검출 복합체는, 증폭이 일어나서 상기 검출 복합체가 해리될 때까지 플루오레세인과 로다민 표지 모두의 형광을 소멸시키는 다브실 소광인자 잔기를 포함하는 동일한 공통의 PNA 어닐링 중합체(PNA 소광인자)를 이용한다.

재료 및 방법

프로브, 프라이머 및 주형:

PNA 소광인자:

PNA 소광인자(표 1, 번호 6) C 다브실(K)-AGTAAGCGTTAGT-OO-+-Ac N

C=카르복실 말단, N=아민 말단, "Ac", "K", "+", "다브실" 및 "O"는 앞서 정의된 바와 같다.

DNA 프라이머:

3' DNA 프라이머는 관심있는 표적 핵산상의 프라이밍 부위에 상보적인 프라이밍 서열과, PNA 소광인자가 하이브리드화되는 공통의 복합체 형성 세그먼트(CFS; 진하게 나타냄) 모두를 포함한다. 5' 프라이머는 표지되지 않는다.

프라이머 세트 A(K-ras 프라이머 세트)

5' 프라이머 5' HO-ATGACTGAATATAAACTTGT-OH 3'(서열 6)

3' 프라이머 5' Flu-TCATTCGCAATCACTCTATTGTTGGATCATATT-OH 3'(서열 3)

프라이머 세트 B(BR322 프라이머 세트)

5' 프라이머 5'-HO-CACTATCGACTACGCGATCA-OH 3'(서열 7)

3' 프라이머 5' Rho-TCATTCGCAATCATAGGTTGAGGCCGTTGAGCA-OH 3'(서열 8)

프라이머 세트 C(K-ras ＆ BR322 프라이머 세트)

이러한 프라이머 세트는 프라이머 세트 A ＆ 프라이머 세트 B의 혼합물을 포함한다. 이러한 프라이머 세트는 K-ras 플라스미드와 BR322 플라스미드 주형 중의 어느 하나 또는 둘다를 동시에 다중체 확인하는데 유용하다.

테트라메틸 로다민(Rho)으로 표지된 BR322 3' 프라이머(서열 8)을 공급원(Genosys, The Woodlands, Texas)으로부터 수득한다. 시판용 시약과 기기를 사용하여 3' K-ras 프라이머를 만든다. PNA 소광인자를 50% 수성 DMF에서 희석시키고 4℃에서 저장하는 반면, DNA 프라이머와 DNA 주형을 TE에 희석시키며 4℃에서 저장한다.

dsDNA 주형:

K-ras 플라스미드: 이러한 플라스미드의 제조와 이의 증폭된 영역의 서열이 실시예 15에 기재되어 있다.

BR322 플라스미드: 이러한 플라스미드는 시판중이고 공급원(New England BioLabs, #303-35)로부터 수득한다. 상기 플라스미드의 증폭된 영역의 서열이 다음에 제시된다:

dsDNA 주형(증폭된 영역만: 프라이밍 부위가 밑줄쳐져 있다)

실시예 15에 기재된 바와 같이, 상기 프라이머에 의해 증폭된 K-ras 플라스미드의 영역은 길이가 111bp이다. 그러나, 본 실시예 16에 기재된 DNA 프라이머 모두를 사용하여 증폭시킨 경우에는, 124bp 앰플리콘이 발생되는데, 이는 3' 프라이머로부터 하나의 13bp 복합체 형성 세그먼트(CFS)의 혼입이 앰플리콘을 13bp정도 연장시키기 때문이다(111+13=124).

유사하게, BR322 플라스미드는 통상적으로 사용되고 광범위하게 입수 가능한 클로닝 벡터이다. 본 실시예 16에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우에는, 3' 프라이머 중의 하나의 13bp 복합체 형성 세그먼트를 혼입함으로써 274bp 앰플리콘을 연장시킨다. 따라서, 예상된 앰플리콘의 길이는 287bp이다(274+13=287bp).

특정화되지 않은 기타 시약이 실시예 15에 기재되어 있다.

PCR 검정:

PCR 반응을 개별적인 미니-에펜도르프 튜브 중에서 퍼킨-엘머 2400 더모사이클러에서 수행한다. 각 50㎕ PCR 반응물은 3mM MgCl₂, 250μM ATP, 250μM CTP, 250μM GTP, 250μM TTP, 2단위 Ampli Taq DNA 폴리머라제, 50mM KCl, 및 10mM 트리스, pH 8.3을 함유한다. 각 반응물은 또한, 프라이머 세트 A, B 또는 C, 및 PNA 소광인자를 함유한다. 표적을 함유하는 반응물에 1㎕(6E+09분자/㎕)의 적당한 플라스미드를 가한다.

프라이머 세트 A는 0.1μM K-ras 3' 프라이머, 0.2μM K-ras 5' 프라이머 및 0.4μM PNA 소광인자를 포함한다. 프라이머 세트 B는 0.05μM BR322 3' 프라이머, 0.1μM BR322 5' 프라이머 및 0.4μM PNA 소광인자를 포함한다. 프라이머 세트 C를 사용하는 반응물은 0.1μM K-ras 3' 프라이머, 0.2μM K-ras 5' 프라이머, 0.05μM BR322 3' 프라이머, 0.1μM BR322 5' 프라이머 및 0.6μM PNA 소광인자를 포함한다. 본 실시예를 위하여 비대칭적 PCR 증폭을 선택함으로써 과량의 비-표지된 쇄를 발생시키는데, 이는 증폭 반응 동안 이중쇄 앰플리콘으로부터 PNA 소광인자 모두의 전위를 포스터시키는 것으로 예상되었기 때문이다.

이러한 PCR 프로토콜은 95℃까지 20초 가온시킨 다음(단지 1회전임), 95℃에서 20초간 변성시키고, 55℃에서 30분간 어닐링시키며, 74℃에서 30초간 연장시키는 것을 포함한다. 변성-어닐링-연장 주기를 35회 반복한다. 74℃에서 설정된 부가의 5분 연장을 35주기 후에 수행한다.

실시예 15에서 수행된 바와 같이,각 반응물의 형광을 왈락 다중표지 계수기로 검사한다. 각 측정을 위해, 각 샘플 10㎕를 50mM 트리스-HCl, pH 8.3, 100mM NaCl을 함유하는 90㎕의 용액으로 희석시킨다. 형광(그린)을 검출하는 경우, 빛을 485nm 필터 내로 통과시킴으로써 상기 샘플을 여기시키고, 빛을 535nm 필터(그린 필터 세트) 내로 통과시킴으로써 방사를 수득한다. 로다민(적색)을 검출하는 경우에는, 빛을 530nm 필터 내로 통과시킴으로써 상기 샘플을 여기시키고, 빛을 590nm 필터(레드 필터 세트) 내로 통과시킴으로써 방사를 수득한다.

PCR 후, 10㎕의 각 샘플을 2.5㎕의 5X 부하용 염료와 혼합하고 조 반응 생성물을 10 내지 20% 구배 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨다. 본 실시예의 경우, 상기 겔을 검사하고, 에티듐 브로마이드 염색 전 및 후에 트랜스일루미네이터를 사용하여 사진을 찍는다. 도 16을 포함하는 사진의 두 음화 영상은 염색되지 않은 겔로부터의 것(영상 A) 및 에티듐 브로마이드 염색된 겔로부터의 것(영상 B)이다.

결과

본 실시예 16에 대해 수득된 데이타가 표 4 및 도 15 및 16에 제시되어 있다. 표 4를 참조로 하면, 가변적 검정 성분과 왈락 다중표지 계수기로부터 수득된 처리된 데이타 모두에 대한 데이타가 요약되어 있다. 구체적으로 언급하면, 샘플 번호가 칼럼 A에 제시되어 있고; 반응물에 존재하는 표적의 본질이 칼럼 B에 제시되어 있으며; 프라이머 세트(들)가 칼럼 C에 제시되어 있고; 각 샘플에 대한 로다민 후-PCR 형광 데이타가 칼럼 D에 제시되어 있으며; 각 샘플에 대한 플루오레세인 후-PCR 형광 데이타가 칼럼 E에 제시되어 있다.

A	B	C	D	E	F	G
샘플 번호	표적	프라이머 세트	로다민 후-PCR	플루오레세인 후-PCR	로다민 마이너스-NI	플루오레세인 마이너스-NI
1	표적이 없음	A	263	917	0	0
2	pK-ras	A	280	1768	17	850
3	pBR322	A	253	734	(-10)	(-183)
4	표적이 없음	B	537	118	0	0
5	pK-ras	B	600	115	63	(-3)
6	pBR322	B	1457	118	920	0
7	표적이 없음	C	733	716	0	0
8	pK-ras	C	480	1711	(-252)	994
9	pBR322	C	1478	418	745	(-298)
10	pK-ras 및 pBR322	C	1497	1122	764	406

표 4의 칼럼 F 및 G에 제시된 처리된 데이타를 생성시키기 위해서는, 각 프라이머 세트에 대한 표적이 없는 대조군을 로다민 또는 플루오레세인 표지에 대한 "후-PCR" 형광치에 대한 값으로부터 삭감한다. 예를 들면, 1열의 칼럼 F 및 G의 값은 모두 0인데, 이는 263-263이 0이고(칼럼 F, 1열) 917-917이 0이기(칼럼 G, 1열) 때문이다. 2열에서의 데이타에 대한 값이 유사하게 유도된다(280-263=17(칼럼 F, 2열) 및 1768-917=850(칼럼 G, 2열)). 칼럼 F 및 G에 대한 기타 모든 값은 각 프라이머 세트 내에서 유사하게 유도된다.

표 4, 1 내지 3열 및 칼럼 F 및 G를 참조로 하면, 프라이머 세트 A(K-ras 프라이머 세트-그린 형광단)를 사용한 경우에 플루오레세인 표지로부터의 신호의 증가와 K-ras 플라스미드의 존재 간에는 명백한 상관이 있다. 구체적으로 언급하면, BR322 플라스미드가 사용된 경우에는 음성 값(열 3, 칼럼 F ＆ G)이 수득되지만, K-ras 플라스미드가 존재하는 경우에는 그린 필터 세트를 사용하여 850의 강력한 값(열 2, 칼럼 G)이 수득된다. 열 2, 칼럼 F에서의 약간 양성 값이 나타날 수 있는데, 이는 단지, 다중표지 계수기에서 사용된 필터 세트가 컷 오프에서 전적으로 완벽하지 않고 이러한 값이 레드 필터 세트로 측정 가능한 플루오레세인 표지로부터의 신호를 실제적으로 나타낼 수 있기 때문이다. 이러한 해석은 폴리아크릴아미드 겔 분석에서 관찰된 바와 같이 증폭된 모든 생성물의 결여와 부합된다(다음 논의 참조). 그럼에도 불구하고, 열 2 및 3, 칼럼 F 및 G에서의 데이타 간의 신호 세기 차이는, K-ras 플라스미드가 상기 검정에 존재하는 경우에 강력한 양성 값이 수득된다는 것을 명백하게 입증해준다.

유사하게 및 표 4, 열 4 내지 6 및 칼럼 F 및 G를 참조로 하면, 프라이머 세트 B(BR322 프라이머 세트-레드 형광단)를 사용한 경우에 로다민 형광단으로부터의 신호의 증가와 BR322 플라스미드의 존재 간에는 명백한 상관이 있다. 구체적으로 언급하면, K-ras 플라스미드가 사용된 경우에는 작거나 음성인 값(열 5, 칼럼 F ＆ G)이 수득되지만, BR322 플라스미드가 존재하는 경우에는 레드 필터 세트를 사용하여 920의 강력한 값(열 6, 칼럼 F)이 수득된다. 열 5, 칼럼 F에서의 약간 양성 값이 나타날 수 있는데, 이는 상기 BR322 프라이머 세트와 K-ras 플라스미드의 비-특이적 프라이밍 때문이다. 이러한 해석은 폴리아크릴아미드 겔 분석에서 관찰된 바와 같이 비-특이적 앰플리머 생성물의 발생과 부합된다(다음 논의 참조). 그럼에도 불구하고, 열 5 및 6, 칼럼 F 및 G에서의 데이타 간의 신호 세기 차이는, BR322 플라스미드에 대해 강력한 양성 결과가 수득된다는 것을 명백하게 입증해준다. 이러한 양성 결과는 비-특이적 프라이밍으로부터 발생되는 가(false) 양성에 비해 명백히 구별 가능하다.

유사하게 및 표 4, 열 7 내지 10 및 칼럼 F 및 G를 참조로 하면, 하나 이상의 표적이 존재하는 모든 증폭 반응에서는, 로다민 표지로부터의 신호의 증가와 BR322 플라스미드의 존재 간에는 명백한 상관이 있을 뿐만 아니라 플루오레세인 표지로부터의 신호 증가와 K-ras 플라스미드의 존재 간에는 명백한 상관이 있다. 열 8을 참조로 하면, 로다민 표지에 대해서는 어떠한 신호도 검출되지 않았고 플루오레세인 표지에 대해서는 매우 강력한 신호가 검출되었다. 이는 각각 BR322 플라스미드의 부재와 K-ras 플라스미드의 존재와 부합된다. 마찬가지로, 및 열 9를 참조로 하면, 플루오레세인 표지에 대해서는 어떠한 신호도 검출되지 않았고 로다민 표지에 대해서는 매우 강력한 신호가 검출되었다. 이는 각각 K-ras 플라스미드의 부재와 BR322 플라스미드의 존재와 부합된다. 최종적으로, 열 10을 참조로 하면, 플루오레세인 표지와 로다민 표지 모두에 대해서 강력한 신호가 검출되었다. 이는 K-ras 플라스미드와 BR322 플라스미드 표적 모두의 존재와 부합된다.

이상하게도, 프라이머 세트와 K-ras 플라스미드 모두가 상기 검정에 존재하는 경우에 미스-프라이밍이 전혀 관찰되지 않았다(칼럼 F 및 G, 열 5에서의 데이타를 칼럼 F 및 G, 열 8 및 10에서의 데이타와 비교함). 다중체 검정에서의 미스-프라이밍의 부재는 공지되지 않은 이유로 인해, 단일 PCR 반응에 둘 이상의 프라이머 세트를 이용함으로써 미스-프라이밍을 감소 또는 없애는 것이 유익할 수 있다는 것을 제안해준다.

표 4의 칼럼 F 및 G에서 제시된 표로 만든 데이타가 또한, 배트 그래프 형태로 도 15에 도시되어 있다. 이러한 그래프적 도시는 검정에서 발생된 형광 신호의 상대적 세기의 실재적인 차이를 가시적으로 부여하므로, 진짜 양성 결과와 음성 결과 간의 차이를 확인하기가 더 용이해진다.

앞서 기재된 바와 같이, 각 증폭 반응의 생성물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하고 에티듐 브로마이드 염색 전 및 후의 겔 사진을 찍는다. 도 16(A 및 B)는 동일한 폴리아크릴아미드 겔의 두 사진 각각의 영상 음화의 디지탈 복합물이다. 도 16에 제시된 사진 영상은 샘플 5를 제외하고는, PCR 증폭 반응에서 관찰된 형광 증가가 상기 의도된 플라스미드의 특이적 증폭으로부터 유래되어 예상된 고유의 형광성을 지니는 예상된 크기의 앰플리콘을 생성한다는 것을 결론적으로 입증해준다.

이러한 사진 영상이 상단에서 샘플 웰과 함께 표시되어 있으며, 각 겔 영상은 12레인을 포함한다. 레인 1 및 12는 HaeIII로 분해된 1㎍의 PhiX174 dsDNA를 함유한다. 레인 2 내지 11은 PCR 반응 샘플 번호 1 내지 10이다.

도 16, 사진 A를 참조로 하면, 겔을 트랜스일루미네이터 상에 놓아둠으로써 겔을 수행한 직후에 겔의 본래의 형광이 관찰되었다. PCR 검출 복합체에서의 표지의 본질이 주어진 경우에는, 예상된 색상의 형광 밴드가 레인 3(그린), 7(레드), 9(그린), 10(레드) 및 11(그린 및 레드)에서 가시적이다.

도 16, 영상 B를 참조로 하면, 겔을 에티듐 브로마이드로 처리한 후에 트랜스일루미네이터 상에서 형광이 관찰되었다. 영상 B에서 가시적인 밴드는 본래 형광성이거나 에티듐 브로마이드로 염색된 중합체 또는 PCR 생성물이다. 다시 언급하면, 밴드는 레인 3, 7, 9, 10 및 11에서 가시적일 뿐만 아니라 크기 마커를함유하는 레인 1 및 12에서도 가시적이다. 영상 B의 레인 3 및 9에서의 뛰어난 밴드(이는 또한 영상 A에서도 가시적이다)는 크기 마커의 118bp와 194bp 사이에 있다. 이러한 형광성과 크기 데이타는 K-ras 플라스미드(124bp)에 대한 앰플리콘의 예상된 성질과 부합된다. 영상 B의 레인 7 및 10에서의 뛰어난 밴드(이는 또한 영상 A에서도 가시적이다)는 크기 마커의 234bp와 310bp 사이에 있다. 따라서, 이러한 형광성과 크기 데이타는 BR322 플라스미드(287bp)에 대한 앰플리콘의 예상된 성질과 부합된다. 유사하게, BR322와 K-ras 플라스미드 모두에 대한 예상된 성질을 지닌 밴드가 영상 A와 B 모두의 레인 11에 존재한다.

영상 B의 레인 6(샘플 번호 5)을 참조로 하면, K-ras 또는 BR322 플라스미드에 대한 예상된 앰플리콘인 것으로 보이지 않는 겔에서는 약한 밴드가 관찰된다. 샘플 번호 5를 참조로 하면, 상기 반응물은 K-ras 및 BR322 프라이머 세트를 함유한다. 결과적으로, 어떠한 증폭된 예상되지 않았다. 다중의 약한 밴드가 존재하기 때문에, 데이타는 미스-프라이밍이 발생됨으로써 비-특이적 생성물이 생성될 수 있다는 것을 제안하고 있다. 이러한 데이타는 표 4, 열 5, 칼럼 F에서 기록된 약한 양성 형광 신호과 부합된다. 이상하게도, K-ras 플라스미드와 BR322 프라이머 세트 모두가 존재하는 샘플 8 또는 10(레인 8 및 11)에서는 미스-프라이밍이 전혀 발생되지 않은 것으로 여겨진다.

레인 3, 7, 9, 10 및 11을 참조로 하면, 최종적으로 보다 고차수로 수행되는밴드가 에티듐 브로마이드 염색된 겔(영상 B)에서 가시적이다. 이러한 가공물은 비대칭 PCR과 연관된 것으로 여겨지므로, 비대칭 PCR 반응으로 인해 과발현되는 단일쇄 핵산 생성물인 것으로 간주된다.

주:

상기 실험의 샘플 번호 5는 프라이머 이량체 형성 및 표적 미스-프라이밍과 같은 비-특이적 하이브리드화 사건으로부터 가 양성 결과가 수득될 수 있다는 것을 입증해준다.

어느 하나의 PCR 반응과 연관된 전형적인 문제가 있으므로, 본원에 기재된 검출 복합체는, 최적 보다 못한 PCR 조건하에서 증폭 반응을 수행한 경우에 이들 바람직하지 못한 성질을 나타낼 수 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련인은 단지 통상적인 실험을 이용하여 이들 문제점을 최소화하거나 없애기 위해 증폭 조건을 최적화할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 증폭 조건은 프라이머를 변형시키거나, 또는 상기 검정이 수행되는 "적합한 하이브리드화 조건"을 다양하게 함으로써 최적화시킨다(본원 명세서 44쪽 참조). 또한, 실시예 18은 밀폐된 튜브 검정의 정확성을 보장해 줄 수 있는 실시간 또는 종점 방법으로서의 "내부 검정 모니터링"의 원리를 입증해준다.

요약:

다중체 검정의 개별적인 성분들에 대한 데이타는 명백한 양성 결과를 발생시키기 위해 제시되는데, 이는 비-특이적 증폭으로부터 유래되는 신호과는 구별될 수 있다. 이러한 성분들을 다중체 검정 내로 조합하는 경우, 그 결과는 유사하게 인상적이다. 전체적으로 보면, 본 실시예에는 둘 이상의 표적 서열 또는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 동시에 결정하기 위하여 단일 샘플의 밀폐된 튜브 다중체 분석을 수행하는 것의 타당성을 입증해준다.

실시예 17: PCR 클램핑과 조합하여 PCR 검출 복합체를 사용한 점 돌연변이 검출

개론

본 실시예 17은 실시예 15에서 사용된 K-ras 시스템의 변형을 이용한다. 구체적으로 언급하면, 프라이머 세트를 변형시킴으로써, 본원에 기재된 PCR 검출 복합체를 PCR 클램핑과 조합하는 경우에 점 돌연변이 식별이 달성될 수 있는 것으로 입증되었다.

재료 및 방법

프로브, 프라이머 및 주형:

PNA 소광인자:

PNA 소광인자(표 1, 번호 6) C 다브실(K)-AGTAAGCGTTAGT-OO-+-Ac N

DNA 프라이머:

5' K-ras 프라이머는 관심있는 야생형(WT) 또는 돌연변이체(MU) 표적 핵산 상의 프라이밍 부위에 상보적인 15개 누클레오티드 프라이밍 서열과, PNA 소광인자가 하이브리드화되는 공통의 복합체 형성 세그먼트(CFS; 진하게 나타냄) 모두를 포함한다. 돌연변이체에 대한 5' K-ras 프라이머(K-rasMU) 및 야생형(K-ras) 표적은 프라이밍 섹션의 중간에서의 1개의 누클레오티드 만이 상이한데, 이로써 상기 누클레오티드가 점 돌연변이물(밑줄쳐진 부분에 진하게 표시됨)로서 관련이 있다. 3' 프라이머는 표지되지 않는다.

5' 프라이머:

K-rasWT 프라이머 5' Flu-TCATTCGCAATCAACGCCACCAGCTCCA-OH 3'(서열 11)

K-rasMU 프라이머 5' Flu-TCATTCGCAATCAACGCCACAAGCTCCA-OH 3'(서열 12)

3' 프라이머

M13-40 프라이머 5' HO-GTTTTCCCAGTCACGAC-OH 3'(서열 13)

M13-40 프라이머는 시판중이고 공급원(New England BioLabs)으로부터 #1212로서 수득된다. PNA 클램핑 프로브 및 PNA 소광인자를 50% 수성 DMF에 희석시키고 4℃ 하에 저장한다. DNA 프라이머 및 DNA 주형을 TE에서 희석시키고 4℃에서 저장한다.

PNA 클램핑 프로브:

2개의 PNA 클램핑 프로브는 상기 올리고머의 중간 부분에 존재하는 1개의 누클레오티드(밑줄쳐진 부분에서 진하게 표시됨) 만이 상이하다. 따라서, 이들은 단일 누클레오염기 부정합물로서 언급된다.

PNA-WT N H-OO-ACGCCACCAGCTCCA-NH₂C

PNA-MU N H-OO-ACGCCACAAGCTCCA-NH₂C

N=아민 말단, C=카르복시 말단, "O"은 앞서 정의된 바와 같다.

dsDNA 주형

K-ras: 이 플라스미드는 실시예 15에 기재된 바와 같이 제조한다.

K-rasMU: 이 플라스미드는 사람 K-ras 유전자의 염기 129에서 G 내지 T 돌연변이를 갖는 세포주로부터의 서브-클로닝된 서열을 함유한다. 그러나, 돌연변이를 혼입하기 위해서는, 상기 플라스미드를 동일한 방식 및 동시에 실시예 15에 기재된 야생형 플라스미드로서 생성시킨다. 따라서, K-ras 및 K-rasMU는 K-ras 유전자의 점 돌연변이를 함유하는 플라스미드로서 언급된다. M13-40 프라이머는 K-ras와 K-rasMU 플라스미드 모두를 발생시키기 위해 사용되는 클로닝 벡터 pCR2.1에서의 특정 영역과 하이브리드화된다. 클램핑 프로브의 부재하에서, M13-40 프라이머와 K-rasWT 프라이머 또는 K-rasMU 프라이머를 사용하게 되면, K-ras 또는 K-rasMU 플라스미드가 상기 증폭 반응에 존재하는지에 상관없이 183 염기쌍 앰플리콘이 생성될 것이다.

dsDNA WT 및 MU 주형(단지 증폭된 영역: 점 돌연변이가 밑줄친 부분에서 진하게 표시됨)

언급되지 않은 기타 시약은 실시예 15에서 기재된 바와 같다.

PCR 검정:

PCR 반응을 개별적인 미니-에펜도르프 튜브 중에서 퍼킨-엘머 2400 더모사이클러에서 수행한다. 각 30㎕ PCR 반응물은 2.25mM MgCl₂, 200μM ATP, 200μM CTP, 200μM GTP, 200μM TTP, 166nM M13-40 프라이머, 166nM PNA 소광인자, 1단위 Ampli Taq DNA 폴리머라제, 50mM KCl, 및 10mM 트리스, pH 8.3을 함유한다. 각 반응물은 또한, 83nM K-rasWT 또는 83nM K-rasMU 프라이머 중의 하나, 및 1㎕의 10nM K-ras 플라스미드, 1㎕ 또는 10nM K-rasMU 플라스미드, 또는 1㎕의 물("표적이 없는" 대조군) 함유한다. 또한, 반응물은 1.25㎕의 20μM PNA-WT, 1.25㎕의 20μM PNA-MU 또는 1.25㎕의 50% 수성 DMF("PNA 클램프 없는" 대조군) 중의 하나를 포함한다. 각 PCR 반응에 가해진 다양한 시약에 관한 요약이 표 5에 나타나있다.

이러한 PCR 프로토콜은 95℃까지 20초 가온시킨 다음(단지 1회전임), 95℃에서 20초간 변성시키고, 30초간 어닐링시키며, 74℃에서 30초간 연장시키는 것을 포함한다. 변성-어닐링-연장 주기를 25회 반복한다. PCR 프로토콜에 대한 어닐링 온도는 사용된 프라이머에 좌우된다: K-rasMU 프라이머(샘플 6 내지 10)의 경우에는 54℃이고; K-rasWT 프라이머(샘플 1 내지 5)의 경우에는 56℃이다.

이러한 PCR 반응을 완료한 후, 상기 튜브를 트랜스일루미네이터 상에 놓아둠으로써 튜브에서 가시적인 형광을 발생시키고, 사진을 찍는다. 이러한 사진의 복합 디지탈 음화 영상이 도 18에 제시되어 있다.

부가적으로, 각 반응물의 형광을 왈락 다중표지 계수기로 검사한다. 각 측정을 위해, 샘플 5㎕를 50mM KCl, 3mM MgCl 및 10mM 트리스-HCl, pH 8.3을 함유하는 45㎕의 용액으로 희석시킨다. 그린 필터 세트를 사용하여 형광을 검사한다(실시예 16 참조). 열 형광 데이타를 기록하고 표 5, 칼럼 E에 나타낸다.

유사하게, 각 반응의 10㎕ 샘플을 2.5㎕의 5X 부하용 염료와 혼합하고 10 내지 20% 구배 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨다. 본 실시예의 경우, 상기 겔을 검사하고, 에티듐 브로마이드 염색 전 및 후에 트랜스일루미네이터를 사용하여 사진을 찍는다. 도 17을 포함하는 사진의 두 음화 영상은 염색되지 않은 겔로부터의 것(영상 A) 및 에티듐 브로마이드 염색된 겔로부터의 것(영상 B)이다.

결과

본 실시예 17에 대해 수득된 데이타가 표 5 및 도 17 및 18에 제시되어 있다. 표 5를 참조로 하면, 샘플 번호가 칼럼 A에 제시되어 있고; 5' 프라이머의 본질이 칼럼 B에 제시되어 있으며; 표적의 존재 또는 실체가 칼럼 C에 제시되어 있고; PNA 클램핑 프로브의 존재 또는 실체가 칼럼 D에 제시되어 있으며; 개개의 샘플에 대한 조 후-PCR 형광 데이타가 칼럼 E에 제시되어 있다.

일반적으로, 상기 표는 K-ras-WT 5'-프라이머가 반응물에 존재하는 샘플 1 내지 5와, K-ras-MU 5'-프라이머가 반응물에 존재하는 샘플 6 내지 10으로 나눈다. 이들 두 군의 각각에서, 표적이 없는 대조군과 PNA 클램프가 없는 대조군을 수행한다(열 1 및 6 참조). 이러한 음성 조절군은 기타 모든 반응 샘플과의 비교를 위한 기준선을 제공해준다. 이들 두 군의 각각에서, 야생형(열 2, 4, 7 및 9) 또는 돌연변이체(열 3, 5, 8 및 10) K-ras 플라스미드 중의 하나를 사용하여 검정을 수행하는데, 이는 적합한 PNA 클램프를 사용하거나(열 4, 5, 9 및 10) 사용하지 않는다(열 2, 3, 7 및 8).

A	B	C	D	E
샘플 번호	5'-프라이머	표적	PNA 클램프	조 형광 데이타
1	K-ras-WT	표적이 없음	PNA 클램프가 없음	178
2	K-ras-WT	K-ras	PNA 클램프가 없음	2774
3	K-ras-WT	K-ras-MU	PNA 클램프가 없음	2652
4	K-ras-WT	K-ras	PNA-MU	2452
5	K-ras-WT	K-ras-MU	PNA-MU	296
6	K-ras-MU	표적이 없음	PNA 클램프가 없음	750
7	K-ras-MU	K-ras	PNA 클램프가 없음	2878
8	K-ras-MU	K-ras-MU	PNA 클램프가 없음	3030
9	K-ras-MU	K-ras	PNA-WT	352
10	K-ras-MU	K-ras-MU	PNA-WT	2632

표 5의 칼럼 E를 참조로 하면, "표적이 없는" 및 "PNA 클램핑 프로브가 없는" 대조군의 형광 세기(칼럼 E, 열 1 및 6 참조)는 매우 낮다(각 데이타 지점은 1000상대 광 단위(RLU)의 훨씬 아래이다). 이러한 데이타는 반응에서 어떠한 증폭도 발생되지 않는다는 것과 부합된다. 이러한 수는 상기 시스템의 배경 형광의 대표적인 것이다.

열 2 및 3을 참조로 하면, 다중표지 계수기로 측정된 바와 같은 양 샘플에 대한 상대 형광치는 음성 대조군(샘플 1)에서 측정된 형광치보다는 명백하게 훨씬 위이고, 필수적으로 양 반응에 대해 동일하다(각각 2774 및 2652). 이러한 데이타는 5' 프라이머는, 본 검정의 조건하에서 및 PNA 클램프의 부재하에서, 거의 등가의 효율로 야생형 플라스미드와 돌연변이체 플라스미드 모두를 증폭시킨다는 것을 지시하고 있다(칼럼 D 참조).

비교하고 열 4 및 5를 참조로 하면, 돌연변이체 PNA 클램프(PNA-MU)를 함유하는 샘플에 대한 상대 형광치는 다중표지 계수기로 측정된 바와 같이, 실질적으로 상이하다. PNA-MU 및 돌연변이체 플라스미드 주형(K-rasMU)이 반응물에 존재하는 경우, 형광 세기는 어떠한 표적의 부재하에서 관찰된 것과 거의 등가이다(열 1, 칼럼 E와 열 5, 칼럼 E 내지 열 3, 칼럼 E를 비교한다). 이러한 데이타는 본 반응에서 어떠한 증폭도 실질적으로 일어나지 않았다는 것을 지시해준다. 비교하면, 형광 세기는, 야생형 플라스미드(K-ras)가 존재하는 경우에 어떠한 PNA 클램프의 부재하에서 관찰된 것과 거의 등가이다(열 4, 칼럼 E와 열 2, 칼럼 E 내지 열 1, 칼럼 E를 비교한다). 이러한 데이타는 PNA 클램핑을 PCR 검출 복합체와 조합함으로써 점 돌연변이 식별에 적합한 밀폐된 튜브 검정을 달성할 수 있다는 것을 지시해준다.

유사하게, 열 7 및 8을 참조로 하면, 다중표지 계수기로 측정된 바와 같은 양 샘플에 대한 상대 형광치는 음성 대조군(샘플 6)에서 측정된 형광치보다는 명백하게 훨씬 위이고, 필수적으로 양 반응에 대해 동일하다(각각 2878 및 3030). 이러한 데이타는 5' 프라이머는, 본 검정의 조건하에서 및 PNA 클램프의 부재하에서, 거의 등가의 효율로 야생형 플라스미드와 돌연변이체 플라스미드 모두를 증폭시킨다는 것을 지시하고 있다.

비교하고 열 9 및 10를 참조로 하면, 야생형 PNA 클램프(PNA-WT)를 함유하는 샘플에 대한 상대 형광치는 다중표지 계수기로 측정된 바와 같이, 실질적으로 상이하다. PNA-WT 및 야생형 플라스미드 주형(K-ras)이 반응물에 존재하는 경우, 형광 세기는 어떠한 표적의 부재하에서 관찰된 것과 거의 등가이다(열 9, 칼럼 E와 열 6, 칼럼 E 내지 열 7, 칼럼 E를 비교한다). 이러한 데이타는 본 반응에서 어떠한 증폭도 실질적으로 일어나지 않았다는 것을 지시해준다. 비교하면, 형광 세기는, 돌연변이체 플라스미드(K-rasMU)가 존재하는 경우에 어떠한 PNA 클램프의 부재하에서 관찰된 것과 거의 등가이다(열 10, 칼럼 E와 열 8, 칼럼 E 내지 열 6, 칼럼 E를 비교한다). 이러한 데이타는 PNA 클램핑을 PCR 검출 복합체와 조합함으로써 점 돌연변이 식별에 적합한 밀폐된 튜브 검정을 달성할 수 있다는 것을 지시해준다.

앞서 언급된 바와 같이, 각 증폭 반응의 생성물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하고 에티듐 브로마이드 염색 전 및 후의 겔 사진을 찍는다. 도 17(A 및 B)은 동일한 폴리아크릴아미드 겔의 두 사진 각각의 영상 음화의 디지탈 복합물이다. 도 17에 제시된 사진 영상은 샘플 5를 제외하고는, PCR 증폭 반응에서 관찰된 형광 증가가 상기 반응에 존재하는 플라스미드의 특이적 증폭으로부터 유래되어 예상된 고유의 형광성을 지니는 예상된 크기의 앰플리콘을 생성한다는 것을 결론적으로 입증해준다.

도 17, 사진 A를 참조로 하면, 강력한 그린 형광성 밴드가 레인 3,4, 5, 8, 9 및 11에서 관찰된다. 이는 샘플2, 3, 4, 7, 8 및 10에 각각 상응한다. 상기 겔에서의 강력한 형광성 밴드의 존재는 표 5에 나타낸 데이타와 부합되는데, 이는 증폭이 단지 샘플 2, 3, 4, 7, 8 및 10에서만 일어났다는 것을 지시해준다.

도 17, 영상 B를 참조로 하면, 겔을 에티듐 브로마이드로 처리한 후에 트랜스일루미네이터 상에서 형광이 관찰되었다. 영상 B에서 가시적인 밴드는 본래 형광성이거나 에티듐 브로마이드로 염색된 중합체 또는 PCR 생성물이다. 다시 언급하면, 동일한 강력한 형광성 밴드가 에티듐 염색된 겔의 레인 3, 4, 5, 8, 9 및 11에서 가시적이다. 부가적으로, 에티듐 브로마이드 염색 후에 레인 1 및 12에서 크기 마커가 가시적이다. 이러한 밴드는 크기 마커의 118bp와 194bp 사이에 대략적으로 있다. 이는 183bp 앰플리콘과 부합된다. 결과적으로, 형광성과 단편 크기 데이타는 본원에 사용된 주형과 프라이머 조합물이 제공된다면 상기 앰플리콘에 대해 예상된 성질과 부합된다.

도 18을 참조로 하면, 트랜스일루미네이터 상에 놓여있는 후-PCR 반응 튜브의 음화 영상 사진의 디지탈 복합물이 제시된다. 샘플은 상기 도면에서 1 내지 10으로 제시된다. 영상을 분석한 결과, 형광 신호가 튜브 2, 3, 4, 7, 8 및 10에서 육안으로 가시적이라는 것이 확인되었다. 이러한 데이타는 다중표지 계수기 및 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수득된 데이타와 부합되므로, 기기나 사람 육안을 이용하여 본원에 기재된 밀폐된 튜브 검정을 분석할 수 있다는 것이 확인되었다.

요약:

전반적으로 언급하면, 상기 데이타는 본 발명의 PCR 검출 복합체를 PCR 클램핑과 조합함으로써, 점 돌연변이의 실시간 및 종점 분석 모두에 적합한 밀폐된 튜브 검정을 발생시킬 수 있다는 것을 입증해준다. 더욱이, 이러한 방법은 너무나 간단하여, 자외선 하에 동일한 튜브를 단지 바라다 봄으로써 그 결과를 해석할 수 있다.

실시예 18: 다중체 검정에서 검출 복합체와 단일분자상 "비이컨" 프로브의 동시 사용

개론

본 실시예는 단일 복합체 검정에서 독립적으로 검출 가능한 검출 복합체와 단일분자상 "비이컨" 프로브(선형 비이컨이 본 실시예에서 사용된다)를 혼합하는 것의 타당성을 입증하기 위해 수행한다. 이러한 검정 포맷 용도의 비-제한적인 예로는 내부 PCR 검정 모니터링 및 앰플리콘 특징(들)의 독립적인 확인이 있다.

재료 및 방법

프로브, 프라이머 및 주형:

PNA 올리고머:

PNA 플루오르:

CY3-PNA C (Cy3)K-AGTAAGCGTTAGT-OO-+-Ac N

선형 비이컨:

LBK.003 N Flu-O-ACGCCACCAGCTCCA-K(다브실) C

C=카르복시 말단, N=아민 말단, "K", "Flu", "Ac", "+", "Cy3" 및 "O"는 앞서 정의된 바와 같다.

DNA 프라이머:

3' DNA 프라이머는 관심있는 표적 핵산 상의 프라이밍 부위에 상보적인 프라이밍 서열과, PNA 플루오르가 하이브리드화되는 공통의 복합체 형성 세그먼트(CFS: 진하게 표시됨)를 모두 포함한다. 앞서 실시예와 비교해보면, 공여체 형광단과 수용체 소광인자가 전위되어, 당해 검출 복합체의 형광성 중합체가 증폭 반응의 작동에 의해 용액 내로 방출된다. 이러한 변화는 또한, 양 양태가 작동 가능하다는 것을 입증해준다. 5' 프라이머는 표지되지 않는다.

5' 프라이머

5' HO-ATGACTGAATATAAACTTGT-OH 3'(서열 6)

3' 프라이머

5' 다브실(링커)-TCATTCGCAATCACTCTATTGTTGGATCATATT-OH 3'(서열 16)

이러한 프라이머 DNA는 시판용 시약 및 기기를 사용하여 제조하고 당해 분야의 숙련인에게 공지된 조건을 이용하여 정제한다. 링커는 시판되고 있는 아미노헥실 링커이다. 이러한 프라이머의 아민을 절단시키기 이전에 다브실-NHS로 표지시켜, 5(6)-카르복시플루오레세인-NHS로 지지체 결합된 PNA를 형광 표지시키는데 사용된 것과 유사한 조건을 이용하여 합성 지지체를 형성시킨다.

dsDNA 플라스미드 주형:

K-ras: 이러한 플라스미드의 제조는 실시예 15에 기재된 바와 같은데, 단 본실시예에서는 제한 엔도누클레아제 SpeI로 분해함으로써 선형화시킨다. SepI은 본 실험에서 증폭된 영역으로부터 35염기(5')를 1회 절단한다.

상기 PNA 플루오르를 50% 수성 DMF에 희석시키고 4℃ 하에 저장하는 반면, DNA 프라이머 및 DNA 주형은 TE에서 희석시키고 4℃에서 저장한다. 언급되지 않은 기타 시약은 실시예 15에 기재된 바와 같다.

PCR 검정:

PCR 반응을 개별적인 미니-에펜도르프 튜브 중에서 퍼킨-엘머 2400 더모사이클러에서 수행한다. 각 25㎕ PCR 반응물은 2.5mM MgCl₂, 200μM ATP, 200μM CTP, 200μM GTP, 200μM TTP, 1.0μM 5' 프라이머, 0.2μM 3' 프라이머, 0.1μM Cy3-PNA, 2단위 Ampli Taq DNA 폴리머라제, 50mM KCl, 및 10mM 트리스, pH 8.3을 함유한다. 각 반응물은 또한, 1㎕의 1nM K-ras/SepI(K-ras 플라스미드는 SepI로 분해된다), 또는 물("표적이 없는" 대조군)을 함유한다. 또한, 반응물은 1.0㎕의 5μM LBK.003, 또는 물("선형 비이컨이 없는" 대조군)을 포함한다. 각 PCR 반응을 2회 수행한다. 각 PCR 반응에 가해진 다양한 시약에 관한 요약이 표 6에 나타나 있다.

이러한 PCR 프로토콜은 95℃까지 20초 가온시킨 다음(단지 1회전임), 95℃에서 5초간 변성시키고, 55℃에서 30초간 어닐링시키며, 74℃에서 30초간 연장시키는 것을 포함한다. 변성-어닐링-연장 주기를 25회 반복한다.

각 반응물을 형광 분석하기 위하여, PCR 반응을 수행하기 전 및 후에 분석용 샘플 5㎕를 취한다. 각 샘플을 95㎕ 50mM KCl, 3mM MgCl₂및 10mM 트리스, pH 8.3으로 희석시킨다. 이어서, 실시예 16에 기재된 바와 같은 그린 필터 세트와 레드 필터 세트를 사용하여 왈락 다중표지 계수기로 각 샘플을 분석한다. 다중표지 계수기에서 수득된 데이타는 표 6에 나타내고 특정 부분을 도 19a에 그래프로 도시하였다.

후-PCR 형광 분석 이외에도, 10㎕의 각 샘플을 2.5㎕의 5X 부하용 염료와 혼합하고 10 내지 20% 구배 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨다. 에티듐 브로마이드로 염색한 후의 겔의 음화 영상 사진의 디지탈 복합물이 도 19b에 도시되어 있다.

결과

본 실시예 18에 대해 수득된 데이타가 표 6 및 도 19a 및 19b에 제시되어 있다. 표 6을 참조로 하면, 샘플 번호가 칼럼 A에 제시되어 있고; 증폭용 플라스미드 주형의 본질이 칼럼 B에 제시되어 있으며; 선형 비이컨(단일분자상 "비이컨")의 존재 또는 부재가 칼럼 C에 제시되어 있고; 그린 필터 세트를 사용한 조 전-PCR 형광이 칼럼 D에 제시되어 있으며; 그린 필터 세트를 사용한 조 후-PCR 형광이 칼럼 E에 제시되어 있고; 레드 필터 세트를 사용한 조 전-PCR 형광이 칼럼 F에 제시되어 있으며; 레드 필터 세트를 사용한 조 후-PCR 형광이 칼럼 G에 제시되어 있다. 그린 필터 세트를 사용한 선형 비이컨이 없는 대조군에 대한 데이타는 다음 표에 제시되지 않는데, 이는 이들 반응에서는 플루오레세인이 전혀 존재하기 않기 때문이다.

A	B	C	D	E	F	G	H	I
샘플 번호	표적	프로브	FLU 전	FLU 후	Cy3 전	Cy3 후	FLU X	Cy3 X
1	표적이 아님	선형 비이컨이 아님	N/A	N/A	258	302	N/A	1.2
2	K-ras/SepI	선형 비이컨이 아님	N/A	N/A	262	1004	N/A	3.8
3	표적이 아님	LBK.003	406	460	268	280	1.1	1.0
4	K-ras/SepI	LBK.003	378	794	234	830	2.1	3.5
5	표적이 아님	선형 비이컨이 아님	N/A	N/A	256	296	N/A	1.2
6	K-ras/SepI	선형 비이컨이 아님	N/A	N/A	268	978	N/A	3.6
7	표적이 아님	LBK.003	404	506	282	266	1.3	0.9
8	K-ras/SepI	LBK.003	358	744	258	860	2.1	3.3

표 6의 칼럼 H 및 I의 데이타는 형광단에 대한 후-PCR 측정치를 전-PCR 측정치로 나눔으로써 생성된 것이다. 예를 들면, 열 3, 칼럼 1의 데이타(1.1)는 460(열 3, 칼럼 E)을 406(열 3, 칼럼 D)로 나눔으로써 생성된 것이다. 따라서, 이러한 칼럼 H 및 I의 데이타는 PCR 반응을 수행한 결과로서 일어나는 플루오레세인(Flu) 및 시아닌(Cy3) 표지의 상대적인 형광 세기 증가가 많다는 것을 나타낸다. 칼럼 D 및 E에 데이타가 전혀 제공되지 못한 경우에는 칼럼 H에서의 데이타도 제공되지 못한다.

표 6을 참조로 하면, 샘플 1 내지 4의 조성은 샘플 5 내지 8의 조성의 복제본이다. 샘플 1 내지 4와 5 내지 8모두에 대한 데이타가 매우 유사하기 때문에, 샘플 1 내지 4에 대한 데이타 만이 다음에 논의될 것이다. 그럼에도 불구하고, 데이타의 일관성은 이의 재생 가능성을 입증해준다.

PCR 반응을 수행한 결과로서 일어나는 상대적인 형광 세기 증가가 많다는 것은 상기 검정의 적당한 작동을 지시하고, 분석은 표 6의 칼럼 H 및 I에 초점을 맞출 것이다. 가시적 검사를 위해, 이러한 데이타가 또한, 도 19a에 바 그래프 형태로 도시된다. 칼럼 I를 참조로 하면, 열 1 및 2에서의 데이타는 칼럼 3 및 4에서의 데이타와 각각 잘 비교된다. Cy3 표지로부터의 신호가 당해 검출 복합체의 해리를 지시하기 때문에, 상기 플라스미드 주형의 부재(열 1 및 3)과 비교하여 이러한 플라스미드 주형의 존재(열 2 및 4)하에서 레드 형광의 3배 증가는, 선형 비이컨이 PCR 반응에 존재하는지의 여부와 상관없이 이러한 PCR 반응이 수행되었다는 것을 제안하고 있다.

칼럼 H를 참조로 하면, 상기 플라스미드 주형의 부재(열 3)과 비교하여 이러한 플라스미드 주형의 존재(열 4)하에서 그린 형광의 2배 증가는 선형 비이컨(LBK.003)이 하이브리드화되는 앰플리콘이 발생됨으로써 검출 가능한 신호가 발생된다는 것을 지시해준다. 따라서, 이러한 데이타는 목적하는 앰플리콘의 형성과 부합된다.

도 19b에서 에티듐 브로마이드 염색된 겔의 영상을 참조로 하면, 적당한 크기의 강력한 밴드가 샘플 2 및 4에 대해 표시된 레인에 나타났지만, 플라스미드 주형이 결여된 샘플 1 및 3(음성 대조군)에 대해 표시된 레인에서는 밴드가 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 겔은, 샘플 2 및 4에서는 증폭이 발생하여 목적하는 앰플리콘이 생성되었고 샘플 1 또는 3에서는 증폭이 전혀 일어나지 않았다는 것을 결론적으로 입증해준다. 이러한 데이타는 표 6 및 도 19a에 제시된 형광 데이타와 잘 상관이 있다.

요약:

상기 데이타는 PCR 증폭이, 당해 검출 복합체와 단일분자상 선형 비이컨 프로브 모두로부터 양성의 독립적으로 검출 가능한 신호를 발생시켰다는 것을 지시해준다. 결과적으로, 이 데이타는 독립적으로 검출 가능한 검출 복합체와 단일분자상 "비이컨" 프로브를 동일한 다중체 밀폐된 튜브 검정에서 혼합할 수 있다는 것을 입증해준다. 이러한 검정 포맷에 대한 용도의 비-제한적인 예로는 내부 PCR 검정 모니터링 및 앰플리콘 양태의 독립적인 확인이 있다.

등가 양태

본 발명이 바람직한 양태를 참조로 하여 특정하게 제시되고 기재되긴 하였지만, 당해 분야의 숙련인은 첨부된 청구의 범위에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 요지 및 범위로부터 벗어나지 않고서도 각종 형태 변화 및 상세 내역이 만들어질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당해 분야의 숙련인은 단지 통상적인 실험을 이용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태와의 많은 등가 양태를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 양태는 당해 청구의 범위에 포괄된다.

Claims

a. 표적 서열에 하이브리드화하는 프로빙 세그먼트 및 하나 이상의 다른 성분 중합체와 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 포함하는 하나 이상의 성분 프로빙 중합체;

b. 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 성분 중합체의 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 성분 어닐링 중합체; 및

c. 복합체의 형성이 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함하는, 둘 이상의 성분 중합체로 제조된 조성물로서, 단, 조성물의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체인 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 모든 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 조성물.
제 3항에 있어서, 성분 중합체의 PNA 서브유닛이 하기 화학식을 가짐을 특징으로 하는 조성물:

상기 식에서,

각각의 J는 동일하거나 상이하며, H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br 및 I로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 K는 동일하거나 상이하며, O, S, NH 및 NR¹로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 R¹은 동일하거나 상이하며, 헤테로원자를 임의로 함유할 수 있는 1개 내지 5개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고;

각각의 A는 단일 결합, 화학식 (CJ₂)_S-의 기 및 화학식 -(CJ₂)_SC(O)-의 기 (여기에서, J는 상기한 바와 같고, 각각의 s는 1 내지 5의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 t는 1 또는 2이고;

각각의 u는 1 또는 2이고;

각각의 L은 동일하거나 상이하며, J, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우리딘, 5-메틸시토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,6-디아미노푸린, 히포크산틴, 슈도이소시토신, 2-티오우라실, 2-티오티미딘, 그 밖의 천연 누클레오염기 유사체, 그 밖의 합성 누클레오염기, 치환된 방향족 잔기 및 비치환된 방향족 잔기, 비오틴, 플루오레세인 및 다브실로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제 5항에 있어서, 각각의 PNA 서브유닛이 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 N-[2-(아미노에틸)]글리신 주쇄의 아자 질소에 부착된 천연 누클레오염기로 구성됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 공여체 잔기가 형광단임을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서, 형광단이 5(6)-카르복시플루오레세인, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥산산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 시아닌 2 염료, 시아닌 3.5 염료, 시아닌 5 염료, 시아닌 5.5 염료, 시아닌 7 염료 및 시아닌 9 염료로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 수용체 잔기가 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 조성물.
제 9항에 있어서, 소광인자 잔기가 4-((-4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산 (다브실)임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 스페이서 잔기가 하나 이상의 공여체와 수용체 잔기를 성분 중합체에 구속시킴을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 링커가 성분 중합체의 두 세그먼트를 함께 결합시키는데 사용됨을 특징으로 하는 조성물.
제 12항에 있어서, 어닐링 중합체가 하나 이상의 링커에 의해 결합된 상호작용기의 두 세그먼트를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 표면에 고정되거나 구속됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상호작용기가 소수성 잔기, 이온성 잔기 및 수소 결합 잔기로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 15항에 있어서, 이온성 잔기가 염 쌍을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 15항에 있어서, 수소 결합 잔기가 둘 이상의 성분 중합체의 서브유닛에 결합된 상보적 누클레오염기를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상호작용기가 하나 이상의 성분 중합체의 한쪽 말단에 위치함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상호작용기가 하나 이상의 성분 중합체의 양쪽 말단에 위치함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상호작용기가 하나 이상의 성분 중합체내의 중심에 위치함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 복합체가 하나의 프로빙 중합체와 하나의 어닐링 중합체만을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 복합체가 셋 이상의 성분 중합체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 복합체가 둘 이상의 비이컨 세트(Beacon Set)를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 23항에 있어서, 각각의 비이컨 세트가 독립적으로 검출가능한 잔기를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 24항에 있어서, 각각의 비이컨 세트의 독립적으로 검출가능한 잔기가 독립적으로 검출가능한 공여체 형광단이고, 각각의 비이컨 세트의 수용체 잔기가 동일하거나 상이한 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 조성물.
제 25항에 있어서, 모든 수용체 잔기가 동일한 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 조성물.
제 26항에 있어서, 소광인자 잔기가 다브실임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 소광인자 잔기로 표지된 PNA 중합체임을 특징으로 하는 조성물.
제 28항에 있어서, PNA 중합체가 다브실로 C 말단 표지됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 프로빙 세그먼트가 표적 서열에 하이브리드화시에, 프로빙 중합체가 연장 반응에서 프라이머로서 작용할 수 있음을 특징으로 하는 조성물.
제 30항에 있어서, 프로빙 중합체가 폴리머라제 연장을 촉진시키도록 개질된 PNA 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서,

(i.) 프로빙 중합체가 표적 서열과 서열 특이적으로 상호작용하지 않는 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함하고;

(ii.) 어닐링 중합체가 프로빙 중합체의 상호작용기에 대한 정확한 상보체인 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 32항에 있어서, 프로빙 중합체가 5' 형광단이 함유된 핵산이고, 어닐링 중합체가 C 말단 소광인자 잔기가 함유된 PNA 중합체임을 특징으로 하는 조성물.
제 33항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 표면에 고정되거나 구속됨을 특징으로 하는 조성물.
하나 이상의 결합된 수용체 잔기은 함유하지만 결합된 공여체 잔기은 함유하지 않는 비-핵산 중합체.
제 35항에 있어서, 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 비-핵산 중합체.
제 35항에 있어서, 수용체 잔기가 다브실임을 특징으로 하는 비-핵산 중합체.
제 36항에 있어서, 소광인자 잔기가 다브실임을 특징으로 하는 PNA.
어레이의 둘 이상의 복합체가 각각,

a. 독특한 표적 서열에 하이브리드화하는 프로빙 세그먼트 및 하나 이상의 다른 성분 중합체와 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 포함하는 하나 이상의 성분 프로빙 중합체;

b. 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 성분 중합체의 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 성분 어닐링 중합체; 및

c. 복합체의 형성이 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함하는, 둘 이상의 상이한 복합체의 어레이로서, 단, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체이고, 각각의 상이한 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 어레이의 표면에 고정되거나 구속되는 어레이.
제 39항에 있어서, 모든 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 모든 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 어레이.
제 41항에 있어서, 성분 중합체의 PNA 서브유닛이 하기 화학식을 가짐을 특징으로 하는 어레이:

상기 식에서,

각각의 J는 동일하거나 상이하며, H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br 및 I로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의K는 동일하거나 상이하며, O, S, NH 및 NR¹로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 R¹은 동일하거나 상이하며, 헤테로원자를 임의로 함유할 수 있는 1개 내지 5개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고;

각각의 A는 단일 결합, 화학식 (CJ₂)_S-의 기 및 화학식 -(CJ₂)_SC(O)-의 기 (여기에서, J는 상기한 바와 같고, 각각의 s는 1 내지 5의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 t는 1 또는 2이고;

각각의 u는 1 또는 2이고;

각각의 L은 동일하거나 상이하며, J, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우리딘, 5-메틸시토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,6-디아미노푸린, 히포크산틴, 슈도이소시토신, 2-티오우라실, 2-티오티미딘, 그 밖의 천연 누클레오염기 유사체, 그 밖의 합성 누클레오염기, 치환된 방향족 잔기 및 비치환된 방향족 잔기, 비오틴, 플루오레세인 및 다브실로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제 43항에 있어서, 각각의 PNA 서브유닛이 메틸 카르보닐 결합에 의해 N-[2-(아미노에틸)]글리신 주쇄의 아자 질소에 부착된 천연 누클레오염기로 구성됨을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 각각의 복합체의 공여체 잔기가 형광단임을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 각각의 복합체의 수용체 잔기가 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 상호작용기가 소수성 잔기, 이온성 잔기 및 수소 결합 잔기로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 어레이의 하나 이상의 복합체가 셋 이상의 중합체를 포함함을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 어레이의 하나 이상의 복합체가 독립적으로 검출가능한 잔기를 각각 포함하는 둘 이상의 비이컨 세트를 포함함을 특징으로 하는 어레이.
제 49항에 있어서, 각각의 세트의 독립적으로 검출가능한 잔기가 독립적으로 검출가능한 공여체 형광단이고, 각각의 세트의 수용체 잔기가 동일하거나 상이한 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 어레이.
제 50항에 있어서, 모든 수용체 잔기가 동일한 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 어레이의 하나 이상의 복합체의 어닐링 중합체가 소광인자 잔기를 포함하는 PNA 중합체임을 특징으로 하는 어레이.
제 52항에 있어서, 동일한 PNA 어닐링 중합체가 어레이의 상이한 복합체의 둘 이상의 상이한 고정된 성분 중합체의 공통 상호작용기에 어닐링됨을 특징으로 하는 어레이.
제 39항에 있어서, 프로빙 세그먼트가 표적 서열에 하이브리드화시에, 하나 이상의 복합체의 프로빙 중합체가 증폭 반응에서 프라이머로서 작용할 수 있음을 특징으로 하는 어레이.
제 54항에 있어서, 프로빙 중합체가 폴리머라제 연장을 촉진시키도록 개질된 PNA 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 어레이.
제 55항에 있어서,

(i.) 프로빙 중합체가 표적 서열과 서열 특이적으로 상호작용하지 않는 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함하고;

(ii.) 어닐링 중합체가 프로빙 중합체의 상호작용기에 대한 정확한 상보체인 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함함을 특징으로 하는 어레이.
제 56항에 있어서, 프로빙 중합체가 5' 형광단이 함유된 핵산이고, 어닐링 중합체가 C 말단 소광인자 잔기가 함유된 PNA 중합체임을 특징으로 하는 어레이.
샘플중에서 하나 이상의 표적 서열이 포함된 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하거나 확인하는 방법으로서,

a. 샘플을,

(ⅰ) 표적 서열에 하이브리드화하는 프로빙 세그먼트 및 하나 이상의 다른 성분 중합체와 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 포함하는 하나 이상의 성분 프로빙 중합체;

(ⅱ) 성분 중합체의 상호작용기의 상호작용이 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 성분 어닐링 중합체; 및

(ⅲ) 복합체의 형성이, 성분 중합체가 복합체화되지 않거나 프로빙 세그먼트가 표적 서열에 하이브리드화되는 경우와 비교하여 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함하는 복합체로서, 단, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체인 하나 이상의 복합체와 접촉시키고;

b. 복합체의 해리시 또는 프로빙 세그먼트가 표적 서열에 하이브리드화시의 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달의 변화에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 검출하거나, 확인하거나, 정량하고, 신호의 변화를 샘플중의 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 관련시키는 것을 포함하는 방법.
제 58항에 있어서, 모든 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 모든 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이, 밀폐된 튜브 검정에 존재할 수 있거나, 여기에서 생성될 수 있는 목적 핵산 표적 분자를 검출하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 62항에 있어서, 방법이 핵산 증폭 반응을 수행한 결과로써 생성된 앰플리콘을 검출하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 62항에 있어서, 표적 분자가 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 쇄 전위 증폭(SDA), 전사-중개된 증폭(TMA), Q-베타 레플리카제 증폭(Q-베타) 및 롤링 써클 증폭(RCA)으로 구성된 군으로부터 선택된 공정에 의해 생성됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이 세포 또는 조직의 생존 여부와 무관하게 세포 또는 조직중의 표적 분자를 검출하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 프로빙 세그먼트가 표적 서열 이외의 서열에 결합하는 것을 억제시키도록, 샘플이 하나 이상의 블록킹 프로브와 접촉됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이 샘플중의 생물체 또는 바이러스를 검출하거나, 확인하거나, 정량하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이 샘플중의 하나 이상의 생물체 종을 검출하거나, 확인하거나, 정량하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이 샘플중의 하나 이상의 생물체의 증식에 대한 항미생물 제제의 효과를 결정하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이 샘플중의 생물체의 분류학적 군의 존재 또는 양을 결정하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 방법이 의학적으로 중요한 질환을 진단하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 표적 분자가 표면에 고정됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 목적 샘플과 접촉하는 표면에 고정되거나 구속됨을 특징으로 하는 방법.
제 73항에 있어서, 복합체가 해리되어 하나 이상의 표지된 성분 중합체를 용액내로 방출시킴을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 목적 샘플과 접촉하는 둘 이상의 고정되거나 구속된 복합체중의 하나임을 특징으로 하는 방법.
제 75항에 있어서, 복합체가 해리되어 하나 이상의 표지된 성분 중합체를 용액내로 방출시킴을 특징으로 하는 방법.
제 76항에 있어서, 표지된 성분 중합체가 어레이의 둘 이상의 상이한 고정되거나 구속된 복합체로부터 방출됨을 특징으로 하는 방법.
제 77항에 있어서, 동일한 공통 표지된 성분 중합체가 어레이의 둘 이상의 상이한 고정되거나 구속된 복합체중의 어느 하나로부터 방출됨을 특징으로 하는 방법.
제 78항에 있어서, 방출된 성분 중합체가 소광인자 잔기로 표지된 PNA 중합체 임을 특징으로 하는 방법.
제 78항에 있어서,

a. 임의의 하이브리드화된 표적 분자를 표면으로부터 분리시키고;

b. 표면을 어레이의 모든 복합체를 재생시키는데 필요한 양의 공통 표지된 성분 중합체와 접촉시킴으로써, 어레이의 복합체가 표면상에서 재생됨을 특징으로 하는 방법.
제 80항에 있어서, 공통 표지된 성분 중합체가 소광인자 잔기로 표지된 PNA 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 80항에 있어서, 둘 이상의 고정되거나 구속된 성분 중합체가 PNA 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 복합체의 직접적 또는 간접적 해리 없이 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 표적 분자의 표적 서열에 하이브리드화됨으로써 검출가능한 신호가 생성됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 표적 분자의 표적 서열에 하이브리드화되어 복합체의 간접 해리를 일으킴으로써 검출가능한 신호가 생성됨을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 표적 분자의 표적 서열에 하이브리드화되어 복합체의 간접 해리를 일으키는 2차 자극을 촉진시킴으로써 검출가능한 신호가 생성됨을 특징으로 하는 방법.
샘플중에서 하나 이상의 프라이밍 부위를 포함하는 목적 핵산 표적 분자를 검출하거나, 확인하거나, 정량하는 방법으로서,

a. 샘플을,

I. 둘 이상의 성분 중합체로 제조된 하나 이상의 복합체로서,

(ⅰ) 프라이머 연장 반응에서 프라이머로서 작용할 수 있고, 최소한,

1. 제 1 프라이밍 부위에 하이브리드화하는 프로빙 세그먼트 및

2. 하나 이상의 다른 성분 중합체와 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 포함하는 하나 이상의 성분 프로빙 중합체;

(ⅱ) 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 성분 중합체의 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 성분 어닐링 중합체; 및

(ⅲ) 복합체의 형성이, 성분 중합체가 독립적으로 또는 비결합된 상태로 존재하는 경우와는 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함하는 복합체; 및

II. 프라이머 연장 반응을 수행하는데 필요한 모든 다른 성분과 접촉시키고;

b. 프라이머 연장 반응을 수행하여, 프라이머 연장 반응에 의해 생성된 핵산의 양에 비례하여 복합체를 해리시키고;

c. 복합체의 해리시의 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 검출하거나, 확인하거나, 정량하고, 신호를 샘플중의 목적 핵산 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 관련시키는 것을 포함하는 방법.
제 86항에 있어서, 복합체의 모든 성분 중합체가 표지된 핵산임을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 어닐링 중합체가 소광인자 잔기가 함유된 PNA 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 90항에 있어서, 소광인자 잔기가 다브실임을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 프로빙 중합체가 폴리머라제 연장을 촉진하도록 개질된 PNA 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 92항에 있어서,

(i.) 프로빙 중합체가 제 1 프라이머 부위와 서열 특이적으로 상호작용하지 않는 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함하고;

(ii.) 어닐링 중합체가 프로빙 중합체의 상호작용기에 대한 정확한 상보체인 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 표면에 고정되거나 구속됨을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 연장 반응이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 쇄 전위 증폭(SDA), 전사-중개된 증폭(TMA), Q-베타 레플리카제 증폭(Q-베타) 및 롤링 써클 증폭(RCA)으로 구성된 군으로부터 선택된 공정의 요소임을 특징으로 하는 방법.
제 86항에 있어서, 프라이머 연장 반응이 핵산 증폭 공정의 일부임을 특징으로 하는 방법.
제 96항에 있어서, 방법이 PCR에 대한 주형인 목적 핵산 표적 분자를 검출하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 97항에 있어서, 복합체 해리가 증폭 공정의 작용의 결과로써 일어나며, 복합체의 해리에 의해 생성된 신호가 종말점 또는 실시간 검정 측정 둘 모두를 촉진시키는 밀폐된 튜브 검정 포맷에서 모니터됨을 특징으로 하는 방법.
제 98항에 있어서, 증폭 공정이 PCR임을 특징으로 하는 방법.
제 99항에 있어서, 그 밖의 검정용 성분이 완충제, 무기 염, 마그네슘, 누클레오시드 트리포스페이트, 폴리머라제 효소, 및 제 2 프라이머를 포함하고, 제 2 프라이머와 복합체가 PCR 반응의 정방향 및 역방향 프라이머를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 100항에 있어서, 제 2 프라이머가 표적 분자의 제 2 프라이머 부위에 하이브리드화하는 제 2 복합체이며; 제 2 복합체가,

(a) 1. PCR 공정에서 제 2 프라이머로서 작용하는 프로빙 세그먼트 및

2. 하나 이상의 다른 성분 중합체와 제 2 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 제 2 성분 프로빙 중합체;

(b) 제 2 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 성분 중합체의 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 제 2 성분 어닐링 중합체; 및

(c) 제 2 복합체의 형성이, 제 2 복합체의 성분 중합체가 독립적으로 또는 비결합된 상태로 존재하는 경우와는 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 제 2 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 제 2 복합체의 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 제 2 세트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 제 2 복합체의 모든 성분 중합체가 적절히 표지된 핵산임을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 제 2 복합체의 어닐링 중합체가 소광인자 잔기가 함유된 PNA 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 동일한 공통 어닐링 중합체가 제 1 복합체와 제 2 복합체 둘 모두에 공통임을 특징으로 하는 방법.
제 106항에 있어서, 공통 어닐링 중합체가 소광인자 수용체 잔기가 함유된 PNA임을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 제 2 복합체의 프로빙 중합체가 폴리머라제 연장을 촉진시키도록 변형시킨 PNA 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 108항에 있어서, 프로빙 중합체가 5(6)-카르복시플루오레세인, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥산산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 시아닌 2 염료(Dye), 시아닌 3.5 염료, 시아닌 5 염료, 시아닌 5.5 염료, 시아닌 7 염료 및 시아닌 9 염료로 구성된 군으로부터 선택된 공여체 형광단을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서,

(i.) 제 2 복합체의 프로빙 중합체가 제 2 프라이밍 부위와 서열 특이적으로 상호작용하지 않는 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함하고;

(ii.) 제 2 복합체의 어닐링 중합체가 프로빙 중합체의 상호작용기에 대한 정확한 상보체인 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 101항에 있어서, 제 1 및 제 2 복합체가 동일한 공여체 형광단 및 수용체 소광인자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 111항에 있어서, 수용체 소광인자가 다브실임을 특징으로 하는 방법.
제 86항 또는 101항에 있어서, 하나 이상의 복합체의 프로빙 중합체의 프로빙 세그먼트가 표적 분자상의 프라이밍 부위에 결합하는 것을 억제시키도록, 샘플이 하나 이상의 블록킹 프로브와 추가로 접촉됨을 특징으로 하는 방법.
제 86항 또는 101항에 있어서, PCR 클램핑이, 실시간으로 또는 종말점에서 둘 모두로 모니터될 수 있는 밀폐된 튜브 점 돌연변이 분석을 수행하기에 적합하도록, 검정법을 변형시키는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 86항 또는 101항에 있어서, 방법이 의학적으로 중요한 질환을 진단하는데 이용됨을 특징으로 하는 방법.
제 97항 또는 101항에 있어서, 하나 이상의 독립적으로 검출가능한 단분자 "비이컨" 프로브가 PCR 검정에 추가로 포함되어, PCR 증폭의 적절한 작동을 모니터하거나 검정에서 발생된 앰플리콘의 특징을 독립적으로 확인하는데 이용될 수 있는 독립적으로 검출가능한 신호를 발생시키도록 앰플리콘내의 하이브리드화 부위에 하이브리드화됨을 특징으로 하는 방법.
제 116항에 있어서, 검정에 의해 결정하려는 특정한 특징이 야생형, 변이체 또는 둘 모두의 표적 분자가 샘플중에 존재하는 지의 여부임을 특징으로 하는 방법.
제 117항에 있어서, 야생형 및 변이체 표적 분자의 하이브리드화 부위가 점 돌연변이로서 관련됨을 특징으로 하는 방법.
제 117항에 있어서, 특정한 특징이 밀폐된 튜브 포맷에서 검정의 실시간으로 또는 종말점에서 독립적으로 검출될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
제 119항에 있어서, 검정에 존재하는 하나 이상의 PCR 검출 복합체와 하나 이상의 단분자 "비이컨" 프로브로부터의 신호가 밀폐된 튜브 포맷에서 검정의 실시간으로 또는 종말점에서 독립적으로 검출가능함을 특징으로 하는 방법.
제 117항에 있어서, 검정에 의해 결정하려는 특정한 특징이 생물체의 하나 이상의 특정한 종이 샘플중에 존재하는 지의 여부임을 특징으로 하는 방법.
제 86항 또는 101항에 있어서, 둘 이상의 독립적으로 검출가능한 복합체가 동일한 샘플 및 동일한 검정에서 둘 이상의 목적 표적 분자를 동시에 검출하거나, 확인하거나, 정량하는데 이용되는 단일의 복합 검정에 존재함을 특징으로 하는 방법.
제 122항에 있어서, 독립적으로 검출가능한 복합체가 밀폐된 튜브 포맷에서 사용되고, 각각의 독립적으로 검출가능한 복합체로부터의 신호의 검출가능한 변화가 검정의 실시간으로 또는 종말점에서 모니터될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
복합체의 형성을 촉진시키는 조건하에서 둘 이상의 성분 중합체를 함께 혼합시키는 것을 포함하여 복합체를 형성시키는 방법으로서, 복합체가,

a. 표적 서열에 하이브리드화하는 프로빙 세그먼트 및 하나 이상의 다른 성분 중합체와 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 포함하는 하나 이상의 성분 프로빙 중합체;

b. 성분 중합체의 상호작용기의 상호작용이 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 성분 어닐링 중합체; 및

c. 복합체의 형성이, 성분 중합체가 복합체화되지 않거나 프로빙 세그먼트가 표적 서열에 하이브리드화되는 경우와 비교하여 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함하며, 단, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체인 방법.
제 124항에 있어서, 모든 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 124항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.
제 124항에 있어서, PNA 서브유닛이 하기 화학식을 가짐을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

각각의 J는 동일하거나 상이하며, H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br 및 I로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 K는 동일하거나 상이하며, O, S, NH 및 NR¹로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 R¹은 동일하거나 상이하며, 헤테로원자를 임의로 함유할 수 있는 1개 내지 5개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고;

각각의 A는 단일 결합, 화학식 (CJ₂)_S-의 기 및 화학식 -(CJ₂)_SC(O)-의 기 (여기에서, J는 상기한 바와 같고, 각각의 s는 1 내지 5의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 t는 1 또는 2이고;

각각의 u는 1 또는 2이고;

각각의 L은 동일하거나 상이하며, J, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우리딘, 5-메틸시토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,6-디아미노푸린, 히포크산틴, 슈도이소시토신, 2-티오우라실, 2-티오티미딘, 그 밖의 천연 누클레오염기 유사체, 그 밖의 합성 누클레오염기, 치환된 방향족 잔기 및 비치환된 방향족 잔기, 비오틴, 플루오레세인 및 다브실로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제 127항에 있어서, 각각의 PNA 서브유닛이 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 N-[2-(아미노에틸)]글리신 주쇄의 아자 질소에 부착된 천연 누클레오염기로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
제 124항에 있어서, 공여체 잔기가 형광단임을 특징으로 하는 방법.
제 129항에 있어서, 형광단이 5(6)-카르복시플루오레세인, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥산산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 시아닌 2 염료(Dye), 시아닌 3.5 염료, 시아닌 5 염료, 시아닌 5.5 염료, 시아닌 7 염료 및 시아닌 9 염료로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 124항에 있어서, 수용체 잔기가 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 방법.
제 131항에 있어서, 소광인자 잔기가 4-((-4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산 (다브실)임을 특징으로 하는 방법.
제 124항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 결합된 지지체임을 특징으로 하는 방법.
하나 이상의 복합체를 형성시키기에 적합한 둘 이상의 성분 복합체를 포함하는 키트로서,

a. 표적 서열에 하이브리드화하는 프로빙 세그먼트 및 하나 이상의 다른 성분 중합체와 복합체를 형성하기에 적합한 하나 이상의 상호작용기를 포함하는 하나 이상의 성분 프로빙 중합체;

b. 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 하나 이상의 상호작용기를 최소한 포함하는 하나 이상의 성분 어닐링 중합체; 및

c. 복합체의 형성이, 성분 중합체가 복합체화되지 않거나 프로빙 세그먼트가 표적 서열에 하이브리드화되는 경우와 비교하여 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체 각각에 결합되는 공여체와 수용체 잔기의 하나 이상의 세트를 포함하며, 단, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체인 키트.
제 134항에 있어서, 모든 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 키트.
제 134항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 키트.
제 136항에 있어서, 성분 중합체의 PNA 서브유닛이 하기 화학식을 가짐을 특징으로 하는 키트:

상기 식에서,

각각의 J는 동일하거나 상이하며, H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br 및 I로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 K는 동일하거나 상이하며, O, S, NH 및 NR¹로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 R¹은 동일하거나 상이하며, 헤테로원자를 임의로 함유할 수 있는 1개 내지 5개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고;

각각의 A는 단일 결합, 화학식 (CJ₂)_S-의 기 및 화학식 -(CJ₂)_SC(O)-의 기 (여기에서, J는 상기한 바와 같고, 각각의 s는 1 내지 5의 정수임)로 구성된 군으로부터 선택되고;

각각의 t는 1 또는 2이고;

각각의 u는 1 또는 2이고;

각각의 L은 동일하거나 상이하며, J, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우리딘, 5-메틸시토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,6-디아미노푸린, 히포크산틴, 슈도이소시토신, 2-티오우라실, 2-티오티미딘, 그 밖의 천연 누클레오염기 유사체, 그 밖의 합성 누클레오염기, 치환된 방향족 잔기 및 비치환된 방향족 잔기, 비오틴, 플루오레세인 및 다브실로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제 137항에 있어서, 성분 중합체의 각각의 PNA 서브유닛이 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 N-[2-(아미노에틸)]글리신 주쇄의 아자 질소에 부착된 천연 누클레오염기로 구성됨을 특징으로 하는 키트.
제 134항에 있어서, 세트의 공여체 잔기가 형광단임을 특징으로 하는 키트.
제 136항에 있어서, 형광단이 5(6)-카르복시플루오레세인, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥산산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 시아닌 2 염료(Dye), 시아닌 3.5 염료, 시아닌 5 염료, 시아닌 5.5 염료, 시아닌 7 염료 및 시아닌 9 염료로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트.
제 134항에 있어서, 세트의 수용체 잔기가 소광인자 잔기임을 특징으로 하는 키트.
제 141항에 있어서, 소광인자 잔기가 4-((-4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산 (다브실)임을 특징으로 하는 키트.
제 134항에 있어서, 프로빙 중합체가 프라이머 연장 반응에서 프라이머로서 작용할 수 있는 프로빙 세그먼트를 포함함을 특징으로 하는 키트.
제 143항에 있어서,

(i.) 프로빙 중합체가 표적 서열과 서열 특이적으로 상호작용하지 않는 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함하고;

(ii.) 어닐링 중합체가 프로빙 중합체의 상호작용기에 대한 정확한 상보체인 상호작용기를 함유하는 누클레오염기를 포함함을 특징으로 하는 키트.
a. 임의의 하이브리드화된 표적 분자를 표면으로부터 분리시키고;

b. 표면을, 지지체 결합된 복합체를 재생시키는데 필요한 양의 표지된 성분 중합체와 접촉시키는 것을 포함하여 지지체 결합된 복합체를 재생시키는 방법.
a. 임의의 하이브리드화된 표적 분자를 어레이 표면으로부터 분리시키고;

b. 표면을, 어레이의 상이한 복합체를 재생시키는데 필요한 양의 공통 표지된 성분 중합체와 접촉시키는 것을 포함하여 둘 이상의 상이한 복합체의 어레이를 재생시키는 방법.
a. 각각 조성물을 형성하고 이를 안정화시키는 상호작용기를 포함하는 둘 이상의 성분 중합체; 및

b. 조성물의 형성이, 성분 중합체가 복합체화되지 않는 경우와 비교하여 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체에 결합되는 공여체와 수용체의 하나 이상의 세트를 포함하는 조성물로서, 조성물이 효소의 작용시에 해리되는 기질을 형성함을 추가로 특징으로 하는 조성물.
제 146항에 있어서, 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 조성물.
제 147항에 있어서, 비-핵산 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.
샘플중에서 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 표적 분자의 존재, 부재 또는 양을 검출하거나, 확인하는 방법으로서,

a. 효소를 표적 분자의 표적 서열에 고정시키고;

b. 샘플을,

(ⅰ) 각각 복합체를 형성하고 이를 안정화시키는 상호작용기를 포함하는 둘 이상의 성분 중합체; 및

(ⅱ) 조성물의 형성이, 성분 중합체가 복합체화되지 않는 경우와 비교하여 검출가능하게 상이한 방식으로, 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달을 촉진시키게 되도록 세트로부터의 하나 이상의 잔기가 둘 이상의 성분 중합체에 결합되는 공여체와 수용체의 하나 이상의 세트를 포함하는 복합체로서, 복합체가 효소의 작용시에 해리되는 기질을 형성함을 추가로 특징으로 하는 복합체와 접촉시키고;

c. 복합체의 해리시의 세트의 공여체와 수용체 잔기 사이의 에너지 전달에 기인하는 검출가능한 신호의 변화를 검출하거나, 확인하거나, 정량하고, 신호를 샘플중의 목적 표적 분자의 존재, 부재 또는 양과 관련시키는 것을 포함하는 방법.
제 149항에 있어서, 복합체의 하나 이상의 성분 중합체가 비-핵산 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제 150항에 있어서, 복합체의 비-핵산 중합체가 PNA임을 특징으로 하는 방법.